Biologia de los microorganismos (523)

Vista previa del material en texto

344 G E N Ó M I C A , G E N É T I C A Y V I R O L O G Í A
la PCR. El cebador mutágeno se diseña para aparearse con la 
diana con el error de apareamiento en medio, y debe tener sufi-
cientes nucleótidos apareados en ambos lados del sitio de error 
para que se mantenga estable durante la PCR. El cebador mutá-
geno es apareado luego con un cebador normal. Cuando la PCR 
amplifica el DNA diana, incorpora la mutación (o mutaciones) 
en el producto final amplificado.
Aplicaciones de la mutagénesis dirigida
La mutagénesis dirigida se puede utilizar para estudiar la acti-
vidad de las proteínas que contienen sustituciones conoci-
das de aminoácidos. Supongamos que estudiásemos el centro 
activo de una enzima. La mutagénesis dirigida podría usarse 
para cambiar un aminoácido específico de la enzima, y después 
podríamos ensayar la actividad de la enzima modificada y com-
pararla con la de tipo salvaje. En este experimento, el vector 
que codifica la enzima mutante se inserta en una cepa hospeda-
dora mutante incapaz de sintetizar la enzima original. Por con-
siguiente, la actividad que medida será debida únicamente a la 
versión mutante de la enzima.
Gracias a la mutagénesis dirigida, los enzimólogos pueden 
relacionar con la secuencia de aminoácidos específicos de la 
proteína prácticamente cualquier aspecto de la actividad de una 
enzima, como la catálisis, la resistencia o la sensibilidad a agen-
tes químicos o f ísicos, o las interacciones con otras proteínas. 
En concreto, en un ejemplo de la ingeniería genética, la muta-
génesis dirigida ha permitido modificar la afinidad del sitio de 
unión al receptor de la hormona de crecimiento bovino soma-
totropina, de tal modo que esta estimule el crecimiento y no la 
producción de leche en los humanos (Sección 11.12).
Mutagénesis por inserción de un casete 
e interrupción génica
Para hacer cambios en el DNA mayores que unos pocos pares 
de bases o para reemplazar fragmentos de un gen de interés, 
se pueden usar fragmentos sintéticos llamados casetes de
DNA (o cartuchos) para mutar el DNA en un proceso cono-
cido como mutagénesis por inserción de casete. Estos case-
tes, que se pueden sintetizar mediante la reacción en cadena de 
la polimerasa o por síntesis directa del DNA, podrán reempla-
zar fragmentos en el DNA de interés usando sitios de restric-
ción. No obstante, si no hay sitios de restricción adecuados en 
la ubicación que interesa, se pueden insertar por mutagénesis 
sólido y se repite la serie de reacciones para añadir el nucleótido 
siguiente. Cuando el oligonucleótido tiene la longitud deseada, 
se separa del soporte en fase sólida mediante un reactivo espe-
cífico y se purifica para eliminar subproductos y contaminantes. 
Mutagénesis dirigida
La mutagénesis dirigida es una herramienta potente que per-
mite cambiar cualquier par de bases de un gen concreto, de 
modo que tiene muchas aplicaciones en genética. La mutagé-
nesis dirigida se emplea para cambiar las propiedades de una 
proteína como la actividad enzimática o la afinidad del sitio de 
unión (Sección 11.12). Para esto se modifica la secuencia génica 
de tal modo que provoque un cambio en la secuencia de ami-
noácidos. El procedimiento básico consiste en sintetizar un 
oligonucleótido corto de DNA que actúe como cebador y que 
contenga el cambio de par de bases (la mutación) deseado y per-
mitir que se aparee con el DNA monocatenario que contiene 
el gen diana. El apareamiento será total excepto en la pequeña 
región del error. Entonces, usando una DNA polimerasa, se 
extenderá el oligonucleótido sintético y se copiará el resto del 
gen. A continuación, la molécula bicatenaria obtenida se inserta 
en una célula hospedadora por transformación. A menudo, los 
mutantes se seleccionan mediante algún tipo de selección posi-
tiva, como la resistencia a antibióticos; en este caso, el DNA 
modificado también llevará un marcador de resistencia a anti-
bióticos.
En la Figura 11.9 se ilustra un método de mutagénesis dirigida. 
El proceso empieza con la clonación del gen diana en un vector 
plasmídico. Este vector bicatenario se desnaturaliza para pro-
ducir DNA monocatenario y el oligonucleótido mutado puede 
unirse a continuación mediante apareamiento de bases comple-
mentarias con el gen diana. Después de la extensión mediante 
una DNA polimerasa, la molécula de DNA tiene un error de 
apareamiento en una cadena. Después de la transformación 
en una célula hospedadora, de la replicación del DNA vector 
y de la división celular, las dos moléculas hijas estarán comple-
tamente apareadas, pero una de ellas llevará una mutación y la 
otra será de tipo salvaje. Entonces se hace un cribado de las bac-
terias de la nueva generación en busca de las portadoras de la 
mutación. 
La mutagénesis dirigida también puede llevarse a cabo 
mediante la PCR. En este caso, el oligonucleótido pequeño de 
DNA con la mutación de interés se utiliza como cebador en 
Figura 11.9 Mutagénesis dirigida usando DNA sintético. Se pueden utilizar pequeños oligonucleótidos sintéticos para generar mutaciones. Se clona el DNA
de origen en un plásmido y se desnaturaliza, lo que genera el DNA monocatenario necesario para la mutagénesis dirigida.
DNA de origen DNA plasmídico 
monocatenario
Apareamiento con 
los genes de origen
Clonación
y selección 
de mutantes
1. Clonación en
el plásmido y
desnaturalización
2. Adición de
oligonucleótido
sintético con error
en una base
3. Extensión de
cadena sencilla
con la DNA
polimerasa
4. Transformación
y selección
https://booksmedicos.org
	booksmedicos.org
	Botón1: