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Universidad Nacional de Tucumán 
Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia 
Área Temática: Ciencias de la Salud 
Núcleo Académico: CA Atención Primaria de la Salud 
 
 
ESTUDIO BACTERIOLOGICO Y APLICACIÓN DE BIOLOGIA MOLECULAR EN EL 
DIAGNOSTICO DE OTITIS MEDIA CON EFUSION 
González ML1, Delgado G1, Rubio M1, Mesurado MI2, Villagra de Trejo A 1 
1-Laboratorio de Bacteriología. Hospital del Niño Jesús. 
2-Servicio de Otorrinolaringología. Hospital del Niño Jesús. logonzalez@hotmail.com 
Director: Valdez, Juan Carlos 
 
Palabras claves: Otitis media con efusión, bacterias, PCR, Otite média com efusao, 
bactérias, PCR 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cuartas Jornadas de Jóvenes Investigadores UNT - CONICET Tucumán, 22, 23 y 24 de Junio de 2010
mailto:logonzalez@hotmail.com
 La Otitis Media con Efusión (OME) es una inflamación del oído medio en el que el fluido se 
acumula detrás del tímpano, sin signos o síntomas de infección aguda, con una membrana 
timpánica intacta siendo una de las principales causas de hipoacusia auditiva en la infancia 
(1). Esta patología se presenta en la infancia y su incidencia varía entre 10 y 25% (2). Es 
importante destacar que Otitis Media Secretora, Otitis Media no Supurativa, Otitis Media 
Serosa y Otitis Media Mucoide son sinónimos de Otitis Media con Efusión. Donde la 
frecuente opacidad y edema de la membrana timpánica puede obstaculizar la identificación 
del tipo de efusión. La OME a menudo se considera una prolongación directa del proceso 
inflamatorio de larga duración o episodios recurrentes de Otitis Media Aguda (OMA), teoría 
que se ve reforzada en la práctica por el hecho de que casi todos los casos de OME siguen 
a episodios de OMA, como así también por estudios experimentales con animales. 
La alta prevalencia de infecciones de las vías respiratorias superiores (URTI) durante la 
infancia implica una relación directa entre URTI y OME. Por ejemplo en aquellos niños que 
tengan más de cuatro URTI en un año, la tasa de incidencia de derrame llegará al 40% (3). 
Actualmente la formación del biofilm es reconocida como responsable de numerosas 
infecciones crónicas y de los periodos de exacerbaciones. Donde los patógenos como, 
Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae en otitis media crónica y 
Staphylococcus aureus en rinosinusitis, están asociados a la formación de biofilm. Por lo 
tanto, en los procesos infecciosos por estos microorganismos se le agrega la complejidad 
de la formación de biofilm. Estos usualmente se definen como comunidades microbianas 
asociadas adheridas a una superficie, rodeadas por una matriz polimérica extracelular. Se 
ha demostrado que su formación por parte de los agentes patógenos es claramente una 
estrategia de supervivencia. Por lo general los biofilms se encuentran en infecciones 
crónicas como mecanismo de resistencia a la respuesta inmune del huésped y los 
tratamientos con antibióticos fracasan permitiendo a las bacterias a persistir in vivo. 
Los biofilms bacterianos son complejas comunidades microbianas formadas por docenasa 
ciebtos de especies diferentes encontradas en prácticamente todas las mucosas en 
animales y los seres humanos, como se ha descripto en el biofilm de intestino, vagina y 
cavidad oral. Los cambios en la ecología del biofilm pueden dar lugar a enfermedades 
inflamatorias tales como enfermedad intestinal, vaginitis y caries (4). 
Las infecciones producidas por biofilms son difíciles de diagnosticar con la aplicación de 
técnicas bacteriológicas tradicionales y cuando esto es posible, los antibióticos a utilizar 
resultantes de las pruebas de sensibilidad no resuelven la infección y tan sólo la reducen en 
los periodos de exacerbación. Los graves problemas generados por este hecho, 
comenzaron a ser explicados a fines de la década de los 80, cuando con la aplicación de 
métodos de biología molecular para el diagnóstico, tecnica de Reacción en Cadena de la 
Polimerasa ( PCR) e Hibridación in situ con Fluorescencia (FISH), se determinó la presencia 
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de bacterias metabólicamente activas aún cuando no se las recuperaba por el tradicional 
hisopado y plaqueo. En el caso especifco de OME en niños la falla en el aislamiento de la 
bacteria causante llevó a considerar la misma como una enfermedad autoinmune o viral. Sin 
embargo la aplicación de metodologías diagnosticas tales como PCR o FISH permitio 
determinar el origen del agente etiologico como bacterias productoras de biofilm 
(Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrallis) (5). 
En un estudio realizado en Brasil a niños con otitis media con efusion se encontro que, 
Haemophilus influenzae fue el más frecuente luego Streptococcus pneumoniae y Moraxella 
catarrhallis. El analisis por PCR revela mayor sensibilidad que el cultivo ya que el 67% de 
las PCR positivas dieron cultivos negativos (6). Similares resultados son reportado en Korea 
donde ademas se determina que la mayor contribución a las otitis media con efusion es 
OMA (7). La deteccion de bacterias por tecnicas bacteriologicas fue positiva para patogenos 
en niños sometidos a la colocacion de tubo de timpanestomia en menos del 30% de los 
casos, comparado con tecnicas de PCR detectandose el 80-90 % de los casos (8).El 85% 
del biofilm es matriz extracelular y sólo el 15% son células con un particular metabolismo 
que no son blanco para los antibióticos. El 90% de las OME son producidas por bacterias 
formadoras de biofilm y entre los tratamientos habituales estan la miringotomia y tubos de 
timpanostomia que estan sujetos a contaminación y a la formación de biofilms en su 
superficie (9). Los estudios bacteriológicos del derrame en OME han demostrado la 
presencia de varios agentes bacteriológicos en 22-52% de los casos .La identificación de un 
agente bacteriano específico en el derrame del oído medio es la base para la aplicación de 
los antibióticos como terapia en OME (10). Es conocido que la técnica de PCR tiene una 
sensibilidad superior en la detección de especies bacterianas. Puesto que la técnica se basa 
en la amplificación de una pequeña porción de material genético, la viabilidad del agente 
patógeno en cualquier material clínico no constituye un obstáculo. En un estudio 
previamente publicado se informó, la aplicación de la prueba de PCR a un derrame de los 
casos de OME para la detección de ADN bacteriano (11). El objetivo del presente estudio 
consiste en demostrar la presencia de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae 
y Moraxella catarrhalis en los derrames de otitis media con efusión, por métodos 
bacteriológicos estandarizados convencionales, como así también por métodos genéticos 
como la PCR para los dos primeros. 
 
 
 
 
 
 
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MATERIALES Y MÉTODOS 
Tipo de estudio: Retrospectivo 
Pacientes: Se trabajó con 66 muestras de 38 niños (1 mes-12meses de edad) con OME 
obtenidas por timpanocentesis en el Servicio de Otorrinolaringologia del Hospital del Niño 
Jesús. 
Timpanocentesis: Se desinfecto el conducto auditivo externo con 1 o 2 hisopos embebidos 
en alcohol. Visualizando la membrana timpánica se punzo con una jeringa de tipo insulina, 
provista de una aguja fina y corta con bisel corto, se aspiro suavemente. 
Estudios bacteriológicos: Los exudados del oído medio, previa coloración de Gram de la 
muestra directa, fueron plaqueados en agar sangre de carnero, con estria de 
Staphylococcus aureus ATCC 25923 , agar chocolate y en caldo de tioglicolato e incubadas 
a 37° C en atmósfera húmeda al 5% CO2 durante 24 y 48hs. 
Aislamiento e identificación: Se realizó la coloración de Gram para su posterior 
aislamiento en agar sangre y/o agar chocolate e identificación bioquímica empleandoprueba 
de catalasa, crecimiento en tioglicolato, pruebas complementarias . 
Extracción de ADN, PCR y Revelado: 
Se emplearon 200 ul de muestra para extraer el ADN mediante el método de proteinasa K / 
fenol / cloroformo y Precipitación Alcohólica (12). Se resuspendieron los extractos de ADN 
en 20 ul de H2Odd. Se emplearon 3 ul del extracto para cada reacción de PCR en un 
volumen final de 25ul cuyas condiciones de amplificación fueron: 200 uM dNTPs, 0,2 U de 
Go taq polimerasa, 1,5 mM de Mg+2 y 0,2 uM de cada cebador. Los cebadores empleados 
amplifican un fragmento de 308 pb del gen Lyt A para Streptococcus pneumoniae, Fw5´-
CAA CCG TAC AGA ATG AAG CGG-3´ / Rv5´-TTA TTC GTG CAA TAC TCG TGC G-3´, y 
un fragmento de 124 pb del gen RNAr16S para Haemophilus influenzae Fw5´-GGA GTG 
GGT TGT ACC AGA AGT AGA T-3´ / Rv5´-AGG AGG TGA TCC AAC CGC A-3´, cebadores 
originalmente diseñados por Nagai et al. 2001 y U. Gok et al. 2001 respectivamente. Las 
condiciones de amplificación fueron de 94ºC 3 minutos, seguido de 35 ciclos de 94ºC 45 
seg., 54ºC 45 seg., 72ºC 45 seg. y 5 min. de extensión final a 72ºC. El termociclador 
empleado fue THERMO Px2 que no requiere el uso de aceite mineral. 
El producto de amplificación se observó en transiluminador UVP luego de sembrar y correr 
10 ul de producto de PCR en geles de Agarosa al 2% con Bromuro de Ethidio 0,5 ug/ml a 
voltaje constante de 80 voltios por 20 minutos sumergido en buffer TAE 1X. 
Análisis estadístico: Los resultados de los cultivos y PCR fueron comparados aplicando 
Test de McNemar. 
 
 
 
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RESULTADOS 
Grafico Nº 1: Resultados de cultivos positivos de oído derecho y oído izquierdo para 
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis. 
 
37%
32%
17%
13%
3% 3%
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
OD (n=35) OI (n=31)
Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Moraxella catarrhalis
 
 
 
Grafico Nº 2: Resultados de PCR positivas de oído derecho y oído izquierdo para 
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae. 
63% 64%63% 64%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
OD (n=35) OI (n=31)
Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae
 
 
 
 
 
 
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Grafico Nº 3: Resultados de PCR según resultados de Cultivo para Streptococcus 
pneumoniae en oído derecho. 
 
13
9
13
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Positivo Negativo
Cultivo
Negativo PCR
Positivo PCR
 
 
 
Al analizar los resultados de las muestras de OD para la bacteria Streptococcus pneumoniae 
(n=35), se observó que de las muestras cuyos resultados fueron positivos según Cultivo, 
ninguna presentó resultado negativo para PCR y de las que dieron resultado negativo según 
Cultivo, el 41% (9) dio resultado positivo según PCR. La frecuencia de resultado positivo fue 
significativamente superior para PCR que para Cultivo. (Test de McNemar, p=0.003) 
 
Grafico Nº 4: Resultados de PCR según resultados de Cultivo para Streptococcus 
pneumoniae en oído izquierdo. 
 
10
10
11
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Positivo Negativo
Cultivo
Negativo PCR
Positivo PCR
 
 
Al analizar los resultados de las muestras de OI para la bacteria Streptococcus pneumoniae 
(n=31), se observó que de las muestras cuyos resultados fueron positivos según Cultivo, 
ninguna presentó resultado negativo para PCR y de las que dieron resultado negativo según 
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Cultivo, el 48% (10) dio resultado positivo según PCR. La frecuencia de resultado positivo 
fue significativamente superior para PCR que para Cultivo. (Test de McNemar, p=0.004) 
 
Grafico Nº 5: Resultados de PCR según resultados de Cultivo para Haemophilus influenzae 
en oído derecho. 
 
6
16
13
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Positivo Negativo
Cultivo
Negativo PCR
Positivo PCR
 
 
Al analizar los resultados de las muestras de oído derecho para la bacteria Haemophilus 
influenzae (n=35), se observó que de las muestras cuyos resultados fueron positivos según 
Cultivo, ninguna presentó resultado negativo para PCR y de las que dieron resultado 
negativo según Cultivo, el 55% (16) dio resultado positivo según PCR. La frecuencia de 
resultado positivo fue significativamente superior para PCR que para Cultivo. (Test de 
McNemar, p=0.0002). 
 
Grafico Nº 6: Resultados de PCR según resultados de Cultivo para Haemophilus influenzae 
en oido izquierdo. 
4
16
11
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Positivo Negativo
Cultivo
Negativo PCR
Positivo PCR
 
 
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Al analizar los resultados de las muestras de oído izquierdo para la bacteria Haemophilus 
influenzae (n=31), se observó que de las muestras cuyos resultados fueron positivos según 
Cultivo, ninguna presentó resultado negativo para PCR y de las que dieron resultado 
negativo según Cultivo, el 59% (16) dio resultado positivo según PCR. La frecuencia de 
resultado positivo fue significativamente superior para PCR que para Cultivo. (Test de 
McNemar, p=0.0002). 
 
Figura n°1: Producto de PCR en Gel de Agarosa al 2%. 
 
