T26 y T27_ CITOESQUELETO_

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CITOESQUELETO I 
Prof. Dr. Nicolás Favale
· Estructura, ensamblaje y regulación
· Proteínas accesorias 
· Funciones del citoesqueleto en la fisiología celular
Citoesqueleto: no es estático, gran número de funciones en la célula necesitan del citoesqueleto. Convierte energía química en energía cinética
Se puede organizar en dos grandes grupos: 
1. Organización espacial interna
· Orden y distribución de organelas 
· Tránsito vesicular 
· División celular 
· Polaridad 
· Estructura de membrana 
2. Interacción célula-entorno
· Interacción célula-célula 
· Responder estímulos 
· Interacción célula-matriz
Pueden ser dos tipos de estructuras:
· ESTRUCTURAS DINÁMICAS ADAPTABLES: Hay cambios estructurales en función de la necesidad. 
· ESTRUCTURAS ESTABLES: no estáticas. Tienen polaridad
Un mismo citoesqueleto dentro de una misma célula puede tener organizaciones distintas.
Faloidina-FITC: sirve para ver la actina 
EN LA CÉLULA EXISTEN 3 TIPOS DE CITOESQUELETO:
 
· Microfilamentos: entre 5 y 9 nm constituidos por un monómero polimerizado de actina. Los podemos ver porque están fluorescentes.
Función principal es la forma y locomoción de la célula. La actina es fundamental en el sarcómero.
Son muy flexibles
· Microtúbulos: Formados por tubulina (alfa y beta). miden 25 nm. Función: Transporte y localización intracelular. Forma los cilios y flagelos (estructuras móviles y no móviles) . 
No son flexibles y se pueden quebrar. Formados por 13 protofilamentos
· Filamentos intermedios: en los 10 nm. Formados por una familia de proteínas. Función: resistencia mecánica. 
Los 3 citoesqueletos interactúan entres sí. 
Cuando se polimeriza la actina, tubulina o filamentos intermedios NO hay enlaces covalentes -porque la presencia de uniones covalentes necesitan para romperse energía, pero como necesitan romperse porque son dinámicas no hay tiempo para eso. 
La estructura es helicoidal (termodinámicamente muy favorables porque hay muchas interacciones). 
La actina y tubulina son globulares y se organizan de forma tubular. Los filamentos intermedios son globulares y fibrosos (Cabeza globular y cola fibrilar) y no tienen polaridad.
La dinámica dependerá del control sobre el proceso de polimerización - despolimerización
Cada uno de los microfilamentos enrollados se llama protofilamentos. 
Los filamentos intermedios son 8 filamentos uno encima del otro en forma desfasada. simula un cable. Dan resistencia mecánica porque no se quiebra.
NUCLEACIÓN: 
Polímero lineal: subunidad unida una a otra. Un polímero se unen por cierta afinidad que depende de una constante se asociacion (Kon) y depende de la cantidad de subunidades que haya. La velocidad de crecimiento de polimerización depende de una constante Kon y de la cantidad de subunidades de monómeros libres para polimerizar
La velocidad de acortamiento depende de una constante Koff y NO depende de la cantidad de subunidades por lo que es constante.
Cantidad de monómeros mínimos que debe existir: Los primeros 3 monómeros se unen con determinada velocidad, luego los monómeros interaccionan con más monómeros por lo que entran con más velocidad. 
El núcleo mínimo en la actina es de 3, en la -tubulina es de 13. Luego del núcleo mínimo aumenta la velocidad. Hasta que se forma el núcleo (lo más lento) se denomina nucleación (parámetro que la célula puede modificar). 
Llega un momento donde la velocidad de polimerización y despolarización se igualan y estamos en estado estacionario. 
Velon=Veloff
Velon= Kon [C]
Veloff= Koff(ind de [C])
Kon [C]= Koff
[Cc]=Koff/Kon -> concentración crítica. Donde Koff y Kon son iguales. 
