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celular del insecta (Gazit et a/. 1994) por las regiones hidrofobicas N-terminal, en particular las alfa-helices pueden formar canales anfifaticos que se extienden a traves de la membrana (Pietrantonio et a/. 1993) . Se construyeron siete genes mutados a partir del fragmento activo de la protelna de 60 KDa y de la region adyacente de la de 130 KDa de B. thuringiensis aizawai remplazando los codones Arg y Lys par el codon Gin y expresandolos en E. coli. Las protelnas mutantes producidas a partir de eso genes, tenian algunas de las siguientes mutaciones Arg . 87, 131 , 198, 311 , 368, 402, 458, 502, 512, 526, 528, 0 601 , las cuales redujeron su actividad insecticida contra larvas de Spodoptera litura . EI mutante Arg. 601 fue sensible a digestion proteolltica con jugos del intestino de larvas de S. litura. Los mutantes en Arg . 619, Lys. 622 , Y Lys. 637 tuvieron casi la misma actividad que el tipo silvestre y 10 contrario sucedio con el mutante de triple reemplazo en Arg . 619, Lys. 622, Y Lys. 637 que fue 2.5 veces mas activo contra estas larvas que el tipo silvestre. Este mutante triple fue digerido un poco diferente con los jugos del intestino que el del tipo silvestre. EI proceso proteolltico en los jugos de S. litura del mutante con el remplazo en Arg 601 fue muy rapido y no produjo una cantidad detectable del fragmento activo de 60kDa 0 de otros fragmentos procesados. EI analisis de las secuencias amino acidicas de las 13 protelnas mutantes, mostro que Arg . 601 esta en la region altamente conservada entre los residuos amino 35 acidicos 597 Y 606; Y los correspondientes residuos de las otras 12 proteinas mutantes son tambiem Arg. 0 Lys, las cuales tienen un residuo cargado y podrfa ser una proteasa que corta en el sitio. Este estudio sugiere que Arg 601 de la protefna de 130 KDa de B. thuringienis aizawai y de su fragmento procesado puede estar relacionada con la susceptibilidad a la digestion proteoiltica en los jugos del intestino. Ademas, el amino acido Arg 601 parece ser importante para la permanencia de una conformacion tridimensional especffica del fragmento activo que es relativamente resistente a digestion proteoiftica con lIevando a la desintoxicacion (Nakamura et al. 1992). 1.2.2 Proceso proteolltico y activacion de las toxinas. Las proteinas del cristal de B. thuringiensis son sintetizadas como protoxinas por 10 cual deben ser procesadas en fragmentos activos en el intestin~ medio de las laNas de los insectos susceptibles (Watanabe et al. 1996). Despues de la ingestion de las esporas y del cristal parasparal de B. thuringiensis par las laNas, los cristales son solubilizados y activados par las proteasas alcalinas del intestino del insecto. Las enzimas proteoliticas que actUan sobre las proteinas del cristal disuelto pueden ser de origen endogen~ 0 exogeno, una proteasa endogena esta asociada con el cristal y puede contribuir a la liberacion 0 adivacion de la toxina , pero esta enzima no es esencial. Las enzimas exogenas del intestin~ medio del insecta son principalmente las responsables de la degradacion de las protefnas del cristal para farmar las endotoxinas (Thurley et al. 1985) . 36 37 Un aspecto interesante del proceso de activacion es que las variaciones en el pH del intestino medio del insecto y la actividad de las proteasas determinan el espectro de actividad de algunas protefnas de B. thuringiensis. Quizas la mayor demostracion es la protefna insecticida del cristal (PIC) de B. thuringiensis aizawai IC1, la cual puede ser activa contra lepidopteros 0 dfpteros cuando se procesa por proteasas de lepidopteros 0 de dfpteros, respectivamente. Esto se puede explicar por la especificidad determinada por los aminoacidos 524-595 de la de la region C-terminal de la toxina, mientras los aminoacidos 524-558 son importantes para la toxicidad contra dfpteros, los 558-595 son crfticos para la toxicidad a lepidopteros (Haider and Mahmood, 1990). Las protoxinas activas (130, 140 KOa) contra lepidopteros son cortadas en sitios especfficos generando fragmentos activos de 60, 70 KOa derivados de la mitad N terminal de la protoxina, responsables de la toxicidad y resistentes a las proteasas (Hofte and Whiteley, 1989; Federici, 1993). En general , el tamano del fragmento activo varia con el tipo de protefna de B. ·ensis, por ejemplo para protoxinas Cryl la proteolisis ocurre en la region N-termina~ mientras alrededor de 500 aminoacidos estructarales de la molecula son remo os de la parte C-terminal. Los aminoacidos NyC terminal del sitio de corte de CryIA(c) son ile 29 y Lys 623, respectivamente (Bietlot et al. 1989) , mientras p CryIA(b) son ile29 y Arg601 (Hofte et al. 1986; Nakamura et al. 1992). Estudios de delecciones de los genes que codifican para la regi6n central NyC terminal responsable de la actividad t6xica de las protefna ISRH3 (CryIV8) e ISRH4 (CryIVA) de B. thuringiensis israelensis mostraron una actividad reducida 10 cual sugiere que la regi6n central es importante para la actividad mosquitocida (Yoshida et al. 1993) . Ge et al. 1989 localizaron en la regi6n central de las protefnas de 130 KDa de B. thuringiensis kurstaki la regi6n responsable de la especificidad t6xica a hacia B. mori. En el caso de la protefna de 130 KDa de B. thuringiensis israelensis la regi6n central puede determinar el mismo tipo de actividad selectiva (Yoshida et a/. 1993). Las protefnas Cryll , Crylll, y CrylVD no sufren un corte significativo en la parte C terminal ya que esta regi6n parece ser una variaci6n natural de la protefna Cry de 130-140 kDa, fundamental para su funcionamiento, esto se ha corroborado con estudios de delecci6n de 11 aminoacidos de la regi6n C-terminal de la toxina CryliA la cual produce perdida de actividad (Widner and Whiteley, 1989). EI corte por proteasas de la regi6n C-terminal tanto de la toxina CryiliA como de la CrylVD genera la perdida de actividad insecticida debido a que estas toxinas tienen en las secuencias C-terminal 5 dominios conservados que son requeridas para la toxicidad en diferentes toxinas Cryl activadas (Widner and Whiteley, 1989). Sin embargo, parece que CrylllA puede sufrir un corte de hasta 150 aminoaacidos 38 39 por las proteasas del intestino medio del insecto en la region ninguna disminucion en la actividad biologica (Carroll et a/. 1989). N-terminal sin En lepidopteros las enzimas proteoliticas activan la protoxina por la remocion de los primeros 28 aminoacidos de la parte N-terminal y de la parte media de la region C-terminal hidrofflica para formar una toxina de aproximadamente 66 KDa de peso molecular (Arvidson et al. 1989), pero la estructura secuendaria permanece similar a la de su protoxina (Choma et al.) . I I La digestion de la protoxina CrylVA de 135-KDa origina una toxina activa de 72 KDa, mientras que el fragmento toxico activo de 76 KDa de CrylVB contiene los aminoacidos 30-695 (Ward and Ellar, 1988). Sin embargo, la incubacion de las protefnas CrylVA y CrylVB con extractos del intestino de mosquitos originan protefnas de 46 a 48 KDa (Angsuthanasombat et a/. 