T1 QB - Proteínas 1

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@rose.studygram_
Teórico 1
Aminoácidos, péptidos y proteínas
Proteínas: efectores de la célula, cada célula tiene más de 1000 tipos de proteínas diferentes. 
Funciones de las proteínas:
· Proteínas estructurales: colágeno, queratina, elastina 
· Proteínas transportadoras: hemoglobina, citocromos 
· Proteínas de almacenamiento: ovoalbúmina, caseína 
· Proteínas motoras: actina, miosina. 
· Enzimas
· Hormonas
· Proteínas protectoras: Anticuerpos; cascada de coagulación 
· Señalización intracelular: receptores, enzimas 
Hagamos un repaso …
Las unidades estructurales que componen a las proteínas son los aminoácidos (aa) donde cada uno presenta una propiedad particular la cual se transfiere a la proteína. 
· El carbono alfa es asimétrico y, por lo tanto, existen 2 estereoisómeros (enantiómeros) de cada aa. Unido al carbono alfa hay unido un grupo amino y un grupo carboxilo, además de un grupo R que los distingue. 
· En las proteínas solo se encuentran los isómeros L. No se sabe porque.
Para formar proteínas es necesario que todos los aa sean de la misma serie, los aa de la serie D son muy raros (bacterianos, antibióticos, etc …)
A partir de la serie R podemos clasificar a los aa:		
· No polares, con grupos R alifáticos
Glicina y prolina: son particulares, la glicina tiene 2 sustituyentes igual por lo tanto NO ES ASIMÉTRICO y como el R es tan pequeño tiene propiedades particulares en la proteína; la prolina forma un anillo (es cíclico), será rígido con propiedades particulares para las proteínas. 
Alanina: tiene el residuo más chico. 
Valina
Leucina e isoleucina: presenta el mismo PM, hay técnicas de detección que no distinguen entre estos 2 ej: espectrometría de masa. 
Metionina: tiene un grupo azufre. 
· Polares, grupos R sin carga
Serina y Treonina: presenta grupos -OH difiriendo en un -CH3, el -OH es posible de fosforilación o modificaciones covalentes. 
Cysteina: tiene un -SH libre ¿que aporta? pueden oxidarse y formar el puente disulfuro permitiendo que se forme un enlace covalente diferente al peptídico en partes de la proteínas → sirve para establecer la estructura tridimensional de la proteína. 
Asparagina y Glutamina: presentan una amida -CONH3 distal, son muy parecidos a los aa aspártico y glutámico, es decir, se corresponde con el ácido aspártico y el ácido glutámico.
· Grupos R aromáticos
Los aa en general son incoloros, algunas características de los aromáticos:	
- Los aminoácidos aromáticos absorben luz UV.
- Las proteínas tienen un máximo de absorbancia UV en 275-280 nm
- La absortividad molar del Trp es 5 veces mayor que Tyr y 50 veces la de Phe
- Conociendo la absortividad molar de una proteína particular, se puede determinar su concentración por espectrofotometría: 
A = ε b c → Ley de Lambert-Beer
Análisis del gráfico: es una escala logarítmica, se hace un barrido de 𝛌 donde cada aa presenta un máx diferente, se toma a 270 nm para determinar proteínas donde si mido proteínas a ese 𝛌 estaría midiendo triptófano (Trp) en caso de que no haya Trp no se vería; por otro lado, se mide la tirosina (Tyr). En estas condiciones de 280 nm la fenilalanina (Phe) no aporta. 
Esto me sirve para la cuantificación de proteínas. 
· Grupos R cargados positivamente (aminoácidos básicos)
Lysina y Arginina: están ionizados a pH fisiológico. 
Histidina: no se encuentra ionizada a pH fisiológico. Tiene la posibilidad de ser ionizado por ello se la considera dentro de los grupos con carga positiva. 
· Grupos R cargados negativamente (aminoácidos ácidos).
Aspartato y Glutamato: ambos difieren en 1 CH3, por lo tanto son muy parecidos entre sí. 
· Los aa habituales son 20
· 8 de ellos son esenciales para los humanos. 
Además de los 20 aa, hay muchos otros que son menos frecuentes, muchos surgen por modificación de las proteínas. Algunos residuos se pueden modificar transitoriamente para alterar la función de la proteína. La modificación más frecuente es la fosforilación (Tyr, Ser, Thr). 
Propiedades de los aa
Entre las propiedades de los aa, por el hecho de tener un grupo alfa amino y alfa carboxilo y por ser ionizable, a pH fisiológico esos 2 grupos están siempre ionizados. En un aa sencillo la carga neta es cercana a cero, por compensación ¿qué quiere decir esto? la carga se ve afectada por el pH. 
A pH bajo (rosa), encontramos que toda la especie está protonada; a medida que sube el pH desplazo H+, se va removiendo el H+ y vemos que disminuye la curva rosa = se pierde la especie toda protonada. A expensas de esto, aparece la forma zwitteriónica, conserva el -NH3 protonado y perdió H+ del carboxilo. Durante cierta cc de H+ se mantiene la especie zwitteriónica hasta que en algún momento se empieza a desprender el otro H+ (curva verde) y empezamos a obtener la forma toda desprotonada con carga neta negativa. 
Disminuye la forma zwitteriónica y aparece la forma desprotonada, representado en un eje de pH y los equivalente de -OH observamos que hay 3 zonas:
1. Zona central: en algún momento dado no hace falta muchos equivalente y cambia todo el pH de la sc. Estamos en presencia de la especie zwitteriónica, donde en un punto en particular la carga neta es 0 = punto isoeléctrico de aa en sc (tambien existe para proteínas). 
2. Zona baja en celeste
3. Zona superior en celeste
La zona 2 y 3 consiste en los pH en torno a los pKa de los grupos ionizables. Donde el primer grupo hace referencia al pKa del grupo carboxilo y el segundo al grupo amino. 
· pKa del ácido acético en torno a 4,00, para el grupo alfa aa es mucho menor cercano a 2. pKa amina alifática es alrededor de 12, mientras que en los aa es cercano a 10 eso se debe a la proximidad de las cargas y que están compensadas.
· Además se establecen 2 mesetas, esto quiere decir que la molécula es poco sensible al agregado de mucho -OH por lo tanto sirve como buffer ya que amortigua el pH.
El punto isoeléctrico surge de la media aritmética de los dos pKa, es decir, coincide con la media de los pKa del carboxilo y amino. 
¿Qué ocurre cuando el aa tiene restos laterales ionizables?
Glutamato: en posición delta presenta un grupo -COOH, entonces tenemos los 2 grupos ionizables y además el carboxilo distal. Ahora bien:
· especie toda protonada: carga neta=positiva +1. Agregamos -OH y pasamos a … 
· especie carga neta cero: seguimos agregando -OH y pasamos a …
· especie carga neta -1.
Entonces primero se desprotona el alfa carboxilato, luego el alfa carboxilo distal y finalmente se desprotona el grupo amino ¿como determino el pI? buscamos los pKa alrededor de la especie con carga neta 0, es decir, el alfa carboxilo y el carboxilo del resto lateral. entonces en vez de estar cercano a 6 será 3. 
Histidina: tenemos que el pI será >6 cercano a 8. SIEMPRE el primer protón que se pierde es del alfa carboxilo, luego el del resto lateral y FINALMENTE el grupo amino. 
Repaso del enlace peptídico
· La formación del enlace peptídico en una reacción de condensación
· Los aminoácidos que forman parte de un péptido se llaman residuos, para indicar la pérdida de la molécula de agua.
· Los átomos de la cadena principal son el C⍺, al que se le une la cadena lateral, el grupo NH y el grupo C´. 
· Los residuos se unen entre sí mediante un enlace peptídico con el C´de un residuo y el N del siguiente. 
· Por lo tanto, la unidad estructural de repetición es NH-C⍺H-C´=O. Las reacciones de cuantificación de proteínas son, en su mayoría, reacciones del enlace peptídico. 
· El enlace peptídico absorbe en el UV lejano (<220 nm)
En la imagen se observa un esquema de la formación de aa, esquematizando en celeste la pérdida de una molécula de H2O para la formación del polipéptido. 
Un aa va hacia un lado y luego el aa siguiente se escribe hacia el otro, por lo tanto podemos decir que el enlace peptídico está en -trans. 	
Según la cantidad de residuos, se los denomina:
· péptido: si el número de aminoácidos es pequeño	
· oligopéptido: si el número de residuos que la componen es menor a 10
· polipéptido: si el número de residuos es mayor a 10
· proteína:si el número de residuos es mayor a 50 
No hay una cantidad clara para la cual un polipéptido puede comenzar a llamarse proteínas, con un PM arriba de 10 mil podemos pensar en llamarla proteína. 
· En muchas proteínas, el N-terminal se encuentra bloqueado con grupos formilo o acetilo.
¿cuantos aa puede tener una proteína? lo que de, lo típico es de X cientos y puede llegar a 2000, hay algunas que son la excepción a la regla. En la imagen de abajo tenemos una cadena peptídica con una sucesión de aa unidos, la parte de repetición de una unidad estructural entre C⍺ la llamaremos esqueleto peptídico/backbone, está dado por los sucesivos enlaces peptídicos. 
Titulación de péptidos
· Además del amino libre en el N-terminal y del carboxilo libre en el C-terminal, muchos péptidos tienen grupos ionizables en sus cadenas laterales.
· El hecho de que distintos péptidos tengan distinta carga en función del pH puede utilizarse para su separación.
Resolución de ejercicio ¿cuál es la carga neta a pH3?:
1. Encontrar grupos ionizables: tenemos el amino y carboxilo terminal, solamente hay 1 de cada ya que todos los demas estan comprometidos en el enlace peptídico. Ahora, hay que tener en cuenta los grupos R de cada aa conformando el péptido, tenemos un resto -COO- y un NH3+0 0 + 0
+1
2. Representamos cada aa con su letra y marcamos los restos ionizables (mirar imagen derecha). Se observa en la tabla un gradiente de pH entonces se busca analizar cómo será la ionización de las especies en cada situación. 
No casualmente la variación de pH se da con valores impares ¿por qué? porque los pKa redondeados son pares, entonces estoy cubriendo la diferencia de un grupo a otro, es decir, la desprotonación de un grupo ionizable. 
Niveles de organización de las proteínas
Estructura primaria hace referencia a la secuencia de la proteína. 
Estructura secundaria hace referencia al ordenamiento local de la cadena. 
Estructura terciaria observamos el plegado de la proteína
Estructura cuaternaria corresponde a las distintas subunidades de plegamiento de la una proteína. 
La estructura depende de la secuencia de aa
Estructura primaria					
Consiste en la secuencia de aminoácidos de las proteínas, es decir, ORDEN DEFINIDO DE AA. 
· La estructura primaria de una proteína es la secuencia ordenada de los aminoácidos que componen la cadena proteica, descrita desde el amino al carboxilo terminal.
· La estructura primaria también está dada por todos los enlaces covalentes de la proteína.
· Los 20 aminoácidos que se incorporan a las proteínas están codificados en los genes de todos los organismos. 
Cada proteína tiene una secuencia única, lo que define la IDENTIDAD de la proteína.
La secuencia de las proteínas se organizan en tablas, establecemos la posición relativa del aa. 
Cualquier combinación de 20 aa si cambio UNO SOLO cambio la proteína, si tomo 1 proteína de 100 residuos, las combinaciones posibles son .
La gran variedad en cadenas laterales de los aa permiten la diversidad estructural y funcional de las proteínas.
Puentes disulfuro
Además del enlace peptídico, aparece el puente disulfuro que puede vincular partes de la cadena que no están próximas entre sí. 
· Ocurre por oxidación de pares de cisteínas.
· Adoptan una conformación no plana e imponen restricciones a la estructura proteica. 
· Aportan gran estabilidad a la estructura
· Pueden ser inter o intramoleculares. 
Se verá en seminario
Hasta el momento dijimos:
· Cada proteína tiene una secuencia única de aa.
· La secuencia confiere identidad.
· Cada proteína tiene una estructura 3D que le confiere una FUNCIÓN ESPECÍFICA.
· La estructura terciaria está determinada por la secuencia
· La función depende de la secuencia y forma que adopte
· Si se altera la secuencia de aa la función puede cambiar.
¿Cómo hacemos para conocer la estructura primaria? Hay 2 opciones
1. Secuenciación de ADN
2. Secuenciación de proteínas
a. Degradación secuencial de Edman.
b. Microsecuenciación de proteínas por espectroscopia de masa (MS).
Cada proteína tiene una composición en aa característica, para empezar a secuenciar se debe conocer la composición en aa ¿cómo? rompiendo los enlaces péptidos, son muy estables, entonces requiere de condiciones drásticas para romperlos.
1. Hidrólisis (HCl 6N, 110°C, 24h)
2. Separación 
3. Cuantificación. 
Uno puede armar la lista de aa y ver cuantos aa componen la proteínas, varían en número, longitud y además diferente composición, es decir, la proporción de cada aa también característica de cada proteína. 
Identidad de Secuencia
Ejemplo: La mioglobina humana y de cachalote presentan un 84 % de identidad si se tienen en cuenta los aminoácidos idénticos y un 94 % si se tienen en cuenta las sustituciones conservadoras. 
