Biologia de los microorganismos (509)

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I N G E N I E R Í A G E N É T I C A Y B I O T E C N O L O G Í A 337
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una de las dos cadenas esté modificada, la secuencia de reco-
nocimiento deja de ser sustrato para la enzima de restricción 
correspondiente.
Electroforesis en gel: separación de las moléculas 
de DNA
Para la manipulación de ácidos nucleicos in vitro a menudo es 
necesario separar estas moléculas según su tamaño. Por ejem-
plo, muchas enzimas de restricción cortan las moléculas de 
DNA en segmentos que varían en longitud desde varios cientos 
hasta varios miles de pares de bases. Una vez cortado el DNA, 
los fragmentos generados pueden separarse entre sí por elec-
troforesis en gel y analizarse. La electroforesis en gel se usa 
también para verificar que la amplificación de un ácido nucleico 
se ha realizado correctamente (Sección 11.3).
La electroforesis es una técnica que separa las moléculas 
cargadas que migran en un campo eléctrico. La velocidad de 
migración está determinada por la carga de la molécula y por 
su tamaño y su forma. En la electroforesis en gel (Figura 11.2a) 
las moléculas se separan en un gel poroso. Los geles de agarosa, 
un polisacárido, se utilizan para separar fragmentos de DNA. 
Cuando se aplica una corriente eléctrica, los ácidos nucleicos 
se mueven por el gel hacia el electrodo positivo a causa de sus 
grupos fosfato cargados negativamente. La presencia de la malla 
que forma el gel dificulta el progreso del DNA, y las moléculas 
pequeñas o compactas migran más rápidamente que las gran-
des. Cuanto mayor es la concentración de agarosa en el gel, 
mayor será la resistencia que encuentren las moléculas grandes 
para desplazarse. Por tanto, geles con diferentes concentracio-
nes de agarosa se emplean para separar moléculas con diferen-
tes rangos de tamaños.
Transcurrido el tiempo suficiente para separar las moléculas 
de DNA, el gel se puede teñir con un compuesto que se una al 
DNA, como el bromuro de etidio, y el DNA emitirá fluorescen-
cia bajo la radiación ultravioleta (Figura 11.2b). Para estimar el 
tamaño del DNA de interés, su migración puede compararse 
con una muestra control consistente en fragmentos de DNA de 
tamaños conocidos, llamado el DNA marcador. Después de la 
electroforesis, los fragmentos de DNA se pueden purificar del 
gel y utilizarse con objetivos variados.
MINIRREVISIÓN
 ¿Por qué son útiles las enzimas de restricción para la biología 
molecular?
 ¿Cuál es la base de la separación de moléculas por 
electroforesis?
11.2 Hibridación de ácidos nucleicos
Cuando el DNA se desnaturaliza (es decir, que las dos cade-
nas se separan), las cadenas sencillas pueden formar moléculas 
bicatenarias con otras moléculas de DNA (o RNA) monocate-
narias, mediante el apareamiento complementario (o casi com-
plementario) de sus bases (   Sección  4.2). Este fenómeno 
recibe el nombre de hibridación de los ácidos nucleicos, o hibri-
dación, para abreviar, y es muy utilizado para detectar, caracte-
rizar e identificar segmentos de DNA y RNA. 
puedan aparecer en una posición a determinada con la misma 
frecuencia y que la proporción de G+C en el DNA sea del 
50 %. Por tanto, en una molécula larga de DNA debería haber 
varios sitios de corte de EcoRI y EcoRV. Se conocen varios 
miles de enzimas de restricción con especificidades diferentes, 
muchas de las cuales están disponibles comercialmente. En la 
Tabla 11.1 se indican algunas de estas enzimas y sus secuencias 
de reconocimiento. 
Modificación: protección frente a la restricción
La función natural de las enzimas de restricción en la célula es, 
probablemente, proteger a la célula de la invasión de DNA forá-
neo, especialmente DNA vírico. Si un DNA foráneo entra en 
la célula, las enzimas de restricción lo destruirán (Sección 8.6). 
Sin embargo, una célula debe proteger su propio DNA de la 
destrucción inadvertida por sus propias enzimas de restricción. 
Esta protección se obtiene gracias a las enzimas de modifi-
cación. Cada enzima de restricción está acompañada por la 
enzima de modificación correspondiente, con la que tiene en 
común la misma secuencia de reconocimiento. Estas enzimas 
modifican químicamente nucleótidos específicos en las secuen-
cias de reconocimiento de la restricción, en el DNA de la propia 
célula. Las secuencias modificadas ya no pueden ser cortadas 
por las propias enzimas de restricción. Normalmente, la modi-
ficación consiste en la metilación de bases específicas dentro 
de la secuencia de reconocimiento, lo que impide que la endo-
nucleasa de restricción se una a ella. Por ejemplo, las secuen-
cias reconocidas por las enzimas de restricción EcoRI y EcoRV 
(Figura 11.1a) se pueden modificar por metilación de las dos 
adeninas más interiores (Figura 11.1b). Las enzimas que llevan 
a cabo esta modificación son llamadas metilasas. Solo con que 
Tabla 11.1 Secuencias de reconocimiento de algunas 
endonucleasas de restricción
Organismo 
Nombre 
de la enzimaa
Secuencia 
de reconocimientob
Bacillus globigii BglII ATGATCT
Brevibacterium albidum BalI TGGTC*CA
Escherichia coli EcoRI GTAA*TTCc
Escherichia coli EcoRV GATTA*TCc
Haemophilus haemolyticus HhaI GC*GTC
Haemophilus influenzae HindIII ATAGCTT
Klebsiella pneumoniae KpnI GGTACTC
Nocardia otitidiscaviarum NotI GCTGGC*CGC
Proteus vulgaris PvuI CGATTCG
Serratia marcescens SmaI CCCTGGG
Thermus aquaticus TaqI TTCGA*
aNomenclatura: La primera letra de la abreviatura de tres letras de una 
endonucleasa de restricción designa el género del que procede la enzima; 
las siguientes dos letras, la especie. El número romano indica el orden de 
descubrimiento de la enzima en ese organismo concreto, y cualquier otra letra 
adicional es una designación de la cepa.
bLas flechas indican el sitio de ataque enzimático. Los asteriscos indican el sitio 
de metilación (modificación) G, guanina; C, citosina; A, adenina; T, timina. Solo 
se muestra la secuencia 5′ S 3′.
cVéase la Figura 11.1a.
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