1992). La protefna insecticida de B. thuringiensis aizawai produce un fragmento de 60 KDa en el intestino medio de larvas susceptibles (Nakamura et al. 1992) La protefna CrylVD de B. thuringiensis israenlensis produce un fragmento toxico de 32 a 40 KDa al ser cortada por tripsina, quimotripsina 0 por proteasas del intestino medio de mosquitos asociadas con el cuerpo parasporal (Dai and Gill, 1993). Los polipeptidos de CrylVD producidos par tripsina in vitro son aparentemente mas activ~s a lineas de celulas de mosquito que la toxina intacta de 72KDa (Chilcott and Ellar, 1988). Es posible que el corte de la protefna CrylVD en pequenos fragmentos sea un paso de activacion 10 cual se ha observado tambien para la toxina activa contra coleopteros CryiliA cuandoes clivada por proteasas del intestino medio de crisomelidos 0 por quimitripsina produce un fragmento activo de 42 KDa que se une al epitelio de la membrana celular con mayor afinidad que cuando la toxina esta intacta (Martinez and Real , 1996). En el intestino medio del insecta la toxina CrylVD forma productos de 32-40 KDa derivados del corte en los sitios Thr347 y/o Phe 348 iguales a los obtenidos in vitro por termolisina 0 quimotripsina (Dai and Gill , 1993). EI fragmento de 40 KDa formado contiene la secuencia N-terminal de la proteina de 72 KDa y el fragmento C-terminal observado es el de 32.5 KDa el cual es posteriormente es cortado en un peptido de 31 KDa que es resistente a mas proteolisis. EI fragmento de 40-KDa es entonces cortado en Leu 9 y probablemente sufre proceso de clivaje en la region C-terminal para producir un fragmento de 36 KDa (Pietrantonio et a/. 1993). Thomas and Ellar, 1983 detectaron la amplia actividad citolltica del cuerpo parasporal solubilizado de la CytA, atribuyeron esta actividad a la proteina de 25 KDa obtenida por clivaje de la proteina de 27 KDa cuando el cuerpo parasporal es solubilizado bajo condiciones alcalinas, la cual tambien se procesa en un producto activo de 24 KDa que resulta de la proteolisis en las regiones NyC terminal(Gili et a/. 1987). 1.2.3 Interacci6n de las endotoxinas con la membrana. Hasta ahora se desconoce el mecanismo molecular por el cual las endotoxinas de B. thuringiensis causan la muerte de las celulas de su hospedero. Basados en el 40 anal isis de la estructura molecular de las delta endotoxinas, y de bioensayos in vivo con larvas de insectos, e in vitro con celulas en cultivo se ha encontrado que se activan 0 forman poros que atraviesan la membrana de celulas especificas del epitelio del intestino medio del insecto, y que estos poros estan asociados con el hinchamiento y lisis celular, sin embargo, no se sabe si estos poros son causantes de toxicidad 0 si son el resultado de un proceso de intoxicaci6n desconocido (Pietrantonio et al. 1993). Algunos experimentos realizados con membranas artificiales, demuestran que las endotoxinas de B. thuringiensis pueden formar poros en estas membranas, pero unicamente se forman con concentraciones 50 a 100 veces mas altas que las requeridas para causar toxicidad in vivo. Se requiere mayor evidencia para sugerir que las toxinas de B. thuringiensis primero se unen a las celulas insertandose en la membrana celular, y luego causan la formaci6n, directa 0 indirectamente, del poro que atraviesa la membrana, 10 que conlleva a un desequilibrio osm6tico y posteriormente a la muerte celular (Pietrantonio et al. 1993) Ademas, se sabe desde hace ya varios arios, que la acci6n principal de las toxinas de B. thuringiensis es sobre el epitelio del intestino medio de los insectos sensibles, solo recientemente se ha demostrado que la toxina se une especificamente a la parte apical 6 borde del cepillo de las vesiculas de la membrana (BCVM) epitelial del intestino medio del insecto,los cuales pertenecen principalmente a las celulas del tipo columnar de la membrana. 