Manual de microbiologia en alimentos pdf versión 1 - Karla Morales Hernandez

Vista previa del material en texto

MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
A mis Padres, quienes formaron al hombre que soy ahora; a mi Familia, fuente de 
apoyo incondicional; al Ejército Argentino, fragua constante de templanza y a 
Dios nuestro Señor, por permitirme escribir para transmitir enseñanzas. 
 
 
 Teniente Coronel Veterinario D SANTIAGO PABLO BAGGINI 
Servicio de Bromatología - HOSPITAL MILITAR REGIONAL CORDOBA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
ACLARACION 
 
 
 
El presente Manual, es una traducción íntegra y literal de la Obra en inglés, 
MANUAL DE BACTERIOLOGÍA ANALÍTICA EN AGUA Y ALIMENTOS, editada 
por el U. S. Department of Health, Education and Welfare – Washington D. C. – 
20204, Third Edition – 1972, y realizada por el Teniente Coronel Veterinario 
SANTIAGO PABLO BAGGINI, Jefe del Servicio de Bromatología del HOSPITAL 
MILITAR REGIONAL CORDOBA. Obviamente, en la actualidad han cambiado 
algunas técnicas y existen nuevos y mejores medios de cultivo. 
 
 
CORDOBA, 28 de julio de 2007 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
TABLA DE CONTENIDOS 
 
 
 
 
 
CAPITULO I: INTRODUCCION 
 
 
1. Manejo de muestras y muestreo 
 
 
CAPITULO II: PREPARACION DE COMIDAS 
 
 
1. Preparación de comidas homogenadas 
 
a. Aparatología y Materiales 
 
b. Procedimientos 
 
 
CAPITULO III: EXAMEN MICROSCOPICO DE ALIMENTOS 
 
 
1. Aparatología y Materiales 
 
2. Procedimientos 
 
 
CAPITULO IV: RECUENTO DE AEROBIOS MESOFILOS EN PLACA 
 
 
1. Aparatología, Materiales y Medios de cultivo 
 
2. Procedimientos 
 
 
CAPITULO V: ORGANISMO COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLI 
 
 
1. Aparatología, Materiales y Medios de cultivo 
 
2. Test presuntivo para organismos coniformes 
 
3. Test confirmativo para organismos coniformes 
 
4. Test confirmativo para Escherichia coli 
 
5. Método rápido para recuperación de Escherichia coli 
 
3 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
CAPITULO VI: STREPTOCOCUS FECALIS 
 
 
1. Método de recuento en placa 
 
2. Método del NMP 
 
 
CAPITULO VII: STAFILOCOCUS AUREUS 
 
 
1. Método de conteo directo en placa 
 
2. Método del NMP 
 
3. Test de la reacción a la coagulasa 
 
 
CAPITULO VIII: SALMONELLA 
 
 
1. Equipamiento y Materiales 
 
2. Medios y Reactivos 
 
3. Métodos de preparación en distintos alimentos, para el aislamiento de 
Salmonella 
4. Aislamiento de Salmonella 
 
5. Identificación de Salmonella 
 
6. Tests serológicos para Salmonella 
 
 
CAPITULO IX: SHIGELLA 
 
 
1. Equipamiento y Materiales 
 
2. Medios y Reactivos 
 
3. Procedimientos de enriquecimiento para Shigella 
 
4. Aislamiento de Shigella 
 
5. Identificación de Shigella 
 
 
 
 
 
4 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
CAPITULO X: VIBRIO PARAHEMOLYTICUS 
 
 
1. Equipamiento y Materiales 
 
2. Medios y Reactivos 
 
3.Procedimientos para el enriquecimiento y el aislamiento de Vibrio 
parahemolyticus 
 
4. Procedimientos para su identificación bioquímica 
 
5. Características de identidad de Vibrio parahemolyticus 
 
6. Suplemento del método de detección de Vibrio parahemolyticus 
 
 
CAPITULO XI: CLOSTRIDIUM BOTULINUM 
 
 
1. Equipamiento y Materiales 
 
2. Medios y Reactivos 
 
3. Detección de toxinas preformadas en alimentos 
 
4. Detección de Clostridium botulinum Tipos: A, B y E 
 
5. Detección de Clostridium botulinum Tipo E en pescados ahumados 
 
6. Aislamiento de Clostridium botulinum 
 
7. Detección de toxina botulínica en el suero sanguíneo 
 
 
CAPITULO XII: CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 
 
 
1. Equipamiento y Materiales 
 
2. Medios y Reactivos 
 
3. Procedimientos para aislamiento 
 
4. Confirmación de Clostridium perfringens 
 
5. Método de enumeración de alfa-toxina de Clostridium perfringens 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
CAPITULO XIII: BACILLUS CEREUS 
 
 
1. Equipamiento y Materiales 
 
2. Medios y Reactivos 
 
3. Procedimientos para enumeración y aislamiento 
 
4. Identificación de Bacillus cereus 
 
 
CAPITULO XIV: ENUMERACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS 
 
 
1. Generalidades 
 
 
CAPITULO XV: EXAMEN DE ALIMENTOS CONSERVADOS (Conservas enlatadas) 
 
 
1. Exámen de las latas de conserva 
 
2 Incubación de las latas de conserva 
 
3. Apertura de las latas de conserva 
 
4. Exámen de cultivos 
 
5. Examen microscópico 
 
6. Examen del contenido enlatado 
 
7. Evaluación del cierre de la lata 
 
8. Interpretación de resultados 
 
 
CAPITULO XVI: EXAMEN DE ESTERILIDAD EN PRODUCTOS LACTEOS 
 
 
1. Equipamiento y Materiales 
 
2. Procedimientos 
 
3. Interpretación de resultados 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
CAPITULO XVII: EXAMEN MICROSCOPICO DIRECTO DE HUEVOS 
 
 
1. Aparatología y Materiales 
 
2. Huevos líquidos y congelados 
 
3. Productos de huevos secos (en polvo, etc.) 
 
 
CAPITULO XVIII: DETERMINACION SEROLOGICA DE ENTEROTOXINA 
ESTAFILOCOCCICA 
 
1. Equipamiento y Materiales 
 
2. Medios y Reactivos 
 
3. Preparación de Materiales y Medios 
 
4. Procedimientos 
 
a. Enumeración y selección de colonias 
 
b. Producción de enterotoxinas 
 
c. Test de difusión en gel 
 
 
APENDICES 
 
 
A. Medios de Cultivo 
 
B. Reactivos, Diluyentes, Colorantes e Indicadores 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
 
Los Capítulos de ésta obra, han sido preparados por los siguientes miembros de la División de 
Microbiología, Administración de Medicamentos y Alimentos de Washington D.C. 
 
• Arthur P. Durringan: Capítulos I, II, III, IV, VI, XIII, XIV, XV, XVI, y XVII. 
 
• Morris Filshein: Capítulos V, IX y X. 
 
• Edgard F. Baer: Capítulo VII. 
 
• Paul L. Pochna: Capítulo VIII. 
 
• Hain M. Solomon: Capítulo XI. 
 
• Stanley M. Harmon: Capítulo XII. 
 
• Reginald W. Benett: Capítulo XVIII. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
PREFACIO 
 
 
 
La realización de los Análisis Microbiológicos de los Alimentos de la FDA – USA, han hecho 
mucho en el campo de acción de los Laboratorios Distritales. 
Para poder juzgar apropiadamente la calidad microbiológica de un alimento, se dispondrá de una 
utilización efectiva de los métodos específicos de análisis. 
 
Además, resulta esencial lograr un método efectivo para informar los diferentes análisis en un 
mismo laboratorio o en distintas dependencias, y esto es especialmente importante en vista de lo 
extensivo que resulta la distribución de alimentos, tanto a nivel nacional como internacional, así 
como las normativas referidas a la seguridad y calidad de un producto, de un alimento en 
particular o de sus procesos de elaboración 
 
El propósito de la elaboracióndel presente Manual, es el de proporcionar a los laboratorios, los 
métodos necesarios para la identificación cuali y cuantitativa de microorganismos y/o de sus 
productos metabólicos. 
 
Estos métodos, no obstante, no son el final de un camino, pues siempre habrá por salir otros 
superiores y quizá también, igualmente válidos. Por ahora, los aquí presentados, son los más 
utilizados por la FDA y considerados como los más convenientes para la investigación en: 
alimentos, monodrogas, medicamentos y productos de cosmética. 
De acuerdo a lo establecido por la FDA, éste Manual provee los mecanismos de información para 
otras Agencias Gubernamentales, industrias, etc., sobre los métodos de bacteriología analítica 
más comúnmente utilizados por los laboratorios de la FDA para el exámen de alimentos. 
 
La primera y segunda edición del presente Manual, incluían métodos aplicables a alimentos, 
drogas medicinales y cosméticos. Esta tercera edición, se restringe a la metodología aplicable 
primariamente a los alimentos, con base en la Metodología Oficial de la AOAC. 
 
La preparación de ésta obra, ha sido posible gracias al esfuerzo combinado de varios individuos. 
Miembros más informados del staff de ésta División, sometieron a exámen materiales y métodos 
y fueron los responsables de la preparación y de la revisión inicial del borrador. 
 
También han sido muy valiosos los comentarios y sugerencias recibidos por parte de nuestros 
colegas universitarios y de la industria. 
 
 
 
 
9 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
El Dr. Arthur P. Dunningan, miembro Senior de ésta División y por su profunda preparación en 
métodos analíticos, ha sido el coordinador del esfuerzo total para la redacción y la edición de éste 
Manual. 
 
Por último destaco, que resulta evidente la futura incorporación a ésta obra de suplementos, 
revisiones y modificaciones de los métodos aquí presentados. 
Por ello, se valorarán y serán bienvenidas las sugerencias respectivas que por otra parte 
necesitamos, así como de comentarios constructivos para el mejoramiento de él presente libro. 
 
 
 
JOSEPH O. OLSON, Jr 
 
Director de la División de Microbiología 
 
Oficina de Ciencias 
 
AGENCIA PARA LA ADMINISTACION DE ALIMENTOS Y MEDICAMENTOS (FDA) 
 
U S A 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
CAPITULO I: INTRODUCCION 
 
 
1. MUESTREO Y MANEJO DE MUESTRAS 
 
 
La eficacia de un Laboratorio, es el punto de partida para la exactitud de los resultados sobre 
la muestra recibida, siendo por lo tanto de primera importancia. 
 
Las muestras que no fueran recolectadas apropiadamente, o que no fueran manipuladas 
correctamente, o que no fueran representativas, darán resultados de laboratorio que no serán 
válidos o datos sin sentido. 
 
Este principio se aplicará a todas las categorías y a todas las características de las muestras a 
analizar. 
 
Una aplicación uniforme de procedimientos estandarizados en las mismas es esencial y es el 
deseo del analista o investigador para su interpretación. Así, por ejemplo, a partir de un 
pequeño lote de muestra, se puede inferir el resultado de todo un lote de conservas. 
 
Una muestra representativa del total es importante, cuando la investigación tiene como 
misión la de detectar presencia de patógenos o de sus toxinas, los cuales quizás, estén 
dispersos en todo el alimento o cuando el decomiso y posterior destrucción de un embarque 
de alimentos, en relación con los estándares legales, dependa de las demostraciones de la 
presencia de microorganismos patógenos. 
 
Asimismo, las unidades uniformes de una muestra representativa, deberán ser 
significativamente estadísticas con respecto al universo original. 
El mayor interés, radica en seleccionar e identificar suficientes muestras y submuestras en el 
laboratorio. La composición y naturaleza de cada lote de alimento sometido a la aprobación 
estadística de procedimientos de muestreo, puede afectar a la uniformidad y a la 
homogeneidad del total de la muestra. 
La aplicación de procedimientos definidos para muestras sólidas, semisólidas, viscosas y 
líquidas, serán determinadas por el Inspector actuante. 
 
Una muestra simple, puede no ser representativa de la masa de alimentos, pero puede ser la 
mejor alternativa avalable bajo condiciones definidas. 
Es necesaria la consideración de la condición de un alimento sólido, semisólido o viscoso, 
antes de su procesamiento y posterior embalaje. 
 
11 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
Existe una recomendación estadística para la recolección de la muestra, que deberá ser igual a 
la raíz cuadrada del total del lote. Puede que éste sea un número excesivo, sin embargo y para 
una rutina microbiológica el tamaño de la muestra será mayor a la diez (10) unidades 
 
Hay experimentos que avalan ésta cifra de diez unidades, para la representación de un lote 
grande o de un número importante de contenedores a ser muestreados, al igual que 
continentes o envases. 
 
Cuando sea posible, el producto deberá ser llevado al laboratorio en su envase original y sin 
abrir, a efectos de prevenir su potencial contaminación y de poder obtener fidedignamente su 
presentación real para ser ofrecido al público. 
 
De no ser ello posible, por no ser práctica su remisión de ésta manera, se transferirán 
porciones representativas en envases estériles y bajo condiciones asépticas. 
 
Se utilizarán para ello, instrumentos estériles o desinfectados convenientemente al alcohol o a 
la llama, como ser: bisturís, cubiertos, espátulas, platos de metal, etc. 
Esto se hará así, a fin de no comprometer el material y contribuir a su mantenimiento 
preferentemente estéril (Técnicas de Asepsia). 
 
Serán aceptables los envases estériles de plástico de uso comercial, o frascos de vidrio de 
boca ancha y tapa de metal roscada y esterilizados por calor seco (30´ a 160º C). Cada frasco 
estéril deberá contener al menos 100 grs de la muestra a ser analizada etiquetándose 
convenientemente con una tela plástica, e identificando: producto, Nº de lote y fecha del 
proceso. 
 
De ser posible, entregar rápidamente la muestra al laboratorio, manteniendo las condiciones 
originales de la misma. En el caso de muestras líquidas, puede tomarse una adicional para 
control de temperatura y todos estos datos deberán ser chequeados y grabados en el envase 
que se remite al laboratorio. 
Aquí, también se asentará el tiempo que tardó en llegar la muestra, desde su obtención hasta 
su procesamiento. Las muestras se congelarán o se frisarán de acuerdo a su naturaleza y 
envase, así como de acuerdo al tiempo de demora en su entrega y/o transporte al laboratorio. 
 
Algunos microorganismos como Clostridium perfringens, no resisten el frizer, por lo que no 
deberá aplicarse ésta cadena de frío para su investigación. 
 
 
 
 
 
12 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
CAPITULO II: PREPARACION DE COMIDAS HOMOGENADAS 
 
 
1. APARATOLOGÍA y MATERIALES 
 
 
a) Licuadora metálica cónica de una o dos velocidades con control de reóstato y con una 
velocidad máxima de 8000 rpm. 
 
b) Jarra de vidrio o metálica de 1000 ml de capacidad, con tapa y resistente al 
autoclavado (15`a 121º C). Utilizar una jarra estéril por cada espécimen a muestrear. 
c) Balanza de 2000 grs de capacidad y sensibilidad de 0,1 g. 
 
d) Vasos de precipitado de 250 ml, esterilizados y envueltos en papel de aluminio;uno 
por cada muestra a procesar. 
 
e) Instrumental esterilizado. 
 
f) Pipetas graduadas y estériles de: 1, 5 y 10 ml. 
 
g) Solución de buffer fosfato diluido o Solución de peptona esterilizados en autoclave 
(Ver Apéndice B), para cada muestra y en botellas de 500 ml o frascos de 100 ml con 
un pH final de 7,00. 
 
2. PROCEDIMIENTOS 
 
 
a) Se parte de una muestra congelada o de su envase original con no más de 18 hs de 
conservada entre 2º y 5º C. 
b) Tarar la balanza con la jarra o con el vaso de precipitado estériles y colocar en su 
interior en forma aséptica, 50 grs de la muestra de alimento. 
 
c) Dependiendo del propósito del análisis y de la naturaleza de la muestra, se analizará 
 
ésta de manera completa (por ejemplo: helados de crema), o por separado cada 
ingrediente (muestras congeladas y deshidratadas de distintos alimentos en una sola 
muestra). 
 
Se agrega a la licuadora, una solución de buffer fosfato o de peptona en cantidad de 450 
ml y se licúa junto con la muestra por espacio de 2 minutos a 8000 rpm, quedando 
preparada así una solución de 10 
-1
 
 
 
13 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
d) Deberá licuarse el alimento sembrándolo en diferentes diluciones de manera rápida y 
sin pérdidas de tiempo. 
e) Preparar las diluciones necesarias y sucesivas, partiendo de 10 ml de la solución 
madre 10 
-1
 con 90 ml de diluyente estéril y así sucesivamente. 
f) Usar pipetas con capacidad no mayor al 10 % del volumen total a analizar, por 
ejemplo: para 0,1 ml, usar de 1 ml; para 1 ml, utilizar la de 10 ml, etc. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
CAPITULO III: EXÁMEN MICROSCÓPICO DE LOS ALIMENTOS 
 
 
Si se sospecha de que un alimento es la causa de una intoxicación alimentaría (ETA), se debe 
sembrar el mismo en forma directa y a través de un hisopado, o realizar diluciones pero sin 
pérdida de tiempo. 
 
Esto puede suministrar información sobre otros tipos de exámenes que eventualmente deban 
hacerse. 
 
El examen microscópico debe de ser transportado uniformemente aunque el alimento tenga o 
pueda tener o experimentar tratamiento por calor. 
 
1. APARATOLOGÍA y MATERIALES 
 
 
a) Un portaobjetos de vidrio para frotis de cada dilución (1 por c/u). 
 
b) Ansa de platino de 3 – 4 mm de diámetro. 
 
c) Coloración de Gram. 
 
d) Microscopio con objetivo de inmersión. 
 
e) Aceite de cedro para inmersión. 
 
 
2. PROCEDIMIENTOS 
 
 
a) Preparar la extensión en el portaobjetos, de acuerdo con la marca de la dilución 
correspondiente. 
 
b) Secar al aire y fijar a la llama de mechero Bunsen. 
 
c) Realizar inmersión en xilol por 1’ a 2’. 
 
d) Drenar y secar. 
 
e) Realizar coloración de Gram. 
 
f) Observar con objetivo de 100 X en aceite de inmersión. 
 
g) Examinar al menos 10 campos / porta, verificando en especial la presencia de: 
Clostridios, Cocos Gram (+) y Bacilos Gram (-). 
 
 
 
 
 
15 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
CAPITULO IV: RECUENTO DE AEROBIOS EN PLACA 
 
 
1. APARATOLOGÍA y MATERIALES 
 
 
a) Placa de Petri de vidrio de 10 cm de diámetro o de plástico descartable de 9 cm de 
diámetro. 
 
b) Pipetas graduadas de 1, 5, 10 y 11 ml. 
 
c) Frasco de dilución de vidrio borosilicato de 160 ml, con tapa plástica o de goma. 
 
d) Baño María de 45° C 
 
e) Contador de colonias con luz. 
 
f) Estufa de cultivo a 37° C. 
 
g) Registro escrito. 
 
h) 100 ml de buffer fosfato en agua destilada. 
 
i) Agar PCA. 
 
 
2. PROCEDIMIENTOS 
 
 
a) De una muestra madre homogénea, usar pipetas estériles para realizar diluciones 
decimales de: 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
 y 10
-4
. 
b) Prepara las diluciones decimales transfiriendo 10 ml de la dilución previa en 90 ml de 
diluyente. 
c) Agitar cada botella con la dilución para resuspender el material. De allí pipetear 1 ml de 
cada dilución y llevarlo a la placa de Petri que corresponda a ésa dilución. 
 
d) Agregar Agar PCA a 45° C a cada placa convenientemente rotulada; 1 placa por cada 
dilución de cada alimento analizado. 
e) Inmediatamente realizar movimientos rotatorios para mezclar el agar con el inóculo 
(siembra en profundidad), tapar la placa y dejarla solidificar. 
 
f) Inmediatamente de solidificadas las placas, se invertirán y se incubarán 48 hs a 37° C. 
 
g) Seguidamente de la incubación, se contarán todas las colonias registrándose sobre cada 
placa según la dilución. 
 
h) Se registrará e informará como: Nº de colonias de aerobios mesófilos / gramo. 
 
16 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
CAPITULO V: ORGANISMOS COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLI 
 
 
1. APARATOLOGÍA y MATERIALES 
 
 
a) Ídem a IV 1. de a) a g). 
 
b) Baño María a 45° C. 
 
c) Ansa de inoculación de 3 mm de diámetro. 
 
d) Caldo BRILA (Verde Brillante Bilis Lactosa). 
 
e) Caldo LST (Laurel Sulfato Triptosa). 
 
f) Caldo ET. 
 
g) Agar EMB de Levine. 
 
h) Caldo TRIPTONA o TRIPTICASE SOYA. 
 
i) Caldo GLUCOSA Bufferado (Caldo RM – VP) 
 
j) Agar CITRATO de KOSER. 
 
 
2. TEST DE PRESUNCION DE ORGANISMOS COLIFORMES 
 
 
a) Utilizar pipetas estériles y a partir de diluciones de 10-1 a 10-3 o mayores, de ser 
necesario (Ver Capítulo II, 2. a) a g)). 
 
b) Inocular tres tubos con Caldo LST con 1 ml de cada dilución y con campanita de 
Durham. 
c) Tomar cada pipeta y escurrir lentamente el resto de cada una por las paredes del tubo. 
 
d) Permitir que cada pipeta drene por gravedad evitando soplar la misma para apurar el 
proceso, evitando contaminar con el aliento ése material residual. 
e) Incubar los tubos 48 hs a 37° C. 
 
f) Examinar a las 24 hs a fin de detectar posible formación de gas. 
 
g) El gas se observará dentro de la campanita de Durham o por efervescencia del medio a 
la agitación vigorosa del tubo. 
h) Luego de ésta primera vista, reincubar los tubos (-) por otras 24 hs. 
 
i) Si hay gas presente luego de 48 hs de incubación, será considerado como un test (+) 
 
de presencia de coliformes. 
 
17 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
j) Confirmar los tests presuntivos. 
 
3. CONFIRMACION DEL TEST (+) A ORGANISMOS COLIFORMES 
 
 
a) Sacudir suavemente cada tubo por rotación. 
 
b) Transferir con ansa estéril de 3 mm de diámetro, una película de cada tubo (+) a un 
tubo con Caldo BRILA 2%. 
c) Incubar 48 hs a 37° C. 
 
d) Ver pasos anteriores (2., g) a j)). 
 
e) Usar la tabla del Nº más probable (NMP – Apéndice C) en base a los tubos (+) de 
Caldo BRILA. 
f) Reportar como NMP de organismos coliformes/gramo (Apéndice C). 
 
 
4. CONFIRMACION DEL TEST PARA ESCHERICHIA COLI 
 
 
a) Ver 3., a). 
 
b) Transferir con ansa estéril de 3 mm de diámetro, una película de cada tubo (+) de 
Caldo LST a un tubo con Caldo EC. 
c) Incubar cada tubo en Baño María a 45° C por 48 hs. 
 
d) Cada tubo (+) por formación de gas, es tomado para resiembra en estrías con ansa 
sobre Agar EMB de Levine. 
 
e) Incubar 24 hs a 37° C. 
 
f) Tipificar con pruebas bioquímicas IMViC. 
 
 
5. TEST IMViC 
 
 
a. Producción de Indol: 
 
1) De la colonia sospechosa, se inocula con un ansa puntiforme el fondo de cada tubo en 
profundidad, con Agar SIM (Sulfito – Indol – Movilidad). 
 
2) Se incuba 24 hs a 37° C. 
 
3) Se adicionan 0,3 ml de Reactivo de Kovacs. 
 
4) El test dará(+) cuando se forme un anillo rojo en la superficie del medio. 
 
18 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
b. Reacciones de Rojo de Metilo y Voges Proskauer: 
 
1) Inocular con ansa de 3 mm un tubo con 5 ml de Caldo RM – VP. 
 
2) Incubar 48 hs a 37º C. 
 
3) Agregar 0,1 ml de una solución de alfa naftol al 5 % y 0,1 de K(OH) al 40 %. 
 
4) Un resultado (+) al test de VP es cuando se desarrolla un color rojo eosina dentro de 
las siguientes dos horas. 
5) Para la prueba del RM, se reincuban los tubos otras 48 hs a 37º C. 
 