Está marcado en azul donde la secuencia es idéntica, en verde donde la secuencia se reemplaza por otro similar (del mismo grupo). Tenemos 2 tipos de sustituciones:
· Sustitución conservadora: conservan la naturaleza de la cadena lateral (ej: Asp x Glu o Ile x Leu).
· Sustitución no conservadora: no presentan similitud (ej: Cys x Ala).
Por lo tanto, las proteínas NO SON IGUALES pero cumplen la MISMA FUNCIÓN en distintas especies, no necesariamente es idéntica, es decir, la Hb humana no se si le puede servir a los cachalotes.			
Identidad es una característica cuantitativa → se expresa en porcentaje 
Comparando las secuencias se puede encontrar que tiene mucha más identidad de la que se esperaba originalmente ¿cómo se genera la identidad de secuencia? por cambios de aa.
Estrategia para secuenciar una proteína
· Tener la proteína de interés pura ¿por qué? Si tengo una mezcla de proteínas hay fracaso. Hay que tener en cuenta:
· solubilidad (precipitación por salado)
· tamaño (ultra centrifugación, cromatografía de exclusión molecular, SDS-Page)
· carga eléctrica (electroforesis)
· polaridad (cromatografía en fase reversa o de adsorción). 
· afinidad de unión (cromatografía de afinidad)
· Determinar cuántas cadenas polipeptídicas componen la proteína: si hay más de una, separarlas.		
· Desnaturalizarla, es decir, romper su estructura 3D. Se rompen solamente uniones débiles perdiendo la actividad. 
Se logra agregando agentes desnaturalizantes:
· ácidos y bases
· solventes orgánicos
· calor
· detergentes
· urea y cloruro de guanidino
· Romper los puentes –S-S- y bloquear los grupos –SH.	Si no los bloqueo se vuelven a formar
· Determinar la composición en aminoácidos de cada cadena polipeptídica.
· Determinar los residuos amino y carboxilo terminal de cada cadena.
· Determinar de la secuencia de aminoácidos por reacción de Edman, proteólisis específicas, ordenamiento de los fragmentos y superposición (corto con + de un rvo).
Puedo separar un aa N-terminal y obtener a su vez una cadena con un nuevo N-terminal, no sirve para secuenciar proteínas completas. 
· Localizar los puentes disulfuro.
Secuencia consenso
Se refiere a los aa o bases más frecuentes encontrados en una posición determinada luego de comparar varias secuencias. 
El tamaño en la imagen indica la frecuencia, a mayor tamaño, mayor frecuencia. Las letras chicas indican que no hay un aa definido. 
¿por qué son importantes? Con esto se pudo comparar varios citocromos, borrando todo lo que estaba repetido, en amarillo se representan las secuencias consenso, por lo tanto, esas zonas pueden representar algo importante para la proteína. 
Homología de secuencia (árbol filogenético de proteínas)
Busca comparar en cuánto difieren 2 proteínas relacionadas, permite establecer hace cuanto tiempo se separaron las especies. 
Cuanto más se parecen, más están filogenéticamente relacionadas esas especies. 
· Las proteínas homólogas presentan similitudes en secuencia de aa y estructura 3D
· Comparten características estructurales y funcionales. 
Homología es una característica cualitativa → NO se expresa en porcentaje.
Síntesis química de péptidos
No puedo obtener proteínas por síntesis química porque la reacciones son muy complicadas,por lo tanto solo puedo obtener péptidos. 
La formación del enlace peptídico es sencilla, pero si mezclo 2 aa A-B tengo 4 dímeros posibles (AB; BA; AA; BB), por lo tanto:
1. Deben poder añadirse los aa de a uno
2. Los aa deben activarse de algún modo para favorecer la reacción. 
3. Para evitar reacciones secundarias, deben bloquearse todos los grupos rvos distintos del amino y carboxilo que forman el enlace. 
Síntesis en fase sólida
Parte de un soporte sólido al que por anclaje se le une el primer aa, a través del C-terminal; la síntesis biológica es de amino a carboxilo mientras que la síntesis química de péptidos es de carboxilo a amino.
La siguiente reacción es de desbloquear el grupo amino del aa, por otro lado el aa que se agregó se compra bloqueado, entonces se favorece la reacción. A su vez, una vez acoplados hay que desbloquear y así, por último, una vez que tengo el péptido formado lo liberó del soporte sólido. 
Construcción de matrices para arreglos de proteínas
· péptidos cortos (distintos pero relacionados) se sintetizan sobre un soporte sólido.
· permite evaluar sustituciones.
· sobre ese soporte se hacen distintas reacciones bioquímicas de reconocimiento.