41 En varios estudios, se ha encontrado que hay una correlaci6n positiva entre la actividad biol6gica de las toxinas Cry y su habilidad para unirse a los BCVM de las larvas susceptibles; como tambiem con el numero de receptores disponibles, por 10 tanto a mayor concentraci6n de receptores , mayor toxicidad. Varias investigaciones demuestran que las toxinas Cry requieren un receptor de membrana especifico sobre los microvellos de las celulas epiteliales del intestin~ medio del insecto; por ejemplo, CryIA(a) no increment6 la permeabilidad del BCVM renal de rat6n, por 10 cual se cree que es necesarfa para la toxicidad la interacci6n de la toxina con sus celulas especificas (Rie et al. 1990).Rie et al. (1900) reportaron que la resistencia de una cepa seleccionada en laboratorio del lepid6ptero Piodia interpunctelJa a las proteinas del cristal parasporal de B. thuringiensis kurstaki reduj6 la afinidad de los receptores de la membrana a las protefnas del cristal , y que la cepa resistente fue sensible a otras protefnas del cristal parasporal (PCP) de B. thuringiensis entomocidus HD11 o. Se ha considerado que si los receptores de las celulas de los insectos tienen alta afinidad por una determinada proteina t6xica, sera altamente t6xica hacia el insecto, y viceversa. In vitro se ha evaluado la afinidad de los receptores por el fragmento t6xico de las proteinas de 130 KDa de B. thuringiensis israeiensisis en la membrana celular de las celulas de TN-368 para reaccionar con las proteinas t6xicas la cual es suficientemente alta. 42 En estudios de afinidad de las toxinas Cry por el receptor se ha encontrado que las celulas de los insectos tienen probablemente multiples tipos de receptores de toxinas (Pietrantonio et al. 1993). En pruebas de saturaci6n de los receptores de las membranas se ha encontrado que en especies no afectadas las toxinas tambiem se unen a los receptores hasta saturarlos (Rie et al. 1990). Cultivos de celulas de lepid6pteros (TN-368) extrafdos del ovario de Trichocp/usia ni, han mostrado que se afectan por proteinas del cristal parasporal solubilizadas de B. thuringiensis israe/ensisis, a pesar de la especificidad insecticida de estas protefnas hacia dfpteros, sin embargo, la toxicidad de las protefnas no es tan alta como in vivo. En un estudio reciente con larvas de "Ia polilla gitana" Lymantria dispar (Lepidoptera) no hubo correlaci6n directa entre la concentraci6n del receptor y la toxicidad pero si se observ6 una correlaci6n negativa entre la afinidad del receptor y la toxicidad (Wolfersberger, 1990). Aunque la toxina CryIA(c) tiene poca toxicidad hacia el lepid6ptero S. frugiperda, se une a los BCVM del insecta y no se ha obtenido en todos los casos de B. thuringiensis estudiados una correlaci6n directa entre toxicidad y uni6n de la toxina a los BCVM (Garczynski et al. 1991). Wolfersberger (1990) report6 que la toxicidad de CrylA no estuvo correlacionada con la uni6n al receptor, asf que pueden existir otros factores que determinan la especificidad insecticida de las protefnas t6xica de B. thuringiensis. Por ejemplo, 43 las PCP de B. thuringiensi israelensis, in vivo son solubilizadas y digeridas en el intestino medio del insecto, y se IJnen a las celulas receptoras. En el ensayo realizado con endotoxinas de B. thuringiensis israelensis son solubilizadas en celulas de E. coli y parcial mente degradas por prote6lisis. T. ni, puede ser resistente a las PCP de B. thuringiensis israelensis debido a una inhabilidad para digerirlas 0 a la alta especificidad restringida de los receptores, pero las celulas cultivadas de T. ni fueron afectadas por los fragmentos t6xicos de las proteinas de 130 KDa de B. thuringiensis israelensis 10 cual supone que la especificidad insecticida in vitro de las toxinas de B. thuringiensis no es tan estricta como se ha predicho de las fen6menos observados in vivo (Yoshida et al. 1993) . En investigacioones sobre