BACILOS_GRAM_NEGATIVOS

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UNIVERSIDAD DE SANTANDER 
FACULTAD DE MEDICINA- V SEMESTRE 
 
Yiceth Katherine Acosta Triana 
Docente 
 
BACILOS GRAM NEGATIVOS: ASPECTOS PRÁCTICOS 
INTRODUCCIÓN 
Durante la práctica se le entregarán a los estudiantes distintas cepas de Bacilos Gram (-) para su identificación. 
El primer paso para la identificación de una especie bacteriana es el estudio de su morfología microscópica y 
macroscópica. Luego se deben estudiar sus requerimientos atmosféricos y nutricionales. Por último se 
procederá a la interpretación de pruebas bioquímicas que permitirán llegar a la identificación de género y 
especie bacteriana. 
Para el cultivo de los bacilos Gram negativos se utilizan diferentes tipos de medios: 
Medios simples: Son aquellos que contienen pocas sustancias nutritivas. Ejemplo: Agar nutriente. 
Medios complejos: Son aquellos a los cuales se les añade ingredientes de composición química no bien 
definida, como peptona, extracto de carne, extracto de levadura, líquidos orgánicos, que permiten el desarrollo 
de una gran variedad de microorganismos de la más amplia exigencia nutricional. Ej: Agar sangre. 
Medios diferenciales: Son aquellos a los que se les agrega un indicador de pH de distinta índole y los cuales 
contienen un azúcar degradable por la bacteria, el cual cambiará de color (viraje del indicador) cuando un 
grupo de organismos determinado se desarrolla en él utilizando ese carbohidrato. Ejemplo: Agar-lactosa-rojo-
fenol. 
Medios selectivos y diferenciales: Son medios a los que se les agrega Lactosa-rojo-fenol y otras sustancias 
tales como cristal violeta, que permite el crecimiento de bacilos Gram negativos e inhibe el desarrollo de los 
Gram positivos. Ejemplo: Agar MacConkey. (Consultar este medio) 
 
Diferenciamos tres grandes grupos de bacilos Gram (-): 
1. Enterobacteriaceae. 
2. Bacilos Gram (-) no fermentadores. 
3. Bacilos poco frecuentes. 
 
Enterobacteriaceae: Este grupo incluye los microorganismos más frecuentemente hallados en el laboratorio 
de Microbiología, todos los miembros de esta familia, salvos raras excepciones: 
✓ Metabolizan la glucosa mediante fermentación. 
✓ Carecen de actividad citocromo-oxidasa. 
✓ Reducen los nitratos a nitritos. 
✓ Pueden ser aerobios o anaerobios facultativos. 
La familia Enterobacteriaceae es un grupo heterogéneo y extenso de bacilos gramnegativos cuyo hábitat 
natural es el intestino del ser humano y de los animales. La familia comprende muchos géneros 
(Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus y otros más) 
 
BACILOS GRAM (-) NO FERMENTADORES: Engloba un grupo de bacterias aerobias, no esporuladas, 
incapaces de utilizar la glucosa (u otro Hidrato de Carbono) como fuente de energía o bien la degradan por la 
vía oxidativa principalmente. En este grupo se incluyen los géneros siguientes: Pseudomonas, Acinetobacter, 
Flavobacterium, Bordetella, Moraxella, Xanthomonas, Alcalígenas. 
 
BACILOS POCO FRECUENTES (BPF): Incluye un grupo amplio de especies bacterianas sin relación 
taxonómica, que rara vez se detectan en el laboratorio como agentes causales de enfermedad humana. Se 
incluyen las siguientes especies: Brucella, Pasteurella, Bordetella, Haemophilus, Vibrio (Cholera). 
Morfología microscópica y macroscópica: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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UNIVERSIDAD DE SANTANDER 
FACULTAD DE MEDICINA- V SEMESTRE 
 
Yiceth Katherine Acosta Triana 
Docente 
 
Con las cepas suminitradas en a practica completar el siguiente cuadro: 
 
Generalidades de pruebas bioquímicas: 
 
Prueba de la Oxidasa: 
 
