T7 y T8_ REPLICACION, REPARACION Y RECOMBINACION DEL DNA_

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REPLICACIÓN, REPARACIÓN Y RECOMBINACIÓN DEL DNA
Replicación: Duplicó el DNA
(Recomendación: Cap 4 lodish; cap 5 alberts. Leer alberts)
¿Cuando se replica el DNA en la célula eucarionte? En la fase S (periodo interfásico) del ciclo celular, en esta fase también hay síntesis de proteínas de empaquetamiento (HISTONAS)
La replicación del DNA es semiconservativa, siempre se da en sentido 5` a 3`. Se da en el replicosoma (estructura macromolecular compleja). No puede tener errores ya que si los hubiera la célula hija no sería igual a la madre. Es energéticamente costosa. 
Se descubrió gracias a un cultivo de células Escherichia coli (DNA circular) que crecieron en un cultivo de sales de amonio que están marcadas con un isótopo radioactivo (N15) y el amonio va a ser incorporado en los nucleótidos y estos van a ser incorporados en el DNA, vamos a obtener qué todo el DNA sea radiactivo. Luego del lavado incorporamos con otro isótopo marcado (N14), luego analizamos cómo están constituidas las hebras del DNA en las células hijas. A través de centrifugación diferencial podemos separar el DNA que se marcó con nitrógeno 15 del que se marcó con N14. Ahí podemos ver qué hay bandas intermedias (mitad N14 y mitad N15) en el DNA, ahí se determinó que el mecanismo de replicación del DNA es semiconservativo.
Una hebra de la madre y otra de la hija. 
Sentido de la replicación: 5`->3`
En el extremo 3` tenemos libre el OH y en el 5` está libre el grupo fosfato. 
La cadena patrón se copia en el sentido 5`->3`. E 
El OH 3` libre hace una reacción de ataque nucleofílico al grupo trifosfato del carbono 5 que quiere incorporarse y esto forma un enlace fosfodiéster para elongar la cadena.En esta incorporación hay complementariedad de bases. El ataque nucleofílico parte de un enlace de alta energía y pasa a uno de menor energía (no gasta ATP. ENERGÉTICAMENTE FAVORABLE) en esta interacción participa el magnesio como catión que participa en la exposición de cargas y el ataque nucleofílico para que se genere el enlace fosfodiéster y se una la base complementaria a la cadena patrón.Tracciona al patrón. 
El proceso de polimerización 5`->3` sucede en las DNA-polimerasas (familia de enzimas), tiene una disposición tridimensional parecido a una mano, en la palma de esa mano es donde se encuentra el dominio que contiene el sitio activo con su sitio de unión al sustrato y su sitio catalítico. Unión del nucleótido trifosfato entrante a la cadena que se está copiando y la cadena que está creciendo en sentido 5´->3´, en la cadena hija se incorpora el nucleótido, cuando se incorpora en el sitio activo de la enzima, está censa (cambia su conformación) para ver si es el nucleótido complementario que corresponde. Aquí se produce el ataque nucleofílico y la liberación del pirofosfato, una vez qué sucede eso cambia la conformación de la enzima y se abre para permitir el ingreso de un nuevo nucleótido.
Todo esto ocurre en la horquilla de replicación 
DNA POLIMERASAS: Constituyen una familia de proteínas, comparten dominios y secuencia de aminoácidos y tienen funciones similares (no las mismas). Permite la polimerización de la hebra hija en sentido 5´->3´.
En el extremo 3` comienza (se origina) la replicación por la ADN polimerasa en sentido 5`-> 3`. Se abre la molécula de DNA. Y la DNA polimerasa comienza a copiar. La hebra conductora es la que se copia sin problema, sobre ella actúa la DNA polimerasa Epsilon.
Los fragmentos de Okasaki constituyen la hebra rezagada, qué va en sentido opuesto a la hebra conductora (crece en sentido 5´->3´), la que actúa sobre esta hebra es la DNA polimerasa Delta. Las enzimas hacen el mismo trabajo pero tienen diferente interacción con su sustrato. Ni la polimerasa epsilon ni la delta sintetizan la hebra desde el comienzo, necesitan cebadores o primers (rojo en foto), sintetizados por la primasa (o cebadora), Le dan una plataforma de anclaje a la ADN polimerasa para que inicien el proceso de polimerización. La afinidad de las polimerasas varían. La hebra rezagada necesita varios cebadores, la conductora solo uno. 
