Biologia de los microorganismos (539)

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352 G E N Ó M I C A , G E N É T I C A Y V I R O L O G Í A
genómicas grandes como los operones o los genes eucarióticos, 
se han desarrollado vectores basados en bacteriófagos, cósmi-
dos o cromosomas artificiales. Aunque no los presentaremos en 
detalle aquí, los vectores derivados de los virus se emplean con 
frecuencia como vectores en eucariotas pluricelulares. En par-
ticular, los retrovirus pueden usarse para introducir genes en 
células de mamíferos porque estos virus se replican a través de 
una forma de DNA que se integra directamente en el cromo-
soma del hospedador (  Sección 9.11).
Clonación con el bacteriófago lambda
El bacteriófago lambda (  Sección 8.8) es un vector de clona-
ción útil porque se conoce bien su biología, puede contener más 
cantidad de DNA que la mayoría de los plásmidos, y su DNA 
puede empaquetarse eficazmente en partículas fágicas in vitro. 
También recordaremos que durante la fase lítica del ciclo bioló-
gico del fago, la célula hospedadora de Escherichia coli es repro-
gramada para replicar cantidades grandes de DNA de lambda 
(  Sección 10.7). 
El fago lambda tiene un gran número de genes, pero un ter-
cio de su genoma no es esencial para la infectividad y puede ser 
sustituido por DNA foráneo. Esto permite la clonación de frag-
mentos de DNA relativamente grandes, de hasta unos 20 kbp, 
que es el doble de la capacidad de clonación de los vectores 
plasmídicos pequeños normales. Para facilitar el uso de lambda 
como vector de clonación molecular, muchos de sus sitios para 
enzimas de restricción han sido modificados y se le ha añadido 
un sitio de clonación múltiple (MCS) que contiene el gen para 
la �-galactosidasa para seleccionar los vectores recombinantes.
La clonación con vectores lambda se muestra en la Fi- 
gura 10.20a. El proceso inicial es similar a la clonación del DNA 
en vectores plasmídicos en el sentido que se emplean enzimas 
de restricción y la DNA ligasa. Una vez que el DNA de interés 
ha sido insertado en el DNA de lambda, se empaqueta el vector 
añadiéndole extractos de células lisadas por lambda que conten-
gan las proteínas de cabeza y cola y permitiendo la formación de 
manera espontánea de viriones maduros del fago viables. Estos 
viriones pueden usarse para infectar células hospedadoras apro-
piadas, y esta infección es mucho más eficaz que la transforma-
ción. Entonces se aíslan los clones individuales seleccionando 
las calvas en una cepa de E. coli hospedadora. Se pueden selec-
cionar los fagos recombinantes detectando la interrupción del 
gen de la �-galactosidasa usando agar indicador de color (Sec-
ción 11.7). Las calvas que contengan un fago que no produce 
�-galactosidasa pueden ser detectadas rápidamente porque
carecen de color mientras que las calvas de fagos no recombi-
nantes serán azules (Figura 11.20b). Los métodos de hibrida-
ción de ácidos nucleicos (Sección 11.2) y la secuenciación del
DNA pueden usarse para determinar si un DNA recombinante
de lambda contiene la secuencia de DNA foráneo deseada.
Vectores cósmidos
Los vectores cósmidos utilizan genes lambda específicos y son 
empaquetados en viriones lambda. Los cósmidos son vectores 
plasmídicos que contienen el sitio cos del genoma de lambda, 
que genera extremos cohesivos cuando se corta (   Sec-
ción  8.8). El sitio cos es necesario para empaquetar el DNA 
en los viriones lambda. Los cósmidos se construyen a par-
tir de plásmidos ligando la región cos de lambda al DNA del 
RNA polimerasa de T7 transcribe solo los genes clonados por-
que únicamente reconoce los promotores de T7. Esta polime-
rasa es tan activa que utiliza la mayoría de los precursores del 
RNA, de forma que limita la transcripción de los genes clona-
dos. Por consiguiente, la mayoría de los genes del hospedador 
que necesitan la RNA polimerasa propia quedan sin transcribir 
y, por tanto, la célula deja de crecer. La traducción en estas célu-
las produce principalmente la proteína de interés. Por tanto, el 
sistema de control de T7 es muy eficaz para generar cantidades 
muy grandes de una proteína de interés concreta.
Traducción del gen clonado
Los vectores de expresión también deben diseñarse para ase-
gurar que el mRNA producido se traduzca de manera eficaz. 
Para sintetizar una proteína a partir de una molécula de mRNA, 
es fundamental que los ribosomas se unan al sitio correcto y 
empiecen a leer en el marco de lectura adecuado. En las bac-
terias, esto se consigue teniendo un sitio de unión al ribosoma 
(secuencia de Shine-Dalgarno,  Sección 4.11) y un codón 
de inicio cercano en el mRNA. Los sitios de unión al ribosoma 
bacteriano no se encuentran en los genes eucariotas y hay que 
introducirlos en el vector si se desea obtener altos niveles de 
expresión del gen eucariota. El vector de la Figura 11.18 con-
tiene uno de estos sitios. 
Para asegurar una traducción de alta eficacia puede ser nece-
sario realizar otros ajustes en el gen clonado. Por ejemplo, el uso 
codónico, que está relacionado con la concentración del tRNA 
adecuado en la célula, puede ser un obstáculo (  Sección 6.3 
y Tabla 6.3). Debido a que el código genético es redundante, 
existe más de un tRNA para la mayoría de los aminoácidos (
 Sección 4.11). Así, si un gen clonado tiene un patrón de uso 
codónico muy diferente al del hospedador de expresión, pro-
bablemente sea traducido de manera ineficaz en dicho hospe-
dador. La mutagénesis dirigida (Sección 11.5) se puede utilizar 
para cambiar codones seleccionados del gen, y hacerlos más afi-
nes al patrón de uso codónico del hospedador.
Por último, si el gen clonado contiene intrones, como tie-
nen normalmente los genes eucarióticos (  Sección 4.9), no 
se sintetizará el producto proteico correcto si el hospedador 
es un procariota. Este problema también puede solucionarse 
utilizando DNA sintético. No obstante, el método habitual 
para crear un gen sin intrones es obtener el mRNA (en el que 
los intrones ya han sido eliminados) y utilizar la transcrip-
tasa inversa para generar una copia de DNA complementario 
(cDNA) de este (véanse las Figuras 11.6 y 11.23).
MINIRREVISIÓN
 Describa los componentes necesarios para que un vector 
lanzadera sea eficaz.
 Describa algunos de los componentes de un vector de 
expresión que mejoren la expresión del gen clonado.
11.10 Otros vectores de clonación
Los vectores plasmídicos usados normalmente para la clona-
ción molecular están limitados en cuanto a la cantidad de DNA 
que puede ser insertado, siendo el máximo aproximadamente 
10 kbp. Para aplicaciones que necesitan la clonación de regiones 
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