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EN LA FRONTERA DE LA VIDA: LOS VIRUS Autor: ARMANDO ARANDA ANZALDO COMITÉ DE SELECCIÓN: EDICIONES PRÓLOGO I. INTRODUCCIÓN HISTÓRICA AL ESTUDIO DE LOS VIRUS II. LA ESTRUCTURA DE LOS VIRUS III. EL PROCESO DE INFECCIÓN VIRAL IV. LISOGENIA V. INTERACCIONES ENTRE VIRUS Y CÉLULAS EUCARIÓTICAS VI. INTERFERÓN E INMUNIDAD A LAS INFECCIONES VIRALES VII. INTERACCIONES ENTRE EL VIRUS Y EL ORGANISMO HOSPEDERO VIII. VIRUS Y TUMORES IX. LOS RETROVIRUS: LA CLAVE DE LA ONCOGÉNESIS VIRAL X. PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE LAS INFECCIONES VIRALES XI. VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA XII. LA EVOLUCIÓN DE LOS VIRUS XIII. LOS VIRUS Y LA INGENIERÍA GENÉTICA XIV. EL ORIGEN DE LOS VIRUS XV. LOS VIRUS: PROBLEMAS DE UN CONCEPTO EN EVOLUCIÓN COMITÉ DE SELECCIÓN: Dr. Antonio Alonso Dr. Juan Ramón de la Fuente Dr. Jorge Flores Dr. Leopoldo García-Colín Dr. Tomás Garza Dr. Gonzalo Halffter Dr. Guillermo Haro † Dr. Jaime Martuscelli Dr. Héctor Nava Jaimes Dr. Manuel Peimbert Dr.Juan José Rivaud Dr. Emilio Rosenblueth † Dr. José Sarukhán Dr. Guillermo Soberón Coordinadora Fundadora: Física Alejandra Jaidar † Coordinadora: María del Carmen Farías EDICIONES Primera edición, 1988 Segunda edición, 1995 La Ciencia desde México es proyecto y propiedad del Fondo de Cultura Económica, al que pertenecen también sus derechos. Se publica con los auspicios de la Subsecretaría de Educación Superior e Investigación Científica de la SEP y del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología. D. R. © 1988, FONDO DE CULTURA ECONÓMICA, S. A. DE CV. D. R. © 199S, FONDO DE CULTURA ECONÓMICA. Carretera Picacho-Ajusco 227; 14200 México, D.F. ISBN 968-16-48ll-0 (2a. edición) ISBN 968-16-2923-X (la. edición) Impreso en México PRÓLOGO A LA SEGUNDA EDICIÓN El manuscrito de la primera edición de este libro fue terminado en la primavera de 1987; ocho años han transcurrido desde entonces, lapso en el cual nuevos descubrimientos, en el ámbito de la biología y las ciencias biomédicas, han permitido resolver viejas cuestiones, plantear nuevas incógnitas y también reconsiderar antiguas respuestas que resultaron equivocadas a la luz de los nuevos conocimientos. En el campo de la virología se han producido importantes avances y han sido descritos nuevos agentes virales tanto en bacterias, como en plantas y animales; baste mencionar tres nuevos tipos de virus de Herpes humanos (HHV-6, HHV-7 y HHV-8). Los avances de la biología molecular han permitido desarrollar nuevas técnicas para el rastreo e identificación de nuevas moléculas, nuevos microorganismos y nuevos virus. Por supuesto que el calificativo de nuevo debe ser tomado con reserva; recordemos que Colón descubrió América para los europeos, sin embargo, los indígenas tenían siglos de habitarla. De la misma manera, muchos de los "nuevos" virus pueden haber estado todo el tiempo con nosotros y lo único que ha cambiado es la precisión de los métodos que ahora nos permiten conocer su existencia. La virología es una disciplina en pleno desarrollo y, por lo tanto, resulta arriesgado, por no decir insensato, pretender fijarla y agotarla en el magro espacio del presente libro. En la primera edición, el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) o Human Inmunodeficiency Virus (HIV) fue mencionado en forma por demás somera y sin discutir su relación con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La presente edición pretende subsanar, en la medida de lo posible, las deficiencias de la primera en cuanto al HIV y otros virus de interés médico y general. Sin embargo, algunos lectores notarán también que en el presente texto se han suprimido conceptos que hace unos cuantos años parecían ciertos. Es indudable que el aislamiento y caracterización del llamado virus de la inmunodeficiencia humana ha causado un aumento del interés de la comunidad científica por los virus en general; pero, sobre todo, ha provocado que el término virus ya forme parte del vocabulario cotidiano y que ciertos aspectos de la virología sean de interés para el público en general. Desde 1987 hasta 1993 trabajé en la Universidad de París en proyectos de investigación directamente relacionados con el HIV. Esta experiencia me permitió conocer de primera mano muchos de los factores y actores que han tomado parte en la historia científica del SIDA; historia que con mucha frecuencia se ha visto desviada por intereses personales, competencia desleal y afirmaciones apresuradas que presentan a ciertos fenómenos de laboratorio —artificiales y pasajeros—, como si fueran hechos plenamente demostrados. Pienso que en el caso de un tema que produce reacciones tan diversas e intensas, como el del SIDA, puede ser contraproducente la proliferación de obras de divulgación basadas en información científica de carácter preliminar, por no decir transitorio. Sin embargo, prefiero correr el riesgo de equivocarme en mi presentación del estado actual del conocimiento sobre el HIV y el SIDA, que optar por reproducir cierta información "clásica", misma que continúa siendo divulgada a pesar de ser incorrecta, como lo ha demostrado el propio curso de la investigación sobre este tema. Es común decir que la naturaleza es sabia; sin embargo, la labor del científico consiste en desentrañar dicha sabiduría, lo cual toma su tiempo y dista de ser sencillo. Es indudable que la ciencia y en particular las ciencias biomédicas pueden contribuir en forma muy importante al bienestar del género humano; pero muchas veces nuestras necesidades y urgencias humanas interfieren en el proceso del conocimiento, al constituir presiones para encontrar, a toda costa, respuestas inmediatas. Un claro ejemplo de lo anterior es la compleja interacción que se da en torno al problema del SIDA, entre la ciencia, la opinión pública y los intereses comerciales. Por lo tanto, vale la pena tener presente que en la ciencia, como en cualquier otra actividad humana, más vale tarde que nunca. Toluca, marzo de 1995. I. INTRODUCCIÓN HISTÓRICA AL ESTUDIO DE LOS VIRUS a) UN ANTIGUO PROBLEMA EN LA PATOLOGÍA DE LOS SERES VIVOS El términó virología ha sido incorporado al vocabulario durante las últimas décadas. La primera revista científica dedicada exclusivamente al campo de la virología: Archiv für die Gesamte Virusforschung, hoy conocida como Archives of Virology, empezó su publicación en 1939. El primer texto dedicado sólo a la virología: General Virology, de Salvatore Luria, fue publicado en 1953. Sin embargo, los virus han estado acompañando al hombre durante toda su historia y el término virus tiene muchos siglos de existencia, aunque su uso y connotaciones han variado notablemente a lo largo del tiempo. Se puede decir, en forma un tanto arbitraria, que los orígenes de la disciplina científica hoy día conocida como virología apenas se remontan a las décadas finales del siglo XIX. Pero considerando aspectos epidemiológicos* y semiológicos** dentro del registro histórico, encontramos que enfermedades como la rabia han sido descritas y registradas meticulosamente por más de dos mil años. En el caso particular de la rabia, su misterioso origen, su capacidad para transformar a un perro domesticado en bestia feroz, su largo e impreciso periodo de incubación y los dramáticos síntomas que preceden al final fatal de esta enfermedad en los humanos, constituyen un cuadro pavoroso y a la vez irresistible, que ha merecido la atención de los escritores y pensadores de la Antigüedad. Si se comparan las antiguas descripciones hechas por cronistas griegos y romanos con los casos más recientes de rabia tanto en animales como en humanos, encontramos que desde el punto de vista clínico el virus de la rabia no ha cambiado a lo largo de los siglos. Esta característica lo distingue de otros virus patógenos (capaces de producir enfermedad), confiriéndole una posición única en la historiade la medicina. Diferentes ideas acerca de la causa y el origen de la rabia han sido concebidas en diferentes épocas. Una de las primeras descripciones de la rabia que han sobrevivido hasta nuestros días es la de Aristóteles. "la rabia vuelve loco al animal, y cualquier especie de animal, con excepción del hombre, será contaminado con esta enfermedad si es mordido por un perro rabioso. La enfermedad es fatal para el propio perro y cualquier otro animal mordido por éste, con excepción del hombre". Autores posteriores muchos de los cuales dudaron en cuestionar la credibilidad del gran filósofo griego, se mostraron sorprendidos por la referencia de Aristóteles a la supuesta insusceptibilidad del ser humano para ser contaminado por la rabia. Así, algunos autores propusieron que originalmente el agente causal de la rabia no podía contagiar al hombre y solamente al cabo de los siglos el misterioso agente causal de esta enfermedad había adquirido la capacidad de afectar al ser humano. Sin embargo, el médico renacentista Girolamo Fracastoro hizo notar que Aristóteles solamente quería recalcar el hecho de que no todos aquellos humanos mordidos por un perro rabioso desarrollarían la enfermedad en forma obligatoria. Una descripción de la rabia más precisa y detallada fue proporcionada en el libro De medicina, escrito por Celso, un médico que vivió en el siglo I, en el apogeo del Imperio romano. En particular, hay una frase en el texto de Celso que ha llamado poderosamente la atención de los historiadores de la medicina: "...especialmente en los casos en que el perro es rabioso, el virus debe ser drenado con una ventosa de vidrio..." Por supuesto nadie se atrevería a pensar que Celso identificó al agente de la rabia como un virus en el sentido moderno del término. Sin embargo, es importante hacer notar que Celso utilizó el término virus para denotar al agente causal de la rabia, mientras que en el mismo texto utilizó la palabra venenum para describir la ponzoña de las serpientes. Es probable que tal distinción no haya sido accidental, sobre todo si consideramos que el término latino virus puede significar veneno o también líquido viscoso. Por lo tanto, quizá Celso estaba advertido de que el agente de la rabia era transmitido por medio de la saliva viscosa del perro rabioso. Después de Celso, el término virus se utilizó durante siglos en forma casual como sinónimo de ponzoña o veneno, hasta que a finales del siglo XVIII adquirió claramente el significado de un agente infeccioso, debido a la creciente advertencia general de que existen muchas enfermedades contagiosas y transmisibles. La gradual aceptación del término virus en la literatura médica corrió paralela con el desarrollo de los conceptos de infección y contagio, los cuales deben su origen al estudio de una enfermedad también de naturaleza viral, pero que, a diferencia de la rabia, ha tenido enorme influencia sobre el curso de la historia social y política de la humanidad: la viruela. En términos de la devastación causada en las sociedades medievales, la viruela es solamente comparable con la peste bubónica. Sin embargo, la historia temprana de la viruela presenta grandes dificultades para el historiador de la medicina, ya que, a diferencia de la rabia, es muy difícil establecer un diagnóstico diferencial entre la viruela y otras enfermedades eruptivas de tipo febril, como el sarampión, la varicela o la escarlatina, a partir de las descripciones proporcionadas por los cronistas de la Antigüedad. Pero no cabe duda de que los conquistadores españoles contaron con un inesperado, silencioso y mortal aliado que contribuyó notablemente al éxito de Cortés y a la pronta caída de Tenochtitlán. Un soldado de la expedición de Pánfilo de Narváez arribó a México enfermo de viruela, enfermedad hasta entonces desconocida en Mesoamérica. La falta de inmunidad natural a la viruela permitió que ésta se extendiera rápidamente entre la población indígena con desastrosas consecuencias para la misma. En pocas semanas miles de indígenas sucumbieron a la viruela; recordemos que el propio Cuitláhuac, penúltimo emperador azteca, falleció por causa de esta enfermedad. Recientes estimaciones epidemiológicas han llevado a postular que durante los primeros veinticinco años posteriores a la Conquista más de un tercio de la población indígena sucumbió a la viruela. Es probable que tal devastación natural haya contribuido en forma radical al establecimiento del régimen colonial, explicando también en parte por qué imperios tan poderosos y organizados como el azteca y el inca fueron borrados del mapa, sin mayor oposición, en unos cuantos años. Durante los siglos XVII y XVIII ocurrieron en Europa severas epidemias de viruela, posiblemente debidas a la aparición de nuevas cepas del virus. Médicos y sabios que testimoniaron estas epidemias pudieron darse cuenta de que algún factor esencial era transmitido de persona a persona y de casa en casa. En la antigua China, mucho antes de nuestra era, ocurrieron los primeros intentos para proteger a los individuos contra la viruela. Así, los chinos desarrollaron la práctica conocida como variolación, la cual consiste en la inoculación de individuos sanos con fluidos obtenidos de las vesículas eruptivas de las personas afectadas por casos leves de viruela. En 1721, Mary Worfley Montagu, esposa del embajador británico en Turquía, introdujo la variolación en Gran Bretaña. Dicho procedimiento resultaba muy peligroso, ya que con frecuencia los individuos inoculados desarrollaban la enfermedad y morían a consecuencia de ella, en lugar de ser protegidos contra la viruela. Los problemas causados por las severas epidemias de viruela y la controversia en relación con la variolación fueron la base de mucha bibliografía médica producida en el siglo XVIII. Algunos autores se permitieron especular sobre la naturaleza del agente transmisible causa del contagio, al cual se denominó virus cada vez con mayor frecuencia. En 1730, Thomas Fuller publicó un pequeño libro sobre las fiebres eruptivas (que incluyen la viruela). Ahí escribió: "La forma principal y más común de contraer las fiebres contagiosas, como la viruela y el sarampión, es por medio de infección, o sea, recibiendo a través del aliento o de los poros de la piel los corpúsculos virosos peculiares a la crianza de dichas enfermedades." Por su parte, Angelo Gatti, el gran precursor de Jenner, publicó sus reflexiones sobre la variolación en 1764. Sus observaciones en relación con la naturaleza de la infección y con la necesidad de encontrar un método para atenuar "el virus varioloso", fueron de carácter profético. Sin embargo, Gatti murió en enero de 1798, antes de haber podido conocer el modesto panfleto publicado en el mismo año por el médico británico Edward Jenner, en el cual comunicaba su descubrimiento de que la inoculación con el virus de la vacuna (o sea, con los fluidos obtenidos de las lesiones de la viruela bovina), era capaz de prevenir la infección de la viruela en seres humanos. El descubrimiento de la vacuna es uno de los sucesos más importantes no sólo en la historia de la medicina, sino también en la historia de las sociedades humanas. A pesar de este descubrimiento, se requirieron casi doscientos años para lograr la erradicación de la viruela. A principios del siglo XIX, el término virus se encontraba bien establecido en la bibliografía médica, aunque era utilizado para describir una gran variedad de agentes infecciosos. Este uso persistió durante toda la época del surgimiento de la bacteriología médica, o sea, los primeros dos tercios del siglo XIX. Claude Bernard erigió una infraestructura para la medicina experimental, apoyada en la tradición filosófica de Descartes y Pascal. Por ejemplo, Bernard citó los resultados obtenidos a través de la simple observación en el caso de la garrapata y su relación con enfermedades de la piel. Según Bernard, la misma metodología aplicadaen la observación directa de las garrapatas podía ser aplicada para explorar la validez de las teorías que presumían la existencia de ...el virus, una criatura de la razón. Así, Claude Davaine empezó en 1860 a utilizar una combinación de experimentación y observación para rastrear aquello a lo cual se refirió sucesivamente como el virus, el agente tóxico y finalmente, el bacteridium del ántrax. A falta de filtros artificiales adecuados, Davaine demostró la diferencia entre sangre infectada y no infectada por el ántrax, utilizando como filtro la placenta del cerdo. Sin embargo, en algunos experimentos de Davaine el agente del ántrax era capaz de atravesar el filtro placentario. Robert Koch descubrió en 1876 que el bacilo del ántrax a veces forma pequeñas esporas capaces de atravesar la membrana placentaria. Mientras tanto, Chauveau empezó a trabajar en la identificación del agente de la viruela, utilizando métodos de filtración. Pero no pudo obtener resultados definitivos, por lo cual fue el primero en hacer una distinción entre enfermedades virulentas, causadas por virus, y enfermedades contagiosas, en las cuales era transmitido un microbio o parásito bien conocido. Por lo tanto, el término virus fue restringido a denotar una misteriosa entidad infecciosa capaz de ejercer su efecto patogénico solamente por medio de la asociación en solución de ciertos elementos o partículas de naturaleza desconocida. Chauveau identificó estos cuerpos elementales (granulations élémentaires) como el origen de la actividad patogénica, introduciendo así un término que sobreviviría durante décadas. En los años 1865-1866, ocurrió en la Gran Bretaña un desastroso brote de una enfermedad llamada ictericia hemática bovina o peste del ganado, la cual exterminó una gran cantidad de animales. El médico John Gamgee había urgido, sin éxito, a las autoridades para que impusieran una cuarentena y programas de matanza controlada para evitar la diseminación de la enfermedad. A raíz de su fracaso, Gamgee abandonó el país no sin antes publicar un libro con sus observaciones sobre esta enfermedad; ahí escríbió: Al igual que la mayoría de las ponzoñas animales, el virus de la peste del ganado se reproduce con maravillosa rapidez en los cuerpos de los animales enfermos, de los cuales es también liberado. Tanto el aliento de la res enferma aspirado por un animal sano, como lo productos sólidos de la enfermedad, parecen tener la capacidad de inducir el padecimiento y los antídotos son aplicados demasiado tarde cuando se intenta alcanzar la ponzoña presente en el sistema animal. No conozco ningún antídoto capaz de ser usado internamente en los animales enfermos... Me temo que nunca lograremos alcanzar el virus una vez que éste se encuentra en el animal vivo. Tales palabras desalentadas merecen ser recordadas considerando los escasos avances logrados hasta la fecha en el tratamiento de las enfermedades virales. La etiología u origen del ántrax fue cabalmente entendida gracias al advenimiento de una herramienta que se volvió invaluable en los estudios bacteriológicos, misma que dio lugar al surgimiento a fines del siglo XIX del concepto de virus como entidad filtrable. Al parecer, placas de cerámica blanca no esmaltada y conectadas a una bomba de vacío capaz de ejercer succión fueron utilizadas en trabajos bacteriológicos por primera vez en 1870, por Edwin Klebs. Seis años después, Louis Pasteur utilizó para el mismo propósito filtros hechos con la llamada goma de París. Así, Pasteur, en colaboración con Joubet, aisló el bacilo del ántrax y adoptó la palabra microbio inventada por Séedillot en 1878, de manera que Pasteur declaró: todo virus es un microbio, haciendo caso omiso de la distinción hecha por Chauveau entre enfermedades virulentas y enfermedades contagiosas. A partir de entonces y a través del trabajo pionero sobre las vacunas contra el ántrax, el cólera aviario y la rabia, Pasteur y todos aquellos involucrados en estudios patológicos utilizaron el termino virus para denotar cualquier agente infeccioso (ya fuera o no fuera éste de naturaleza bacteriana) capaz de producir inmunidad después de la convalecencia del organismo afectado por el propio agente infeccioso. Pasteur buscó afanosamente y en vano el agente causal de la rabia. Sin embargo, no existe evidencia de que haya sospechado que dicho agente era esencialmente diferente de los otros microbios patógenos que había logrado caracterizar a lo largo de su vida. En 1897, dos discípulos de Robert Koch encabezaron un estudio sobre el origen de la fiebre aftosa del ganado vacuno. Dichos investigadores demostraron que el agente causal de esta enfermedad era de naturaleza filtrable, o sea, capaz de atravesar los filtros bacteriológicos más finos disponibles en aquel entonces. Loeffler y Frosch observaron que este agente filtrable podía ser pasado de un animal a otro a pesar de que cada pasaje implicaba una gran dilución en la concentración del propio agente filtrable. Por lo tanto, Loeffler y Frosch llegaron a la conclusión de que el agente infeccioso podía reproducirse en los animales infectados, descartándose de esta manera la posibilidad de que se tratara de una toxina, y concluyeron que se trataba de un microbio muy pequeño. No es de sorprender que los bacteriólogos médicos se negaran a buscar una explicación que estaba por fuera del concepto de microbio patógeno. Por otra parte, es notable que un microbiólogo botánico fuera capaz de sugerir, unos cuantos meses después de haberse publicado los resultados de Loeffler y Frosch, una explicación que finalmente resultó correcta en relación con estudios y observaciones similares realizados respecto al agente causal de una enfermedad vegetal conocida como mosaico del tabaco. b) EL VIRUS DEL MOSAICO DEL TABACO A finales del siglo XIX, los éxitos de la microbiología médica habían establecido sólidamente la teoría de que las enfermedades infecciosas son causadas por gérmenes microscópicos que podían ser cultivados en medios nutritivos especiales y aislados por medio de filtros muy finos capaces de retener dichos microorganismos. Sin embargo, en 1892 el ruso Dimitri Ivanovski demostró que el agente causal de la enfermedad vegetal conocida como mosaico del tabaco era capaz de pasar a través de los filtros a prueba de bacterias y no podía ser observado bajo el microscopio ni cultivado en medios artificiales. Estos resultados hicieron a Ivanovsky especular que el mosaico del tabaco era causado por un germen productor de toxinas las cuales podían atravesar el filtro bacteriológico. En 1898, el holandés Martinus Beijerinck realizó experimentos más rigurosos, los cuales demostraron que el agente del mosaico del tabaco pasaba a través de filtros de porcelana y era capaz de multiplicarse en los tejidos de las plantas infectadas, hecho que descartaba la posibilidad de que se tratara de una toxina. Beijerinck denominó Contagium vivum fluidum al agente del mosaico del tabaco. En aquel entonces, el concepto de macromolécula no existía todavía, y las substancias eran divididas básicamente en dos grupos; las substancias corpusculares o particuladas, suspendidas en los fluidos circundantes, como las bacterias y los glóbulos rojos, y las substancias disueltas o solubles, moléculas de bajo peso molecular. Para Beijerinck era de la mayor importancia establecer si el virus era disuelto o corpuscular. Apoyándose en la observación de que el virus era capaz de atravesar filtros a prueba de bacterias, Beijerinck concluyó que debía tratarse de una substancia disuelta o soluble y, por lo tanto, de naturaleza molecular, quizá soluble en agua y capaz de replicarse, pero solamente cuando se encontraba incorporada al protoplasma de la célula viva infectada. Las conclusiones de Beijerinck resultaron sorprendentemente cercanas al moderno concepto de virus; sin embargo, también resultaron ser demasiado avanzadas para su tiempo y encontraron poca aceptaciónentre los patólogos de principios del siglo. A pesar de esto, en los primeros años del siglo XX diversos investigadores descubrieron otros agentes infecciosos filtrables, capaces de producir enfermedades en animales, y gradualmente el término virus, en principio usado por los médicos de la antigua Roma para designar cualquier veneno de origen animal, pasó a denominar estos recién descubiertos agentes infecciosos filtrables. En 1908, dos patólogos daneses informaron haber transmitido la leucemia (un tumor caracterizado por una desmedida proliferación de los glóbulos blancos de la sangre) a pollos, por medio de un filtrado libre de células. Peyton Rous descubrió en 1911 que algunos tumores sólidos, conocidos como sarcomas de los pollos, podían ser transmitidos a pollos sanos por medio de un filtrado obtenido a partir de células tumorales. Sin embargo, estos primeros indicios de la asociación entre los virus y el cáncer permanecieron ignorados por muchos años. c) EL BACTERIÓFAGO En 1915, el inglés F. Twort publicó un artículo en la revista médica The Lancet, en el cual describió un curioso fenómeno observado en ciertos cultivos de micrococos bacterianos que después de incubaciones prolongadas desarrollaban regiones transparentes, las cuales examinadas al microscopio mostraban la ausencia de células bacterianas y la presencia de minúsculos gránulos cristalinos. El material cristalino podía ser pasado por filtros de porcelana y una gota de ese filtrado era suficiente para destruir (lisar) un nuevo cultivo de micrococos. Twort sugirió que el fenómeno podía ser explicado por la existencia de un virus bacteriano o por la producción de una enzima bacteriana capaz de degradar a las propias bacterias. En 1917, Félix d'Herelle observó un fenómeno similar en cultivos del bacilo de la disentería y demostró que era posible usar cultivos de este bacilo utilizando filtrados obtenidos a partir de heces fecales. Félix d'Herelle optó inmediatamente por la explicación de que era un virus la causa de este fenómeno y, debido a que el supuesto virus era incapaz de multiplicarse, excepto a expensas de bacterias vivas, D'Herelle decidió llamarlo bacteriófago (devorador de bacterias). Durante los años veinte la definición del virus se basaba en conceptos puramente negativos: no podían ser vistos al microscopio, no podían ser cultivados en medios artificiales, y además no eran retenidos por los filtros a prueba de bacterias. Sin embargo, las observaciones de D'Herelle permitieron la preparación de grandes cantidades de bacteriófagos (fagos será el término utilizado en adelante), a partir de la lisis de bacterias cultivadas en medios líquidos. Estos lisados podían ser utilizados para infectar otros cultivos. El propio D'Herelle observó que cultivos de bacterias en medio sólido infectados con lisados que contenían fagos, mostraban "claros" o placas en la, por otra parte, uniforme capa de bacterias; el número de estas placas era inversamente proporcional a la dilución del lisado con fagos añadido a dicho cultivo. Por lo tanto, el título de una suspensión de fagos podía ser estimado en términos de unidades formadoras de placas (u.f.p.). De acuerdo con esto, si cada partícula viral presente en la preparación infectante da origen a una placa, entonces la eficiencia de plaqueo (e.p) es igual a la unidad. Muchos años después, este método sería modificado y aplicado al ensayo de los virus de plantas y animales. De hecho, uno de los avances más importantes en el estudio de los virus animales consistió en el ensayo en placa diseñado por Renato Dulbecco en 1952. En este caso, una suspensión de células animales es colocada en una caja de Petri; las células se adhieren y crecen a lo largo y ancho de la superficie de vidrio u otro material sólido, hasta que forman una monocapa de células Entonces se elimina el medio de cultivo y se añade una suspensión viral diluida. Después de una breve incubación que permite que las partículas virales se adhieran (adsorban) a las células, se elimina el exceso de inóculo viral y se añade una capa de agar nutritivo que cubre las células. Después de una incubación que puede durar varios días, las células son teñidas por medio de un colorante vital que solamente penetra en las células vivas, de manera que las muertas por causa de la infección viral permanecen incoloras y se manifiestan como placas desteñidas en la monocapa de células teñidas. Retomando a D'Herelle y los fagos, este investigador creía que la partícula infectante (fago) se multiplicaba dentro de la bacteria y que su progenie era liberada después de la lisis de la bacteria hospedera. En 1939, Ellis y Delbrück realizaron experimento conocido como "curva de crecimiento en un solo paso", el cual constituyó una sólida prueba en apoyo de la hipótesis de D'Herelle (figura I.1.). Sin embargo, persistía una controversia en cuanto a si el crecimiento intracelular del fago introducía la lisis de la bacteria o en realidad dicha lisis bacteriana era un fenómeno secundario sin relación directa con el crecimiento del fago. Experimentos realizados por Delbrück resolvieron esta controversia y demostraron que en la lisis de las bacterias infectadas participan factores tanto dependientes como independientes de la infección viral. Cuando la infección ocurre a baja multiplicidad, o sea, cuando la relación fago/bacteria no es mayor de 2, el fago penetra la bacteria, se multiplica e induce la lisis de la célula bacteriana. Sin embargo, cuando la infección ocurre en altas multiplicidades, o sea, cuando hay un exceso de partículas infectantes, la lisis bacteriana se debe principalmente a un debilitamiento de la pared celular causado por el exceso de fagos adsorbidos a dicha pared. FIGURA I.1. Diagrama de la curva de multiplicación en un solo paso (o escalón) del bacteriófago T2. La primera purificación de un virus fue lograda por Max