6) Se agregan 5 gotas de Reactivo rojo de metilo. 
 
7) Se considera RM (+) cuando el tubo se vuelve de color rojo y RM (-) cuando queda 
de color amarillo. 
 
c. Utilización del Citrato: 
 
1) Inocular en profundidad con ansa puntiforme, un tubo en pico de flauta con Agar 
CITRATO de KOSER. 
2) Incubar 96 hs a 37º C. 
 
3) El test (+) será cuando el medio de color verde haya virado al azul. 
 
 
d. Producción de gas de Lactosa: 
 
1) Sembrar un tubo con tapa a rosca y Caldo LST (Lactosa – Tripticase – Sulfito). 
 
2) Incubar 48 hs a 37º C. 
 
3) El test (+) será cuando se desarrolle gas en la campanita de Durham (2. g), i)). 
 
 
6. CLASIFICACION e INFORMES 
 
 
a) Clasificar a Escherichia coli como: IMViC + + - - o - + - - , a partir de cultivos 
obtenidos de bacilos Gram (-) no esporulados, Lactosa (+) y Gas (+) luego de 48 hs de 
incubación a 37º C. 
 
b) Determinar por la Tabla del NMP (Apéndice C), basado en los tubos (+) a E. coli por 
IMViC, Lactosa y Tinción de Gram. 
 
 
 
 
 
19 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
Tabla de Tipificación bioquímica según Pruebas IMViC: 
 
 
INDOL RM VP CITRATO OBS 
 
+ + - - Típica E. coli 
 
- + - - Atípica E. coli 
 
+ + - + Típica Intermedia 
 
- + - + Atípica Intermedia 
 
- - + + Típico A. aerógenes 
 
+ - - + Atípico A. aerógenes 
 
 
c) Informar Nº E. coli por Tabla de NMP/gramo. 
 
 
7. METODO RAPIDO PARA LA RECUPERACION DE E. COLI 
 
Este método solamente debiera ser usado en aquellos productos donde la presencia de 
Coliformes no es crítica para la evaluación de la flora microbiana, y no debiera usarse en 
aquellos productos en donde se aplica el método oficial. 
 
a) Aparatología, materiales y medios 
 
1) Igual a Capítulo IV, 1. 
 
2) Baño María a 45º C 
 
3) Caldo LAURYL SULFATOTRIPTOSA (LST) 
 
4) Agar EMB de Levine 
 
5) Caldo TRIPTONA o TRIPTICASE 
 
6) Caldo RM – VP 
 
7) Agar CITRATO de KOSER 
 
8) Buffer Fosfato para dilución 
 
b) Procedimiento 
 
1) Igual a Capítulo V, 1., a) – d) 
 
2) Incubar por 24 hs a 45º C observando la posible formación de gas 
 
3) Sembrar los tubos (+) en Agar EMB de Levine, según Capítulo V, 4. y 5. 
 
4) Informar como NMP de E. coli/gramo – MR (Método Rápido) 
 
20 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
CAPITULO VI: ESTREPTOCOCO FECAL 
 
 
A. METODO DE CONTEO EN PLACA (Conveniente para alimentos en donde se esperan 
un gran número de E. fecales). 
 
1. APARATOLOGÍA, MATERIALES y MEDIOS de CULTIVO 
 
 
a) Ídem a IV, 1. 
 
b) Agar KF 
 
 
2. PROCEDIMIENTO 
 
 
a) Pipetear asépticamente 1 ml de la dilución homogénea del alimento a nalizar, 
identificando la correspondiente placa. 
 
b) Poner en cada placa 10 – 15 ml de Agar KF. 
 
c) Mezclar directamente el inóculo con al agar (siembra en profundidad) y dejar 
solidificar. Por cada serie sembrada, colocar una placa control sin inocular como 
testigo. 
 
d) Invertir las placas e incubar 48 hs a 37° C. 
 
e) Observar las colonias con lupa, luego de incubadas, verificando color, textura y 
tamaño de las mismas. 
f) Seleccionar aquellas placas con 30 a 300 colonias, contando solamente aquellas de 
color rojo o rojas con el centro rosa. 
 
g) Calcular el número de microorganismos/gramo de alimento, multiplicando el 
promedio del número de colonias por el factor de dilución correspondiente. 
 
B. METODO DEL NMP (Recomendable como de uso rutinario en la vigilancia de la calidad 
sanitaria de los alimentos y cuando se espere un número bajo de S. fecales en los mimos). 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
1. APARATOLOGÍA, MATERIALES y MEDIOS de CULTIVO 
 
 
a) Ídem a IV, 1. 
 
b) Caldo Streptococus KF, en tubos de 150 x 15 mm; cada uno con 10 ml de caldo y 
utilizando 5 tubos por cada dilución del mismo. 
 
2. PROCEDIMIENTO 
 
 
a) Se pipetean asépticamente 1 ml y se coloca en el 1er tubo realizándose sucesivas 
diluciones en los 4 restantes con 1 ml de cada tubo al siguiente. 
 
b) Se incuban por 48 hs a 37° C. 
 
c) A las 24 y 48 hs se observarán cambios de color, y si hay viraje al amarillo, ése tubo 
será (+) a S. fecal. 
d) Se seleccionan la dilución mayor y las dos siguientes. 
 
e) Se determina el NMP de S. fecalis/gramo (Apéndice C) según los tubos (+) de las 
tres diluciones. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
CAPITULO VII: STAPHILOCOCUS AUREUS 
 
 
A. METODO DIRECTO DE CONTEO EN PLACA (Conveniente cuando se esperan conteos 
iguales o mayores a 100 S. aureus/gramo de alimento). 
 
1. APARATOLOGÍA, MATERIALES y MEDIOS de CULTIVO 
 
 
a) Ídem a IV, 1. 
 
b) Ídem a II, 1. 
 
c) Espátula de Drigalsky (Varilla de vidrio curvado en forma de palo de hockey). 
 
d) Pipetas de 1 ml graduadas a 0,1 ml. 
 
e) Baño María a 37° C y a 50° C. 
 
f) Incubadora o Estufa a 50° C. 
 
g) Tubo de vidrio de 100 x 13 mm. 
 
h) Caldo TRIPTICASE SOYA o GIOLITTI – CANTONI. 
 
i) Agar BAIRD – PARKER. 
 
j) Caldo CEREBRO CORAZON. 
 
k) Plasma coagulasa de conejo con EDTA, deshidratado. 
 