CONCENTRACIÓN CRÍTICA:
Si la concentración de actina es menor a la concentración crítica la Cx< CC el filamento se acora. Sí Cx> CC el filamento se alarga
La célula tiene la 
capacidad de regular la concentración de actina para que polimeriza o despolimeriza. 
En el centro de actina hay ATP. Tanto la actina como la tubulina tienen nucleótidos trifosfato, pero la polimerización ocurre independiente de la hidrólisis de ATP a ADP o de GTP a GDP. Cuando hidroliza pierde afinidad.
En el caso de la tubulina tenemos dímero de beta tubulina y alfa tubulina, tiene GTP pero no lo usa como fuente de energía para polimerizar. Hay polaridad El extremo + o - hay mayor o menor actividad para polimerizar. Generalmente por una cuestión de impedimento esterico el extremo + tiene mayor velocidad de polimerizar que el -. Hay diferentes concentraciones críticas en los extremos. La Cc del + es menor que la del -.
La Cc es un valor de referencia en el cual la polimerización y la despolimerización se igualan. Sale de hacer una cuenta matemática. 
La actina tiene ATP y la tubulina GTP. La función de esto es que dependiendo de si la actina tiene ATP o ADP va a ser más afín para unirse al filamento. SÍ la actina tiene ADP va a ser menos afín que sí tiene ATP. Lo mismo con la tubulina y el GDP o GTP. 
D es menos afín que T. 
Cx(T)<Cx(D)
Los extremos masa nuevos tienen ATP y los más viejos tienen ADP. 
POLARIDAD DE POLIMERIZACIÓN:
El filamento crece por el extremo + y se acorta por el extremo -. Esto genera un intercambio rotatorio (treadmilling) y sucede principalmente en los microfilamentos de actina cuando Cx(T)<C<Cx(D). 
Inestabilidad dinámica: Principalmente en microtúbulos. La concentración crítica es una cuando en la apunta hay GDP y es otra cuando en el otro extremo hay GTP. Este es un fenómeno de un solo extremo (+). La tubulina está muy cerca pero por encima de la Cc cuando en la punta del filamento hay GTP, por lo que el MT crece, pero a la vez va hidrolizando GTP a GDP hasta que la punta tiene GDP (catástrofe) y se pasa a que la concentración de monómero sea menor que la Cc y el filamento se acorta hasta que se incorpora un monómero con GTP y comienza a polimerizar devuelta. Esto es fundamental para la formación del huso mitótico. 
Cuando hay GTP los filamentos de actina están derechos, cuando se hidroliza a GDP pierden estabilidad. 
La célula puede controlar todos los elementos vistos (nucleación, Concentración crítica, ``Polaridad polimerización``, ATP/ADP y GTP/GDP) ya que interviene con proteínas accesorias.
Los filamentos intermedios no tienen polaridad (los extremos son iguales) y son deformables y resistentes. Están formados por una familia de proteínas según la ubicación. CUADRO. Los FI forman queratina. Mutaciones en la queratina da una enfermedad llamada epidermosis bullosa simple. 
Una patología asociada a los neurofilamentos es la esclerosis lateral amiotrófica.
El citoesqueleto está muy conservado evolutivamente. Es común encontrar en la naturaleza un gran número de toxinas que atacan al citoesqueleto, estás moléculas se unen a los monómeros de actina e impiden su polimerización (ej: toxina latrunculina, faloidina que se une a la f- actina e impide su despolimerización y sale del hongo Amanita phalloides del cual también sale la toxina alfa-amanitina. Otro hongo es amarita muscaria que es alucinógeno. Otra toxina fúngica es la citocalasina que bloquea el extremo +. Si uno bloquea el sitio de polimerización lo más probable es que se despolarice). Un fármaco es el taxol que sale del árbol taxus brevifolia y estabiliza los microtúbulos y frena la inestabilidad mecánica que lleva a que inhiban la dinámica de los microtúbulos, se usa para el tratamiento de cáncer para evitar que estas se dividan las células tumorales (y las normales en menor medida), hay otros drogas que también afectan a los microtúbulos. 
Todas estas drogas tienen efectos adversos. 
PROTEÍNAS ACCESORIAS: 
 
Muy importante. Resumen los tres tipos de citoesqueleto. 
Lo que se marca en la foto es la actina. El mismo citoesqueleto de actina está arreglado de diferentes formas debido a las proteínas accesorias qué hay de 4 o 5 tipos. 
Algunas están en la nucleación, en la concentración disponible, en polaridad de polimerización, etc.
Nucleación: Todos los procesos lentos van en contra de la vida, la célula favorece la formación delmonómeros, una estrategia para formar el sitio de nucleación es el gammaTuRC (complejo anular de gamma tubulina), es el sitio de unión de los MT. Esta en el MTOC (centrosoma qué tiene dentro los centriolos. Es el lugar donde nacen los MT en la célula). El centrosoma queda constituido por los centriolos, Matriz y MTOC (centro de organización de microtúbulos). Está ubicado en el extremo - de los MT y lo bloquea, por eso solo crece del extremo más. 
Los centriolos están hechos de MT (3 anillos fusionados). Cada célula tiene 2 centriolos que se dividen cuando se divide la célula. Están en el centro del centrosoma. 
En las células no polarizadas el centrosoma siempre está en el centro, pero cuando la célula se polariza el centrosoma se conoce como cuerpo basal y se ubica encima del cilio. 
Dos factores reguladores:
· ARP(proteínas relacionadas con la actina): nucleacion y ramificación. Gran similitud estructural. La célula puede formar el núcleo de actina que simula el núcleo mínimo a partir del cual se polimeriza la actina. El núcleo que simula es el ARP2/3. Se forma en el extremo menos dejando libre el extremo más. Está ARP ⅔ se une lateralmente a los filamentos polimerización de actina, generando una estructura de redes. Tiende a formar estructuras de gel (ramificadas)
· Fórmina: favorece la polimerización pero no genera estructuras ramificadas, solo lineales. 
Regulación de qué tan rápido o lento se polimeriza la actina. Regula la concentración disponible de actina. 
Sí la célula quiere polimerizar lo que hace es permitir que la actina aumente su concentración por encima del cc. 
Si quiere despolimerizar la célula secuestra monómeros para que la concentración sea menos que el cc y se despolimeriza. Para esto la célula usa la proteína timosina que se une a la actina y bloquea sus extremos de unión al microtúbulo, así la concentración de actina disminuye. La célula tiene por cada molécula de actina una timosina que la mantiene en un estado cerrado. 
Cuando la célula necesite polimerizar se activa la proteína profilina que favorece el intercambio de ADP por ATP y favorece la polimerización por el extremo + (polimerización direccional). Está profilina se regula por fosforilación y por fosfatidil inositol. 
La fórmina puede a su vez unir a la profilina.
Cuando llega el estímulo de polimerización este activa a la profilina que inactiva a la timosina que libera a la actina. A su vez la profilina impide la nucleación y solo permite que se polarimerice por un lado, favoreciendo la polimerización en una dirección.
Mecanismo para la tubulina
La estatmina secuestra los dímeros de tubulina. En los MT es importante la estabilidad dinámica y la estatmina la favorece. La estatmina en ratones tiene injerencia en el compartimiento, sin estatmina se pierde el compartimiento maternal, aumenta el compartimiento social y se pierde la evaluación de riesgo. 
La tropomodulina (proteína de unión a actina que regula la elongación y despolimerización de los microfilamentos por bloqueo del extremo del polímero.). La cap z bloquea el extremo + del filamentos de actina. 
En los microtúbulos las proteínas map estabilizan los extremos +. 