Schlesinger en 1933 utilizando una técnica conocida como centrifugación diferencial, la cual se basa en el hecho de que en un tubo de ensayo sometido a la acción de una fuerza centrífuga las partículas más pesadas sedimentan a menor velocidad que las partículas ligeras. De esta manera es posible separar los fagos de los restos de las células bacterianas. El análisis químico de los fagos purificados demostró que están compuestos por proteínas y ácidos nucleicos en proporciones casi iguales. d) LA NATURALEZA QUÍMICA Y MOLECULAR DE LOS VIRUS En 1935 el químico Wendell Stanley pudo aislar el virus causante del mosaico del tabaco y purificarlo en forma cristalina. Este hecho representó la cristalización de un material biológico supuestamente vivo y, por lo tanto, tuvo un enorme impacto desde el punto de vista filosófico, pues llevó al cuestionamiento de los conceptos establecidos respecto a la naturaleza y propiedades de los seres vivos. En 1937 Bawden y Pirie lograron la total purificación del virus del mosaico del tabaco y demostraron que estaba compuesto por proteína y ácido ribonucleico (ARN). Esto ocurrió en una época en que todavía no se conocía la naturaleza del material genético. Ya en 1928 Fred Griffith había descubierto que cepas no patogénicas de neumococos bacterianos, conocidas como cepas R, podían ser transformadas a la variedad patogénica S cuando eran incubadas en presencia de un extracto libre de células obtenido a partir de neumococos S que habían sido "muertos" (o sea, inactivados) por tratamiento térmico. En 1944, Avery, Mac Leod y Mc Carty informaron que el ácido desoxirribonucleico (ADN) obtenido a partir de neumococos S, era el único factor capaz de transformar a los neumococos R y volverlos patogénicos. Sin embargo, la ortodoxia científica señalaba a las proteínas como posibles constituyentes del material genético. En aquel entonces era una opinión generalizada que los ácidos nucleicos carecían de la versatilidad estructural necesaria para satisfacer el complicado papel atribuidoa los hipotéticos genes. Fue en 1952 cuando Hershey y Chase demostraron sin lugar a dudas que la información genética reside en los ácidos nucleicos. Para esto utilizaron al bacteriófago T2, que usualmente infecta a la bacteria Escherichia coli. En primer lugar, Hershey y Chase crecieron el fago en cultivos de E. coli, en los cuales el medio de cultivo había sido suplementado con azufre o fósforo radiactivos (35S y 32P). El fósforo radiactivo sirvió para marcar exclusivamente el ADN presente en los fagos recién sintetizados por las bacterias infectadas, mientras que el azufre permitió marcar la proteína asociada con las nuevas partículas virales. Posteriormente, estos fagos radiactivos fueron utilizados para infectar otros cultivos de E. coli, permitiendo que los fagos se adsorbieran a las bacterias. Después de una corta incubación, estas suspensiones de fagos y bacterias fueron sometidas a intensa agitación para interrumpir la asociación entre fagos y bacterias. La suspensión resultante fue centrifugada de manera que las bacterias sedimentaron en el fondo de los tubos de ensayo y las partículas virales permanecieron en el líquido sobrenadante. Ambas fracciones (sedimento y sobrenadante) fueron analizadas en su contenido de radiactividad. El resultado indicó que la mayor parte del 32P había penetrado en las bacterias, mientras que casi todo el 35S había permanecido en el sobrenadante. Por otra parte, a pesar de este tratamiento, las bacterias fueron capaces de producir nuevas partículas virales, las cuales contenían un alto porcentaje de 32P y casi nada de 35S. Estos resultados indicaron que solamente el ADN viral penetra en las bacterias y que este ácido nucleico es suficiente para causar una infección productiva en dichas bacterias. La proteína de la cubierta viral no es necesaria para producir la infección debido a que no contiene la información genética. Sin embargo, esta proteína es necesaria para proteger el ácido nucleico y para permitir la adsorción del virus a las células. El experimento mencionado sirvió para demostrar que el ácido nucleido constituye el material genético. (figura I.2.) FIGURA I.2. El experimento de Hershey y Chase. En 1956, Gierer y Schramm purificaron el ácido nucleico del virus del mosaico del tabaco (VMT), y demostraron que ARN viral purificado podía ser infeccioso si se tomaban las precauciones necesarias para protegerlo de ser inactivado por la acción de enzimas capaces de degradar ácido ribonucleico. Experimentos previos habían demostrado que las partículas de VMT podían ser disociadas en proteína y ARN, ambos componentes podían ser reasociados en el tubo de ensayo para formar partículas virales infectivas por completo y morfológícamente maduras. Basándose en esta observación, Frankel Conrat y Singer procedieron a disociar dos cepas diferentes de VMT. El ARN obtenido de una cepa fue reasociado con la proteína obtenida de la otra cepa y viceversa, originando partículas híbridas, las cuales fueron usadas para infectar plantas de tabaco. En todos los casos, las plantas infectadas dieron origen a progenies virales que correspondían al tipo del ARN presente en el híbrido infectante (figura 1.3). Al igual que todos los organismos, los virus pueden generar mutantes en el transcurso de su ciclo de crecimiento; estas mutaciones pueden afectar el tipo de placa formada por la infección viral en los cultivos infectados, el rango de hospederos susceptibles de ser infectados por el virus e incluso las propiedades fisicoquímicas del virus. Un problema asociado con las mutaciones consiste en que varias de éstas pueden ser de tipo letal, o sea, bloquean totalmente la capacidad de replicación del virus y por lo tanto no pueden ser detectadas. Sin embargo, en 1963 Epstein y Edgar descubrieron un tipo muy particular de mutantes virales que ahora son conocidos como "mutantes letales condicionales". Una clase de estos mutantes está constituida por los mutantes sensibles a la temperatura. Estos virus mutantes son capaces de crecer a una cierta temperatura, la temperatura permisiva, pero no pueden hacerlo a una más alta, la temperatura restrictiva misma temperatura que no afecta el crecimiento de virus normales. Otra clase de mutantes condicionales está constituida por los mutantes ámbar, los cuales no pueden crecer en ciertas cepas celulares llamadas no permisivas, mientras que sí pueden hacerlo en cepas celulares permisivas. También se han descrito otros tipos de mutantes condicionales sensibles al frío, los cuales se comportan a la inversa de los mutantes termosensibles anteriormente descritos. FIGURA I.3. El experimento de Frankel-Conrat y Singer que demostró que el ARN es el material genético del virus del mosaico del tabaco (VMT). Los virus constituyen partículas extremadamente pequeñas cuyo tamaño varía más o menos entre 20 y 300 nanómetros (nm).* Por lo tanto, los virus sólo pueden ser observados bajo el microscopio electrónico. En muchos casos los virus infectan a la célula hospedera por medio de interacción directa entre la célula y la partícula viral, pero en otros casos los virus son transmitidos por medio de un agente animal o vegetal que actúa como vector intermediario entre el virus y su hospedero final. Las células que hospedan al virus contienen ambos tipos de ácido nucleico (ADN y ARN), mientras que los virus contienen solamente un tipo de ácido nucleico, el cual será ADN o ARN según el tipo de virus en particular. El virus se reproduce totalmente a partir de su material genético constituido por el ácido nucleico, mientras que la célula hospedera se reproduce a partir de la suma integral de sus componentes. El virus nunca se origina directamente a partir de un virus preexistente, mientras que toda nueva célula se origina de manera directa de una célula madre. Los componentes de un virus son sintetizados en forma independiente y son ensamblados posteriormente para formar una partícula viral madura. En cambio, el crecimiento de las células consiste en un aumento de todos sus componentes sin que la célula pierda en ningún momento su integridad. Los virus dependen de la maquinaria metabólica y sintética presente en la célula hospedera para poder sintetizar el ácido nucleico y las proteínas virales. FIGURA I.4. Diagrama que muestra el tamaño relativo y las formas de diferentes tipos de virus. (a) Poxvirus (vacuna). (b) Poxvirus (dermatitis pustular). (c) Rabdovirus. (d) Virus de la parainfluenza (parotiditis). (e) Bacteriófago. (g) Herpesvirus. (h) Adenovirus. (i) Virus de la influenza. (j) Virus de la papa. (k) Virus del mosaico del tabaco. (l) Polioma/papiloma virus. (m) Virus del mosaico de la alfalfa. (n) Virus de la polio. (o) Fago ØX174. FIGURA I.5. Diagrama que ilustra la terminología utilizada para describir los virus con simetría helicoidal (izquierda) y con simetría icosaédrica (derecha). Existe una terminología bien establecida para describir los diferentes componentes y estructuras de los virus. Una partícula viral completa e infectiva es denominada virión. En el caso de los virus con morfología icosaédrica, la cubierta de proteína es conocida como la cápside que a su vez está compuesta de unidades morfológicas o capsómeras. La cápside rodea un centro compuesto de ácido nucleico y proteínas. La cápside y el centro forman en conjunto la nucleocápside. Ejemplos de virus icosaédricos son el virus de la poliomielitis y el bacteriófago ØXI74. Otros virus tienen aspecto de bastones o cilindros. En tales viriones el ácido nucleico está rodeado por una cápside cilíndrica cuya estructura helicoidal puede ser resuelta bajo el microscopio electrónico. Ejemplos de viriones helicoidales son el virus del mosaico del tabaco y el bacteriófago M13. En viriones de morfología más compleja, la nucleocápside está rodeada por una laxa envoltura membranosa. Dichos viriones tienen forma