 
2. PROCEDIMIENTO 
 
 
a) Lo mismo que en Capítulo II, 2. 
 
b) Colocar 0,5 ml sobre la placa de agar BAIRD – PARKER. 
 
c) Distribuir con espátula de Drigalsky esterilizada a la llama (siembra por 
agotamiento). 
d) Cuando el inóculo esté completamente absorbido por el medio, invertir las placas e 
incubarlas 30 hs a 37° C. 
 
e) Seleccionar aquellas placas representativas que contengan entre 20 a 200 colonias. 
 
f) Contar el número de colonias, siguiendo los siguientes grupos: 
 
1) Colonias convexas, negro brillantes, con o sin halo gris, blanco o claro en el 
medio de cultivo opaco. 
 
23 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
2) Iguales al punto anterior pero con un halo claro alrededor y cubriendo el medio. 
 
3) Ídem pero con halo de 1 mm de diámetro. 
 
g) Seleccionar una colonia de cada grupo y se siembre en un tubo con 0,5 ml de Caldo 
CEREBRO CORAZON y se emulsifica. 
 
h) Incubar 24 hs a 37°c. 
 
i) Se añaden 0,5 ml de plasma coagulasa reconstituido y se mezclan con la emulsión 
anterior. 
 
j) Se incuba a 37° C y se examina la formación de grumos desde 1 hasta 6 horas 
posteriores con intervalos de 60’. Cualquier grado de formación de grumos se 
considerará como coagulasa (+) (Figura VII – 1). 
 
k) Se consideran que todos los cultivos darán coagulasa (+) a las 6 hs post incubación. 
 
l) Calcular el número total de colonias representadas por la coagulasa (+) y multiplicar 
por el factor de dilución correspondiente. 
m) Informar como número de S. aureus/gramo. 
 
 
B. METODO DEL NMP (Recomendado como de uso rutinario en la vigilanciade la calidad 
sanitaria de los alimentos y cuando la expectativa sea de hasta 100 S. aureus/gramo). 
 
1. APARATOLOGÍA, MATERIALES y MEDIOS de CULTIVO 
 
 
a) Ídem a Capítulo VII, A., 1. 
 
b) Caldo TRIPTICASE SOYA con 10% de ClNa o Caldo GIOLITTI – CANTONI. 
 
 
2. PROCEDIMIENTO 
 
 
a) Ídem a Capítulo II, 2. 
 
b) Se inoculan tres tubos de Caldo TRIPTICASE SOYA o GIOLITTI – CANTONI, 
con 1 ml de la solución madre del alimento problema. 
 
c) Incubar 48 hs a 37° C. 
 
d) Transferir con ansa estéril de 3 mm a una placa de Agar BAIRD – PARKER. 
 
e) Distribuir el inóculo. 
 
24 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
f) Incubar las placas por 30 hs a 37° C. 
 
g) Ídem a Capítulo VII, A., 2. 
 
h) Informar como NMP de S. aureus/gramo. 
 
 
2. TEST PARA LA REACCION DE LA COAGULASA 
 
 
a) A continuación ver Figura VII – 1: Tipos de Reacciones de Coagulasa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ( - ) 1(+) 2 (+) 3 (+) 4 (+) 
( - ) No se evidencia formación de fibrina 
1 (+) Pequeños grumos no organizados 
2 (+) Pequeño grumo organizado 
3 (+) Gran grumo organizado 
1 (+) Completo contenido coagulado en el tubo, que no se desplaza al invertir el mismo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
CAPITULO VIII: DETECCION E IDENTIFICACION DE SALMONELLA 
 
El aislamiento de Samonella en alimentos, requiere a menudo de diferentes métodos a los 
utilizados en los Laboratorios Clínicos de la salud pública humana. Por lo tanto no será posible, 
recomendar un método simple para aislamiento de Salmonella y que el mismo sea recomendable 
para todo tipo de alimentos y para todos los serotipos de la enterobacteria en estudio. 
Todos los métodos sin embargo, son esencialmente similares en sus principios y en los 
procedimientos de preenriquecimiento, enriquecimiento, cultivo en placas con agar selectivo y la 
identificación taxonómica de aquellas colonias sospechosas de ser Salmonella. 
 
La complejidad de estos procedimientos, es atribuible al hecho de que ésta Enterobacteria en 
particular se distribuye en forma directa o indirecta desde una contaminación fecal. 
 
Los métodos presentes tratan de favorecer el desarrollo de Salmonella, en detrimento de otros 
microorganismos competitivos por restricción de nutrientes. 
Por regla general, el preenriquecimiento, favorece una rápida recuperación de Salmonellas que 
pudieran haber sido fisiológicamente inactivadas por diversos traumas y que a raíz de la sospecha 
de su existencia en alimentos, se les dio a los mismos diferentes tratamientos como: desecación, 
uso de conservantes, frisado, aumento de la presión osmótica y cambios de pH, entre otros. 
Como los medios de cultivo normales no llevan por lo general el agregado de inhibidores 
químicos, se utilizan medios selectivos que sí los llevan, intentando inhibir de ésta forma, al 
grupo de coliformes y de otros microorganismos que pudieran competir con Salmonella. 
 
Hoy en día, muchos alimentos reciben alguno de los siguientes tratamientos térmicos en su 
procesado: desecación, deshidratación, pulverización, etc; es así que el paso inicial será 
reconstituir dicho alimento en un caldo no selectivo como preenriqueciemiento y el de elección 
será el Caldo LACTOSADO. 
Tales alimentos presentan usualmente una población microbiana reducida, pero de haber 
Salmonellas presentes, las mismas probablemente, estarán inhibidas o disminuidas en su 
crecimiento por otros gérmenes más competitivos. 
 
Es de extrema importancia, ajustar el pH para obtener los mejores resultados en nuestra 
búsqueda. Los antisueros “O” somático y flagelar polivalente “H”, no poseen los anticuerpos 
necesarios para reaccionar ante los más de 1.000 serotipos diferentes de Salmonella presentes en 
la actualidad y aceptados por el esquema de Kauffmann – White. 
 