Proteínas de unión lateral: interaccionan en forma lateral con el citoesqueleto. O estabilizan el filamentos o lo desestabilizan. En el primer caso buscan estructuras estables y en el segundo dinámicas. 
A catanina promueve la desestabilización rápida de los MT. Requiere de ATP y libera el MToC, promueve la mitosis y meiosis. 
La gelsolina promueve la polarización y despolimerización de los MT.
Las MAP a través de unión laterales unen MT. Dan diferentes conformaciones. 
La tropomiosina se une al citoesqueleto de actina y maneja la función del sarcómero
La cofilina favorece la despolimerización 
Proteínas de entrecruzamiento: 
En la célula el citoesqueleto de actina puede organizarse en haces o en redes. En una misma célula puede tener fibras esres, lamelipodios y filopodios (haces paralelos). Las proteínas laterales y como polimeriza lo definen. 
La fimbrina tiene dos dominios de unión de actina, la alfa actina es un dominio. En el caso de la filamina es flexible y los dominios dFan cerca. En la espectrina están lejos. 
Sí los dominios están cerca se forman haces y son rígidos. Sí los dominios están lejos son flexibles y se favorece la formación de redes. 
En el lamelipodio priman las proteínas flexibles como la filamina 
En las fibras de estrés prima la fibrina y la alfa actina.
La separación de los dominios: cuando yo tengo alfa actinina tengo una separación de 39 nm entre fibra y fibra que permiten que ingresen proteínas motoras y son haces contráctiles.
En los haces paralelos hay poca separación y forman por ejemplo microvellosidades. 
Listeria: parásito intracelular. Utiliza el citoesqueleto de actina para impulsarse. Tiene una serie de proteínas en la membrana que activan y reclutan la proteína profilina. Reclutan las mismas proteínas que hacen una polimerización violenta de la actina. 
Proteínas motoras: 
El citoesqueleto tiene proteínas que desplazan sobre los filamentos
En el MFtenemos miosina y en los MT tenemos quinesinas y dineínas.
En ambos casos tiene una cabeza que es .motor y una cola que determinar la especificidad de la carga
Miosina II: tiene estructuras globulares (2 cabeza que determinan la fuerza motora) y una cola que determinar la carga. Contraen el sarcómero.
Miosinas mínimas de eucariontes: I,II y V. Representan la mínima cantidad de miosinas qué tiene que tener un organismo. 
Todas caminan al extremo más (se desplazan al +), salvó la VI que va al revés. 
Las tipo 1 interacciona con la membrana plasmática y con los filamentos de actina de los extremos. Mueve la microvellosidad. Está en la Organización intracelular
Tipo 2: contracción muscular. Produce la citocinesis y la migración.
Tipo 5: transporta organelas por el citoesqueleto de actina. 
Dineinas: se desplazan al extremo menos. 
Quinesinas: se desplazan al extremos más de los MT. Hay 45 quinesinas. La 13 se une al costado del MT y la tracciona para generar la catástrofe. La 14 se desplaza al extremo -
 Ciclo de la miosinas: 
En todos los casos es necesario una conversación de energía química del atp a energía cinética. Para esto hay 2 formas: transformas la hidrólisis de ATP en cambio conformacional y cambio de afinidad. Ciclo de ATP: cuando no hay ATP la miosina está unida a la activa (Rigor). Cuando se une el ATP la miosinas pierde la afinidad por la actina. Luego se produce la hidrólisis del ATP que pasa a ADP y pirofosfato. Se expulsa el fosfato y la miosina vuelve a tener afinidad por actina y se produce un gran cambio de afinidad y se libera el ADP y se vuelve a la posición original. Este es un movimiento de tracción, se desplaza sobre la actina. Desplazamiento rápido. 
La quinesina opera como dímero. Tiene características distintas a la miosina. Siempre está unida, nunca libre. Está constantemente unida a la actina. El desplazamiento es lento y seguro. 
Funciones del citoesqueleto en la fisiología celular: próxima clase