alidavidcifuentesdianamaritzarojas 2005

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INMOVILIZACION DE LIPASA CANDIDA RUGOSA 
 EN SOPORTE DE QUITOSANO 
 
 
 
 
 
 
ALI DAVID CIFUENTES 
 
DIANA MARITZA ROJAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA 
SEDE MANIZALES 
FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA 
 INGENIERIA QUIMICA 
Manizales, Enero de 2005 
 
 
 
INMOVILIZACION DE LIPASA CANDIDA RUGOSA 
EN SOPORTE DE QUITOSANO 
 
 
ALI DAVID CIFUENTES 
Código 399514 
alidavidc@hotmail.com Cel: 311-3069377 
Linea de profundización en alimentos 
DIANA MARITZA ROJAS 
Código 399052 
dianam0729@latinmail.com Cel: 300-7791390 
Línea de profundización en alimentos 
 
 
Trabajo para optar el título de Ingeniero Químico 
MODALIDAD 
Participación en proyecto de investigación: 
Producción De Biodiesel A Partir De Aceite De Palma Y De Higuerilla Por Un 
Proceso De Reacción-Separación Por Enzimas Inmovilizadas. 
 
DIR ECTOR 
CARLOS EDUARDO ORREGO 
Ingeniero Químico, Esp en Tecnología de alimentos 
 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MANIZALES 
FACULTAD DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA 
 INGENIERÍA QUÍMICA 
Manizales, Enero de 2005 
 
 
 
 
 
Nota de aceptación 
________________________________ 
 ________________________________ 
________________________________ 
 
 
 
 
 
________________________________ 
Presidente del Jurado 
 
 
________________________________ 
Jurado 
 
________________________________ 
Jurado 
 
 
 
 
 
 
 
 
Manizales, día____mes___año___ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ali David Cifuentes 
A mis padres por el esfuerzo hecho, a Dios, 
y a los que en una u otra forma me aportaron 
algún granito de arena en mi carrera. 
 
 
 
 
 
Diana Maritza Rojas 
A DIOS, a mi madre y a mi hijo 
por tantos esfuerzos compartidos. 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
Los autores expresan sus agradecimientos a: 
 
• Colciencias y Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales por la 
financiación de éste proyecto. 
 
• Carlos Eduardo Orrego, director del trabajo de grado por su valioso apoyo 
humano e intelectual. 
 
• Al talento humano pertenecientes a los “laboratorios de Química y Análisis 
instrumental de la Universidad Nacional de Colombia sede Manizales. 
 
• Los profesores: Gloria Inés Giraldo, Carlos Ariel Cardona, Héctor Jairo 
Osorio por su orientación pedagógica. 
 
• Al personal administrativo de la Dirección de Investigaciones de Manizales, 
Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales. 
 
• El ingeniero Adamo Alexander Cardona, por su disposición y colaboración 
oportuna. 
 
• Jorge Ariel Guapacha por su colaboración incondicional. 
 
• Demás personal asociado al proyecto por aportar conocimientos pertinentes 
al desarrollo del mismo. 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
 
Se llevó a cabo la producción de un sistema biocatalítico con características físico 
químicas adecuadas, para ser aplicado en reacciones de hidrólisis y 
esterificación. El soporte de inmovilización fue fabricado a partir de un hidrogel 
macroporoso de quitosano con concentración de 3 % el cual se sometió a un 
proceso de criogelificación-crioconcentración por un tiempo de 4-5 días, 
produciéndose en diferentes geometrías. Finalmente se escogió la forma cilíndrica 
ya que los pellets resultaron de fácil producción, resistentes a la abrasión y a la 
agitación. La humedad final de los soportes cilíndricos fue de alrededor del 17% . 
 
Una solución de glutaraldehido fue utilizada como activador del soporte utiizando 
el método de brazo espaciador. El valor óptimo de carga enzimática la produjo un 
tratamiento de activación con glutaraldehido al 0.003 %, La inmovilización de 
lipasa cándida rugosa (CRL) fue llevada a cabo por inmersión del soporte 
activado en una solución de la proteína durante 15h. Así se obtuvo una carga de 
1.065 mg enzima/ g soporte seco, en promedio. 
 
La caracterización del soporte se llevó a cabo por medio de espectroscopia de 
infrarrojo (FTIR) hallando un grado de D-acetilación de 68.86%. La morfología 
externa fue estudiada por microscopia de fuerza atómica en modo de contacto 
encontrándose un tamaño medio de poro de 195 ± 560 nm y rugosidades medias 
de 229 ± 308 nm para el soporte obtenido a partir de la solución del 3% de 
quitosano. La resistencia a la agitación y la solubilidad-degradabilidad fue 
estudiada, encontrándose resistente a agitaciones hasta de 1100 rpm y soluble 
solo en soluciones de ácido acético. El grado de hinchamiento se evaluó para la 
hidrólisis encontrándose que el soporte se hincha en un 77.16 % al cabo de 96h. 
 
La caracterización del sistema biocatalítico se llevó a cabo por hidrólisis de aceite 
de oliva y mediante la esterificación de ácido oleico con n-butanol, presentándose 
una mayor actividad de la enzima inmovilizada con respecto a la enzima libre con 
valores de 14.79 U/mg y 9.69 U/mg respectivamente. 
 
Este trabajo forma parte del proyecto de investigación “Producción de Biodiesel a 
partir de aceite de palma y de higuerilla por un proceso de reacción-separación por 
enzimas Inmovilizadas” adscrito a Colciencias. 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
The aim of this work was the production and characterization of an adequate 
catalytic system for hydrolisis and esterification reactions. As a support it was used 
different pellet shapes of a a macroporous dried hydrogel (ca 17% humidity, wet 
basis) obtained from a chitosan dispersion (3% wt) gelled at 20ºC, 
crioconcentrated at -20ºC and thawed at 20ºC. Easy way of production, good 
abrasion and agitation resistance was the principal reasons to choose the cylinders 
as the final shape of the pellet. 
 
Candida Rugosa Lipase – CRL- was immobilized on the chitosan support after 
immersion contact for 15 h with an enzyme solution .Glutaraldehyde was used as 
activation agent or spaced arm in the lipase immobilization process. Activating 
glutaraldehyde solution (0.003% wt) yield higher enzymatic load on chitosan pellets 
(average value of 1.065 mg enzyme/ g of dried support). 
 
Support characterization included infrared spectroscopy – FTIR- for deacetylation 
degree (68.86%) and atomic force microscopy – contact mode- for roughness 
(between 229 and 308 nm) and pore size (149 to 226 nm). Agitation resistance and 
swelling in water and solubility in different media were also studied. Pellets had a 
good behavior in agitated environment until 1100 rpm; they were dissolved in 
acetic acid solutions. It was measured 77.6% of swelling after 96 h in contact with 
aqueous hydrolysis reaction media solutions 
 
 
Hydrolysis and esterification catalytic activity was made in olive oil hydrolysis and 
n-butanol - oleic acid reaction respectively. Supported lipase system showed 
higher enzymatic activity than free enzyme catalyzed reactions (14.79 U/mg y 9.69 
U/mg forr hydrolysis and esterification respectively). 
 
This work is a part of a major research project called “Producción de Biodiesel a 
partir de aceite de palma y de higuerilla por un proceso de reacción-separación por 
enzimas Inmovilizadas” with finantial support of Colciencias and Universidad 
Nacional Sede Manizales. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TABLA DE CONTENIDO 
 
 
 Pág. 
 
 
INTRODUCCIÓN 13 
1. OBJETIVOS 14 
1.1 GENERALES 14 
1.2 ESPECÍFICOS 14 
2. MARCO TEORICO 15 
2.1 ANTECEDENTES 15 
2.2 INMOVILIZACION 16 
2.2.1 Clases De Inmovilización 18 
2.2.1.1 Inmovilización por retención física 18 
2.2.1.1.1 Atrapamiento 19 
2.2.1.1.2 Inclusión en membranas 19 
2.2.1.2 Inmovilización por unión química 20 
2.2.1.2.1 Unión a soportes 20 
2.2.1.2.2 Adsorción iónica 21 
2.2.1.2.3 Unión covalente 22 
2.2.1.2.4 Inmovilización por reticulación. 23 
2.2.2 Efectos de la Inmovilización 25 
2.3 LIPASAS EN REACCIONES 27 
2.3.1 Clasificación 27 
2.3.2 Propiedades 27 
2.3.3 Reacción de transesterificación 29 
2.3.3.1 Producción de biodiesel 29 
2.4 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA30 
2.5 SOPORTES DE INMOVIIZACION 31 
2.5.1 Características de los soportes para inmovilización 31 
2.6 QUITOSANO COMO SOPORTE DE INMOVILIZACIÓN 33 
2.7 HIDROGELACION 37 
2.8 CRIOGELIFICACION- CRIOCONCENTRACIÓN 38 
3. MATERIALES Y METODOS 40 
3.1 PRODUCCION DEL SOPORTE 40 
3.1.1 Materiales y reactivos 40 
3.1.2 Equipos de análisis y proceso 40 
3.1.3 Procedimiento de gelificación 40 
3.1.4 Procedimiento de secado convectivo 41 
3.1.5 Procedimiento de secado por criogelificación 41 
3.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACIÓN 41 
3.2.1 Materiales y reactivos 42 
3.2.2 Enzima Utilizada 42 
3.2.3 Equipos de análisis y proceso 42 
3.2.4 Procedimiento de activacion 43 
 
