Biologia de los microorganismos (517)

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I N G E N I E R Í A G E N É T I C A Y B I O T E C N O L O G Í A 341
U
N
ID
A
D
 2
transcriptasa inversa utiliza, para iniciar la síntesis, un ceba-
dor complementario en el extremo 3′ del transcrito diana. Si 
el molde es un mRNA eucariótico, se utiliza un cebador com-
plementario con la cola de poli(A) (  Sección 4.9) del mRNA. 
La actividad de la transcriptasa inversa ocasiona una molécula 
de ácido nucleico híbrida formada por DNA y RNA. La RNa-
saH, una ribonucleasa específica para esta molécula híbrida, 
hidroliza el RNA, dejando el cDNA como molde para una PCR 
estándar que utiliza un cebador adicional complementario con 
el extremo 5′. Este procedimiento puede modificarse si se des-
conoce la secuencia del extremo 5′ del mRNA.
MINIRREVISIÓN
 ¿Por qué es necesario un cebador en cada extremo del 
segmento de DNA que se amplifica por PCR?
 ¿De qué organismos se obtienen las DNA-polimerasas 
termoestables?
 ¿En qué se diferencia la RT-PCR de la PCR estándar?
11.4 Fundamentos de clonación 
molecular
En la clonación molecular se aísla y se replica un fragmento 
de DNA. La estrategia básica de la clonación molecular es ais-
lar el gen que se desea (u otro segmento de DNA) de su ubi-
cación original y desplazarlo a un elemento genético sencillo, 
pequeño y manipulable, como un plásmido o un virus, que 
recibe el nombre de vector (Figura 11.7). La clonación molecu-
lar ocasiona un DNA recombinante, que es una molécula de 
para amplificar y analizar DNA de mezclas celulares también 
ha hecho de ella una técnica habitual en la microbiología diag-
nóstica (  Sección 27.10). También se ha utilizado en cien-
cias forenses para identificar personas a partir de muestras muy 
pequeñas de su DNA.
Se han desarrollado variaciones de la técnica estándar de 
PCR según los objetivos moleculares. La PCR con transcrip-
ción inversa (RT-PCR) puede emplearse para sintetizar DNA 
a partir de un mRNA molde (Figura 11.6). Este procedimiento se 
puede utilizar para detectar si un gen se expresa o para produ-
cir genes eucarióticos libres de intrones para su expresión en 
bacterias, como describiremos en la Sección 11.11 para las hor-
monas insulina y somatotropina. La RT-PCR utiliza la enzima 
retrovírica transcriptasa inversa para convertir RNA en su DNA 
complementario (cDNA) (  Sección 9.11). También se puede 
utilizar un procedimiento conocido como PCR cuantitativa 
(qPCR) para cuantificar la cantidad inicial de DNA o RNA pro-
blema en una muestra. Esta técnica utiliza sondas marcadas 
con fluorescencia para monitorizar el proceso de amplificación 
(  Figuras 27.18 y 27.19).
La Figura 11.6 muestra cómo la transcriptasa inversa sinte-
tiza una cadena sencilla de cDNA a partir de un molde de RNA. 
Cuando sintetiza DNA usando RNA como molde, la enzima 
Figura 11.6 PCR con transcriptasa inversa. Etapas de la síntesis de
cDNA a partir de mRNA eucariótico. La transcriptasa inversa sintetiza una 
molécula híbrida que contiene RNA y DNA usando el mRNA como molde y un 
cebador oligo(T) como sustrato. Posteriormente, la enzima RNasa H hidroliza 
la fracción de RNA de la molécula híbrida produciendo una molécula de 
DNA monocatenario complementario (cDNA). Después de añadir un cebador 
complementario al extremo 5′ del cDNA, la Taq polimerasa produce un cDNA 
bicatenario.
 T T T T T 
Híbrido
RNA:DNA 
cDNA de
cadena
sencilla
5′
3′
3′
mRNA 5′ 3′
5′
5′
cDNA
bicatenario
5′
3′
3′
5′
3′ 5′
mRNA 5′ 3′ A A A A An 
1. Adición del
cebador y la
transcriptasa
inversa
Transcripción
inversa para
formar un cDNA
monocatenario
2.
4. Adición de cebador
específico al extremo
5′ más Taq polimerasa
3. Adición
de RNasa H
Oligo dT
como
cebador
Cola
de poli(A)
RNA
degradado 
 Cebador 5′
 A A A A An 
 A A A A A 
 T T T T T 
 T T T T T 
 T T T T T 
 A A A A An 
Figura 11.7 Etapas principales de la clonación génica. El vector puede
ser un plásmido o un genoma vírico. Cortando el DNA foráneo y el DNA del 
vector con la misma enzima de restricción, se generan extremos cohesivos 
complementarios que permiten la inserción del DNA foráneo en el vector.
DNA foráneo
Extremos
cohesivos
Vector
DNA
clonado
4. Introducción del vector
recombinante en un hospedador
1. Corte del DNA con
enzimas de restricción 
2. Se añade un vector
cortado con la misma
enzima de restricción
3. Se añade DNA-ligasa
para formar moléculas
recombinantes
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