Practica Determinación de aerobios mesófilos

Vista previa del material en texto

Muestras de leche y agua
Análisis microbiológico del agua
El control y la detección de microorganismos indicadores y patógenos constituyen una parte importante de la microbiología sanitaria 
 Con la cloración del suministro de agua potable se puede controlar la mayor parte de bacterias patógenas
Enfermedades transmitidas por el agua
	Origen	Enfermedad 	Agente Et.
	Bacteriano	Fiebre tifoidea
Disentería bacilar
Cólera
Diarreas
	Salmonella tiphy
Shigella sp.
Vibrio cholerae
C. yeyuni, E. coli, Y. enterocolítica
	viral	Diarreas
Poliomis
Hepatitis Infecciosa	Enterovirus
Rotavirus
Virus del polio
Virus hepatitis
	Parasitario	Amibiasis
Giardiasis
Shistosomiasis	E. Hystolítica
G. Lamblia 
S. mansoni
Coliformes
Miembros de la familia Enterobacteriaceae, incluyendo a E. coli que constituyen aproximadamente el 10% de los microorganismos intestinales de humanos y animales y se utilizan como organismos indicadores de contaminación de agua y leche.
Características: 
 bacilos Gram negativos 
Anaeróbicas facultativas y anaeróbicos
No esporulantes
Fermentadores de azúcares
Aislados de tubo digestivo de vertebrados
Flora microbiana normal del agua
Serratia marcescens
Chromobacterium violaceum
Pseudomonas fluorescens
Sarcina lútea 
Bacilus subtillis
Fecales no patógenos: 
Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella
Fecales patógenos:
Salmonella, Shigella, Vibrio, E. coli, C. perfringens, S. faecalis, S. faecium, S. bovis, S. equinus
No fecales:
Leptospira
Oscilación de bacterias en el agua
Fluctuante
Contaje directo de superficies (103 bacterias/ml)
Contaje de superficies sumergidas (106-107 bact/ml)
Aguas suelos porosos (Calizo)= + bacterias
Cantidad materia orgánica disponible 
pH del agua 
Concentraciones salinas del agua
Metales pesados (Ag, Cu, Al)= limitantes
 (Fe, Mn)= favorecen 
Variaciones térmicas
Bacteriófagos líticos 
Control microbiológico del agua
Técnica filtración (membrana) (5lts)
Inoculación de alícuotas (500-1000 ml) 
 Obtención de la muestra de agua
Envases cristal estéril tapón boca ancha, 1 lt
Aguas cloradas (TIOSULFATO SODICO) 
 0,5- 1ml (0,01N)
Aguas (lagos, ríos, pantanos): no tomar superficial
 sumergir frasco 10 cm y llenarlo
Traslado: inmediato (2 horas) – refrigerar
 Mayor de 48h= no significativo
 Normas COVENIN
COVENIN 1126- 89. Alimentos.
Codificación y preparación de muestras para análisis microbiológico
COVENIN 2614-89. Agua Potable. 
Toma de muestras.
COVENIN 902-87. Recuento de aerobios mesófilos en placas de petri
Determinación del número más probable (NMP) de coliformes totales 
Prueba presuntiva
Manifiesta fermentación de lactosa y gas
Lectura de tubos (+)= ácido y gas
Lectura de tubos (-)= No ácido y No gas
Prueba Confirmativa
 
Demostración de presencia de “verdaderos coliformes”
Caldo lactosa Bilis Verde Brillante (45°C)
 (Ácido y gas)
Placa E.M.B= Colonias brillo metálico 
IMVIC= (++--)
Indol,Rojo Metilo, Voges Proskauer, Citrato
Determinación del número más probable (NMP) de coliformes totales en muestras de leche
Se inocula 3 a 5 tubos de ensayo con caldo lauril sulfato triptosa (CLST) con tubo de Durhan con 1 ml de la muestra o sus diluciones. 
Se incuban a 35-37°C por 24-48h
De cada tubo que presente gas (+) se transfiere a un tubo con caldo lactosa bilis verde brillante (LBVB) al 2% con tubo de Durhan 
Se incuba a 35-37°C por 24 a 48h 
Se observa producción de gas en LBVB (+)
Los tubos positivos de CLST son confirmados como coliformes en caldo LBVB se anotan como + y se llevan a la tabla
Determinación del número más probable (NMP) de coliformes fecales
A partir de los tubos (+) de CLBVB con tubo de Durhan se inocula con un asa:
Tubo que contenga CLBVB al 2% con tubo de Durhan 
Tubo con agua peptonada o caldo triptonado 
2. Se incuban en baño de maría 44,5°C por 24-48h 
3. Se observa formación de gas en los tubos CLBVB y formación de indol (añadir 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovacs al cultivo de agua peptonada o caldo triptonado luego de 24h, su resultado + se observa con coloración roja (capa alcohólica)
Se consideran + los tubos que den gas e indol. Los resultados se llevan a la tabla de NMP
 Obtención de la muestra
 Expresión de resultados
 Expresión de resultados
 Tanto coliformes totales como fecales se expresan por ml o por g según a muestra haya sido medida o pesada 
 Para la expresión de resultados se debe tomar en cuenta:
Si no se emplean los volúmenes de la tabla (0,1; 0,01; 0,001 ml) el resultado se multiplica por la dilución intermedia y se divide por 100
 