 
 
26 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
Algunos resultados serológicos negativos pueden ocurrir con algunos serotipos de Salmonella 
cuando se testean con éstos antisueros. 
La identificación de tales cultivos puede ser resuelta por tests bioquímicos y por otros análisis 
serológicos. 
 
A. EQUIPAMIENTO y MATERIALES 
 
 
a) Recipientes estériles para mezclar (Capítulo II, 1.). 
 
b) Vasos de precipitado de 500 ml. 
 
c) Espátula de Drigalsky. 
 
d) Balanza con sensibilidad de 0,1 gr y pesas de hasta 2.000 grs de capacidad. 
 
e) Balanza con sensibilidad de 5 gr y pesas de hasta 120 grs de capacidad. 
 
f) Estufa de cultivo de 37° C. 
 
g) Baño María de 50° C. 
 
h) Cucharas estériles para pesar el alimento. 
 
i) Placas de Petri estériles de 100 x 15 mm, plásticas o de vidrio. 
 
j) Pipetas estériles de 1 ml de capacidad graduadas en 0,01 ml; de 5 y 10 ml graduadas 
en 0,1 ml y de 0,2 ml graduadas en 0,02 ml. 
k) Ansa de platino para siembra de 3 mm de diámetro. 
B. MEDIOS DE CULTIVO y REACTIVOS 
a) Caldo LACTOSADO. 
 
b) Caldo SELENITO CISTINA. 
 
c) Caldo TETRATIONATO. 
 
d) Agar VERDE BRILLANTE. 
 
e) Agar SS (Salmonella – Shigella). 
 
f) Agar SULFITO de BISMUTO (Actualmente se utiliza el Agar SIM: Sulfito – Indol 
 
– Movilidad y es un medio semisólido). 
 
g) Agar TSI (Triple azúcar – hierro). 
 
h) Agar TRIPTONA o TRIPTOFANO. 
 
27 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
i) Caldo RM – VP. 
 
j) Agar CITRATO de SIMMONS. 
 
k) Agar UREA. 
 
l) Caldo MALONATO. 
 
m) Agar LISINA HIERRO. 
 
n) Caldo LISINA DESCARBOXILASA. 
 
o) Caldo CIANURO de POTASIO. 
 
p) Caldo ROJO FENOL. 
 
q) Caldo PURPURA CARBOHIDRATO. 
 
r) Agar Mac CONKEY. 
 
s) Caldo NUTRITIVO. 
 
t) Reactivo de KOVACS para Test de Indol. 
 
u) Reactivo para VOGES – PROSKAUER. 
 
v) Indicador para ROJO de METILO. 
 
w) Solución Fisiológica estéril. 
 
x) Solución Fisiológica estéril formalizada. 
 
y) Antisuero polivalente Salmonella somático (O). 
 
z) Antisuero polivalente Salmonella flagelar (H). 
 
aa) Pool de antisuero polivalentes Salmonella (O) Grupos: A, B, C1, C2, D, E1, E2, E3, 
E4, F, G, H, I y Vi. 
 
bb) Antisuero Salmonella flagelar (H) “Spice – Edwards”. 
 
cc) Tiras indicadoras de pH o Peachímetros digitales. 
 
dd) Agua destilada estéril. 
 
ee) Solución verde brillante al 1%. 
 
ff) Caldo TRIPTICASE SOYA con 10 % de ClNa. 
 
 
C. METODO PARA AISLAMIENTO DE SALMONELLA EN ALIMENTOS 
 
 
• Procedimiento para: Huevos (enteros, claras o yemas) deshidratados, Huevos 
pasteurizados líquidos o congelados, Productos de pastelería o panadería, y 
Fórmulas infantiles. 
 
28 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
a) Si la comida fuese congelada, debe trabajarse rápidamente para evitar aumentar el 
número de microorganismos o la destrucción de Salmonellas, evitando sobrepasar 
los 45° C por más de 15’, ni trabajar por debajo de los 5 – 10° C. 
 
b) Pesar asépticamente 25 grs de la muestra problema. 
 
c) Añadir 225 ml de Caldo LACTOSADO. Si la muestra fuese pulverulenta, agregar 
primero 10 a 15 ml de caldo, homogeneizando bien y sin grumos. Luego 
completar el volumen anteriormente indicado. 
 
d) Tapar la mezcla dejándola por 60’ a temperatura ambiente. 
 
e) Determinar el pH de la misma. 
 
f) De ser necesario, ajustar a pH 7,00 con solución estéril 1 N de Na (OH) o ClH. 
 
g) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
h) Continuar según D., 1 – 9, de éste mismo Capítulo. 
 
 
• Procedimiento para: Leches descremadas y en polvo.a) Pesar asépticamente 100 grs de la muestra y llevar a un recipiente estéril de 2.000 
ml de capacidad. 
b) Agregar 1.000 ml de agua destilada estéril, mezclando adecuadamente. 
 
c) Determinar el pH ajustándolo en el caso de encontrarse por debajo de 6,6, con Na 
(OH) 1 N hasta pH 6,8 + - 0,2. 
d) Añadir 2 ml de solución acuosa de VERDE BRILLANTE al 1% y mezclar. 
 
e) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
f) Continuar según D., 1 – 9, de éste mismo Capítulo. 
 
 
• Procedimiento para: Productos con huevos no pasteurizados y congelados. 
 
a) Pesar por duplicado y asépticamente, 25 grs de la muestra. 
 
b) Agregar 225 ml de Caldo SELENITO CISTINA en una muestra y 225 ml de 
Caldo TETRATIONATO en la otra. 
 
c) De ser necesario, ajustar a pH 7,00 con Na (OH) 1 N. 
 
d) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
e) Continuar según D., 3 – 9, de éste mismo Capítulo. 
 
 
 
29 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
• Procedimiento para: Productos farináceos (pastas secas y frescas). 
 
a) Pesar asépticamente 25 grs de la muestra. 
 
b) Agregar 225 ml de Caldo LACTOSADO, y centrifugar durante 2’ a 8.000 rpm. 
 
c) Transferir asépticamente el sobrenadante a otro recipiente estéril. 
 
d) Ajustar el pH que se encuentre por debajo de 6,6 a 7,00 con Na (OH) 1 N. 
 
e) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
f) Continuar según D., 3 – 9, de éste mismo Capítulo. 
 
