Biologia de los microorganismos (507)

Vista previa del material en texto

336 G E N Ó M I C A , G E N É T I C A Y V I R O L O G Í A
En este capítulo estudiaremos las técnicas básicas de la inge-
niería genética, en concreto las que se usan para clonar genes, 
modificar genes y expresarlos eficazmente en organismos hos-
pedadores. Realizar experimentos de genética in vivo (en orga-
nismos vivos) tiene muchas limitaciones que se pueden superar 
manipulando el DNA in vitro (en un tubo de ensayo). Estas téc-
nicas moleculares son la base de la biotecnología. Hacia el final 
de este capítulo brindaremos algunos ejemplos de cómo pueden 
usarse los organismos modificados genéticamente pueden para 
aplicaciones en la industria, la medicina y la agricultura.
I Métodos de manipulación del DNA
La ingeniería genética se refiere al uso de técnicas in vitropara modificar genes en el laboratorio. Estos genes modifi-
cados pueden reinsertarse después en el organismo original o 
en algún otro organismo hospedador. Para la ingeniería gené-
tica es necesario poder aislar el DNA en fragmentos específicos 
y purificar dichos fragmentos para su manipulación posterior. 
Empezaremos considerando las herramientas básicas de inge-
niería genética, que comprenden las enzimas de restricción, la 
separación de ácidos nucleicos por electroforesis, la hibrida-
ción de ácidos nucleicos, amplificación del DNA y la clonación 
molecular. 
11.1 Enzimas de restricción 
y separación de los ácidos 
nucleicos
Todas las células contienen enzimas que pueden modificar la 
composición química del DNA. Una de las clases principales de 
estas enzimas la constituyen las endonucleasas de restricción, o 
enzimas de restricción. Dichas enzimas reconocen secuencias 
de bases específicas en el DNA (secuencias de reconocimiento) 
y escinden el enlace fosfodiéster, ocasionando un corte en la 
cadena doble. Aunque están muy extendidas tanto en Bacte-
ria como en Archaea, son muy raras en los eucariotas. Induda-
blemente, las enzimas de restricción protegen a los procariotas 
del DNA anómalo foráneo, como los genomas víricos. No obs-
tante, las enzimas de restricción se usan también para la mani-
pulación in vitro del DNA y son una herramienta fundamental 
de la ingeniería genética.
Mecanismo de acción de las enzimas de restricción
Las endonucleasas de restricción se dividen en tres clases prin-
cipales. Las enzimas de restricción de tipo I y III se unen al DNA 
en sus secuencias de reconocimiento pero lo cortan a alguna 
distancia de aquellas. En cambio, las enzimas de restricción de 
tipo II cortan el DNA en el interior de las secuencias de reco-
nocimiento, lo que hace que este grupo de enzimas sea mucho 
más útil para la manipulación específica del DNA. 
La mayoría de las secuencias de DNA reconocidas por las 
enzimas de restricción de tipo II son repeticiones invertidas cor-
tas de entre 4 y 8 pares de bases. En la Figura 11.1 se muestran dos 
secuencias de 6 pares de bases a las que dos enzimas de restric-
ción de tipo II de Escherichia coli diferentes reconocen y cor-
tan. Los sitios de corte están indicados por flechas. Obsérvese 
que las dos cadenas de la secuencia de reconocimiento tienen la 
misma secuencia si se leen en sentido opuesto (es decir, si ambas 
se leen en sentido 5′ S 3′). Estas secuencias de repeticiones 
invertidas se llaman palíndromos. La actividad endonucleasa de 
EcoRI (el acrónimo viene de Escherichia coli, cepa RY13, enzima 
de restricción I) hace cortes escalonados, que dejan cadenas 
sencillas cortas con unos extremos sobresalientes, que se cono-
cen como extremos cohesivos o «que se pueden pegar», en los 
dos fragmentos. Otras enzimas de restricción como EcoRV rea-
lizan los cortes en ambas cadenas del DNA directamente uno 
enfrente del otro, generando extremos romos (Figura 11.1a). 
Como se detalla a continuación, estos fragmentos con extremos 
cohesivos son ventajosos para la clonación molecular del DNA 
(véase Figura 11.7). 
Consideremos una vez más las enzimas EcoRI y EcoRV, que 
reconocen una secuencia específica de 6 bp (Figura  11.1). 
Cualquier secuencia específica de 6 bases debería aparecer 
en una cadena de DNA aproximadamente una vez cada 4.096 
nucleótidos de promedio (4.096 = 46; hay 4 posibles bases en 
cada una de las 6 posiciones), suponiendo que las cuatro bases 
Figura 11.1 Restricción y modificación del DNA. (a) (Panel superior)
Secuencias de DNA reconocidas por las endonucleasas de restricción EcoRI 
y EcoRV. Las flechas rojas indican los enlaces que corta la enzima. La línea 
discontinua indica el eje de simetría de la secuencia. (Panel inferior) Aspecto 
del DNA cortado por las enzimas de restricción. Obsérvense los extremos 
«cohesivos» monocatenarios generados por EcoRI y los extremos «romos» 
generados por EcoRV. (b) Las mismas secuencias tras ser modificadas por la 
metilasa correspondiente. Se muestran los grupos metilo añadidos por estas 
enzimas, que protegen el sitio de restricción del corte por EcoRI y EcoRV.
 C T T A A G 
 G A T A T C 
 C T A T A G 
 G A A T T C G A T A T C 
 C T A T A G 
5′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
3′ 5′
3′
C G
G C
CH3
CH3
5′
3′ 5′
3′
CH3
CH3
(a)
(b)
Extremos «cohesivos»
monocatenarios
EcoRI
5′
5′
3′ 5′
3′
3′ 5′
3′
Extremos «romos»
bicatenarios
EcoRV
EcoRI EcoRV
G AT
C TA
AT C
TA G
 A A T T 
 T T A A 
 G A A T T C 
 C T T A A G 
https://booksmedicos.org
	booksmedicos.org
	Botón1: