Informe de laboratorio micobacterias

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LABORATORIO DE INFECTOLOGÍA
 
 
MYCOBACTERIAS: ASPECTOS PRACTICOS
 
INTEGRANTES:
MARÍA GABRIELA SIERRA DIAZ | 
MARIA ISABEL GUARDIAN VEGA | 
DIEGO ANGEL LOPEZ SAES | 
VALENTINA ESCOBAR SUAREZ | 
PAULA RUEDA | 
 
 
DOCENTE: YICETH ACOSTA
 
 
MEDICINA
 
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
SEDE VALLEDUPAR
2022
MATERIALES
· Escobillones.
· Mechero de Bunsen.
· Portaobjetos.
· Muestras clínicas de esputo (positivas para M. tuberculosis)
· Papel secante.
· Agua destilada.
· Microscopios. 
· Aceite de inmersión. 
· Tapabocas N95
· Carbol fucsina (fuscina de Neelsen)
· Azul de metileno
· Solución de alcohol-ácido. 
· Medio de cultivo Ogawa Kudoh.
INTRODUCTION
Las micobacterias son un grupo diverso de bacterias que incluyen varios patógenos notables, como Mycobacterium tuberculosis, el causante de la tuberculosis, y Mycobacterium leprae, responsable de la lepra. Estas bacterias presentan características únicas en su estructura celular, que les permiten sobrevivir y proliferar en entornos desafiantes. Debido a su naturaleza patógena y su impacto en la salud humana, el manejo seguro y preciso de muestras que contienen micobacterias en laboratorios es de suma importancia para prevenir la transmisión y realizar diagnósticos precisos.
En cuanto a la obtención de muestras, es importante tener en cuenta que estas pueden provenir de zonas naturalmente libres de microorganismos, áreas naturalmente contaminadas o incluso áreas originalmente estériles pero que se contaminan en el proceso de obtención. Algunos ejemplos de muestras contaminadas son la expectoración, orina, jugo gástrico y exudados, mientras que las no contaminadas podrían incluir el líquido cefalorraquídeo, líquido pleural y muestras de biopsias, entre otras. En el laboratorio, se aplican rigurosas normas de bioseguridad para el manejo de muestras clínicas que podrían contener micobacterias. Dado que la transmisión inhalatoria es una vía importante para la propagación de enfermedades causadas por estas bacterias, es esencial evitar la generación de partículas aerosolizadas durante la manipulación de muestras. Esto incluye trabajar en áreas bien ventiladas y siguiendo estrictas pautas de higiene, como no fumar, comer o aplicar cosméticos en el laboratorio. Tambien se recomienda utilizar tapabocas N95 y el procesamiento de muestras clínicas se realiza en cabina de bioseguridad. 
Para la identificación de micobacterias en muestras clínicas, una técnica vital es la tinción de Ziehl-Neelsen. Esta técnica de coloración diferencial permite detectar microorganismos que son resistentes a la decoloración con alcohol-ácido. Se basa en la propiedad única de las micobacterias de tener una pared celular que contiene lípidos y ácidos grasos de alto peso molecular, lo que las hace resistentes al proceso de decoloración. En la tinción de Ziehl-Neelsen, se utiliza la carbol fucsina para teñir las micobacterias, y luego se aplican soluciones decolorantes (alcohol-acido) y contra-colorantes (azul de metileno) para resaltar las bacterias en el fondo. Esto permite una identificación visual de microorganismos ácido-alcohol resistentes.
Además de la tinción, el cultivo de micobacterias es esencial para su identificación y caracterización, ya que permite diagnosticar como positivos casos negativos en el examen microscópico. Dos medios de cultivo ampliamente utilizados para el crecimiento de estas bacterias son el medio de cultivo Ogawa Kudoh y el medio de cultivo Lowenstein Jensen, debido a sus propiedades y características únicas que favorecen el crecimiento y la identificación de estas bacterias. El medio Ogawa Kudoh es especialmente adecuado para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas, mientras que el medio Lowenstein Jensen es versátil y permite el crecimiento de varias especies de micobacterias.
En conclusión, el manejo de muestras con micobacterias en laboratorios requiere estrictas precauciones de bioseguridad para prevenir la propagación de enfermedades. La tinción de Ziehl-Neelsen y los medios de cultivo Ogawa Kudoh y Lowenstein Jensen son herramientas esenciales para la detección y caracterización de estas bacterias, contribuyendo así a diagnósticos precisos y tratamientos eficaces.
 
PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO
3. Decolorante: Se aplico una solución de alcohol acido al 3% sobre el frotis durante 3 minutos. Luego se enjuago nuevamente con agua limpia. 
2. Colorante primario: Se cubrió el frotis con carbol fucsina al 0,3% y se calentó por 5 minutos hasta notar un desprendimiento de vapor (aproximadamente a 60 °C). Luego se lavó con agua a chorro (agua limpia: agua destilada, filtrada).
1. Frotis bacteriano: Se tenía un frotis bacteriano de un paciente con tuberculosis previamente preparado. Se tomo una muestra de uno de los integrantes del grupo de laboratorio (María Gabriela Sierra), se realizó u frotis en un portaobjetos limpio y seco y luego se secó a temperatura ambiente. 
Muestra de estudiante
Muestra de Px Tuberculosis
Coloración con Carbol Fuscina
Decoloración con alcohol acido.
4. Coloración de contraste: Luego se cubrió el frotis con azul de metileno al 0,3% durante un minuto. Después se lavo la mancha con agua limpia, se limpió la parte posterior del portaobjetos y se dejo secar al aire. Posteriormente se observó el frotis en el microscopio.
Coloración con azul de metileno. 
Siembra en medio de cultivo selectivo para micobacterias: 
Se tomo una muestra de uno de los integrantes del grupo (María Isabel Guardián V.) con un escobillón, se descontamino la flora en el hidróxido, es decir, se sumergió el escobillón dentro de la solución de hidróxido de sodio cerca del mechero por 2 minutos y se sembró en el medio de cultivo Ogawa Kudoh en forma de zic zac. Luego se cerró el tubo y se colocó el nombre del paciente y la fecha. Este medio es un medio selectivo, utilizado para el aislamiento y cultivo de micobacterias a excepción de M. leprae, permite la identificación de un mínimo de 10 BAAR si se realiza el procedimiento correctamente. 
Luego a las dos semanas se observó crecimiento de micobacterias. Se observaron unas colonias fotocromógenas de color amarillo limón, entre lisas y rugosas, con un centro liso, denso, rodeado de una zona más transparente. Debido al tiempo de crecimiento se descarta que sea M. tuberculosis ya que las colonias tardarían entre 6 y 8 semanas en crecer. Por lo tanto, se sospecha de una Micobacteria no tuberculosa como Micobacterium Kansasii, esta es una MNT de crecimiento lento porque tarda más de 7 días en crecer, y es fotocromogena como se observó en las características de las colonias. 
Descontaminación de la flora en hidróxido.
Siembra en Ogawa Kudoh
RESULTADOS 
	
	Descripción microscópica.
	Dibujo de lo observado
	Resultado
	Lamina 1
	No se observan bacilos acido alcohol resistentes. Solo se observan células epiteliales, leucocitos y el fondo teñidos de azul.
	
	Negativo: No se encuentran BAAR
	Lamina 2
	Se observan bacilos de color rojo fucsia, ligeramente curvados destacándose contra el fondo azul (Bacilos acido alcohol resistentes o BAAR)
	
	Positivo: Se encuentran BAAR
	
DISCUSIÓN
En la práctica del laboratorio se realizaron distintas pruebas para poder observar la morfología de las micobacterias, por lo que se usó un método de coloración distinto al Gram, llamado Ziehl-Neelsen. Esta tinción se utiliza para identificar microorganismos acido-alcohol resistente, utilizando un colorante principal como la fucsina, un decolorante como la solución de alcohol acido, y un colorante de contraste que es el azul de metileno. Las micobacterias contienen ácidos micólicos, confiriéndoles propiedades para resistir el alcohol acido, por esa razón es que tienen el nombre de ácido-alcohol resistentes.
Es decir, La técnica de tinción ZN se basa en las características particulares de las paredes celulares de las Micobacterias. Estas bacterias poseen lípidos y ácidos grasos de gran tamaño, llamados ácidos micólicos, en sus estructuras, lo que les confiere la capacidad de resistirla eliminación de colorante mediante alcohol-ácido después de haber sido teñidas con colorantes básicos y calentadas. Por esta razón, se las denomina bacterias ácido-resistentes o ácido-alcohol resistentes.
El proceso de tinción ZN implica aplicar carbol-fucsina a la muestra y calentarla ligeramente. Esto provoca la disolución de las ceras, lípidos y otros ácidos grasos presentes en la pared celular, permitiendo que el colorante penetre libremente. La carbol-fucsina tiene una afinidad significativa por los ácidos micólicos de la pared celular. Al enfriar la muestra con agua, los componentes de la pared se solidifican nuevamente, lo que evita que el alcohol-ácido erosione el colorante de la célula y la coloración de contraste solo tiñe el fondo y las células presentes en el frotis
Por esta razón los bacilos se observan de color rojo o fucsia en el microscopio óptico, en este caso se observaron en el frotis de la lamina 2 porque esta correspondía a una muestra de esputo de un paciente que presentaba la enfermedad de tuberculosis. 
BIBLIOGRAFIA
· Murray, P. R., Rosenthal, K., & Pfaller, M. A. (2021). Microbiología Médica (9a ed.). Elsevier.
· Sastry, Apurba Sankar, & K, S. B. (2018). Essentials of medical microbiology (2a ed.). Jaypee Brothers Medical.
· Alcaide, F., & Benítez, M. A. (s/f). ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS DE LA INFECCIÓN POR Mycobacterium kansasii. Seimc.org. Recuperado el 29 de agosto de 2023, de https://www.seimc.org/contenidos/ccs/revisionestematicas/micobacterias/mkanrev.pdf