relativamente esférica, pero sonmuy pleomórficos (multiformes) debido a que la envoltura no es rígida. Ejemplo de virus icosaédricos con envoltura son los herpesvirus. En el caso de los virus helicoidales con envoltura como el virus de la influenza, la nucleocápside está enrollada dentro de la envoltura. En viriones cuya estructura es todavía mas compleja, como en el caso del virus de la viruela, no es posible identificar una sola cápside, ya que este tipo de virus tiene varias cubiertas alrededor del ácido nucleico. Las envolturas virales tienen características similares a las de las membranas celulares debido a que tales envolturas se derivan de la membrana de la célula hospedera durante los estadios finales de la infección viral. Por lo tanto, las envolturas virales son ricas en lípidos (grasas) y proteínas, algunas de las cuales forman complejos con diferentes tipos de carbohidratos (azúcares), constituyendo las llamadas glicoproteínas. Los carbohidratos asociados a las proteínas tienden a protuir de la envoltura viral y a veces es posible reconocerlos bajo el microscopio electrónico en forma de espigas presentes en la superficie externa del virión. Las figuras 1.4 y 1.5 dan una idea general de las diversas morfologías y componentes estructurales de los virus. FIGURA I.6. Estructura de las bases púricas y pirimídicas. FIGURA I.7. Estructura de algunos ribonucleótidos. II. LA ESTRUCTURA DE LOS VIRUS a) ÁCIDOS NUCLEICOS EL ÁCIDO nucleico de un virus contiene la información específica y el potencial operacional para modificar la maquinaria de la célula infectada y para dirigirla hacia la producción específica de los componentes de las nuevas partículas virales. Los ácidos nucleicos son macromoléculas constituidas por cadenas de nucleótidos, los cuales a su vez están constituidos por una base nitrogenada asociada a un azúcar del grupo de las pentosas y a uno o más grupos de fosfatos. La base nitrogenada puede derivarse de la purina o de la pirimidina. Las dos bases púricas más importantes son la adenina y la guanina. Las tres bases pirimídicas más importantes son la citosina, el uracilo y la timina (figura 1.6). En un ribonucleótido el azúcar presente es la ribosa, mientras que en un desoxirribonucleótido el azúcar presente es la desoxirribosa. Los nucleósidos son análogos a los nucleótidos, pero carecen de grupos fosfato (figura I.7) FIGURA II.1a.Segmentos de una cadena de desoxirribonucleótidos o ADN (a la izquierda) y de una cadena de ribonucleótidos o ARN (a la derecha). Las notaciones condensadas son ilustradas junto a cada polinucleótido. FIGURA II.1b. Formas de representación esquemática del ADN. (a) Esquema que muestra la polaridad de las cadenas de desoxirribonucleótidos y el apareamiento de bases. (b) Esquema que muestra la estructura en doble hélice y los parámetros helicoidales de la molécula. Los ácidos nucleicos pueden existir en forma de cadena sencilla o de cadena doble. Las bases nitrogenadas presentes en una cadena pueden aparearse con las bases de la cadena opuesta por medio de un tipo de enlace químico conocido como puente de hidrógeno. Las características químicas y estructurales de las bases nitrogenadas hacen que el apareamiento ocurra entre la guanina y la citosina, y entre la adenina y la timina o el uracilo. Generalmente, el ácido ribonucleico (ARN) es de cadena sencilla, aunque también puede existir en forma de cadena doble. Las bases normalmente presentes en el ARN son la adenina, la citosina, la guanina y el uracilo. El ácido desoxirribonucleico por lo general existe en forma de cadena doble formando la famosa estructura en doble hélice. Normalmente el ADN contiene las bases adenina, guanina, citosina y timina (figuras II. (a) y (b)). Los ácidos nucleicos de cadena doble, como el ADN, pueden ser desnaturalizados, o sea, sus cadenas pueden ser separadas por medio de un tratamiento con álcali o por medio de elevar la temperatura, pues los puentes de hidrógeno son rotos por calor y el pH elevado (alcalino). Si una molécula de ADN es sometida a desnaturalización térmica, las cadenas complementarias tienden a separarse conforme se eleva la temperatura. Sin embargo, estas cadenas tenderán a aparearse de nuevo tan pronto la temperatura desciende a 25°C o menos. Cuando se añade a esta mezcla de reacción una molécula de ARN, cuya secuencia es complementaria a cualquiera de las cadenas del ADN desnaturalizado, es posible obtener híbridos ADN-ARN. Cuando las macromoléculas del tipo del ARN y el ADN son sometidas a centrifugación en presencia de una solución concentrada de sales pesadas como el cloruro de cesio (CsCl), las fuerzas opuestas de sedimentación y difusión producen un gradiente de concentración de la sal, generando un aumento continuo de la densidad en dirección de la fuerza centrífuga. Las macromoléculas presentes en semejante gradiente son impulsadas por la fuerza centrífuga hasta la región donde la densidad de la solución salina es igual a la densidad de flotación característica de cada tipo de macromolécula.Cuando existen varias especies de macromoléculas dentro del gradiente, cada especie formará una estrecha banda en la posición donde la densidad del CsCl es igual a la densidad de flotación de la especie molecular en cuestión. Las cinco posibles clases de ácido nucleico: ADN de cadena doble, ADN de cadena sencilla, ARN de cadena sencilla, ARN de cadena doble, híbridos ADN-ARN, pueden ser separadas por medio de centrifugación en gradientes de CsCI. Por otra parte, es posible introducir marcadores de densidad en los ácidos nucleicos, haciendo crecer la fuente del ácido nucleico (virus, bacteria, célula, etc.) en un medio que contenga isótopos pesados de algún elemento que puede ser incorporado en la estructura de los ácidos nucleicos (15N, 18O, 2H), o análogos de las bases nitrogenadas como el 5.bromouracilo, cuyo peso molecular es mayor que el de la timina normalmente presente en el ADN. De esta manera, el nuevo ácido nucleico tiene una densidad de flotación mayor que la del ácido nucleico normal equivalente, y esta característica puede ser de gran utilidad cuando se desea establecer el destino final de una macromécula en particular. Existen cuatro posibles tipos de ácido nucleico viral: ADN de cadena sencilla, ADN de cadena doble, ARN de cadena sencilla y ARN de cadena doble. Virus que contienen cualquiera de estos tipos de ácido nucleico pueden ser encontrados tanto entre los fagos como entre los virus que infectan a plantas o animales. El ADN de algunos bacteriófagos se caracteriza por contener bases raras que substituyen alguna o algunas de las bases normalmente presentes en el ADN. Por ejemplo, el fago PBSl tiene uracilo (normalmente presente en el ARN) en lugar de timina mientras que los fagos T2, T4 y T6 tienen en su ADN hidroximetilcitosina en lugar de citosina. La presencia de estas bases raras permite distinguir con relativa facilidad entre el ácido nucleico viral y aquel correspondiente a la célula hospedera. FIGURA II.2. Formación de dímeros y círculos de ADN del fago después de una incubación bajo condiciones que favorecen la circulación del ADN. En la figura se muestran las secuencias de bases que constituyen los extremos o términos pegajosos. El ADN de cadena doble presente en algunos virus (como el fago λ λ), se caractenza por tener segmentos de cadena sencilla en ambos extremos de la molécula. Debido a que son complementarias las secuencias de nucleótidos presentes en ambos extremos, resulta posible que entren en contacto para formar puentes de hidrógeno dando origen a moléculas circulares de ADN o a dímeros formados por dos moléculas longitudinales de ADN unidas por sus extremos (figura II.2.). Estos extremos de cadena sencilla presentes en una molécula de ácido nucleico que por lo demás es de cadena doble, son denominados como extremos pegajosos o cohesivos.Cuando es desnaturalizado el ADN de algunos virus, como los adenovirus, se observa que cada una de las cadenas de ADN es capaz de formar un círculo por separado. Esto implica que son complementarias las secuencias de nucleótidos presentes en ambos extremos de cada cadena y por lo tanto deben tener la misma secuencia, pero repetida en sentido inverso (figura 11.3.). A este tipo de secuencias se les conoce como repeticiones invertidas. Algunos virus contienen ácido nucleico que está circularizado en forma natural. Este tipo de ácido nucleico es insensible a la acción degradante de enzimas como la exonucleasa III, que tienen la capacidad de digerir moléculas de ácido nucleico que poseen un extremo libre, lo cual no ocurre en las moléculas circulares. El ADN naturalmente circular puede ser de cadena sencilla como en el fago ØXI74, o de cadena doble, como en el virus SV4O. Existe evidencia de que algunos virus ARN que producen infecciones en vegetales como el limonero y la papa contienen moléculas circulares de ARN. La secuencia de los nucleótidos presentes en las cadenas o bandas de los ácidos nucleicos constituye la base del código genético. Cada codón (o letra del código) es definido por una tripleta de nucleótidos que, a través del proceso conocido como traducción es interpretada como una letra que corresponde a uno de los veinte aminoácidos diferentes que constituyen las proteínas. En términos generales, la secuencia de codones que constituyen un gene codifican la secuencia de aminoácidos que constituyen una proteína en particular. FIGURA II.3. Las secuencias de nucleótidos que corresponden a repeticiones invertidas permiten que se formen regiones de cadena doble debidas a reasociación intramolecular. Cuando las repeticiones se encuentran muy próximas entre sí, se forma una horquilla doble con extremo de cadena sencilla. La última columna en el diagrama muestra la apariencia de estas estructuras producidas por la reasocación de las repeticiones invertidas, cuando son observadas al microscopio