3.2.5 Procedimiento de inmovilización 43 
3.2.6 Procedimiento de análisis de proteína 43 
3.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL BIOCATALIZADOR 43 
3.3.1 Materiales y reactivos 44 
3.3.2 Equipos de análisis y proceso 44 
3.3.3 Medida de grado de D- acetilación 44 
3.3.4 Medida de la resistencia 45 
3.3.5 Medida de la solubilidad y la degradabilidad 45 
3.3.6 Medida del hinchamiento (swelling) 45 
3.3.7 Procedimiento de medición de rango de poro 46 
3.3.8 Medida de la actividad enzimática del biocatalizador 46 
3.3.8.1 Hidrólisis 46 
3.3.8.2 Esterificación 47 
4. RESULTADOS Y DISCUSION 48 
4.1 PRODUCCION DEL SOPORTE 48 
4.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACIÓN 58 
4.2.1 Carga enzimática 58 
4.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL BIOCATALIZADOR 61 
4.3.1 Grado de D- acetilación 61 
4.3.2 Resistencia 64 
4.3.3 Solubilidad y degradabilidad 65 
4.3.4 Swelling 66 
4.3.5 Medición de rango de poro 67 
4.3.6 Actividad enzimática del biocatalizador 70 
4.3.6.1 Hidrólisis 70 
4.3.6.2 Esterificación 72 
5. CONCLUSIONES 76 
6. RECOMENDACIONES 79 
BIBLIOGRAFIA 81 
ANEXOS 87 
 
 
LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS 
 
 
Ac Ácido 
AFM Microscopia de fuerza atómica. 
°C Grado Centígrado 
CRL Lipasa Candida Rugosa 
D-Ac Grado de D-acetilación 
EtOH Etanol 
FTIR Espectrofotometría de infrarrojo por transformada de Fourier. 
GA Glutaraldehido 
G Grado de hinchamiento 
nm Nanómetro 
N-Ac Grado de N-acetilación 
SPM Microscopia de barrido por sonda 
TPP Tripolifosfato 
U [µmol/min] ó [µmol/h] 
µm Micro metro 
UV Ultravioleta 
Wd Peso de muestra seca 
Ws(t) Peso de la muestra hinchada en función del tiempo 
Wef Peso de soporte hinchado en el equilibrio. 
 
 
 
 
LISTA DE TABLAS 
 
 
 
TABLA DE CONTENIDOS Pág. 
 
 
Tabla 1. Tipos de Soporte y enzimas utilizadas. 15 
Tabla 2. Comparación entre distintas técnicas de inmovilización. 24 
Tabla 3. Parámetros característicos para analizar enzimas Inmovilizadas. 32 
Tabla 4. Tamaño Inicial y Final de esferas (Diámetro efectivo promedio). 49 
Tabla 5. Tamaño inicial de láminas (longitudes en cm). 49 
Tabla 6. Tamaño Final de láminas (longitudes en cm). 50 
Tabla 7. Tamaño inicial y final de cilindros (Diámetro y longitud media). 50 
Tabla 8. Perdida de tamaño para esferas (%). 50 
Tabla 9. Perdida de tamaño para laminas (%). 51 
Tabla 10. Pérdida de tamaño para cilindros (%) 51 
Tabla 11. Porcentaje de pérdida de peso debido al proceso de secado 52 
Tabla 12. Humedad final de esferas (%). 53 
Tabla 13. Humedad final de Laminas (%) 53 
Tabla 14. Humedad final de Cilindros (%) 53 
Tabla 15. Humedades finales al cabo de 5-6 días (%) 55 
Tabla 16. Análisis de proteína. 58 
Tabla 17. Curva patrón 59 
Tabla 18 Carga de proteína 59 
Tabla 19. Tiempos de carga de enzima 60 
Tabla 20. Resultados de N-Ac y D-Ac 63 
Tabla 21. Resultados de absorbancia de grupos hidroxilo y amida. 63 
Tabla 22. Resistencia del soporte de inmovilización 64 
Tabla 23. Solubilidad en diferentes solventes 65 
Tabla 24. Rugosidad Media. 68 
Tabla 25. Porosidad media. 68 
Tabla 26. Gramos de ácido oleico producido con el tiempo. 70 
Tabla 27. Actividad del biocatalizador en Hidrólisis. 71 
Tabla 28. Gramos de ácido que reaccionan con el tiempo. 72 
Tabla 29. Actividad del biocatalizador en Esterificación 73 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
TABLA DE CONTENIDOS Pág. 
 
Figura 1. Métodos de inmovilización por retención física 18 
Figura 2. Métodos de inmovilización por Unión química. 20 
Figura 3. Lipasa de naturaleza amfifilica. 28 
Figura 4. Migración de la lipasa a la interfase 28 
Figura 5. Estructura química del quitosano 34 
Figura 6. Estructura química de la quitina 34 
Figura 7. Formación de quitosano a partir de quitina 35 
Figura 8. Proceso de inmovilización sobre quitosano. 37 
Figura 9. Hidrogel de esferas de 1.8% 48 
Figura 10. Hidrogel de Láminas de 3% 48 
Figura 11. Hidrogel de cilindros de 3% 49 
Figura 12. Proceso combinado de secado. 52 
Figura 13. Esferas secas 54 
Figura 14. Laminas secas 54 
Figura 15. Cilindros secos. 54 
Figura 16. Comparación del soporte convencional con biológico. 56 
Figura 17. Soporte biológico 56 
Figura 18. Soportes por hidrogelación en frió 57 
Figura 19. Soporte producidos por uso de TPP. 58 
Figura 20. Espectros de quitosano puro pastilla de KCl 61 
Figura 21. Espectros de quitosano al 1.8% por lámina. 62 
Figura 22. Hinchamiento de muestras en hidrólisis a 25ºC 66 
Figura 23 Swelling a cada intervalo de tiempo 66 
Figura 24. Concentración de quitosano de 1.8 % 67 
Figura 25. Concentración de quitosano de 2.4 % 67 
Figura 26. Concentración de quitosano de 3 % 68 
Figura 27. Micrografía de quitosano con Glutaraldehido de 0.003 % 69 
Figura 28. Micrografía de quitosano con Glutaraldehido de 0.01 % 69 
Figura 29. Hidrólisis del aceite de oliva (producción del ácido oleico). 70 
Figura 30. Actividad de Cándida rugosa en la reacción de hidrólisis. 71 
Figura 31. Esterificación del ácido oleico y n-butanol. 72 
Figura 32. Actividad de Cándida rugosa en la reacción de Esterificación. 73 
Figura 33. Reutilización del sistema biocatalítico (actividad) en hidrólisis 74 
Figura 34. Reutilización del sistema biocatalítico en hidrólisis 75 
 (porcentaje) 
 
 
 
LISTA DE ANEXOS 
 
Anexo 1. Procedimiento de gelificación 
Anexo 2. Procedimiento de secado 
Anexo 3. Procedimiento de enlace covalente 
Anexo 4. Método de biuret 
Anexo 5. Hidrogeles de quitosano 
Anexo 6. Métodos de secado 
Anexo 7. Espectros de infrarojo 
Anexo 8. Espectro de lipasa 
Anexo 9. Perfiles Lineales de AFM 
Anexo 10. Datos Experimentales 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Julian
TABLA DE CONTENIDOS
 
 
 
 
INTRODUCCIÓN 
 
 
Hoy por hoy las transformaciones químicas de materias primas en productos 
elaborados no son una simple idea de años atrás; la generación de productos con 
alto valor agregado a bajos costos, pero al mismo tiempo atractivos 
ambientalmente, es la idea de muchas industrias que le apuntan a las reacciones 
en síntesis orgánica, siendo esta una de las áreas que aporta elementos para 
mejorar la calidad de vida de este último siglo y para la cual se usan 
crecientemente los catalizadores enzimáticos como un aporte al mejoramiento de 
diferentes procesos industriales de síntesis. Es así como en algunas reacciones 
tales como esterificación, transesterificación, interesterificación, alcoholisis, 
acidólisis, hidrólisis y glicerolisis aparecen las lipasas como catalizadores “limpios 
y biológicos” que aumentan la productividad debido a su alta especificidad por el 
sustrato y por su actividad, si se compara con catalizadores orgánicos e 
inorgánicos. 
 
Las lipasas se utilizan en diversos campos que van desde la industria dedetergentes, la de alimentos, la farmacéutica, la cosmética, la oleoquímica, la 
industria del papel, la síntesis orgánica, pesticidas, fungicidas y aplicaciones 
biomédicas, hasta la industria energética; participando en esta ultima en la 
producción de biodiesel por transesterificación para contrarrestar el hecho del 
agotamiento del petróleo a nivel mundial. 
 
Las lipasas pueden ser obtenidas comercialmente de diferentes microorganismos 
tales como levaduras, mohos y de bacterias; se pueden utilizar tanto libres como 
inmovilizadas. 
 
Dentro de una gran gama de materiales de soportes de inmovilización una buena 
opción es el quitosano (obtenido a partir de la deacetilación de la quitina, el 
segundo polímero más abundante en la tierra). Este material es biocompatible, 
no-tóxico y de remarcada afinidad con las proteínas. 
 
 
 
1. OBJETIVOS 
 
 
 
 
1.1 GENERALES 
 
 Inmovilizar una lipasa en quitosano 
 
 
 
1.2 ESPECÍFICOS 
 
 Producir el soporte de quitosano para la inmovilización. 
 
 Obtener un protocolo de inmovilización de la lipasa sobre el soporte 
 
 Caracterizar el soporte y el sistema biocatalítico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. MARCO TEORICO 
 
 
2.1 ANTECEDENTES 
 
 
Desde una perspectiva biotecnológica existen muchas ventajas del empleo de 
enzimas en medios orgánicos: La facilidad de lograr alta solubilidad del sustrato y 
de modificar la selectividad propia de la enzima por el simple diseño del medio de 
reacción, la mejora sustancial de la termoestabilidad de las enzimas y la 
posibilidad de recuperación del producto por evaporación del solvente de reacción. 
La baja actividad de las enzimas generalmente observada en los solventes 
orgánicos se debe a que las enzimas son insolubles en tales medios y forman 
agregados en los cuales aproximadamente el 30%±60% de sus sitios activos son 
inaccesibles para los sustratos [31, 65]. 
 
