Biologia de los microorganismos (519)

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342 G E N Ó M I C A , G E N É T I C A Y V I R O L O G Í A
3. Introducción del DNA clonado en un organismo hos-
pedador. Las moléculas de DNA recombinante obteni-
das in vitro se introducen en organismos hospedadores
adecuados donde se puedan replicar. La transforma-
ción (  Sección 10.6) se usa a menudo para introdu-
cir el DNA recombinante en las células. En la práctica,
a menudo esto produce una mezcla de variantes recom-
binantes. Algunas células contienen el gen de interés
clonado, mientras otras células contienen otros genes clo-
nados del mismo DNA original. Esta mezcla se conoce
con el nombre de biblioteca genómica, porque se pue-
den purificar muchos clones diferentes a partir de la mez-
cla, cada uno de ellos con segmentos de DNA diferentes
clonados del organismo original. La elaboración de una
biblioteca genómica por clonación de fragmentos al azar
de un genoma se llama clonación al azar y es muy utili-
zada en los análisis genómicos como veremos en la Sec-
ción 11.15 para la minería de genomas.
Cómo encontrar el clon correcto
La ingeniería genética usualmente comienza clonando un gen 
de interés. Pero primero es necesario identificar la colonia hos-
pedadora que contiene el clon correcto. Se pueden aislar célu-
las hospedadoras que contengan un plásmido vector mediante 
la selección de un marcador del vector, como la resistencia a 
antibióticos, de forma que solo estas células formen colonias. 
Cuando se emplea un vector vírico, simplemente hay que bus-
car calvas en el cultivo (  Sección 8.4). Estas colonias o calvas 
también se pueden analizar para detectar vectores recombinan-
tes buscando la inactivación de un gen del vector debido a la 
inserción del DNA foráneo (Sección 11.7). Cuando se clona un 
solo fragmento de DNA generado por PCR o purificado por 
cualquier otro método, normalmente es suficiente con estas 
selecciones o rastreos sencillos.
Una biblioteca genómica puede contener miles o decenas 
de miles de clones, y con frecuencia solo uno o unos pocos 
tienen el gen de interés. Por tanto, la identificación de las 
células que contienen el DNA clonado es solo el primer paso. 
El mayor desaf ío sigue siendo encontrar el clon que contiene 
el gen de interés. Se deben examinar las colonias de bacterias 
o las calvas de las células infectadas por el virus que crecen
en placas de agar y detectar esas pocas que contienen el gen
de interés. Esto se puede hacer por secuenciación del DNA o
por análisis de restricción de los plásmidos extraídos de un
gran número de colonias. Otro enfoque es usar la hibrida-
ción como se describió en la Sección 11.2 y como se muestra
en la Figura 11.8a.
Detección de genes foráneos expresados 
en el hospedador de clonación 
Si el gen foráneo se expresa en el hospedador de clonación, se 
puede realizar un cribado para encontrar la proteína que codi-
fica. Para que esto funcione el hospedador no debe producir 
por sí mismo la proteína de estudio. La selección de células que 
contienen genes clonados es relativamente sencilla, siempre que 
el producto de la expresión de estos genes sea fácil de detectar.
Los anticuerpos se pueden utilizar para detectar una proteína 
de interés. Los anticuerpos son proteínas del sistema inmunita-
rio que se unen de forma muy específica a una molécula diana, 
DNA que contiene DNA de dos o más procedencias. Cuando el 
vector recombinante se replica, el DNA clonado que contiene 
se replica también. Una vez clonado, el gen de interés puede ser 
manipulado de varios modos e incluso ser insertado de nuevo 
en una célula viva. Este método proporciona la base para gran 
parte de la ingeniería genética, y ha facilitado en gran medida el 
análisis detallado de los genomas. 
El objetivo principal de la clonación génica es aislar copias 
de genes específicos en forma pura. Analicemos la natura-
leza del problema. Para un organismo genéticamente «senci-
llo» como Escherichia coli, un gen medio es codificado por 
1-2 kbp de DNA de un genoma de cerca de 4.600 kbp. Así,
un gen de E. coli ocupa menos del 0,05 % del DNA total de la
célula. En el DNA humano, el problema es aún más compli-
cado, porque las regiones codificantes de los genes norma-
les no son mucho mayores que en E. coli, pero normalmente
los genes están escindidos en fragmentos y el genoma es casi
1.000 veces mayor. No obstante, nuestro conocimiento de la
química del DNA y de la enzimología nos permite cortar, unir
y replicar moléculas de DNA in vitro. Las enzimas de restric-
ción, la DNA-ligasa, la reacción en cadena de la polimerasa, y
el DNA sintético son herramientas fundamentales para la clo-
nación molecular.
Resumen de la etapas de la clonación génica
La lista siguiente resume la secuencia de fases en la clonación 
de genes:
1. Aislamiento y fragmentación del DNA de origen.
El DNA de origen puede ser el DNA genómico total
de un organismo de interés, DNA sintetizado a partir
de un molde de RNA por la transcriptasa inversa (Sec-
ción 11.3), uno o más genes amplificados por la reacción
en cadena de la polimerasa (Sección 11.3) o incluso DNA 
sintetizado completamente in vitro en el laboratorio
(Sección 11.5). Si el DNA original es genómico, primero
se corta con enzimas de restricción (Sección 11.1) para
obtener una mezcla de fragmentos de tamaño maneja-
ble (Figura 11.7).
2. Inserción del fragmento de DNA en un vector de clo-
nación. Los vectores de clonación son elementos genéti-
cos pequeños que se replican independientemente y que
se pueden utilizar para transportar y replicar segmentos
clonados de DNA. La mayoría de los vectores son plás-
midos o virus diseñados normalmente para permitir la
inserción in vitro de DNA foráneo en un sitio de res-
tricción que corta al vector sin afectar a su replicación
(Figura 11.7). Si el DNA original y el vector se cortan con
la misma enzima de restricción que produce extremos
cohesivos, la unión de las dos moléculas está muy favo-
recida por el apareamiento de dichos extremos cohesivos 
complementarios. Los extremos romos generados por
algunas enzimas de restricción se pueden unir por liga-
ción directa o usando ligadores (en inglés linkers) o adap-
tadores sintéticos de DNA. En cualquier caso, las cadenas 
se unen por la DNA ligasa, una enzima que une covalen-
temente ambas cadenas del vector y el DNA insertado.
Si el DNA original es un producto de una PCR, la DNA
ligasa se utiliza para unir el DNA amplificado a vectores
especializados (ver Figura 11.15).
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