Pone en evidencia la enzima indofenol-oxidasa, mediante la oxidación de un colorante previamente reducido 
que cambia de color en su presencia. Permite diferenciar entre bacilos Gram negativos no fermentadores, de 
aquellos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. 
Procedimiento: Se toma una porción de una colonia pura de 24 horas, se deposita sobre una tira de papel 
impregnada en el reactivo de oxidasa. 
Lectura: Reacción positiva: Aparición de un color rojo violáceo entre los 10 y 60 segundos 
Prueba O-F (oxido- fermentativa): Las bacterias que respiran aerobiamente crecen en la superficie del 
medio del tubo abierto. Transforman la glucosa en CO2, la superficie del medio se verá ligeramente amarilla 
(por la formación de ácido carbónico originado al reaccionar el CO2 con el agua del medio). En el tubo cerrado 
el cultivo se mantiene azul-verdoso. Las bacterias fermentadoras producen ácidos a partir de la glucosa. 
Viran el cultivo del tubo cerrado a amarillo; en el tubo abierto se inicia el viraje en el fondo, pero transcurridas 
24 horas los ácidos pueden difundir por todo el medio virándolo a amarillo. 
Fermentación de azucares: Se determina si la bacteria es capaz de fermentar un carbohidrato particular 
(producción de ácidos acompañados o no de gases). Se aplica a bacterias con metabolismo fermentador, 
ensayándose por separado diferentes carbohidratos. 
Prueba del citrato: Determina la capacidad de un germen de utilizar el citrato y sales inorgánicas de amonio 
como única fuente de Carbono y Nitrógeno. El desarrollo bacteriano provoca un viraje del indicador de pH 
(azul de bromotimol) del verde al azul. 
Lectura: Reacción positiva: Se observa un intenso color azul. Reacción negativa: no hay desarrollo ni cambio 
de color. 
 
Prueba de la ureasa: Determina la habilidad de un microorganismo de hidrolizar la urea formando dos 
moléculas de amoniáco por acción de la enzima ureasa. La alcalinización del medio por el Hidróxido de Amonio 
hace virar el indicador de pH (rojo fenol). Es un medio líquido, de color naranja pálido que se siembra con asa, 
y se incuba a 37ºC por 24 horas. 
Lectura: Reacción positiva: Cuando hay viraje del indicador al rosa intenso. Reacción negativa: El color 
permanece incambiado. 
 
Prueba de indol: Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de las bacterias para producir indol a 
partir del triptófano. 
Lectura: Prueba positiva: Anillo rojo en la superficie 
 Prueba negativa: No se aprecia cambio de color 
 
 
 CEPAN. 1: CEPAN. 2: CEPA N. 3: CEPA N. 4: CEPA N. 5: 
 
Morfología 
macroscópica: 
 
Morfología 
microscópica : 
 
Grupo al que 
pertenece : 
 
Medio de 
crecimiento: 
 
Fermentación: 
Oxidación: 
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Yiceth Katherine Acosta Triana 
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Prueba de Voges Proskauer: consiste en determinar la capacidad que tiene un microorganismo para producir 
el metabolito acetilmetil carbinol (acetoína) como producto intermediario derivado del metabolismo de la 
glucosa (fermentación butanodiólica). En presencia del oxígeno del aire y de álcali, la acetoina es oxidada a 
diacetilo, que generará un color al añadirle los reactivos del kit. 
Lectura: VP +: Coloración rojo-rosada en la superficie antes de 1 hora 
 
Prueba de reducción de Nitratos: Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo 
para reducir los nitratos a nitritos o gas nitrógeno libre, una característica que a menudo tiene valor diferencial 
Lectura: Para determinar si el nitrato ha sido reducido a nitrito, después de la incubación, añádale al medio 
de cultivo, 2 gotas de solución A, y luego 2 gotas de la solución B del reactivo de Griess y mezcle. La aparición 
de una coloración rosada o roja indica que los nitratos han sido reducidos a nitritos. 
 
Prueba de producción de Ácido Sulfhídrico: La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de 
una reacción de reducción que da un sulfito y un sulfato. El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, 
citrato férrico de amonio para producir un precipitado negro insoluble, sulfato ferroso. 
Lectura: Positivo: ennegrecimiento del medio 
 Negativo: Sin ennegrecimiento 
 
Prueba de Descarboxilacion de la Lisina: Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un 
microorganismo de producir una enzima que descarboxila el aminoácido lisina 
Lectura: Las enterobacterias, por fermentación de la glucosa producen ácido, el cual hace virar el indicador a 
color amarillo. Si la bacteria posee una lisina descarboxilasa, por la descarboxilación de la lisina se producirá 
una amina, la cual neutralizará el ácido producido por la fermentación de la glucosa retornando el medio a su 
color original violeta. 
 
En base a las generalidades de las pruebas bioquímicas y el panel de identificación suministrado, 
complete el siguiente cuadro: 
 
BIBLIOGRAFIA 
Esta debe ser citada y consultada por el grupo. 
Anexo: guía de interpretación colorimétrica de reacciones para Gram Negativos 
 
 
 
RESULTADO 
Citrato: 
Descarboxilacion de la Lisina: 
H2S: 
INDOL: 
O-F 
Fermentación azucares ( mencionarlas ) : 
Nitrato: 
Urea: 
VP: 
Posible microorganismo en estudio: 
Maria Isabel
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