La inmovilización de enzimas sobre soportes artificiales se remonta hacia los años 
50’s. Se han utilizado técnicas de inclusión de enzimas en matrices poliméricas, 
conexión por enlaces sobre materiales de soporte y la adsorción sobre materiales 
inertes. Muchos métodos han sido usados para inmovilizar lipasas, incluyendo la 
adsorción o la precipitación sobre materiales hidrofóbicos [68], enlace covalente 
con grupos funcionales [53], atrapamiento en geles de polímeros [57], adsorción 
en resinas de intercambio iónico [52], microencapsulación [4], y atrapamiento en 
sol–gel [29, 34]. La lipasa de C. cylindracea fue inmovilizada sobre un copolimero 
de divinil metil acrilato y sus derivados [69]. La lipasa inmovilizada tiene una 
resistencia mejorada a la desnaturalización térmica que la enzima nativa [50, 69]. 
 
Algunos estudios han llegado a la conclusión que el proceso de inmovilización 
incrementa la actividad enzimática comparada con la que presentan las enzimas 
libres [42]. Con ello se contribuye al desarrollo de procesos continuos y 
adaptabilidad a una variedad de configuraciones y procesos específicos llevados 
en reactores. Un resumen de los diferentes tipos de soportes y lipasas utilizadas 
en algunos estudios anteriores se presenta en la tabla 1. 
 
 
Tabla 1. Tipos de soporte y enzimas utilizadas reportadas en la literatura 
 
TITULO DEL TRABAJO Ref SOPORTE LIPASA 
 
1. Inmobilized lipase-catalyzed 
production of alkyl esters of 
restaurant grease as biodiesel. 
 
26 macro poros de resina acrílica y sílice 
granulado 
cándida antártica 
2. Imaging the distribution and 
secondary structure of inmobilized 
enzymes using infrared 
microespectroscopy. 
 
38 Macro poros de 
polimetilmetacrilato. cándida antártica 
 
TITULO DEL TRABAJO Ref SOPORTE LIPASA 
3. Inmobilization of pseudomonas 
cepacia lipase in a phyllosilicate 
sol-gel matrix effectiveness as a 
biocatalyst 
 
27 Matriz de sol gel de 
silicato 
pseudomonas 
cepacia 
4. Preparation of porous 
polyurethane particles and their 
use in enzyme immobilitation 
 
64 Particulas porosas de poliuretano cándida rugosa 
5. Designer hydrogels for lipase 
immobilitation 
 
25
Hidrogeles 
poliméricos de 
poliacrilamida 
porcine pancreas 
6. Catalytic membrane preparation 
for enzymatic Hydrolysis reactions 
carried out in the membrane phase 
contactor 
 
 
61 
 
Membrana de 
polipropileno, 
nitrocelulosa, 
celulosa y poliamidas 
cándida antarctica y 
pancreatic porcine 
7. Immobilization, stability and 
esterification studies of a lipase 
from a Bacillus sp 
 
13 silica (Merck), pellets HP-20 . Bacillus sp. 
8. Lipase Immobilization into Porous 
Chitoxan Beads: Activities in 
Aqueous and Organic Media and 
Lipase Localization 
 
 
15 
 
 
Complejo de 
quitosano. 
 
candida rugosa 
9. Waste edible oils and fats for 
biodiesel production by lipase-
catalyzed transesterification 
 
8 
Silicona, 
Materiales sol-gel de 
silicato. 
 
10. Production of biodiesel fuel from 
triglycerides and alcohol using 
immobilized lipase 
 
6 Caolita porosa. 
Pseudomonas 
fluorescens 
11. Preparation, characterization and 
application of immobilized 
 carboxypeptidase 
 
62 
 
Poliacrilamida. Carboxipeptidasa y silica 
12. Effect of chemical modification on 
the activity of lipases in organic 
solvent 
 
 
32 
 - 
Rhizomucor Miehei, 
cándida antarctica 
14. Immobilization of a-L-
arabinofuranosidase on chitin and 
chitosan 
 
55 
 
 
quitosano 
α-L-
arabinofuranoxidase
 
 
2.2 INMOVILIZACION 
 
 
A partir de las observaciones de Berzelius en el año de 1835 se detectó la 
necesidad de utilizar “sustancias” que modificaran el proceso de elaboración de 
vino, queso o pan positivamente, es así como aproximadamente 150 años atrás se 
 
llamo a dichas sustancias como “fuerza catalítica”. Los catalizadores son 
sustancias que afectan la velocidad de una reacción, sin sufrir cambios, 
promoviendo un mecanismo diferente para la reacción sin afectar el equilibrio. 
[17]. 
 
Los biocatalizadores son un ejemplo simple de lo anterior, también conocidos 
como catalizadores biológicos –enzimas, ribositas y anticuerpos catalíticos-, han 
invadido el mercado mundial con variadas aplicaciones industriales. 
 
Las enzimas son biocatalizadores con actividad biológica que en su mayoría son 
de origen microbiano o pertenecen a enzimas extracelulares con excelentes 
propiedades en diferentes aspectos como: a) altamente catalíticas frecuentemente 
de 108 -1011 veces mas rápidas que los catalizadores no enzimáticos, manejando 
temperaturas suaves y presiones atmosféricas b) poseen un amplio rango de 
aplicaciones industriales c) son muchos mas específicos en cuanto al tipo de 
reacción que catalizan (incluso estereoselectividad y regioespecificidad); por ello 
en aplicaciones industriales de las que hacen parte las enzimas han contribuido 
significativas transformaciones industriales [67]. 
 
En las reacciones catalizadas por enzimas la separación de los sustratos y 
productos es difícil. Las enzimas no se pueden reutilizar y como son estructuras 
lábiles e inestables frente a factores físicos como (calor, radiación), químicos 
(oxidación, reducción, disolventes orgánicos, iones metálicos, fuerza iónica y pH) o 
biológicos (proteólisis, modificación y degradación enzimática) disminuyen su 
actividad catalítica y solubilidad a medida que transcurre el tiempo [5]. 
 
Para garantizar la estabilidad termodinámica y/o cinética se han elaborado 
diversos métodos. Uno de ellos corresponde a la selección de microorganismos 
extremófilos, que intervienen en intervalos de temperatura, acidez, basicidad, 
presión o salinidad únicos; adicionalmente se ha encontrado que la inmovilización 
es de gran utilidad para brindar estabilidad a las enzimas [5] 
 
La inmovilización se define como el proceso por el cual el movimiento de las 
enzimas, células, organelas u y otras especies se ve restringido total o 
parcialmente, dando lugar a una forma insoluble en el medio de reacción, en 
donde se presenta una mayor estabilidad como resultadode este acoplamiento. 
La inmovilización de enzimas se refiere a enzimas unidas, insolubilizadas, 
soportadas o ligadas a una matriz, que se caracterizan por aspectos positivos 
tales como: 
 
 Aumento en estabilidad de la enzima. 
 Posible reutilización del sistema inmovilizado, por lo que disminuyen los 
costos del proceso. 
 Posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, 
adaptado a la aplicación de enzimas inmovilizadas donde se permiten 
cargas elevadas de enzima y uso de procesos continuos. Estos sistemas 
 
pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de productos con 
mayor pureza. 
 
Pero también implica factores que contrarrestan lo anterior, tales como: 
 
 La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo. 
 La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir 
distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con diferente número de 
uniones al soporte. 
 Pérdida de actividad de la enzima durante la inmovilización. 
 El sistema biocatalitico es más caro que la enzima nativa [2] 
 
 
2.2.1 Clases De Inmovilización 
 
 
2.2.1.1 Inmovilización por retención física 
 
 
Este método representa modificaciones físicas del microentorno de la enzima tal y 
como su atrapamiento en la red espacial de una matriz polimérica o su inclusión 
en membranas. Un diagrama típico de esta clase de técnicas es mostrado en la 
figura 1. 
 
 
Figura 1. Métodos de inmovilización por retención física. 
 
 
(Fuente: [2]) 
 
 
 
 
 
 
2.2.1.1.1 Atrapamiento 
 
 
Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una 
matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros entrecruzables o 
polímeros de tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de 
poliuretano. El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión 
de la enzima en una solución del monómero. Posteriormente se inicia la 
polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo 
químico. El atrapamiento puede ser en geles (poliacrilamida) o en fibras (acetato 
de celulosa), que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la 
enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo la 
enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sintética. 
El atrapamiento, es simple desde el punto de vista experimental, requiere poca 
cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la 
enzima no sufre ninguna alteración en su estructura ya que la enzima no esta 
unida de ninguna forma y además se pueden obtener sistemas multienzimaticos. 
De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones 
de polimerización, así como la comprobación de que la naturaleza química del 
proceso no altera los grupos reactivos de la proteína [2] 
 
 
2.2.1.1.2 Inclusión en membranas 
 
 
Se destacan dos técnicas tales como: el microencapsulado que consiste en 
atrapar la enzima en membranas poliméricas semipermeables esféricas y el 
reactor de membrana que consiste en confinar la enzima en una membrana que 
sirve de pared permeable selectiva al interior de un reactor. 
 
En la microencapsulación las enzimas están rodeadas de membranas 
semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero 
no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes 
(originadas por polimerización interfacial) o no permanentes (generadas por 
surfactantes, también llamadas “micelas reversas”). Las microcápsulas obtenidas 
son de forma esférica, con tamaños comprendidos entre 1 y 100 mm de diámetro. 
Mediante este método se pueden encapsular simultáneamente una gran variedad 
de enzimas, células o biomoléculas, permitiendo que se lleven a cabo 
determinadas reacciones que suceden en múltiples pasos. Presentan una gran 
superficie de contacto entre la enzima y el sustrato para un volumen relativamente 
pequeño y la posibilidad de inmovilizar enzimas en una sola etapa [2]. 
 
 
 
 
 
 
 
2.2.1.2 Inmovilización por unión química 
 
 
Las técnicas a las que hacen mención la inmovilización por unión química se 
basan en las interacciones que puedan generarse entre el soporte y la enzima, ya 
sea por interacciones iónicas, por adsorción física, enlace covalente, quelación o 
unión metálica o los enlaces que se pueden generar entre enzimas como el 
reticulado (entrecruzamiento) [2,67]. 
 
 
Figura 2. Métodos de inmovilización por Unión química. 
 
 
 
(Fuente: [2]) 
 
 
2.2.1.2.1 Unión a soportes 
 
 
Esta técnica implica la unión de una enzima a un soporte insoluble; siendo esta 
técnica la más antigua de todas y de la que se dispone de más información. La 
elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el 
comportamiento posterior del sistema biocatalitico. Se debe procurar que la 
inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, 
amplíe el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles contaminaciones 
microbianas. Además el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las 
condiciones de operación del reactor y ser fácilmente separable del medio líquido 
para que pueda ser reutilizado [67]. 
 
Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la 
inmovilización de numerosas enzimas. Estos difieren en tamaño, densidad, 
porosidad y forma, aunque generalmente los encontramos en forma de cilindro, 
 
hojas, fibras y más corrientemente en forma de esferas, una ampliación del tema 
se puede ver en el aparte 2.5. 
 
 
2.2.1.2.2 Adsorción iónica 
 
 
Muchos autores encuentran dentro de esta calificación subdivisiones debido a las 
variantes que se pueden presentar, otros solo se limitan a unir las interacciones de 
tipo iónico entre la enzima y el soporte en una sola clasificación. 
 
En la adsorción, la enzima se une a un soporte mediante interacciones iónicas de 
tipo fuerzas de Van de Waals, por puentes de hidrógeno, interacciones 
hidrofóbicas y otras. El contacto de la solución acuosa de la enzima se puede 
realizar por procedimientos estáticos, electrodeposición, procesos en reactor o 
baño con agitación, siendo en esta última en la que se obtiene una deposición 
uniforme de la enzima. 
 
Los principales factores que influyen en la adsorción implican el pH del medio ya 
que controla el número y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de 
la proteína y del sólido, si la fuerza iónica aumenta se produce la desorción de la 
enzima, ya que los iones inorgánicos se unen con más fuerza al soporte que la 
proteína, el diámetro de poro juega un papel importante ya que debe ser 
aproximadamente dos veces el tamaño del eje mayor de la enzima, la presencia 
de iones que actúen como cofactores de la enzima incrementa la carga enzimática 
del derivado. 
 
Como principales ventajas implican 
 
 Preparación sencilla. 
 su bajo costo. 
 No hay cambios de especificidad enzimática. 
 Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en 
agua. 
 
Los inconvenientes de la adsorción son principalmente: 
 
 La optimización de las variables que controlan la adsorción. 
 Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista 
mecánico. 
 La unión al soporte es débil. 
 
Dentro de las variantes que algunos autores reportan consiste en emplear resinas 
de intercambio iónico (método de enlace iónico), las cuales contienen grupos 
funcionales y contraiones móviles. Estos contraiones se pueden intercambiar 
reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan cambios 
en la matriz insoluble. La fuerza de unión entre la enzima y el soporte es mucho 
 
más alta, los cambios conformacionales solo se producen en pequeña extensión 
[67]. 
 
 
2.2.1.2.3 Unión covalente 
 
 
La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de 
inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La metodología 
de la unióncovalente se basa en la activación de grupos químicos del soporte 
para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas. De entre los 20 aminoácidos 
diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los más empleados 
para la formación de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la 
cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano, la 
arginina y el ácido aspártico y glutámico, el resto de aminoácidos, debido a su 
carácter hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie 
proteica y no pueden intervenir en la unión covalente. Los más involucrados son 
los del grupo amino (NH2) de la lisina o arginina, el grupo carboxilo (CO2H) del 
ácido aspártico o el ácido glutámico, el grupo hidroxilo (OH) de la serina o 
treonina, y el grupo sulfhidrilo (SH) de la cisteína, estos aminoácidos no deben de 
ser esenciales en la acción catalítica, con respecto a esto último se han diseñado 
varios métodos que previenen la inactivación enzimática por reacción con los 
residuos de aminoácidos esenciales en los que se encuentran enlaces covalentes 
de enzima en presencia de un substrato o un inhibidor competitivo, por enlace de 
un complejo enzima-inhibidor formado mediante un enlace covalente reversible, 
uso de enzima soluble modificada químicamente de forma que el enlace covalente 
a la matriz se lleve a cabo mediante los residuos nuevos incorporados o el uso del 
zimógeno precursor [67]. 
 
El enlace normalmente se forma entre el grupo funcional presente sobre la 
superficie del soporte y el grupo funcional perteneciente al aminoácido residual 
sobre la superficie de la enzima, pero la mayoría de los soportes no poseen 
grupos funcionales que reaccionen directamente con las enzimas, sino que tienen 
grupos hidroxilo, amino, amido o carboxilo que necesitan ser activados para poder 
proceder a el proceso de inmovilización. El bromo cianuro (BrCN) ha sido 
ampliamente utilizado como activante del grupo funcional hidroxilo en soportes de 
materiales polisacáridos. En este método, la enzima y el soporte están unidos por 
medio de un enlace isourea. En el caso de la activación de la carbodiimida, el 
material de soporte puede tener un grupo funcional carboxilo (CO2H), y la enzima 
y el soporte están unidos por medio de un enlace peptídico. Si el material de 
soporte contiene un grupo funcional amino aromático, puede ser diazotizado 
usando ácido nítrico. Seguidamente, la adición de pequeñas cantidades de 
enzima conducen a la formación del enlace diazo entre el grupo reactivo diazo 
sobre el soporte y el anillo de la estructura de un aminoácido aromático, como la 
tirosina [51]. 
 
 
Las reacciones de acoplamiento entre los grupos reactivos del soporte y los 
grupos reactivos de la enzima han sido ampliamente difundidas, entre ellos se 
encuentran la diatozotizacion como los ocurridos entre la celulosa y la tripsina, 
papaina o pepsina, la formación de enlaces amida mediante inmovilización de 
agarosa con triacilglecerol lipasa, la alquilación o arilación sucedida entre 
metacrilato de polihidroxialquilo y la tripsina, la formación de bases de Schiff entre 
quitosano y pepsina A, reacciones ugi, reacciones de amidinación, intercambio tiol 
disulfuro, interacciones mercurio enzima, acoplamiento inducido por irradiación 
gamma, para una amplia consulta de antecedentes se remite al lector a [67]. 
 
Este método presenta las siguientes ventajas: 
 
 La manipulación de los derivados inmovilizados es sencilla. 
 La carga de enzima permanece constante después de la inmovilización. 
 Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, 
de lecho fluidizado o tanque agitado. 
 Una mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la temperatura, de 
los disolventes orgánicos o del pH, al tener estabilizada su estructura 
terciaria. 
 
En cambio la inmovilización por enlace covalente también presenta una serie de 
inconvenientes: 
 
 Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de 
superficie, ya que condiciona el número de uniones enzima-soporte y su 
geometría, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos. 
 El proceso de inmovilización puede alterar la estructura del centro activo. 
Para evitar esta posible alteración, se realiza la inmovilización en presencia 
de un inhibidor que bloquee el centro activo. 
 La inmovilización covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy 
sensibles a cambios de pH, fuerza iónica, etc. 
 
 
2.2.1.2.4 Inmovilización por reticulación. 
 
 
También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que ha sido 
ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas, el método consiste 
en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las 
moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales (homobifuncionales o 
heteromultifuncionales) se pueden emplear dialdehídos, diiminoésteres, 
diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si están activadas con 
carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces 
intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y 
temperatura. 
 
 
El co-reticulado como una subdivisión alterna permite eliminar las pérdidas de 
actividad enzimática debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento 
de las enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de 
lisina (por ejemplo, la albúmina bovina). Un procedimiento mixto de inmovilización 
muy común consiste en inmovilizar la enzima por adsorción sobre una resina de 
intercambio iónico o un soporte polimérico (con lo que se consigue una elevada 
carga enzimática) y posteriormente añadir el reactivo bifuncional. 
 
Actualmente el método más novedoso de cross-linking consiste en la cristalización 
de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehido (Cross-Linked Enzyme 
Crystals o CLECs). El aumento de estabilidad se basa en la obtención de un 
entramado cristalino, donde las moléculas de enzima están rodeadas 
exclusivamente por otras moléculas de proteína. De esta manera la propia enzima 
actúa como soporte, y su estructura terciaria está estabilizada por las uniones 
covalentes intermoleculares. La estructura cristalina posee canales microscópicos 
(20-50Å) que permiten el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima 
donde se cataliza la reacción. Estos cristales pueden soportar temperaturas 
elevadas y pH extremos, así como la acción de las proteasas. Esta tecnología se 
ha utilizado en la obtención de compuestos enatioméricamente puros y en la 
síntesis de péptidos [3]. 
 
Un resumen de algunas propiedades para las diferentes clases de Inmovilización 
pueden verse en la tabla 2, en la cual se diferencian varias características entre 
distintas técnicas de inmovilización. 
 
 
Tabla 2. Comparación entre distintas técnicas de inmovilización 
 
Propiedad Enlace Cruzado 
Adsorción 
Física 
Enlace 
Iónico Quelación
Enlace 
Covalente Atrapamiento
Preparación 
Intermedio Simple Simple Simple Difícil Difícil 
Fuerza del Enlace Fuerte Débil Intermedio Intermedio Fuerte Intermedia 
Actividad 
Enzimática 
Bajo Intermedio Alto Alto Alta Bajo 
Regeneración del 
Soporte 
Imposible Posible Posible Intermedio Alta Intermedio 
Costo de la 
Inmovilización 
Intermedio Bajo Bajo Intermedio Alta Intermedia 
Estabilidad Alto Bajo Intermedio Intermedio Alta Alto 
Protección de la 
enzima contra 
ataque microbiano 
 
Algunas 
Veces 
 
No 
 
No 
 
No 
 
No 
 
Si 
Fuente: [67] 
 
 
2.2.2 Efectos de la Inmovilización 
 
 
La inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas, es 
así como la actividad de la preparación es siempre diferente a la de la forma 
natural, es así como efectos de índole conformacional, de partición o difusionales 
son los culpables de estos cambios que pueden afectar la estabilidad y la 
actividad enzimática[3]. 
 