 
 
 
Calle 1,2 muestras de otitis, calle 3 control positivo (Dna Hinf) y calle 4 control de PCR 
(H2O) y en la última calle un marcador de PM de 100pb. 
CONCLUSIONES 
En este trabajo observamos que Streptococcus pneumoniae es el principal agente etiológico 
de OMA en la población bajo estudio, coincidiendo con otros resultados publicados en 
Latinoamérica (13), como segundo agente causal encontramos encontramos Haemophilus 
influenzae. Esto se debería a dos causas, la primera sería la aplicación sistemática de la 
vacuna anti Haemophilus influenzae en menores de edad, la cual está incluida en el plan 
Nacional de Vacunación y que disminuye ostensiblemente la presencia de la bacteria como 
responsable de enfermedades (14).La segunda causa podría deberse a la presencia de 
Haemophilus influenzae como biofilm, lo cual hace difícil su detección por los métodos 
bacteriológicos tradicionales. Este inconveniente es solucionado mediante el uso de técnicas 
moleculares para la detección de Haemophilus influenzae por PCR. 
Existen diferentes asociaciones entre las bacterias usualmente aisladas de muestras de 
Otitis Media. Muchas no se detectan por que una de ellas está formando biofilm. La PCR 
revela estas asociaciones. La infección dependerá de una compleja competición entre 
bacterias patógenas, comensales y la respuesta defensiva del hospedador. Este estudio 
sugiere que la técnica de PCR debe ser considerada en la práctica clínica como un método 
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de diagnóstico rápido y más útil en la etiología de pacientes con OME que los métodos de 
cultivo tradicionales. 
BIBLIOGRAFÍA: 
 
1. - Klein J.O., Tos M., Hussl B., Naunton, Ohyama M., P.B. van Cauwenberge(1989). 
Recent advances in otitis media. Definition and classification. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol 
Suppl. Apr; 139:10 
2. - Kitajiri M., Sando I., Takahara T.(1987).Postnatal development of the eustachian tube 
and its surrounding structures, Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. Mar-Apr; 96 :191–8. 
3. - C.D. Bluestone, J.O. Klein, Otitis Media in Infants and Children, W.B. Saunders, 
Philadelphia (1998). 
4. -Costerton, J. W., Z. Lewandowski, D. E. Caldwell, D. R. Korber, and H. M. Lappin-Scott. 
(1995). Microbial biofilms. Annu. Rev. Microbiol. 49:711–745 
5. - Costerton, J.W., Stewart, P.S., and Greenberg, E.P. 1999. Bacterial biofilms: A common 
cause of persistent infections. Science. 284:1318-1322. 
6.- Rotta-Pereira MB, Pereira MN, Cantarelli V, Costa S.(2004). Prevalence of bacteria in 
children with otitis edia with efusión. Jornal de Pediatria. 80:41-48 
7.- Park C-W, Han J-H, Jeong J-H, et al. (2004). Detection rates of bacteria in chronic otitis 
media with effusion in children. J. Korean Med. Sci. 19: 735-738. 
8.- Hall-Stoodley et al. (2006).Direct detection of bacterial biofilms on the middle-ear mucosa 
of children with chronic otitis media. JAMA. 2006 Jul 12;296(2):202-11 
9.-Costerton W., R. Vee, M. Shirtliff, et.al. (2003). The application of biofilm science to the 
study and control of chronic bacterial infecctions. J. Clin. Invest. 112: 1466-1477. 
10.- J.C. Post, J.J. Preston, M. Aul, J.R. Pettigrew, K.W. White, R.M. Anderson, et al. 
(1995).Molecular analysis of bacterial pathogens in otitis media with effusion, JAMA 273; 
1598–1604. 
11. - U. 50 Gok et al. (2001). Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. 60: 49–54]. 
12. - Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis, T. Chapter 6: Preparation and Analysis of 
Eucaryotic Genomic DNA. MolecularCloning: a Laboratory Manual, Third Edition, Cold 
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. NY. 2001. 
13.- M. Elena Santolaya de P. (2007). Otitis media aguda. Diagnóstico y tratamiento. Rev 
Chil Infect 24 (4): 297-300 
14.- Lucia Ferro Bricks, Caio Márcio Figueredo Mendes, Bianca Rezende Lucarevschi, 
Carmem Paz Oplustil, Rosemeire C. Zanella, Adriana Bori and Ciro João Bertoli. (2004). 
Oropharyngeal colonization by Haemophylus influenzae in healthy children from Taubaté 
(São Paulo), prior to the Haemophylus influenzae type b vaccination program in Brazil. REV. 
HOSP. CLÍN. FAC. MED. S. PAULO 59(5):236-243 
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