los factores que afectan la acci6n insecticida de las toxinas CryIA(a) y CryIA(b) de B. thuringiensis aizawai IPL7 en la membrana epitelial del insecta se encontr6 que a pesar de la alta homologia (90%) de la secuencia aminoacidica de las dos endotoxinas, la CryIA(a) fue 17 veces mas t6xica sobre ellepid6ptero B. mori que la CryIA(b) . Este tipo de diferencias en la actividad insecticida de diferentes endo-toxinas se ha explicado por factores como el pH y la actividad de las proteasas en el lumen del intestino medio del insecto (Jaquet et al. 1987 y Haider et al. 1986), sin embargo, los resultados obtenidos por Ihara et aJ. (1993) sugieren que los pasos de procesamiento de las toxinas en el intestino medio del insecto pueden no ser tan 44 importantes para la toxicidad de CryIA(a) y CryIA(b)en B. mari pero en cambio puede ser mas importante para la especificidad, la union de las delta-endotoxinas a los receptores especfficos de los BCVM ya que la union de ambas toxinas a estos BCVM fue altamente especffica y saturable. Experimentos de competencia indicaron que CryIA(a) y CryIA(b) se unen sobre los mismos sitios, aunque, la con stante de disociacion fue levemente diferente entre ambas toxinas, de la diferencia no estuvo correlacionada con su toxicidad. Ademas, que el proceso de disociacion para ambas toxinas fue bifasico, con una etapa rapida y una muy lenta. Esto sugiere que la union de las toxinas se da a traves de un procedimiento reversible y otro aparentemente irreversible. La proporcion de componentes entre ambas toxinas fUeron diferenciadas, el mayor componente irreversible fue para la union de CryIA(a) y reversible para la union de CryIA(b), de tal manera que los eventos de postunion parecen estar relacionados con la integracion de la delta endotoxina hacia dentro de la membrana y con la formacion del poro 0 canal en la membrana, por 10 cual es razonable asumir que el componente irreversible corresponde al proceso de integracion de la toxina hacia dentro de la membrana. EI grado de diferencia de integracion puede estar correlacionada con la diferencia de toxicidad de CryIA(a) y CryIA(b) a B. mari (lhara et al. 1993). A pesar de que Ellar et al. (1985) senalan que la proteina de 25 KDa de B. thuringiensis israelensis fue la unica proteina del cuerpo parasporal que se 45 inserto en los fosfolipidos de la doble capa lipldica, Chilcott ef al. (1990) sugieren que aun existe la posibilidad de que en celulas sensibles a esta toxina se puedan encontrar otro tipo de receptores ya que son mas sensibles Ifneas de celulas cultivadas de mosquitos a la toxina de 25 KDa que Ifneas de celulas de lepidopteros; aunque, ambos tipos de celulas contienen receptores de fosfolfpidos disponibles en sus membranas. Chilcott (1983) observo que celulas del dfptero Aedes aegypti tratadas con proteasas de Streptomyseus griseus no fueron susceptibles a la toxina de 25 KDa, por 10 tanto ademas de los fosfolipidos receptores, puede estar involucrada una glicoproteina como receptora de la toxina. Tambien, se cree que una glicoprotefna es la receptora de la toxina de 130 KDa P1 para B. thuringiensis kurstaki. Dtros trabajos con mutantes de la toxina generados por mutagenesis dirigida, sugieren que la toxina de 25 KDa pueda unirse a otros componentes de la superficie de la celula, por ejemplo en un rreemplazo del acido glutamico 204 por alan ina, se altero la capacidad para unirse a la fosfatidil colina de liposomas insaturados, pero mantuvo la capacidad para lisar celulas de A. aegypty y A. gambiae. Ademas, se encontro que a diferencia de la toxina tipo silvestre, no fue capaz de lisar una linea de celulas cultivadas de Lepidoptera 10 cual se puede interpretar como que la accion citolitica de la protefna de 25 KOa se aumenta por la presencia 46 de receptores especificos de la celula, ademas de los fosfolfpidos de la membrana (Ward et a/1988 Chilcott et a/. 