Helicasas: Interactúan con la molécula de DNA, particularmente con las hebras simples Tiene forma de barril. Cuando la molécula de DNA está completa (doble hebra) la helicasa rompe uniones (las cliva) (energéticamente costoso, aquí participa la hidrólisis de ATP), Hay helicasas que van de 5`->3` y otras que van de 3`->5`.Como se están generando dos hebras simples La rezagada o retardada tiene más tiempo de estar desplegada como hebra simple, pueden interaccionar bases complementarias de la misma hebra y formarse bucles internos. 
La ADN-polimerasa delta avanza cuando la hebra está lineal, sí llega al bucle deja de avanzar ya qué este no entra dentro del sitio catalítico por lo que la célula mantiene a la hebra rezagada de manera lineal (evita bucles) a través de proteínas de unión de cadena simple (SSB o RPA)
“single strand binding protein”
el DNA es pequeño a comparación de las proteínas 
Porque necesitamos a los cebadores? El cebador es un cebador inicialmente de RNA (menos estable y más lábil que el DNA ya que el OH en posición 2 lo hace más reactivo), el cebador da lugar para que interaccione la polimerasa y luego el cebador se degrada (el fragmento de RNA) 
La enzima ADN polimerasa sintetiza hasta que encuentra un fragmento de ARN. 
Luego cuando se sueltan los fragmentos de ARN (se autodegradan), la enzima ligasa, liga los fragmentos de Okazaki. 
La afinidad de las polimerasa por la hebra es baja por lo que para que no se separen existen unas proteínas llamadas abrazaderas que mantienen posicionada a la DNA polimerasa sobre la hebra de DNA, esta tiene forma de dos semicirculos. Estas abrazaderas están unidas a un cargador que regula la conformacion a través de la hidrolisis de ATP, el cargador interacciona con la molécula de ATP y la hidroliza, esto genera un cambio conformacional en la abrazadera que la permite interaccionar con la DNA-polimerasa 
El cargador y la abrazadera solo interaccionan con la presencia de ATP. La abrazadera posiciona la ADN-polimeraza sobre la hebra de DNA.
abrazadera
Sí yo abro la molécula de DNA aumenta la torsion de la hebra, para eso están las topoisomerasas 1 (rompen 1 hebra) y topoisomerasas 2 (rompen 2 hebras), ambas rompen ácidos nucleicos de manera reversible, como rompe es una nucleasa. en la topoisomerasa 1 No hay consumo de ATP.
En la topoisomerasa 2 sí hay consumo de ATP porque al finalizar la ruptura hay que rehacer el enlace de ATP.
REPLICOSOMA: todo el proceso conjunto. 
ADN polimerasa epsilon-> hebra continua 
ADN polimerasa delta-> hebra discontinua
La molécula de DNA está doblada 
ORÍGENES DE REPLICACIÓN: Son secuencias específicas en la molécula de DNA que permiten la interacción del DNA con el replicosoma 
Teórico 8: 
HORQUILLAS DE REPLICACIÓN: Las células procariontes tienen DNA circular. Se forman dos horquillas. EL proceso de replicación es bidireccional. Se llama BURBUJA DE REPLICACIÓN, esto se ve mejor en el ADN circular, se elimina por la enzima decoR1 (reconoce una secuencia específica en el dna circular. 
Hay un fragmento conocido como origen/inicio de replicación. La secuencia se abre gracias a la helicasa y luego aumenta su tamaño hasta llegar a la burbuja de replicación, este crecimiento es bidireccional tanto en el virus como en células procariontes y también en células eucariontes.
En la burbuja de replicación vamos a tener una hebra continua y una rezagada. 
El origen de replicación está caracterizado por la alta repetición de secuencia de bases adenina o timina A=T (2 enlaces puente H), las helicasas abren para ambos lados. 
DONDE, CUANDO Y CUANTAS VECES SE INICIA LA REPLICACIÓN?
¿Dónde, cuándo y cuántas veces se inicia la replicación? 
En una célula procarionte, podemos trabajar el DNA con una enzima que lo haga lineal. Los orígenes de replicación tienen alta repetición de secuencia adenina-timina que interaccionan por 2 puentes de hidrógenos. Gasta menos energíaromper esa secuencia A-T que las secuencias C-G. La célula sólo replica una vez su DNA para crear una célula hija, entonces debe estar muy regulada para que no sea constante. Entonces vamos a observar que, en las células procariontes, cerca de los orígenes de replicación además de la secuencia A-T existe una secuencia de DNA que interacciona con proteínas iniciadoras del proceso de replicación, que NO forman parte del replicosoma. No están implicadas directamente en la replicación, sino que marcan a partir de que parte se origina la replicación. Cuando las proteínas iniciadoras interaccionan con la molécula de DNA de la célula procarionte, esa interacción cambia la disposición tridimensional de ese origen de replicación en la molécula de DNA y ese cambio es el que permite que la helicasa reconozca el origen de replicación rico en A-T y se una, luego abriendo la hebra. Se degradan las interacciones que mantienen la doble hebra y así obtenemos la burbuja, donde así pueden interaccionar el resto de las enzimas del replicosoma. Sólo vimos inicio de la replicación por unión de la helicasa y la posibilidad de que la primasa y polimerasa se unan al origen de replicación. 
En el cromosoma circular de la célula procarionte, en los orígenes de replicación, la célula presenta una gran cantidad de bases que están metiladas. Si pongo un metilo (grupo metilo, CH3) voy a modificar la superficie de la base. La metilación lo que hace es marcar los orígenes de replicación y ocurre en secuencias GATC. Encontramos las dos hebras entonces metiladas. Cuando se inicia la replicación, la hebra patrón va a estar metilada, pero las hebras hijas NO. En esas condiciones, lo que tenemos es una hemi metilación: la mitad de la molécula está metilada y otra no. En estas condiciones hay una proteína que reconoce la hemi metilación, marca que se inicio la replicación y marca que ahí no se pueden unir devuelta proteínas iniciadoras. Cuando esa burbuja termina de replicar todo el cromosoma, entonces tenemos un tiempo en el cual enzimas metil-transferasas le incorporan un metilo a la hebra hija. Ahí sí, una vez que la hebra se metiló podemos decir que estamos nuevamente en condiciones de iniciar nuevamente la replicación. 
Entonces en el origen de replicación tengo facilidad para la apertura por helicasas, secuencias que marcan el inicio del proceso de replicación y secuencias que regulan que ese proceso se abra una sola vez. 
Célula eucarionte:150 millones de pares de bases. Si fuera exactamente como en las procariotas, tardaríamos un mes en replicar una sola célula. Entonces se modifican esos orígenes de replicación. La presencia de histonas y todo el empaquetamiento de las células eucariontes también complican la replicación.
Hay diferentes zonas del cromosoma: en los extremos telómeros, en el centro el centrómero. Hay múltiples orígenes de replicación (en la procarionte sólo 1). Esto va a permitir que sea más rápida. Esos orígenes de replicación se agrupan en el cromosoma, de a 20 o 30, formando unidades de replicación. Se puede estudiar con una autorradiografía; se usa timidina tritiada, se hace una placa radiográfica y donde se ve es porque hay alta concentración de timina, hay muchos T-A y hay un inicio de replicación y lo veo en la autorradiografía. Hay muchos orígenes próximos, formando las unidades de replicación.
La fase S tiene muchos periodos a lo largo de la replicación. Vamos a tener orígenes de replicación que se replican de inmediato, otros que toman más tiempo. No es que comienza y se replica todo el cromosoma de una vez, y así se ve como algunos comienzan a replicarse y otros recién lo hacen en la fase S tardía. 
Si uno amplia los orígenes de replicación y ve las secuencias de DNA, vamos a ver muchas secuencias A-T fáciles de desenrollar (en común con procarionte). Va a tener un sitio de unión para proteínas ORC (en lugar de proteína iniciadora, tenemos proteína ORC, un complejo de reconocimiento del origen). Además, hay otro sitio de unión a proteínas auxiliares. Muy similar al de la procarionte, pero ahora es más específico. 
Durante la fase G1, cada uno de los cromosomas tiene múltiples orígenes de replicación. La proteína ORC va a interaccionar con la secuencia que le corresponde, va a tener un cambio conformacional que le permite interaccionar con proteínas accesorias, llama a la helicasa. Todo esto es PREVIO a la replicación; complejo pre-replicativo. Ocurre por interacción de la ORC con proteínas accesorias y la helicasa.