Generalmente se observa un incremento en la estabilidadde las enzimas después 
de su inmovilización ya que la existencia de uniones multipuntuales enzima-
soporte, hacen que la estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor rigidez 
y se haga más resistente a la desactivación térmica o química; la protección 
frente a las proteasas cuando se unen al soporte elimina su capacidad proteolítica, 
y evita su autólisis; se evita la agregación intermolecular al mantener las 
moléculas de enzima retenidas en una determinada región del espacio y por ultimo 
la alteración del microentorno ayuda a diferentes enzimas debida a la interacción 
de la enzima con el soporte, es por ello , si una enzima sensible al oxígeno (como 
las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sitúa en la superficie de un soporte 
cargado, la fuerza iónica efectiva en el microentorno de la enzima será muy alta y, 
como consecuencia, la concentración de oxígeno disuelto será mucho menor en 
esa zona que en el medio de reacción, en otros casos el soporte tiene un efecto 
tamponador de tal manera que mantiene el pH óptimo de la enzima en su 
microentorno, aunque en la disolución se produzcan cambios importantes de pH. 
Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en 
presencia de disolventes orgánicos, el agua ligada al soporte o su capacidad para 
retener agua, regula la actividad de la enzima, Cuanto mayor es el 
comportamiento hidrófilo del soporte, más agua adsorbe y la enzima poseerá la 
cantidad necesaria de agua en su microentorno para mantener su conformación 
activa[3]. 
 
Tras una inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso 
perderse por diversas razones; la unión al soporte se produce de tal forma que el 
paso del sustrato al centro activo está impedido, los grupos reactivos del soporte 
reaccionan con algún aminoácido que forme parte del centro activo o que sea 
esencial para la actividad catalítica de la enzima, la inmovilización puede originar 
un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva o las condiciones 
experimentales del proceso causan la desnaturalización o desactivación de la 
enzima[3]. 
 
Otros cambios que pueden originarse pueden ser debidos a efectos difusionales, 
electroestáticos o de microentorno que originarían un aumento o disminución de la 
actividad enzimática. Los efectos difusionales se originan debido a la difusión de 
los sustratos hacia el centro activo de la enzima, los cuales pueden estar impedida 
por resistencias de tipo externo como la película líquida estacionaria (capa de 
Nernst o de difusión) que rodea el soporte que origina un gradiente de 
concentración a través de la zona de difusión y resistencias de tipo interno ya que 
 
los sustratos tienen que atravesar el interior del gel, microcápsula, fibra o poro del 
soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada, esto ultimo se contrarresta en 
algunos casos disminuyendo el tamaño del sistema biocatalítico, aumentando la 
concentración de sustrato, incrementando la agitación o el flujo en el reactor[3]. 
 
Los efectos electrostáticos entre el sustrato y el soporte, son importantes a tener 
en cuenta, de tal manera que, si tienen la misma carga existe una repulsión 
mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atracción. El Impedimento 
estérico o de tamaño de sustrato es otra de las variables importantes ya que en un 
principio, cualquier enzima puede ser inmovilizada sin que haya una pérdida 
apreciable de su actividad, este hecho suele ser válido en el caso de que el 
sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de sustratos con pesos 
moleculares elevados, la actividad de la enzima inmovilizada disminuye 
drásticamente. Este “efecto estérico” se puede evitar mediante una inmovilización 
covalente a través de un brazo espaciador enzima-soporte más largo[3]. 
 
Por ultimo los efectos en el microentorno tienen su efecto sobre la actividad 
enzimática ya que la enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al 
habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados eléctricamente. 
El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH óptimo de la 
catálisis enzimática y, muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en 
el cual la enzima puede actuar, es así como una enzima unida a un soporte 
cargado negativamente tendrá en su microentorno una concentración mayor de 
hidrogeniones que en el medio de reacción. Como resultado, la enzima 
inmovilizada será más activa a un pH más alcalino. La enzima sería más activa a 
pH más ácidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente [3]. 
 
Como tal las enzimas pertenecen a diferentes clases, pero son las hidrolasas las 
que han sido utilizadas en mas de un 80 % de los proceso industriales que a su 
vez son el 42 % de los usos que se les dan a las enzimas, se destacan las 
proteasas, las isomerasas, carbohidratasas y lipasas que catalizan reacciones de 
hidrólisis y que actúan sobre enlaces ester, peptídicos, éter y otros [5]. 
 
El estudio de lipasas ha sido de gran estudio y las técnicas de inmovilización 
donde se usan polímeros hidrofílicos han causado gran revolución debido a sus 
innumerables aplicaciones de las cuales han sido objeto, dentro de ellas se 
encuentran: Síntesis orgánicas, aplicaciones farmacéuticas, químicas y 
biotecnológicas. La microencapsulación de enzimas es una técnica que ha sido 
usada continuamente para la inmovilización, lo cual no solo se puede conjugar con 
el atrapamiento al interior del soporte, si no, que da facilidad para crear soportes 
en los cuales se puede atrapar exteriormente las enzimas conjugándolas con 
enlaces covalentes usando activantes de grupos reactivos determinados o 
mediante el uso de brazos espaciadores [58]. 
 
Al hablar de lipasas es de primordial importancia reconocer sus propiedades 
funcionales tales y como se mencionaron anteriormente, estas clases de enzimas 
 
diferentes autores las han reportado como precursora de muchas síntesis a nivel 
orgánico y acuoso [45]. 
 
 
2.3 LIPASAS EN REACCIONES 
 
 
2.3.1 Clasificación 
 
 
La clasificación de enzimas según la Enzyme Commission se basa en 4 dígitos 
que caracterizan las enzimas, para la triaciglicerol lipasa como comúnmente es 
llamada las lipasas se asigno la clasificación con numero 3.1.1.3 que pertenecen a 
la clase de hidrolasas y subclase de enlaces ester que catalizan reacciones de 
hidrólisis donde los triagliceroles se convierten en glicerol y ácidos grasos libres: 
 
 
OHRRCOOHHOHRRCOO ′+↔+′ 
 (TRIGLICERIDO) (AGUA) (ACIDO GRASO) (GLICEROL) 
 
Su nombre sistémico corresponde a triaciglicerol acilhidrolasa [5] 
 
 
2.3.2 Propiedades 
 
 
Las lipasas son catalizadores versátiles que se aplican dentro de un amplio rango 
de bioconversiones tales como hidrólisis, interesterifiación, esterificación, 
alcoholisis, acidolisis y aminolisis aplicándose en tecnología de alimentos, 
aplicaciones biomédicas e industria química. Son de naturaleza amfifilica, es decir 
que se caracterizan por la presencia de una parte tanto hidrofílica como 
hidrofóbica en sus moléculas (Figura 3); estas enzimas en una emulsión de aceite 
y agua, migran a la interfase en donde la parte de sus moléculas hidrofóbicas 
permanecen en contacto con la fase hidrofóbica u oleosa y la parte hidrofílica 
permanece en contacto con la fase acuosa (Figura 4). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Lipasa de naturaleza amfifílica (Fuente: [54]) 
 
 
(Fuente: [54]) 
 
Figura 4. Migración de la lipasa a la interfase (Fuente: [54]) 
 
 
 
(Fuente: [54]). 
 
Las lipasas han sido estudiadas por muchos años y se han producido de muchos 
microorganismos por el crecimiento vía fermentativa. Son mucho mas abundantes 
en la flora microbiana comprendida entre bacterias y algunos hongos, además de 
encontrarse en el páncreas de mamíferos como cerdos y humanos y además en 
plantas muy grandes del tipo Ricinus communis. Los principales microorganismos 
de los que se han producido son aspergillius,bacilus, cándida y 
Chromobacterium. 
 
Las lipasas se han utilizado en diferentes industrias tales como la de detergentes, 
por su capacidad para hidrolizar grasas; en la industria de alimentos en la cual las 
lipasas permiten alterar las propiedades de lípidos, jugos de frutas, en 
fermentación vegetal y para el desarrollo de sabores de quesos; en la industria de 
pulpa y papel para remover el residuo hidrofóbico de esta industria. Se utilizan 
además en síntesis orgánica tal como en procesos de esterificación y 
transesterificación en la industria óleo-química. En aplicaciones biomédicas ya que 
 
poseen una excelente capacidad parar reacciones de regioselectividad especifica, 
en síntesis de agentes antitumorantes, alcaloides, antibióticos y vitaminas, en 
biosensores como diagnostico clínico. También se usan en pesticidas, 
insecticidas, herbicidas y fungicidas[45]. 
 
Las reacciones típicas en donde intervienen las lipasas corresponden a la 
hidrólisis del tipo de reacción de triglicéridos para formar glicerol y ácidos libres, y 
la esterificación de ácidos y alcoholes para formar esteres; la reacción de 
transesterificación es también catalizada por las lipasas. 
 
 
2.3.3 Reacción de transesterificación 
 
 
En la reacción de transesterificación un triglicérido y un alcohol forman un tri-ester 
y glicerol mediante uso de un catalizador. Es de importancia que en la reacción 
haya cantidades limitadas de agua ya que se pueden presentar reacciones 
colaterales de formación de jabón. [9]. 
 
 
2.3.3.1 Producción de biodiesel [9,37]. 
 
 
La nueva tendencia mundial apunta hacia la generación de los denominados 
productos “limpios” con lo cual aparecen los biocombustibles basados en la 
transformación de la biomasa, que, para el caso de la producción de uno de los 
biocombustibles biológicos mas importantes a nivel mundial como es el biodiesel 
corresponde a los aceites de origen animal o vegetal. 
 
La producción de biodiesel se basa en la reacción de transesterificación de 
triglicéridos. La idea de usar aceites y grasas de origen vegetal y animal no es 
algo nuevo. Desde 1900, cuando Rudolf Diesel hizo funcionar el prototipo de su 
motor diesel utilizando aceite de maní, el concepto de usar aceites y grasas como 
una fuente renovable de combustibles ha sido reintroducido periódicamente. 
 
Pero la idea de usar un combustible biológico se debe a los problemas que han 
generado los combustibles derivados del petróleo son muchos entre los que se 
encuentran las emisiones contaminantes. 
 