electrónico: las regiones de cadena doble se distinguen por su mayor grosor En los últimos diez años se han desarrollado una variedad de técnicas y métodos que permiten determinar la secuencia de nucleótidos en cualquier tipo de ácido nucleico. La primera secuencia completa de un ARN viral fue determinada en el fago MS2 por el grupo de Walter Fiers en 1976. En 1977, Fred Sanger y colaboradores publicaron la secuencia completa del genoma del fagoØXl74, constituido por ADN de cadena sencilla. Posteriormente, muchos otros genomas virales de mayor tamaño y complejidad han sido secuenciados en parte o en su totalidad. Una vez que se conoce la secuencia del genoma viral es posible establecer la forma como están organizados los genes presentes en el ácido nucleico. Los avances de la biología molecular han permitido determinar la naturaleza de las secuencias de nucleótidos que actúan como signos de puntuación en la lectura de la información genética. Normalmente en los genomas de bacterias, plantas y animales cada gene abarca uno o varios segmentos del ácido nucleico, estos segmentos están separados de los segmentos correspondientes a los genes adyacentes. En el caso de los virus, los genomas virales resultan ser muy pequeños cuando se les compara con los genomas de las bacterias más simples; esto implica que los virus tienen una capacidad muy limitada para contener información genética. Sin embargo, algunos virus han desarrollado estrategias para obtener una máxima capacidad de almacenamiento de la información genética. Una de estas estrategias consiste en la traslapación de genes, de manera que un segmento del ácido nucleico puede contener la secuencia de nucleótidos correspondiente a la totalidad del gene A y a la vez contener la secuencia inicial correspondiente al gene B, mismo que se continúa en otra región del ácido nucleico posterior al término del gene A. La otra estrategia consiste en la superposición de genes, de manera que el segmento del ácido nucleico que corresponde al gene C incluye también al gene D que codifica una proteína más pequeña que la codificada por el gene C. Esta multiplicidad de marcos de lectura característica de algunos genomas virales implica la necesidad de una compleja regulación y coordinación de la expresión genética en esos virus (figura II.4.). FIGURA II.4. Mapa genético del ADN del virus SV40 que contiene 5 243 pares de bases. La región temprana (transcrita en el sentido opuesto de las manecillas del reloj) es ilustrada en gris, y la región tardía (transcrita en el sentido de las manecillas del reloj) es ilustrada en negro. El origen de replicación es marcado Ori. b) LA FUNCIÓN PROTECTORA Y MORFOLÓGICA DE LAS PROTEÍNAS VIRALES El análisis de partículas virales purificadas muestra que con tienen entre 50 y 90% de proteína. Si consideramos que los ácidos nucleicos en solución son susceptibles de ser fácilmente fragmentados o degradados, podemos asumir que el componente proteico de los virus tiene fundamentalmente un papel protector. Una tripleta de nucleótidos (codón) tiene un peso molecular promedio de alrededor de 1000 daltones y sólo codifica un aminoácido cuyo peso molecular promedio es de aproximadamente 100 daltones. Por lo tanto, un ácido nucleico puede especificar cuando mucho una décima parte de su peso molecular en proteína. Con mucha frecuencia los virus contienen más de un 50% de su peso en forma de proteína; esto sugiere que deben estar presentes varias copias de una misma proteína de bajo peso molecular, ya que se requiere de menos material genético para especificar un solo tipo de molécula de proteína la cual puede ser usada como subunidad para construir la cubierta del virus. Sin embargo, no es esencial que la cubierta del virus esté formada por subunidades idénticas, siempre y cuando los pesos moleculares combinados de los diferentes tipos de subunidades sean suficientemente pequeños en relación con el peso molecular de la molécula del ácido nucleico viral. La construcción de las partículas virales a partir de subunidades estructurales incrementa la estabilidad genética del propio virus, ya que al reducirse el tamaño de las subunidades estructurales se reduce la posibilidad de que ocurran mutaciones nocivas en el gene que codifica dicha subunidad. El fenómeno de autoensamble es particularmente relevante para los virus y otros sistemas biológicos debido a sus atributos de economía y eficiencia. Por ejemplo, en la industria de la construcción ha sido posible abatir los costos e incrementar la eficiencia utilizando unidades prefabricadas que a su vez son ensambladas en forma rápida y barata en el sitio de construcción. Esto involucra dos procesos: la fabricación de unidades básicas y el ensamble de las mismas para formar edificaciones complejas. En el caso de los sistemas biológicos, la fabricación de unidades es análoga a la síntesis de moléculas de proteína a partir de aminoácidos. Esta síntesis depende de las instrucciones contenidas en la secuencia de nucleótidos presentes en los ácidos nucleicos. El proceso de ensamble es independiente de instrucciones externas ya que la información necesaria para construir los complejos moleculares está incluida dentro de los propios componentes individuales. El mecanismo de autoensamble tiene la ventaja de que puede ser controlado en cada nivel de organización. Por ejemplo, las subunidades defectuosas son eliminadas automáticamente durante el proceso de ensamble, de manera que estructuras complejas son construidas con exactitud y eficiencia. En el caso particular de los virus, las moléculas de proteína que constituyen las subunidades de la cápside interaccionan con la cadena o cadenas del ácido nucleico viral para formar una partícula viral. El proceso depende de la formación de enlaces entre las subunidades y al igual que en el proceso de cristalización, la regularidad de la estructurafinal es consecuencia de factores termodinámicos que obligan a formar un máximo número de uniones no covalentes entre las subunidades. Sin embargo, en un cristal todas las moléculas se encuentran en ambientes similares, mientras que tal situación rara vez ocurre en el caso de estructuras hechas a partir de subunidades de proteína. Una proteína es una macromolécula compuesta por una variedad de moléculas individuales denominadas aminoácidos. Los aminoácidos se encuentran unidos por enlaces químicos conocidos como uniones o enlaces peptídicos; por lo tanto, toda proteína puede ser considerada como una cadena polipeptídica, la cual tendrá una conformación espacial o estructura terciaria que depende directamente de la composición de los aminoácidos presentes en dicha proteína. Debido a su composición química; los aminoácidos se dividen en neutros, hidrofóbicos e hidrofílicos. Así, cuando una proteína se encuentra rodeada completamente por un medio acuoso, los grupos hidrofóbicos tienden a juntarse en el interior de la molécula de proteína, mientras que los grupos hidrofílicos tienden a permanecer en la superficie de la molécula, haciendo contacto con el medio. Estas interacciones determinan la conformación espacial de la proteína. En el caso del virus del mosaico del tabaco (VMT), una proteína compuesta por 158 aminoácidos constituye la subunidad básica a partir de la cual se construye la cápside del virus. En dicha proteína cuando menos la mitad de los aminoácidos presentes en el interior de la macromolécula son de tipo hidrofóbico, mientras que en la superficie de la misma hay tan sólo cuatro grupos hidrofóbicos en un segmento constituido por 24 residuos de aminoácidos. Por lo tanto, se puede decir que los mismos principios fisicoquímicos que rigen el desarrollo de la estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas son causa de la organización de las cápsides virales. Las múltiples uniones formadas durante la agregación de las subunidades de proteína contribuyen al enmascaramiento de sitios potencialmente susceptibles a la acción de enzimas capaces de degradar proteínas; de esta manera las proteínas de la cápside viral adquieren también mayor resistencia al calor y otros agentes físicos. Es bien sabido que las suspensiones de partículas virales pueden ser mantenidas por largos periodos en el laboratorio esto implica que dichas partículas constituyen estructuras estabIes. Una condición necesaria para lograr la estabilidad de cualquier estructura consiste en que la estructura se encuentre en su estado de mínima energía libre; esto se logra estableciendo un máximo número de uniones entre las subunidades que constituyen dicha estructura. Debido a que las subunidades de la cubierta viral son relativamente asimétricas, se requiere que estén dispuestas o ensambladas en forma simétrica para que pueda formarse el mayor número de uniones entre dichas subunidades. Existe un número limitado de formas que permiten el ensamble simétrico de subunidades asimétricas. c) VIRUS FILAMENTOSOS Una posible forma de generar una estructura simétrica tridimensional a partir de componentes asimétricos como las proteínas consiste en distribuir las proteínas alrededor de una circunferencia de manera que formen un disco. Apilando un gran número de discos se obtiene una estructura tridimensional con una cavidad interna apropiada para albergar la molécula del ácido nucleico (figura II.5.). Un ejemplo de virus filamentosos está dado por el virus del mosaico del tabaco. El examen detallado del VMT muestra que las subunidades de proteína no están dispuestas en forma de anillos sino en forma helicoidal. Esto resulta lógico considerando que el ARN del VMT tiene una forma helicoidal y, por lo tanto, al disponer las subunidades de proteína en forma helicoidal es posible formar el mayor número de uniones entre las subunidades de proteína y el ácido nucleico. Todos los virus filamentosos estudiados hasta la fecha muestran una estructura helicoidal indicando que el ácido nucleico es el factor esencial que rige este tipo de arreglo estructural. FIGURA II.5.