Cuando la célula abandona la etapa G1, hay actividad de enzimas quinasas: las dependientes de ciclinas, lo que hacen es fosforilar a las proteínas accesorias. Modifico la actividad por fosforilación. Lo que hace es modificar no sólo a esas proteínas, sino también a las ORC. Ese cambio es el que activa a las helicasas para iniciar la burbuja de replicación.
 Durante la fase S, G2 y M, ese complejo permanece fosforilado. Por lo tanto, hay actividad de quinasas dependientes de ciclinas que mantienen fosforilado, lo que no permite que se vuelva a iniciar el proceso de replicación. Mientras esté fosforilado, no se le pueden unir otras proteínas accesorias, como la helicasa, entonces no puede volver a iniciar el proceso. (la helicasa se une si no está fosforilado, cuando se fosforila la suelta y acciona). Sin complejos pre replicativos, no puedo tener más replicaciones. La procarionte regula por hemi metilación, el eucarionte por fosforilación. 
En las eucariontes, además, tenemos el empaquetamiento del DNA. No solo hay que abrirla, sino remodelar las histonas, la cromatina. Hay una distribución de histonas viejas y recién sintetizadas. Durante la fase S hay aumento en la transcripción del RNA mensajero de histonas, es decir hay síntesis de histonas, para poder enrollar el DNA nuevo. Se disminuye la degradación de histonas también. Hay un intercambio entre la histona nueva y la vieja con las hebras nuevas y viejas. Mecanismo aún no bien descripto. 
Además de los orígenes de replicación, están los telómeros. (otro problema propio de eucariontes). Son problemáticos porque están los extremos, y en la hebra rezagada no puedo poner el cebador en ese extremo. Si yo coloco un cebador, cada extremo de la hebra tiene que ser replicado, sino pierdo información. Es decir, en el extremo mismo no puedo poner un cebador, pero si lo pongo un poco más adelante pierdo nucleótidos, pierdo información genética. Las células eucariontes intentan evitar la perdida de información mediante telómeros, que son secuencias ricas en GGGTTA. Se encuentran en el extremo 3’. Para poder colocar el cebador en el extremo, existe una enzima telomerasa que elonga el extremo 3’ para que en la hebra rezagada se puedan colocar los cebadores y no se pierda información. 
Las telomerasas, esas enzimas que extienden al telómero, son proteínas donde se encuentra el sitio activo, pero también presentan RNA mensajero. No es una enzima proteica pura, sino una RNA-Proteína. Lo que tiene ese RNA es la capacidad de reconocer el extremo 3’, ubicarlo en su sitio activo y vamos a ver actividad como enzima de retrotranscribir: transcribo de DNA a RNA, retro transcribo de RNA a DNA. Ese RNA de la enzima tiene las secuencias complementarias para extender las secuencias del DNA de la célula eucarionte. Es una enzima retrotransciptasa telomerasa. Esto permite que yo pueda poner el cebador y replicar, poner el extremo que de otra forma no podría haber copiado porque no tenía el cebador. La actividad de telomerasa disminuye a medida que envejecemos y también se muta en algunos tumores. 
MECANISMOS DE CORRECCIÓN DE ERRORES: 
Uno de los principales lo ejerce la DNA polimerasa. Tiene la capacidad de censar la alta afinidad del nucleótido correcto (si es el complementario al que tiene que incorporarse), comprueba la geometría de esa interacción y además realiza una corrección exonucleotídica.
La DNA polimerasa épsilon y delta tienen un dominio con actividad exonucleotídica. Es activo y funcional, la alfa también lo tiene, pero no es activoni funcional. La alfa no tiene corrección que hacer porque sólo ayuda a estacionar la polimerasa. 
Si el nucleótido no es el correcto, se desplaza a otro dominio, el exonucleotídico 🡪 rompe en los extremos, las puntas, los nucleótidos. Rompe el último nucleótido que se incorporó y no era el complementario. Ocurre cuando se incorporan tautómeros. El más común es la citosina: tiene una forma amino y una forma imino: esto en el espacio ocupo tridimensionalmente formas diferentes, la complementariedad no es la misma. Se reconoce el tautómero, se destruye la unión establecida y se vuelve a unir una citosina normal. 
Hay cierta inestabilidad en el DNA debido a mutaciones puntuales. La célula siempre intenta reparar esas mutaciones. 
La citosina está metilada, eso hace que hay una desaminación, lo que genera que se convierta en timina. Cuando se duplique, voy a tener una molécula de DNA silvestre sin mutaciones y otra mutante. A veces estas mutaciones son silenciosas, no afectan en nada. Otras veces sí. 
Otra posibilidad es el daño oxidativo de bases, ataque hidrolítico o metilación incontrolada. También ocurre depuración instantánea: se pierde en la guanina la base o en la citosina si de-amina. La luz violeta por ejemplo forma dímeros de timina. 
Todos los mecanismos son:
· Escisión de bases 🡪 apareamiento incorrecto T-C y bases dañadas. El apareamiento genera que la estructura de la hebra de DNA no sea la correcta, esto es reconocido por glucosidasas específica. Proyecta a la Timina hacia el exterior, para que una endonucleasa (corta nucleótidos dentro de la molécula de DNA) y la DNA polimerasa beta repara (forma enalces fosfodiéster, se especializa en reconocer las rupturas producidas por reparación de bases). Este proceso ocurre ANTES de la replicación. El dominio exonucleotídico de la polimerasa no logro reconocer esta mutación y lo hace ahora. 
· Escisión por apareamientos incorrectos 🡪 no solo es que se cambió uno de los nucleótidos, sino un conjunto. De este mecanismo no se sabe muy bien como se sabe cuál de las hebras es la que está incorrecta. Ocurre después de la replicación, una helicasa abre, una endonucleasa corta y la DNA 
polimerasa delta repara el daño. Sin una ligasa no puede entrar la endonucleasa para romper ni la DNA polimerasa delta para poder reconstruir. En este caso hay un varias bases, en el anterior una sola. 
· Escisión de nucleótidos 🡪 reparar aductos químicos. Ocurre con dímeros. Se reconoce, se proyecta porque genera una torsión en la molécula. Una proteína reconoce esa tensión y lo que hace es que un factor de la transcripción ayuda a la replicación (no se sabe por qué). Obtiene actividad de helicasa y permite que se unan las RPA (proteínas de unión a cadena simple, similares). La endonucleasa corta, la DNA polimerasa une. El mecanismo siempre es el mismo, lo que varía es la proteína de reconocimiento.
· Recombinación homóloga 🡪 rotura de DNA de doble cadena. Mecanismo que permite la variabilidad genética pero también posibilita la reparación del DNA. ¿Por qué sabemos que ocurre esto? Ocurre aún en procariontes, donde no hay recombinación homóloga vinculada a meiosis. El mecanismo en sí es el mismo, la variación es que en la meiosis ocurre en lugares específicos del cromosoma, con enzimas muy estrictas. En la reparación, las polimerasas son menos estrictas. La horquilla de replicación cuando llega esa ruptura se rompe; existen proteínas exonucleasas (porque se genera un extremo) que lo va a degradar (al extremo 5’) y vamos a ver que la hebra hija de la hebra complementaria va a invadir la cadena. Esto va a permitir que se repare la zona que no tenía codificación y entonces siga la cadena como corresponde. Esto ocurre en la proximidad de las dos moléculas de DNA, es decir en el heteroduplex entre la doble hélice y la hebra simple que está invadiendo. Para que ocurra esto necesito de proteínas que las coloquen muy próximas unas de otras, sino no ocurre la invasión y bifurcación. En la E. Coli se llama RecA, en humanos es la RAD 51. Permiten que la parte que no estaba sintetizándose por estar rota, por el proceso de invasión y bifurcación, pueda seguir avanzando en su síntesis. 
· Unión de extremos no homólogos 🡪 rotura de DNA de doble cadena. Uno los dos extremos (endonucleasa rompe, ligasa liga), pero pierdo la información de ese nucleótido. (mecanismo de pérdida de nucleótido sucio).
Muchos tumores se basan en alteraciones en estos mecanismos de reparación. Uno de ellos es el marcador tumoral, el BRCA, una proteína que participa reconociendo los extremos rotos de la doble hélice. En estos tumores la reparación del DNA por recombinación homóloga no se puede llevar adelante, no ocurre la invasión y bifurcación. Si se acumula, da lugar a mayor posibilidad de tumores. Cuando una célula acumula muchos errores, entra en apoptosis. 
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