T13 y T14_ MICROSCOPIA_

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MICROSCOPIA
Desde el punto de vista técnico la microscopia varió poco en los últimos años. 
Los primeros microscopios se usan desde el 1632
Antonie Van Leeuwenhoek: descubrió los espermatozoides, glóbulos rojos y bacterias. 
Robert Hooke: célula. Utilizó un microscopio compuesto (2 lentes). No obtuvo imagenes muy buenas. 
Microscopio: Instrumento que permite observar objetos demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. 
Tipos de microscopía: Óptica y Electrónica 
· Microscopía óptica: microscopio qué está compuesto por un sistema de lentes que utiliza luz.
Límite de difracción de Abbe: límite de resolución teórico de un microscopio óptico. 
Microscopio invertido: luz desde arriba. Sistema de luz más complejo
· Parámetros fundamentales de la microscopia: 
. Magnificación (cuántas veces yo aumento de tamaño)
. Resolución (distinguir dos puntos)
. Contrate 
· Fundamento de la microscopia (interacciones):
. Luz-luz 
. Luz- materia
Luz: dualidad onda-partícula. Es una onda electromagnética
l
Longitud de onda: Es el periodo espacial de la onda. La distancia sobre la cual se repite la forma de la onda, o la distancia entre dos puntos de una misma fase (ej: dos máximos). Se mide en metros
Frecuencia: Es una magnitud que mide el número de repeticiones por unidad de tiempo de cualquier fenómeno o suceso periódico. Es el periodo temporal de la onda. Se mide en Hertz (Hz)= 1/segundo. 
Puede ocurrir que la muestra absorbe la luz con una determinada longitud de onda y luego la emite con otra longitud de onda distinta. Está es la fluorescencia. 
En el objetivo hay mucha óptica. Tiene muchas lentes, cuántas más lentes corrige más aberraciones. 
Objetivo: Foto Numero X/ otro número. El número por la X es la magnificación, cuántas veces aumenta la imagen (hay que multiplicarla por el aumento del ocular). El otro término es la apertura numérica que define el límite de resolución
Resolución: Capacidad de un sistema óptico de diferenciar dos puntos como tales. (propuesto por Lord Rayleigh) Lr: 0,61x landa/ AN
El poder resolutivo es: 1/Lr
 
Apertura numérica: (propuesto por Abbe). Cuanto más chico sea un objeto más dispersión produce. Cuantos más rayos pueda capturar el objetivo, mejor resolución tendrás. A mayor longitud del ángulo mejor apertura numérica y mejor resolución. Nos dice la capacidad del objetivo de captar luz. 
AN= (sen a).n 
a: la mitad del angulo 
n: índice de refracción del medio. Las lentes secas tienen dos índices de refracción distintos (aire y vidrio). Las lentes de inmersión utilizan un aceite de inmersión porque tienen un índice de refracción parecido al vidrio, tienen mejor NA. 
Cuanto menor es el LR mejor es la resolución, Cuantos más rayos pueda capturar el objetivo mejor resolución tendrá. 
T14
Ley de Snell: La refracción es el cambio de dirección y velocidad que experimenta una onda al pasar de un medio a otro con distinto índice refractivo.
Resolución y Magnificación:
La magnificacion no tiene qué ver con la resolucion. Hay objetivos de 40x o 60x con una mejor resolución que uno de 100x. Aumentó=/= Resolución
Contraste: se define como la diferencia de intensidad (brillo) entre un punto de una imagen y su fondo. El ojo humano 2-5%. La vision no es absoluta sino comparativa. La vision depende de la coparacion local, NO ES POSIBLE VER EL BRILLO ABSOLUTO.
TIPOS DE MICROSCOPÍA: 
Microscopia Óptica: El colorante absorbe todas las longitudes de onda menos la del color qué yo veo. 
Campo oscuro: permite ver cosas por debajo del límite de resolucion. Foto. La luz no entra al objetivo, solo entra sí interacciona con la muestra y está cambia la estructura de la luz. 
La difracción es un fenomeno caracteristico de las ondas qué se basa en la desviación de estas al encontrar un obstáculo o atravesar una rendija.
Miroscopa de Normaski: Utiliza contraste de fase y luz polarizada.
Microscopia de fluorescencia: Hay una estructura qué emite luz. Fondo oscuro donde solo emite luz la estructura de interés. 
Fotoluminiscencia que se extingue al cesar la radiación que lo provoca (Vocabulario científico y técnico RACEFN) 
Fotoluminiscencia: que caracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en forma de radiación electromagnética de longitud de onda diferente
Fluorocromo. 
Florescencia: instantaneo
Fosoforescencia:Tarda un tiempo. Se carga con luz. 
Como darle especificidad y selectividad al fluorocromo? 
Hoescht tiene especificidad por DNA (bueno para marcar núcleos
FISH (permite marcar cromosomas humanos)
Fluorocromo unido a anticuerpo-> inmunofluorescencia
Para qué una proteína entre al núcleo tengo qué hacer qué se permeabilice la proteína. 
GFP: green fluorescent protein. Son 11 laminas beta con un centro cromofo. A partir de mutaciones a está proteína se lograron proteínas fluorescentes de distintos colores.
A una proteína de interes le estoy agregando un plasmido qué tiene el gen qué sintetiza la proteína fluorescente. Para saber donde está la proteína tengo qué marcar otras organelas con otro color, asi se en qué organela está. 
El plasmido entra a la célula con ayuda del polietinel glicol en caso de las bacterias (qué tienen poros grandes, el polietinel glicol las hace más permeables) 
en el caso de las eucariotas vegetales se utilizan balas de oro con el plasmido qué se dispara a la célula.
El plasmido tiene qué llegar al núcleo para la transcripcion (evento fortuito). Puede ser de forma transitoria o de forma estable (se mete dentro del DNA de la célula) las células qué reciben el plasmido sobn resistenes a ciertos antibioticos, ya qué el plasmido lo es. 
Semana 5:se clona el plasmido con Cherry (roja)
Semana 6: Purificacion del PLasmido y chequear la presencia del plasmido.
Semana 10: Transfeccion de células eucariontes con el plasmido
Se pueden hacer animales transgenicos qué tienen en su genoma proteínas fluorescentes.
Microscopio de Epifluorescencia: se utiliza un tipo de ilunminacion llamada epiiluminacion, donde la luz sale del objetivo, llega a la muestra, la excita y la luz vuelve por el objetivo. Excito con azul, se emite en verde. Adentro de la maquinaria hay un espejo dicroico qué actúa como espejo con la luz azul pero no con luz verde. La cantidad de verde qué capta el objeto depende del objetivo, el cual depende de la apertura numérica.