(a) Disposición de componentes asimétricos idénticos alrededor de una circunferencia para lograr una estructura simétrica. (b) Segmentos de una partícula de virus de mosaico del tabaco que muestra las subunidades de proteína formando una estructura helicoidal. El ARN se localiza en un surco helicoidal formado por las subunidades de proteína. d) VIRUS ESFÉRICOS También se puede obtener una partícula simétrica disponiendo las subunidades de proteína alrededor de los vértices o caras de un cuerpo con simetría cúbica como el icosaedro, constituido a partir de 20 triángulos equiláteros. Multiplicando el número de subunidades presentes en cada cara por el número de caras, obtenemos el número mínimo de subunidades que pueden ser acomodadas alrededor de tal cuerpo geométrico. En el caso del icosaedro, el número es de 60 subunidades. Este tipo de arreglo representa una de las pocas formas en que objetos asimétricos pueden ser acomodados en forma simétrica sobre la superficie de una esfera. Las micrografías electrónicas de un gran número de virus diferentes muestran que éstos tienen una silueta esférica que al ser examinada más detalladamente corresponde a una estructura con simetría icosaédrica. Varios de los virus esféricos con simetría icosaédrica contienen más de 60 subunidades de proteína. Por ejemplo los adenovirus contienen aproximadamente 1 500 subunidades en su cubierta (figura II.6.). Sin embargo, Donald Caspar y Aaron Klug han descrito las reglas que gobiernan la estructura de los virus esféricos. Tales reglas fueron inspiradas por el estudio de las estructuras geodésicas diseñadas por el arquitecto norteamericano Buckminster Fuller. En dichas estructuras la superficie de una esfera es subdividida en facetas triangulares, las cuales son arregladas con una simetría icosaédrica. Este método de triangulación de la esfera representa el diseño óptimo para una cubierta cerrada construida a partir de subunidades idénticas unidas en forma regular. Ninguna otra forma de subdividir una superficie cerrada puede proporcionar un grado similar de equivalencia. Este tipo de estructuras tienen un mínimo de energía libre, lo cual explica en parte la abundancia de los virus con simetría icosaédrica. FIGURA II.6. Organización de las subunidades de proteína en la cápside del adenovirus. e) VIRUS CON MÁS DE UN TIPO DE SUBUNIDAD Las micrografías electrónicas de los adenovirus muestran que las 1 500 subunidades de proteína están arregladas en 240 hexámeros y 12 pentámeros, y en cada vértice del virus se proyecta una fibra de proteína. Está bien establecido que las fibras, los pentámeros y hexámeros están constituidos por diferentes tipos de proteínas. Los adenovirus representan el ensamble regular de tres diferentes tipos de proteína. Esto puede lograrse arreglando los pentámeros y las fibras en los vértices del icosaedro, y los hexámeros en las caras del icosaedro. Una forma diferente de arreglo estructural ocurre en los reovirus en los cuales la cápside está constituida a partir de 8 diferentes proteínas dispuestas en dos capas o cubiertas que poseen simetría icosaédrica. Tres de las proteínas están dispuestas en la cubierta externa, y las cinco proteínas restantes en la cubierta interna. f) VIRUS CON ENVOLTURA Muchos de los virus animales más grandes y unos cuantos virus de plantas y bacterias están envueltos por una cubierta membranosa de proximadamente 75Å de grosor. Esta envoltura se deriva en gran parte de las membranas de la célula hospedera y puede ser degradada por medio del tratamiento con detergentes o solventes orgánicos como el éter, ocasionando así la pérdida de la inefectividad del virus. A este tipo de virus también se les conoce como virus sensibles al éter. Los virus de la influenza son representativos de los virus animales con envoltura.Estos virus han sido descritos como pleomórficos (multiformes), aunque las partículas virales en células de animales vivos tienen una forma filamentosa. La apariencia pleomórfica se hace evidente cuando estos virus son cultivados en embriones de pollo. Estos virus poseen debajo de la envoltura una capa o cubierta de proteína llamada proteína M (proteína de la membrana o proteína de la matriz). Dentro de la cubierta formada por la proteína M, pero separado de la misma, se encuentra el componente nucleoproteico constituido por un cilindro flexible de ARN y proteína dispuesta en forma similar a un pasador para el pelo que ha sido doblado. La estructura de la nucleocápside del virus de la influenza es de tipo helicoidal. Cada uno de los diferentes virus de la influenza codifica cuando menos 4 diferentes proteínas que son ensambladas en el virión, dando origen a diferentes estructuras virales. Algunos virus con envoltura tienen nucleocápsides icosaédricas. Particularmente los virus ARN productores de tumores también conocidos como retrovirus, tienen una nucleoproteína que está superenrollada en forma de una esfera hueca rodeada por la envoltura, la cual se deriva de la membrana celular y es modificada por la inserción de glicoproteínas específicas del virus. g) VIRUS CON MORFOLOGÍA DE CABEZA Y COLA Este tipo de morfología sólo ha sido encontrada en cierto tipo de bacteriófagos y está directamente relacionada con la forma en que tales virus infectan a sus bacterias hospederas. El número de fagos con arquitectura de tipo cabeza-cola es considerable; estos fagos pueden ser subdivididos en fagos de cola corta, fagos de cola larga no contráctil, y fagos con colas contráctiles y complejas que también pueden poseer otro tipo de estructuras como collares, placas basales y fibras (figura II.7.). A pesar de su complejidad estructural, los principios que gobiernan el ensamble de estos fagos son similares a los descritos en relación con otros virus cuya arquitectura es más sencilla. Las cabezas de los fagos tienen usualmente una simetría osaédrica mientras que las colas tienen una simetría helicoidal. FIGURA II.7. Representación esquemática de las estructuras de algunos bacteriófagos con cola. Todas las estructuras presentes, como las placas basales poseen alguna forma de simetría. h) EL PRINCIPIO DE AUTOENSAMBLE Los virus son construidos de acuerdo con principios de diseño eficientes y, por lo tanto, son capaces de autoensamblarse sin la participación de ningún factor organizador externo. Esto es posible debido a la formación de un gran número de uniones débiles cuando los componentes del virus son colocados en la configuración adecuada por medio de movimientos al azar propiciados por factores termodinámicos. Por ejemplo, si se trata al VMT con una solución concentrada de urea, ocurre una descomposición del virus en subunidades de proteína y ARN. Si se elimina la urea y son incubadas de nuevo las subunidades de proteína en presencia del ARN viral, las macromoléculas se agregan en forma espontánea dando origen a partículas virales infecciosas. Sin embargo, cuando se omite el ARN viral durante el proceso de repolimerización, se obtienen cilindros de proteína, pero en este caso las subunidades están apiladas en forma de discos en lugar de tener una disposición helicoidal. Además, estos cilindros son menos estables que la particula viral completa, lo que señala la importancia del ácido nucleico en la estabilización de la estructura viral. En el caso de algunos virus icosaédricos, ha sido posible realizar también experimentos de reconstrucción o reconstitución in vitro (o sea, en el tubo de ensayo). Sin embargo, modificando las condiciones de estos experimentos, ha sido posible obtener estructuras tubulares y otras variables morfológicas. Esto indica que las propiedades de empacamiento de las proteínas son las que en última instancia determinan la estructura de la partícula viral. El autoensamble resulta económico para los virus, pues no requieren de información genética específica para lograrlo, y además proporciona un método sencillo y eficiente para eliminar subunidades defectuosas producidas durante la replicación de los componentes virales. Sin embargo, algunos bacteriófagos complejos del tipo cabeza-cola, como el fago T4, muestran cierto grado de control genético en el proceso de ensamblaje; este fenómeno será discutido más adelante. III. EL PROCESO DE INFECCIÓN VIRAL LA INFECCIÓN se inicia cuando entran en contacto una partícula viral y una célula susceptible. En el caso de fagos y bacterias en un cultivo en suspensión, la interacción entre ambos ocurre por simple difusión, ya que partículas con el tamaño de bacterias y virus se encuentran en permanente movimiento browniano cuando están en suspensión. En el caso de los virus animales, la difusión es también el factor más importante que afecta la unión con células animales en cultivo, ya que esta asociación es independiente de la temperatura mientras ésta no afecte el movimiento browniano. Probablemente en el caso de la infección en el animal entero existen otros factores que afectan la asociación entre el virus y las células; sin embargo, es muy difícil diseñar experimentos para estudiar la interacción entre virus y células animales in vivo. En el caso de las plantas, la infección viral generalmente es consecuencia de daño mecánico previo, hecho a la planta por factores externos. En otras ocasiones, la infección viral en plantas es el resultado de la acción de insectos portadores del virus que actúan como vectores del mismo, introduciéndolos en plantas susceptibles. a) ABSORCIÓN La mayoría de los fagos se adsorben (pegan) a la pared celular de las bacterias susceptibles, pero algunos fagos también son capaces de adsorberse a los flagelos, vellosidades (pili) o cápsulas presentes en la superficie de la bacteria hospedera. El caso mejor documentado de adsorción viral está representado por los fagos T2 y T4, los cuales son virus con morfología compleja que incluye una cabeza, cola, placa basal, clavijas y fibras de la cola. La pegada inicial de estos fagos a los receptores presentes en la superficie de la bacteria ocurre por medio de los extremos distales de las fibras de la cola. Estas fibras largas que hacen la primera unión se doblan por en medio, de manera que sus extremos distales hacen contacto con la pared celular a muy corta distancia del punto medio de la partícula viral. Después de ocurrida la adhesión, la partícula viral se aproxima a la superficie de la célula. Cuando la placa basal del fago se encuentra a unos 100Å (angstrom = 10-10 m) de la pared celular, se establece contacto entre las pequeñas clavijas de la placa basal y la pared celular, pero no existe evidencia de que la propia placa basal se adhiera a la pared celular (figura III.1.). FIGURA III.1. Esquema de los principales eventos en la adsorción del bacteriófago T4 a la pared celular de la bacteria E. coli.