1990) . Recientemente, se ha propuesto que las toxinas de B. thuringiensis israelensis pueden ser glicoproteinas, donde el carbohidrato podria ser el responsable de la especificidad de la toxina, a pesar de que no se ha detectado la presencia de este en preparaciones de toxinas purificadas, pero, en otros experimentos se ha observado que la toxina de 25 KDa tiene identicas propiedades de toxicidad y especificidad que esta misma toxina producidas por B. subtilis, 0 E. coli por metodos mutagenicos, aun cuando en estos ultimos microorganismos no se producen estas glicoproteinas (Chilcott and Ellar, 1990). Las proteinas de uni6n estan siendo caracterizadas esencialmente utilizando anal isis de ligand-blot y ensayos inmunol6gicos con los BCVM en soluci6n, 0 por combinaci6n de estas dos procedimientos. Utilizando estas tecnicas se ha demostrado que ciertas toxinas de B. thuringiensis pueden unirse a proteinas especificas sobre estas membranas y de este modo se han identificado como proteinas de uni6n 6 receptores (Chilcott et a/. 1990). Con 'frecuencia las proteinas de la membrana exhiben una buena correlaci6n con el lade hidrof6bico de las regioones que penetran la bicapa lipidica (Chilcott et a/. 1990). En un estudio realizado con el lepid6ptero H. viriscens se encontr6 que la toxina CryIA(c) se unia ados protefnas del insecto, de 140 KDa y 120 KDa (Oddou et a/. 1991), pero en otras investigaciones, se observ6 que la misma toxina se unia 47 a proteinas de diferentes pesos moleculares, como: 155, 120, 103, 90, Y 81 KDa (Garczynski ef al. 1991); y, a una glicoprotefna de 170-KDa (Oddou ef al. 1991) . Se ha observado que la toxina CryIA(c) se une con alta afinidad y alto grado de saturaci6n a los BCVM de los lepid6pteros H. virescens, M. sexta, Helicoverpa zea y S. frugiperda pero solo las dos primeras especies son altamente sensibles a la toxina, y H. zea es moderamente sensible. La alta afinidad de uni6n a los BCVM de S. frugiperda no se esperaba ya que es resistente a dicha toxina. Esta toxina se une a una protefna 120 KDa del intestino medio de M. sexta (Ellar ef al. 1994); a una protefna de 148 KDa en S. frugiperda, y a protefnas de 155, 120, 103, Y 90 KDa en H. zea; y, H. virescens, ademas del de 81 KDa (Garczynski ef al. 1991). Los BCVM tratados con endoglicosidasa mostraron que aparentemente los residuos de carbohidrato no son necesarios para la uni6n de la toxina y ademas que al adicionar N-acetil-galactosamina (GaINAc) se elimino la uni6n de la toxina a las protefnas del intestino medio de M. sexta, reduciendose la uni6n a las protefnas de H. virescens y no tuvo efecto sobre la uni6n de la toxina a las protefnas de los BCVM de Pieris brassicae (Oddou ef al. 1991). En cambio, otros estudios demuestran que la GalNAc parece ser parte del receptor de la toxina CryIA(c) de las celulas CF1 cultivadas de un lepid6ptero y de las celulas epiteliales del intestino medio de M. sexta y H. virescens (Knowles ef al. 1991). 48 Por ultimo, no es claro aun, si las proteinas de los BCVM a las que se unen las toxinas son actual mente receptores especificos para las toxinas de B. thuringiensis 0 simplemente son proteinas a las que se unen las toxinas. 