NMP/g o ml= N° obtenido en la tabla x Dilución intermedia
 100
2. Más de 3 series los resultados en la tabla del NMP son 3 series consecutivas, tomando como primera aquella que presente todos los tubos +.
Cuando ninguna de las series presente ésta condición se tomará aquella cuya dilución intermedia muestre tubos positivos
En caso que todos los tubos sean + se toma en cuenta las series de diluciones más altas de la muestra, expresándose como estimado del NMP. 
Determinación del número más probable (NMP) de coliformes totales en muestras de agua
Prueba presuntiva
1. Se inoculan volúmenes de 10 ml de muestra en cada uno de los 5 tubos con caldo lauril sulfato triptosa doble concentrado con tubo de Durhan y se mezcla.
Si se requiere más precisión se inoculan 10 tubos
2. Se incuban a 35 °C. después de 24h se agitan, si ambas son negativas se reincuban por 24h adicionales
3. Se consideran tubos + los que presentes gas en el tubo de Durhan o turbidez en el medio, después de 24-48h
Prueba Confirmativa
Se agita suavemente cada uno de los tubos positivos de la prueba anterior y se transfiere una asada del cultivo a tubos con caldo lactosa bilis verde brillante al 2% con tubo Durhan
Se incuba a 35°C por 48h
Se considera + aquellos con producción de gas
 Se cuenta el número de positivos obtenidos y el resultado se lleva a las tablas correspondiente
 Expresión de resultados
 Se expresa como número más probable de bacterias coliformes en 100 ml de muestra 
 En caso que todos los tubos sean - se expresa como “menos de 2,2 o menos de 1,1” según se inocularon 5 ó 10 tubos 
 En caso que todos sean positivos se expresa “más de 16 o más de 23” según sean 5 o 10 tubos 
 Recuento de aerobios mesófilos
Tomar una muestra representativa 
A partir de la primera dilución se preparan las diluciones necesarias utilizando el diluente apropiado
Se coloca 1ml de la muestra o de sus diluciones en placas de petri por duplicado 
Se añade a cada placa de 12 a 15 ml de medio de cultivo fundido y temperado a 45-50°C. se mezcla y se deja solidificar por 8 a 10 minutos.
Se invierten las placas y se incuban según: 
 
	Tipo de MO 
	Temperatura	Tiempo
	Psicotróficos 	 7°C	10 días
	 Mesófilos	 32°C	48h
	Termófilos55°C	48h
6. Luego del período de incubación, se seleccionan preferentemente las placas donde aparezcan entre 30 y 300 colonias y se cuentan todas las colonias
7. Si las placas de todas la diluciones tiene más de 300 colonias, se seleccionan las de valor más cercano a 300
8. Si las placas de todas las diluciones tienen menos de 300 colonias, se seleccionan las de valor más cercano a 30 
9. El N° de colonias promedio de las 2 placas de una misma dilución se multiplica por la dilución correspondiente y éste es el resultado final
10. Si las placas de 2 diluciones consecutivas presentan entre 30 y 300 colonias se multiplica cada recuento por la dilución correspondiente, se establece promedio y éste será el resultado final
 Expresión de resultados
Se expresan como recuento estándar por ml o g de muestra
 El N° de colonias obtenido según 7 y 8 se multiplica por la dilución correspondiente y se expresa “estimado del recuento estándar”
Si no hay colonias en ninguna placa, el recuento se reporta como “menos de 1” multiplicado por la primera dilución de la muestra y se expresa como “Estimado del recuento estándar”
GRACIAS!!!