(a) el fago libre muestra las fibras y clavijas de la cola. (b)Adhesión de las fibras de la cola. (c) El fago se acerca a la pared celular y las clavijas entran en contacto con la pared celular. Algunos fagos con cola, como el fago PBSl, se adsorben a los flagelos bacterianos en lugar de a la pared celular. La punta de la cola de este fago tiene una fibra flexible que se adhiere alrededor del filamento del flagelo y entonces el fago se desliza por el filamento hasta alcanzar la base del flagelo. Otros fagos con cola se adsorben a la cápsula de la bacteria. Finalmente, algunos fagos se adhieren a los llamados pili o vellosidades sexuales de las bacterias que contienen el factor sexual "F" o ciertas colicinas (factores de resistencia contra agentes antimicrobianos). Los fagos filamentosos que contienen ADN de cadena sencilla se adsorben a las puntas de estos pili mientras que los fagos esféricos de ARN se adsorben a los costados deestos pili. En el caso de los virus animales, ha sido posible estudiar cómo se adhieren a las células en cultivo y de esta manera determinar el efecto que tienen la temperatura y la concentración de iones en el medio sobre la adsorción viral. Al igual que en el caso de los fagos, la adhesión parece ser de tipo electrostático y es afectada en forma importante por la presencia de iones en medio de cultivo. Sin embargo, todavía se sabe poco en relación con la naturaleza de los receptores celulares para los virus animales, con excepción de aquellos receptores involucrados en la adsorción de los virus de la poliomielitis, la influenza y el SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida). Cuando las células susceptibles al virus de la polio son disociadas al someterlas a congelamiento y subsecuente descongelamiento, liberan una substancia que constituye el receptor celular para el virus. Aparentemente, este receptor es de naturaleza proteica y sus moléculas pueden ser saturadas en presencia de un exceso de partículas virales. Se ha estimado que existen aproximadamente 3 x I0 3 receptores para el poliovirus en la superficie de cada célula susceptible; esto representa un área equivalente al 0.3% de la superficie total de la célula. Las células que carecen de tal receptor específico son inmunes a la infección por poliovirus. Sin embargo, tales células no susceptibles pueden permitir la replicación normal del virus cuando éste es introducido en ellas por métodos artificiales. Cuando se incuban virus de la influenza en presencia de eritrocitos (glóbulos rojos), las células se aglutinan (hemaglutinación) y este fenómeno puede ser utilizado para titular la concentración del virus, simplemente determinando a qué dilución el virus se vuelve incapaz de producir hemaglutinación. Células aglutinadas a 4°C pueden ser calentadas a 37°C, lo cual produce separación de las células y el virus eluido de estas células puede ser utilizado para aglutinar un nuevo lote de células. Sin embargo, las células que previamente estuvieron en contacto con el virus son incapaces de ser reaglutinadas cuando entran en contacto con virus frescos. Esto se debe a la producción y activación de una enzima conocida como enzima destructora del receptor (EDR). Si se aplica una solución de esta enzima al tracto respiratorio de animales experimentales, es posible evitar la infección por el virus de la influenza, ya que el virus no puede adsorberse a las células cuyo receptor específico para el virus ha sido degradado por la acción de la enzima. El receptor para el virus de la influenza se caracteriza por tener una molécula de ácido neuramínico en su extremo distal, el cual forma parte de un pequeño polímero de moléculas de carbohidrato (oligosacárido); este polímero está unido en forma covalente a una proteína insertada en la membrana celular. b) PENETRACIÓN DEL VIRUS El caso mejor estudiado de la penetración de un virus en la célula hospedera está representado por el caso del fago T2. La cola de este fago es contráctil y en su forma extendida consiste de 24 anillos de subunidades que forman una funda que rodea a un elemento central. Cada anillo consta de 6 subunidades pequeñas y 6 subunidades mayores. Después de la adsorción del fago a la pared celular, ocurre una contracción de la cola que resulta en una fusión de las subunidades pequeñas y grandes para dar 12 anillos de 12 subunidades. El núcleo de la cola no es contráctil y por lo tanto es expulsado e impulsado a través de las capas externas de la bacteria; a continuación, la cabeza del fago se contrae y esto resulta en la inyección del ADN viral en la célula bacteriana. Este proceso posiblemente es facilitado por la presencia de la enzima lisozima en la cola del fago; esta enzima es capaz de digerir las proteínas de las cubiertas bacterianas; además, hay 144 moléculas de adenosina trifosfato (ATP) en la funda de la cola del fago; la energía para la contracción de esta funda proviene de la conversión de la ATP en adenosina difosfato (ADP) por medio de una reacción hidrolítica que libera un grupo fosfato de la ATP (figura 111.2.). FIGURA III.2. Esquema del mecanismo de penetración del material genético del fago T4 o T2 a través de la pared celular de la bacteria. (a) Las clavijas del fago entran en contacto con la pared celular y la funda se encuentra extendida. (b) La funda de la cola se contrae y el material genético del fago penetra la pared celular; la lisozima presente en el fago digiere la porción de pared celular localizada directamente bajo la partícula viral. Muchos bacteriófagos carecen de fundas contráctiles y todavía se desconoce el mecanismo detallado por medio del cual penetran en las bacterias. Sin embargo, existe evidencia de que algunos de estos fagos introducen en la célula material proteico además del ácido nucleico. Las células animales carecen de pared celular y sólo están rodeadas por la membrana plasmática que es muy flexible y cambiante en sus componentes estructurales. Las células animales continuamente introducen elementos del medio externo por medio del proceso de pinocitosis y a través de un procedimiento similar, pero inverso, exportan al medio diversas substancias como enzimas, hormonas y neurotransmisores. Los virus animales solamente pueden infectar células que poseen receptores específicos para el virus en particular. Por lo tanto, se requieren diferentes receptores para diferentes tipos de virus. Se conoce con poco detalle el mecanismo preciso por medio del cual los virus penetran en las células animales. Buena parte del problema radica en que la mayoría de las partículas virales que infectan a una célula son incapaces de iniciar con éxito la multiplicación del virus. Usualmente, estas partículas no infecciosas superan a las partículas infecciosas en proporción de 1000:1, y no existen métodos bioquímicos o microscópicos que puedan distinguir entre ambos tipos de partículas virales antes de que haya ocurrido la infección propiamente dicha. Todos los virus ARN y ADN producen estas partículas defectuosas conocidas como interferentes-defectuosas (ID), las cuales son el resultado de errores en la síntesis de ácido nucleico viral. Estas partículas ID son mutantes que carecen de segmentos de ácido nucleico y por lo tanto son incapaces de reproducirse sin la ayuda de partículas virales normales capaces de suplir la información genética ausente en el genoma de las partículas ID. Por esta razón, la propagación de las partículas ID es óptima cuando las células son infectadas en altas multiplicidades de infección. Las partículas ID deprimen el rendimiento de la progenie viral infecciosa debido a que compiten por ciertos productos sintetizados en cantidades limitadas por las partículas virales infecciosas. Los virus con envoltura pueden penetrar a la célula hospedera por medio de la fusión entre las envolturas virales y la membrana de la célula. Tanto los virus con envoltura como los virus que carecen de ésta pueden ser introducidos a la célula por medio del proceso de pinocitosis (figura III.3.). La fusión de membranas ocasiona la liberación del genoma viral en el citoplasma de la célula, pero en el caso de la pinocitosis el virus entero es contenido en una vesícula formada a partir de la membrana plasmática. Es probable que esta vesícula se fusione a su vez con alguna de las membranas internas de la célula y la cubierta viral es modificada a consecuencia de esta fusión, lo que da lugar a la liberación del ácido nucleico viral. Es importante hacer notar que la penetración del virus y la subsecuente eliminación de las envolturas virales no implican forzosamente la presencia intracelular de ácido nucleico viral desnudo. El ácido nucleico viral puede permanecer unido a las proteínas internas del virus, las cuales pueden incluir enzimas necesarias para la replicación del virus. En el caso de cierto tipo de virus ARN en los cuales el genoma viral
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