1.2.4 Efecto de las delta-endotoxinas en el intestino medio del insecto. Se considera que el sitio de acci6n de la endotoxina es unicamente el intestino medio del insecta debido a que el intestino anterior y el posterior continuan en contracci6n por largo tiempo despues de que toda la actividad locomotora y del coraz6n se ha detenido (Nishiitsutsuji-Uwo and Endo 1980). En un insecto susceptible las endotoxinas afectan las superfices proteicas de la membrana celulaar en pocos minutos despues de la ingesti6n del cristal (Percy and Fast, 1983), las celulas columnares son las mas afectadas y en cambio , las celulas en forma de copa exhiben poca 0 nigun cambio (Luthy and Studan 1986). Las delta-endotoxinas producen un hinchamiento, exfoliaci6n, y rompimiento del epitelio del intestino medio del insecta (Cooksey, 1971) por los cambios esrtructurales observados en las celulas como: alargamiento del nucleo, alteraci6n del retlculo endoplasmatico, desintegraci6n de los microvellos, y deformaci6n de los plieges del epitelio basal (Krieg, 1987), ademas de autolisis vacuolar (Luthy and Ebersold, 1981). En algunas especies de Lepidoptera de los generos Pieris y Bombyx se ha observado que las mitocondrias se condensan, mientras en Lymantria, Ephestia (Lepidoptera) y Galleria (Lepidoptera) estan intactas. 49 · - ~~ I OA D NACIONAl DE COI OM I... l~~ Seo & M ....('h I m... . ~~ )E "RfAMENTO DE B I Bl IO~ r: i~ nc io. A QrOO&cuo dol y a.nde! EI efecto de la toxina de B. thuringiensis israelensis despues de 1 horase observa sobre el borde estriado de la membrana de las celulas seguido por el hinchamiento de las organelas epiteliales, ademas se alteran los musculos circulares y logitudinales del intestino, como se visualizo por su hinchamiento y separacion de la lamina de basamento. Seis horas despues, de la exposicion al cristal se afecto severa mente la pared del intestino medio, con el rompimiento de la membrana peritrofica y de la lamina de basamento y posteriormente se observo el cese de la alimentacion. EI comportamiento de letargo y la paralisis del insecta unicamente ocurren en un estado avanzado de intoxicacion, ademas las bacterias pueden invadir el hemocelo antes de la muerte de la larva e inducir una septicemia fatal. Finalmente B. thuringiensis puede incrementar su poblacion por crecimiento saprofftico dentro de la larva muerta y tambien esporular (Singh, et al. 1986). Cuando la toxina del cristal es inoculada hemocelicamente sobre larvas y Ifneas de celulas cultivadas su efecto es mucho menor que el de la alimentacion de la larva con la toxina (Faust and Dougherty 1969), ademas la endotoxina no afecta todos los tipos de celulas, por 10 cual se han detectado lineas cultivadas de celulas resistentes en insectos y vertebrados (Nishiittsutsuji-Uwo et al. 1980). Dado que el principal efecto (los mismos cambios histopatologicos) de las toxinas de B. thuringiensis contra lepidopteros y dfpteros es sobre su intestino medio, se han propuesto teorfas para B. thuringiensis israelensis, que pueden ser aplicables tambien a lepidopteros tales como: poseen actividad como detergente, 50 neurot6xica, 0 causan lisis coloido-osm6tic8. Chilcott et al. 1990 sugieren que la interacci6n de la toxina con receptores especfficos de la membrana del plasma causan un rearreglo que conlleva a la destrucci6n de la integridad de la membrana y a una eventual cit6lisis. La anterior hip6tesis se podrfa explicar por los siguientes eventos: 1- la inhibici6n de la bomba i6nica K+ en la celula (Harvey et al. 1983) y, 2- la formaci6n de pequerios agujeros 0 poros en la membrana plasmatica que resulta en una lisis osm6tica coloidal (Knowles et al. 1989; Chilcot et al. 1990). En I'a primera hip6tesis, la bomba K+, localizada en los terminales de las celulas epiteliales del intestino medio, es irreversiblemente inhibida por I'a delta-endotoxina la cual impide el movimiento de iones hacia dentro de la celula, 10 que conlleva a la cit61isis (Wolfersberger, 1991). La segunda hip6tesis esta basada en: 1- la uni6n de la endotoxina a los sitios receptores