Actualmente la mayoría de los procesos para producir Biodiesel son catalizados 
por bases. Se estudian también procesos catalizados por enzimas, siendo estas 
últimas del tipo lipasas. Este último proceso, las lipasas se usan como catalizador 
en la transesterificación para la preparación de monogliceridos. El proceso tiene 
diferentes ventajas, incluyendo la baja formación de coproductos, la fácil 
separación de los productos, las condiciones de reacción moderadas y la 
formación de esteres de ácidos grasos como el segundo mayor producto. 
 
 
Existen varias ventajas que conlleva el uso de lipasas como catalizador de la 
reacción de transesterificación. Entre ellas se encuentran la disminución selectiva 
de las energías de activación, la fácil recuperación del glicerol formado, la mejora 
considerable de las velocidades de reacción, la posibilidad de recirculación del 
catalizador, la transesterificación de triglicéridos con un alto contenido de ácidos 
grasos libres (insaturados), las bajas temperaturas de reacción, los altos niveles 
de conversión a alquil ésteres, y la posibilidad de uso de alcoholes ramificados 
para la síntesis de ésteres con mejores propiedades de ignición, entre otras. 
 
 
2.4 ACTIVIDAD ENZIMATICA 
 
 
Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que 
cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica 
es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por 
mililitro de disolución (U/ml), en el caso de enzimas inmovilizadas diferentes 
autores reportan como (U/g-soporte). Cuando se usan enzimas en la industria, su 
actividad siempre debe ser expresada en una forma dada, y calculada en 
condiciones tales que se relacionen lo mas estrechamente posible con su 
aplicación, en algunos casos es mas útil expresar la actividad enzimática en 
función de la velocidad de cambio de la velocidad u otro, en vez de en términos 
mas convencionales como µmol de producto formado por mg de enzima por 
segundo. 
 
Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de 
actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato 
por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 106 µmoles y 1 
minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es 
muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como el 
microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat) [67]. 
 
 
Cuando se conoce el peso molecular de la enzima pura y el número de centros 
activos por molécula de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten 
calcular el número o frecuencia de recambio de la enzima, o sea, el número de 
reacciones elementales que realiza la enzima por cada centro activo y por unidad 
de tiempo.[67]. 
 
La actividad de las lipasas puede ser medida por diferentes métodos entre los que 
se reportan la hidrólisis de aceite de oliva, p-Nitrofenil Palmitato medida por 
espectrofotometría o titulación; además puede usarse la esterificación de ácido 
butírico con diferentes alcoholes alifáticos (C2 – C10) y n-butanol con diferentes 
ácidos carboxílicos (C2-C12) por los mismos métodos [1,12, 15, 23, 24, 42]. 
 
 
 
 
2.5 SOPORTES DE INMOVIIZACION 
 
 
Dentro de la tecnología de la inmovilización y según la síntesis biológica que se 
desee realizar juegan un papel primordial, el soporte, la enzima y el método de 
inmovilización. Al considerar un soporte para un enzima se deberá pensar en 
factores tales como el pH, la temperatura, la fuerza iónica, la presión, agitación, la 
conjugación de cofactores y el proceso de separación del sustrato del producto 
[22]. 
 
Como se mencionó anteriormente los soportes pueden variar de forma (láminas, 
tubos, cilindros, esferas), tamaño, propiedades físicas o químicas, encontrándose 
una gran variedad de compuestos naturales o sintéticos, orgánicos o inorgánicos 
clasificándose según [3]: 
 
 Soportes inorgánicos: 
 
 Naturales: (arcillas como la bentonita, piedra pómez, sílice, etc.). 
Manufacturados: (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado, 
vidrio no poroso, alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.) 
 
 Soportes orgánicos: 
 
Polímeros naturales: Polisacáridos (celulosa, almidón, dextranos, agar-agar, 
agarosa, alginatos, quitina, quitosano, etc.); proteínas fibrosas (colágeno, 
queratina, etc). 
 
Polímeros sintéticos: Poliolefinas (como el poliestireno); polímeros acrílicos 
(poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.); Otros tipos (alcohol 
polivinílico, poliamidas, etc). 
 
Los polisacáridos que se han utilizados como soportes varían desde micro esferas 
a lechos de alginato, dextrano, carrragenatos, agarosa, celulosa, quitosano, entre 
otros; todos ellos han sido utilizados con el fin de minimizar los problemas 
presentados en otras técnicas de atrapamiento como: a) baja eficiencia b) uso de 
solventes orgánicos volátiles que contribuyen a problemas ambientales c) uso de 
solventes orgánicos que pueden alterar la estructura y funcionalidad de las 
proteínas [67]. 
 
 
2.5.1 Características de los soportes para inmovilización 
 
 
Aunque no existen soportes universales, hay algunos principios para su selección; 
dentro del proceso de aplicación a gran escala se encuentran: (a) El material debe 
de estar disponible en abundancia y a un bajo precio, (b) el proceso de 
inmovilización tiene que ser simple y efectivocon la consideración de retención de 
 
la actividad enzimática, (c) la capacidad y eficiencia de las enzimas inmovilizadas 
tiene que ser alta y, (d) el diseño del reactor con respecto al mecanismo manejado 
del biocatalizador tiene que ser simple [11]. Además de lo anterior un soporte 
ideal para una aplicación dada es aquel que aumente la interacción con el 
sustrato, disminuya la inhibición por el producto, cambie el pH aparente óptimo 
hasta el valor deseado, frene el crecimiento microbiano y sea fácilmente 
recuperable para poder volverlo a utilizar . El soporte debe de ser estable en 
solución y no debe de deteriorarse en las condiciones de reacción, debe ser rígido 
mecánicamente y tener un grado de compactación bajo en operaciones continuas 
a velocidades de flujo altas cuando se adapte a un diseño en reactores; en 
conclusión se deben de definir necesidades técnicas y económicas (costo, calidad, 
funcionalidad, y seguridad) para definir un buen catalizador en términos de 
eficiencia e integración del costo efectivo [10]. 
 
Muchos factores tienen influencia en la selección de un soporte particular. Los 
grupos hidroxilos del soporte juegan un papel muy importante ya que forman 
puentes de hidrógeno con las moléculas de agua, por eso se crea un ambiente 
acuoso (hidrofílico) con el soporte. Los soportes de polisacáridos son susceptibles 
de desintegración microbiana o fúngica, y solventes orgánicos pueden causar un 
encogimiento del gel en los soportes usualmente utilizados para formar estos 
lechos [51]. 
 
Dentro de la manipulación que se logra observar en el contexto enzima-soporte 
deberán de manejarse características como algunos fenómenos de transporte 
(efectos de transferencia de masa), estabilidad operacional relacionada con el 
numero de ciclos si se hace referencia a un tanque agitado y un método de 
inmovilización que se expresará en términos de rendimiento; todo ello apuntando 
hacia unos datos de funcionamiento el cual se puede expresar como productividad 
(producto producido por unidad de enzima) o consumo de enzima por unidad de 
producto producido. 
 
Un resumen de los parámetros de importancia que se deben considerar en la 
inmovilización de enzimas se puede observar en la Tabla 3 [60]. 
 
 
Tabla 3. Parámetros característicos para analizar enzimas inmovilizadas 
 
CARACTERISTICAS PARÁMETROS DE IMPORTANCIA 
 
ENZIMA 
 
 
 
 
 
 
Propiedades bioquímicas: Masa molecular, grupos 
funcionales en superficie de proteína, pureza. 
 
Parámetros cinéticos: Actividad específica, perfiles de 
pH y temperatura, parámetros cinético de actividad e 
inhibición, Perfiles de estabilidad vs. pH y temperatura, 
solventes, contaminantes, impurezas. 
 
 
 
 
SOPORTE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ENZIMA 
INMOVILIZADA 
 
 
Características químicas: bases químicas y 
composición, grupos funcionales, posibles cambios en 
su comportamiento, volumen accesibles de matriz, 
tamaño de poro, estabilidad química del soporte. 
 
Propiedades mecánicas: diámetro particular, 
comportamiento de partículas a la compresión, 
resistencia al flujo, (para aplicaciones en lechos fijos), 
velocidad de sedimentación (para lechos fluidizados), 
abrasión (para tanques agitados). 
 
 
Método de inmovilización: Rendimiento de la enzima 
activa, atrapamiento de proteína, parámetros cinéticos 
intrínsicos, (Ej.: propiedades y efectos de transferencia 
de masa). 
 
Efectos de transferencia de masa: Diferentes 
concentraciones de soluto al interior y afuera de las 
partículas catalíticas, difusión interna y externa (poros), 
con ello se obtiene la efectividad con relación a la 
enzima libre, bajo condiciones de reacción 
determinadas. 
 
Estabilidad: Estabilidad operacional (expresada como 
actividad que disminuye bajo ciertas Condiciones 
durante el proceso), estabilidad de almacenamiento. 
 
‘Rendimiento’: Productividad (cantidad de producto 
formado por unidad de actividad o masa de enzima), 
consumo de la enzima(Ej.: unidades por Kg. de 
producto) 
 
 
2.6 QUITOSANO COMO SOPORTE DE INMOVILIZACION 
 
 
El quitosano esta siendo reportado para la inmovilización de enzimas, y en 
particular lipasas no solo porque su método de obtención como soporte es simple, 
y no toxico, sino porque brinda propiedades físicas y químicas de interacción 
enzimas-soporte interesantes para llevar a cabo reacciones biológicas con alto 
grado de eficiencia, actividad enzimática y bajo costo [3]. 
 
 
El quitosano (Figura 5) es un amino polisacárido (1-4)-2-amino-2-deoxi-β-D-
glucano obtenido por D-acetilación alcalina de la quitina (Figura 6) (1-4)-2-
acetamido-2-deoxy-β-D-glucano, polisacárido duro, inelástico y nitrogenado que se 
encuentra en las paredes de algunos hongos y en el exoesqueleto de artrópodos 
tales como insectos, escarabajos y crustáceos. La producción mundial de quitina 
es calculada en 150.000 toneladas provenientes de la industria de la fermentación 
que emplea hongos y el resto de la industria pesquera. El quitosano es producido 
por D-acetilación de la quitina al someterla a una solución de NaOH al 40% a 120 
°C por 1-3 horas, produciendo quitosano D-acetilado (Figura 7). [24] 
 
 
 
Figura 5. Estructura química del quitosano 
 
 
 
 
(Fuente: [35]) 
 
 
 
Figura 6. Estructura química de la quitina. 
 
 
 
 
(Fuente [35]). 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Formación de quitosano a partir de quitina 
 
 
 (Quitina) 
 
 (Quitosano) 
(Fuente: [35]) 
 
El quitosano es un biopolímero biodegradable, biocompatible y muco adhesivo, el 
cual juega papel importante como material en muchos propósitos en la industria 
farmacéutica, medica, alimentaría, de síntesis orgánica y biológica [4,5]. Este 
soporte proporciona ventajas como: su versatilidad y disponibilidad en diferentes 
formas (hojuelas, lechos porosos, geles, fibras y membranas), posee baja 
biodegradabilidad, bajo costo, fácil manejo, alta afinidad con proteínas y no 
toxicidad [6], además presenta propiedades físicas, químicas y biológicas muy 
particulares debido a sus iones catiónicos. Esta carga positiva atrae todo 
elemento cercano que tenga iones de carga negativa. Esta condición singular 
permite aplicarla en un extenso abanico de aplicaciones [45]. 
 
Dentro de las aplicaciones de la quitina y el quitosano se encuentran la formación 
de fibras (sistemas amida-LiCl, oxido de amina-agua), cosméticos (cremas, 
lociones), fotografía, piel artificial (neoformación de órganos), comida y nutrición, 
oftalmología (lentes de contacto), ingeniería ambiental (captura de metales a partir 
de corrientes de agua), industria del papel, baterías, farmacéutica (liberación de 
drogas), hidrogeles tales como quitosano–polieter, poli (etilen glicol) macromero-β 
quitosano, quitosano-gelatina, tabletas de quitosano (adición de lactosa), 
microencapsulados y microesferas de quitosano-oxido de polietileno, quitosano-
alginato de calcio, estimulación celular de plantas y animales, agente antibacterial 
y como atrapador de grasa [35]. 
 
El quitosano es insoluble en agua y diversos solventes orgánicos, soluble en 
diferentes ácidos como ácido acético, fórmico y otros, los cuales protonan los 
grupos amino. Produce reacciones típicas de aminas como las N-acetilaciones por 
 
reacciones de Schiff, sus derivados son fácilmente obtenidos bajo condiciones 
suaves y pueden ser considerados como sustitutos de glucanos. A temperatura 
ambiente el quitosano forma aldiminas y cetiminas con aldehídos y cetonas, 
respectivamente. El N-carboximetil quitosano es obtenido a partir de ácido 
glioxilico [35]. 
 
La degradación del quitosano esta inversamente relacionada con el grado de 
cristalinidad el cual es controlado principalmente por el grado de D-acetilación , es 
de notar que una alta D-acetilación exhibe una velocidad de degradación mas 
pequeña [35], además es de notar que el quitosano con D-Ac bajo 40-60 % 
permanece en solución arriba de pH cerca de 9. 
 
Entre las propiedades físicas y químicas de este heteropolimero se destacan sudistribución de pesos moleculares entre 50 kDa a 2000 kDa caracterizados por 
HPLC y diferentes grados de D-acetilación (DDA) entre 40 y 98 %, el cual se 
puede caracterizar por FTIR, RMN o Cromatografía de permeación en gel, entre 
otros [17]. 
 
Diferentes autores reportan el uso de quitosano para membranas de gel con 
propiedades que pueden ser controladas por el grado de entrecruzamiento con el 
glutaraldehido [7,40] y para la inmovilización de proteínas [9]. Los hidrogeles de 
quitosano han sido reportados como adecuados para la inmovilización de lipasas 
por enlaces iónicos intermoleculares estables [7,36, 40,42, 49, 58]. 
 
De la información recolectada inicialmente (tabla 1) que reporta una amplia 
bibliografía, por las propiedades y condiciones del quitosano según la literatura 
antes mencionada y experiencias sobre éste mismo material en la Universidad 
Nacional sede Manizales de la carrera de Ingeniería Química [51] indican que el 
quitosano es un material adecuado como soporte de inmovilización para enzimas. 
 
La inmovilización de enzimas sobre soporte de quitosano es un proceso en el que 
se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar 
a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser 
reutilizadas repetidamente. Con éste fin existen diversos métodos que a lo largo 
de los años se han utilizado y perfeccionado como los son entrecruzamiento 
(cross-linking) que se ha utilizado en inmovilizaciones de diversos tipos de lipasas 
para aplicaciones en medio no acuoso [39]. La adsorción es comúnmente utilizada 
por ser un procedimiento sencillo, teniendo como desventaja una unión débil, por 
lo que en algunos casos se utiliza como complemento con otro método [13]; la 
unión covalente de una enzima a un soporte como el quitosano es quizá el método 
de inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La 
metodología de la unión covalente se basa en la activación de grupos químicos del 
soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas [12] (Figura 8). Otros 
métodos de inmovilización que se reportan mencionan que los hidrogeles de 
quitosano son un medio eficiente de encapsulación de proteínas en forma 
esféricas y rugosas [1]. 
 
 
Figura 8. Proceso de inmovilización sobre quitosano. 
 
 
 
(Fuente: [45]) 
 
Los diferentes soportes de inmovilización para llevar a cabo distintas reacciones 
pueden tener variadas presentaciones, tanto húmedas como secas, donde las 
segundas son principalmente utilizadas, donde los contenidos de humedad bajos 
son deseables para el almacenaje y la estabilidad reactiva [18]. Los métodos de 
secado que se reportan van desde técnicas convectivas en las cuales los soportes 
en húmedo se secan a temperatura ambiente durante un largo periodo de tiempo 
[32], o se someten a temperaturas superiores a 97 °C mediante flujos de vapor 
[18], hasta técnicas de criogelificación y liofilización en las cuales se manejan 
temperaturas de congelación; estas últimas son técnicas eficientes que no 
destruyen la estructura y evidencian una baja degradación de lipasa [12], Otros 
estudios también confirman la utilización de criogeles en esferas de polivinil 
alcohol por el método de congelación-descongelación en un sistema de dos fases. 
Por la porosidad de los criogeles los biocatalizadores de alto peso molecular 
pueden penetrar las esferas, mostrando así un incremento en la estabilidad 
térmica de la lipasa al usarse repetidamente en síntesis de ésteres [56]. 
 
 
2.7 HIDROGELACION 
 
 
Un hidrogel es definido como redes de macromoléculas hinchadas en agua o 
fluidos biológicos. Estos se subdividen en tres clases dependiendo de la 
naturaleza de la red: a) redes entrecruzadas entre si b) redes entrecruzadas 
covalentemente c) redes formadas por interacciones secundarias, para el caso de 
quitosano algunos autores dividen la clasificación en hidrogeles químicos 
formados por enlaces covalentes irreversibles como las hidrogeles de quitosano 
 
entrecruzados covalentemente e hidrogeles físicos formados por enlaces 
reversibles como el tipo de interacciones iónicas [7]. 
 
Los hidrogeles de quitosano entrecruzados covalentemente se dividen en tres tipo 
s dependiendo de su estructura: a) entrecruzados entre si b) redes poliméricas 
híbridas (HPN) c) Redes poliméricas semi – totalmente interpenetradas (IPN). 
Dentro de las tres subdivisiones el principio general se basa en interacciones por 
enlace covalente, pero además se encuentran otras que no se pueden excluir 
como puentes de hidrogeno e interacciones hidrofóbicas, el principio físico de 
estos se basa en tener el quitosano y un entrecruzador en un solvente apropiado 
que usualmente es agua. Se pueden adicionar otros polímeros para formar HPN o 
IPN. Se pueden usar otras moléculas auxiliares para catalizar o iniciar la reacción 
durante la preparación de la red. Los entrecruzadores más importantes son 
dialdehídos como glyoxal y en particular, el glutaraldehido.[7] 
 
Los hidrogeles de quitosano entrecruzados ionicamente se basan en el hecho de 
formar una estructura reversible entre el quitosano, que es un polímero 
policationico, y compuestos cargados negativamente formándose una red a través 
de enlaces iónicos entre cadenas poliméricas. Las interacciones hidrofóbicas se 
favorecen al disminuir el grado de DD del quitosano o los enlaces de hidrogeno 
entre las cadenas debido a una repulsión electrostática después de la 
neutralización del quitosano con el entrecruzador [7]. 
 
En concordancia con lo anterior las dispersiones de quitosano pueden ser 
obtenidas en medio acuoso ácido, el cual protona los grupos amino, el polímero se 
carga positivamente. En el caso de adición de base fuerte (NaOH) a tal dispersión 
se superan las fuerzas asociativas entre cadenas. El quitosano permanece en 
solución hasta cuando el pH llega a 6.2 (quitosano con DD bajo permanece en 
solución por arriba de pH cerca de 9). Superado ése valor, se empieza la 
formación de un tipo de gel hidratado como precipitado, esta precipitación o 
formación de hidrogel es debido a la neutralización de los grupos amino del 
quitosano y una consecuente remoción de fuerza electrostáticas repulsivas entre 
cadenas, lo cual permite agrupar por puentes de hidrogeno e interacciones 
hidrofóbicas entre cadenas 
 
 
2.8 CRIOGELIFICACION (crioconcentración) 
 
 
Los criogeles son matrices de geles formados como resultado de tratamientos 
criogénicos (enfriamiento, almacenamiento en frío por un tiempo definido y 
posterior descongelamiento), los cuales son soportes eficientes para la 
inmovilización de biomoléculas y células. Su estructura única de criogeles, en 
combinación con su estabilidad osmótica, química y mecánica, los hacen matrices 
atractivas para cromatografía de nanoparticulas biológicas. 
 
 
El uso de criogeles como matrices para la inmovilización de biopolímeros 
(enzimas, polisacáridos y ácidos nucleicos) implica en su producción la producción 
de macroporos que permiten una adecuado difusión del sustrato. Los 
supermacroporos en camas continuas, tales como las columnas de criogeles 
desarrollados para la separación de biopartículas, son perfectamente adecuados 
para birreactores de flujo pistón [36]. 
 
 
 
3. MATERIALES Y METODOS 
 
 
3.1 PRODUCCION DEL SOPORTE 
 
 
Uno de los objetivos del presente trabajo consiste en producir un soporte con 
características adecuadas para los sistemas reaccionantes (hidrólisis y 
esterificación). 
 
 
3.1.1 Materiales y reactivos 
 
Quitosano Sigma grado reactivo 
Ácido acético glacial Merck- Grado Reactivo 
Etanol Grado técnico 96% 
Hidróxido de sodio Carlo Erba Grado reactivo 
Tripolifosfato Grado técnico - Disproalquimicos 
 
3.1.2 Equipos de análisis y proceso 
 
 PH metro Schoot Handy Lab 1 
 Balanza analítica Kern (precisión 0.1 mg) 
 Congelador Icasa 
 Vidriería en general 
 Calibrador Digital 
 
 
3.1.3 Procedimiento de gelificación 
 
 
Para producir los hidrogelesde quitosano se recurrió a una técnica modificada de 
la literatura [42] que utiliza como solución gelificante hidróxido de sodio-etanol a un 
pH adecuado que brinde una fuerza iónica para la formación del hidrogel. 
 
 
La dispersión de quitosano se evaluó en tres concentraciones 1.8, 2.4, y 3 %(w/v) 
en solución de 1%(v/v) de ácido acético. Las diferentes geometrías evaluadas 
fueron esferas, láminas y cilindros, los cuales se prepararan depositando la 
mezcla anterior en la solución gelificante, dejándolas en este por un tiempo 
prudencial hasta que el gel sea formado por completo, posteriormente se 
remueven las geometrías y se acondicionan adecuadamente neutralizando el 
hidrogel con agua destilada hasta pH neutro (anexo 1). También se evaluó la 
adición de glutaraldehido a concentraciones de 0.003 y 0.1 % (w/w) en soluciones 
de quitosano. 
 
Las esferas se produjeron por extrusión del quitosano por una aguja de calibre 21 
G (0.8 mm), produciendo una gota que al caer en la solución gelificante formó la 
geometría esperada. En el caso de las láminas se produjeron añadiendo el gel en 
una rejilla metálica. Después de gelificación se hicieron cortes a tamaños 
adecuados. Los cilindros se elaboraron al extruír la solución por una boquilla de 
forma circular (4.5 mm) produciendose así unos cilindros continuos (fideos). 
Posterior a la gelificación se cortaron a las dimensiones adecuadas (anexo 1) 
 
 
3.1.4 Procedimiento de secado convectivo 
 
 
Después de producir el soporte y neutralizarlo, las geometrías de diferentes 
concentraciones se sometieron a temperatura ambiente por más de 24 horas y se 
evaluó las perdidas de peso, las variaciones de las dimensiones y las humedades 
de equilibrio. Las dimensiones se midieron con calibrador digital (anexo 2). 
 
 
3.1.5 Procedimiento de secado por criogelificación (crioconcentración) 
 
 
El término se generó por el uso de procedimientos criogénicos en el cual se 
expone el hidrogel a un almacenamiento en frío y posterior descongelamiento, 
proceso en el cual se elimina el agua y se concentra la estructura del biopolímero. 
 
El soporte se obtuvo por exposiciones sucesivas a -20°C seguidas de 
descongelamiento a temperatura ambiente por más de 24 horas (anexo 2). 
Evaluándose las perdidas de peso, las variaciones de las dimensiones y las 
humedades de equilibrio. Las dimensiones se midieron con calibrador digital. 
 
 
3.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACION 
 
 
La producción del sistema biocatalítico correspondió a la inmovilización de la 
lipasa por enlace covalente a un soporte de quitosano. 
 
3.2.1 Materiales y reactivos 
 
Quitosano Sigma grado reactivo 
Ácido acético glacial Merck 
Etanol Grado técnico 96% 
Aceite de Oliva Tipo comercial – 0.4° acidez 
Glutaraldehido BASF grado técnico 50.8 % 
Tripolifosfato Grado técnico 95.5 % 
Trizma – base Sigma Aldrich- Grado reactivo 
Solución Buffer de fosfato 
Iso-octano Carlo Erba- Grado Reactivo 
Lipasa XX Split- Candida rugosa Proenzimas. 
 
 
3.2.2 Enzima Utilizada 
 
 
Se usó la enzima ENZECO® LIPASE XX distribuida por proenzimas® y producida 
por Enzyme Development Corporation EDC, a partir del microorganismo de 
Candida rugosa, que según especificaciones técnicas puede hidrolizar el 90 % o 
mas de triglicéridos en ácidos grasos. 
 
Actividad nominal: 15.000 unidades de lipasa 
Forma: Sólido con sal finamente pulverizada como diluyente y un 
contenido mínimo de lactosa como vehículo. 
Solubilidad: Completamente soluble en agua 
 
 
3.2.3 Equipos de análisis y proceso 
 
 
 Espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 20 (rango 200-1100nm) 
 Plancha magnética digital Schoot Gerate GMBH 
 PH metro Schoot Handy Lab 1 
 Balanza analítica Kern (precisión 0.1 mg) 
 Vidriería en general 
 
 Micropipeta 5-50 microlitros 
 
 
3.2.4 Procedimiento de activación 
 
 
Para la inmovilización de la lipasa en el soporte de quitosano se recurrió a un 
enlace covalente establecido entre el glutaraldehido y los grupos amino del 
quitosano el cual es uno de los grupos funcionales presente sobre la superficie 
del soporte y un aminoácido residual en la estructura enzimática. 
Inicialmente se preparó la solución acuosa de glutaraldehido (0.003; 0.01; 0.1 % 
w/w) en la cual se depositó el soporte por aproximadamente 1.5 horas bajo 
agitación suave (400 rpm T = 25°C). 
 
 
3.2.5 Procedimiento de Inmovilización 
 
El soporte activado se lavó con agua desionizada y se sumergió en la solución 
enzimática 0.5% (w/v) (disuelta en fosfato de sodio pH 7.3) a temperatura 
ambiente. La enzima inicialmente se diluyó y se centrifugó por 2h, obteniéndose 
un sobrenadante rico en proteína tonel cual se hicieron los ensayos. 
 
Posteriormente se realizaron dos lavados con fosfato de sodio a pH 7.3 por dos 
minutos cada uno, luego se lavó con 0.1 M tris HCl pH 8 por 2 h para bloquear los 
grupos remanentes de CHO. Finalmente el biocatalizador es almacenado en 
fosfato de sodio Buffer a 4°C (anexo 3). Las soluciones residua
3.2.6 Procedimiento de análisis de proteína 
les de fosfato se 
reciclaron para análisis de carga de proteína. 
 
 
 
Para medir la cantidad de enzima atrapada por el soporte se uso las soluciones 
residuales del proceso de inmovilización por enlace covalente a las cuales se les 
adicionó el reactivo de Biuret [66] formando una coloración violácea debido a la 
reacción entre sales de cobre y el nitrógeno de la enzima, la solución se analizó 
por espectrofotometría UV a 540 nm (anexo 4). 
 
 
3.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL SISTEMA BIOCATALÍTICO 
 
 
Producir un soporte de inmovilización o un sistema biocatalítico implica el análisis 
de las características físicas y/o químicas. A partir de estas propiedades se 
 
puede conocer la interrelación que se genera entre el medio adyacente tal como 
las mezclas reaccionantes de hidrólisis y/o esterificación y el soporte catalítico. 
 
 
3.3.1 Materiales y reactivos 
 
Quitosano Sigma grado reactivo 
Ácido acético glacial Merck 
Etanol Grado técnico 96% 
Hidróxido de sodio Carlo Erba Grado reactivo 
Tripolifosfato Grado técnico - 95.5% 
Hexano Grado Reactivo 
Isooctano Carlo Erba – Grado Reactivo 
Glicerina Carlo Erba – Grado Reactivo 
 
 
3.3.2 Equipos de análisis y proceso 
 
 Espectrofotómetro FTIR 
 Microscopio de barrido por sonda (SPM) 
 Plancha magnética digital Schoot Gerate GMBH 
 PH metro Schoot Handy Lab 1 
 Balanza analítica Kern (precisión 0.1 mg) 
 Vidriería en general 
 
 
3.3.3 Medida de grado de D- acetilación 
 
 
El análisis de espectroscopia de infrarrojo se basó en la relación que existe entre 
los grupos hidroxilo y amida del quitosano (derivado N-desacetilado de la quitina) 
los cuales absorben energía a determinadas longitudes de onda. 
 
Para el análisis del grado de acetilación del quitosano se usó el método propuesto 
por García y Canella [20] en el cual se prepara la muestra a analizar en láminas 
transparentes. Estas se realizan con una solución de quitosano de 1.8 % en una 
solución al 2% de ácido acético y se filtró. Se evaporó el solvente a 45°C durante 
aproximadamente 20h, luego se neutralizó las láminas por inmersión en solución 
 
acuosa de NaOH al 5% por 16h, y se retiró el exceso de base con agua destilada. 
El otro método de análisis manipulado trabajó con quitosano en polvo (3 mg) 
mezclándolo con 2 g de KCl, para formar una pastilla. Muestras con adición de 
glutaraldehido (0.003, 0.01 y 0.1% w/w) y enzima de 0.5 %w/v también fueron 
analizadas. 
 
Los espectros de infrarrojo se realizaron en un espectrofotómetro Perkin Elmer BX 
II, analizando en el rango entre 4000-400 cm-1), resolución de 4 cm -1, intervalo de 
2 cm-1 en modo de transmitancia /absorbancia. 
 
El grado de D-acetilación se encuentra por 
%DD = 100 - 100*33.1/
3450
1650






A
A Ec. (1) 
 
 
3.3.4 Medida de resistencia 
 
 
Se determinó por inmersión del soporte seco a las tres concentraciones del 
quitosano en agua destilada,