de las celulas epiteliales del intestino medio, 2- la formaci6n del poro en la membrana celular, y 3- el movimiento libre de iones y moleculas a traves de la membrana permeable (Uemura et al. 1992) 10 cual perturba el equilibrio osm6tico-coloidal y conlleva a la lisis celular. La uni6n del extremo N-terminal de la toxina en el interior de la membrana genera pequerios poros, (Knowles et al. 1989), los cuales se han visualizado utilizando diversos mode,los de sistemas de membranas, con las toxinas CryIA(c) y CrylllA 51 que formaron canales de entrada que fueron altamente selectivos a cationes (English et al. 1994). Con la toxina CytA, tambiem se formaron canales sobre las bicapas lipldicas (Knowles et al. 1989), y estos canales parecen abrirse y cerrarse en sincronia, siendo selectivos para K+ y Na+, pero no permeables para cr; sin embargo, la presencia de K2+ redujo el numero y frecuencia de aberturas del canal. Se cree que las toxinas Cry y Cyt aparentemente no entran a la celula, si no que elias ejercen su toxicidad por segundos mensajeros (Knowles and Farndale, 1988). La formaci6n del poro causa la perdida de semipermeabilidad de la membrana plasmatica, produciendo un influjo neto de iones, acompanado por la afluencia de agua, hinchamiento celular y lisis celular. Muchas de las evidencias para estas hip6tesis estan basadas en la toxina de 25 KDa de la subespecie B. thuringiensis israelensis, pero el mismo mecanismo de acci6n puede ser el responsable de los efectos causados por otras delta-endotoxinas de otras subespecies. Por otro lado, los sitios receptores difieren con las diferentes endotoxinas y esto puede explicar las variaciones de las subespecies de B. thuringiensis en la especificidad por el hospedero (Wolfersberger 1990; Chilcott et al. 1990) . EI modelo del mecanismo de acci6n de las toxinas de B. thuringiensis es consistente con la formaci6n de un poro resultante de la interacci6n de alfas helices de las regi6nes hidrof6bicas N-terminal para formar un canal que atraviesa. 52 No es posible excluir la region que contiene las laminas en confarmacion beta como farmadoras de un canal en la membrana. Aunque las toxinas Cry y Cyt no estan estructuralmente relacionadas, pueden actuar por mecanismos similares, 10 mismo que pueden ser necesarios diferentes componentes de la membrana para la union inicial de estas toxinas a las celulas de las membranas. Las toxinas Cry requieren una protefna receptora en el intestino medio, mientras la union de las toxinas Cyt requieren fosfolfpidos insaturados pero Ia,subsecuentemente insercion de la toxina hacia el interior de la membrana resulta en un paro permeable a pequerios iones y moleculas, 10 cual causa perdida de osmo-regulacion y lIeva a la lisis celular (Hofte and Whiteley, 1989). Las toxinas de B. thur;ng;ens;s actuan para incrementar la permeabilidad selectiva a los iones K+ par apertura de los canales K+ preexistentes 0 par la formacion de nuevos canales (Harvey et at. 1987). Evidencias han mostrado que los iones Ba2+ y Ca2+ son inhibidores de canales K+ neuronales e interrumpen la accion de la toxina en aislados del intestino medio de M. sexta, mientras otros iones no 10 hacen (Crawford and Harvey, 1988). Estudios mas reciente muestran que el dominio I conservado de las toxinas Cry puede no estar involucrado en la formacion del canal K+, aunque esta hipotesis no puede ser excluida hasta el momento. Probablemente, se forma un poro no selectivo Dar las toxinas de B. thur;na;ens;s cuvo radio es de 0.6 - 1.0 nm 53 (Knowles and Ellar, 1987), mas grande que el radio del cristal de K+, Na+ y, NH/ (Stevens, 1991). 54 BIBLIOGRAFIA AIZAWA, K. and M. OHBA 1985. 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