 
• Procedimiento para: Carnes animales y de pescados. 
 
a) Productos cocinados, procesados y/o deshidratados. 
 
1) Pesar asépticamente 25 grs del producto a investigar. 
 
2) Agregar 225 ml de Caldo LACTOSADO estéril, y centrifugar durante 2’ a 
8.000 rpm. 
3) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
4) Continuar según D., 1 – 9, de éste mismo Capítulo. 
 
b) Productos crudos y/o altamente contaminados. 
 
1) Pesar asépticamente 25 grs por duplicado de cada producto a investigar. 
 
2) Agregar 225 ml de Caldo SELENITO CISTINA estéril en una muestra y 
225 ml de Caldo TETRATIONATO VERDE BRILLANTE estéril en la 
muestra duplicada. 
 
3) Mezclar ambas muestras por 2’. 
 
4) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
5) Continuar según D., 3 – 9, de éste mismo Capítulo. 
 
 
D. AISLAMIENTO DE SALMONELLA 
 
1) De las incubaciones anteriores, tomar 1 ml en forma estéril y llevarlo a un tubo con 
10 ml de Caldo SELENITO CISTINA estéril y a otro semejante pero con 10 ml de 
Caldo TETRATIONATO estéril. 
 
2) Incubarlos por 24 hs a 37° C. 
 
 
 
30 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
3) De cada tubo, tomar con un ansa de 3 mm y sembrar en estrías sobre una placa de: 
Agar SS, Agar VERDE BRILLANTE y Agar SIM. 
4) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
5) Colonias típicas de Salmonella en: 
 
a) Agar VERDE BRILLANTE: De color rosa pálido a fucsia, opacas a translúcidas 
con un halo circundante de rosado a rojo. Algunas colonias pueden aparecer no 
obstante, con tonalidades verde transparente a verde amarillentas o decididamente 
verdes. 
b) Agar SS: Incoloras a rosa claras, opacas, transparentes a translúcidas. Alguna 
colonias pueden presentar centro negro. 
c) Agar SIM: Marrones a negras y a veces con brillo metálico. Halos marrones que 
luego pasan a negros. Otras colonias pueden ser verdes con pequeños halos 
obscuros alrededor. 
 
6) De cada colonia típica, se saca material con un ansa puntiforme y se siembran tubos 
en pico de flauta con Agar TSI. Puede sin embargo, se necesaria otra incubación por 
24 hs a 37° C si no se vieran colonias típicas. 
 
7) Incubar los tubos de Agar TSI por 24 hs a 37° C. 
 
8) Los tubos (+) a Salmonella, darán: Reacción alcalina (tonalidad roja del medio) en 
 
el pico de la flauta y ácida en el culote del tubo (tonalidad amarilla del medio). 
Algunas veces habrá producción de SH2 (Sulfuro de Hidrógeno o Acido 
Sulfhídrico), que podrá ennegrecer total o parcialmente al medio. 
9) Realizar pruebas de tipificación bioquímica y sexológica en por lo menos tres 
muestras de Caldo SELENITO CISTINA y en otras tres de Caldo 
TETRATIONATO. 
 
 
E. IDENTIFICACION DE SALMONELLA 
 
a) Cultivos Mixtos 
 
1) Tomar 1 porción de las colonias del pico de flauta del Agar TSI y resembrar en 
estrías en una placa de Agar Mac CONKEY o de Agar VERDE BRILLANTE. 
 
2) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
 
 
31 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
3) En Agar Mac CONKEY, las colonias típicas son transparentes a incoloras con 
centro obscuro. En Agar VERDE BRILLANTE, serán de rosas a fucsias con un halo 
rosado a rojo. 
 
b) Cultivos Puros 
 
1) Test de Ureasa: 
 
a. Repicar cada colonia sospechosa en Agra UREA, incubando por 24 hs a 37° C. 
 
b. Descartar a Ureas (+) (rosados) y conservar a los Ureas (-) (amarillos sin 
cambio de color). 
 
c) Test de Screening para estudio serológico flagelar (H) 
 
1) Transferir material de una colonia en tubo de Ureasa (-) a un tubo con Caldo 
BHI, incubándolo por 5 – 6 hs a 37° C o a un tubo con Caldo TRIPTICASE SOYA, 
incubándolo por 24 hs a 37° C (Test del mismo día o Test del día siguiente, según 
correspondiera). 
2) Por cada 5ml de Caldo, agregar 2,5 ml de Solución salina isotónica estéril. 
 
3) Seleccionar 2 tubos y testear con Antisuero Salmonella Flagelar (H): 
 
• En tubos para tests serológicos, se colocan 0,5 ml de antisuero polivalente 
flagelar (H) diluido convenientemente. 
 
• Se adiciona a cada tubo, 0,5 ml de los tubos preparados en c), 2). 
 
• Se prepara un tubo control con 0,5 ml de solución salina + 0,5 ml de antígeno. 
 
• Incubar por una hora a Baño María de 50° C. 
 
• En una hora, observar con intervalos de 15’: 
 
* Positivos: Aglutinación de tubos problemas y no aglutinación en el control. 
 
* Negativos: Ninguna aglutinación en ninguno de los tubos. 
 
* No específicos: Aglutinan ambos tubos. Se requiere de tests adicionales con 
el Método “Spicer – Edwards” flagelar (H) de siete tubos. 
 
d) Test de Cultivos Ureasa (-): 
 
1) Agar LISINA HIERRO (LIA) 
 
a. Sembrar en pico de flauta tomando una muestra del culote de un tubo con Agar 
TSI. 
 
b. Incubar por 48 hs a 37° C. 
 
c. Examinar a las primeras 24 hs. 
 
32 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
d. Salmonella sp dará una reacción alcalina con un color púrpura en todo el medio. 
 
En los casos (-), hay rojo en el pico de flauta y culote amarillo. 
 
2) Caldo LISINA DESCARBOXILASA 
 
a. Inocular el caldo con una colonia de Agar TSI. 
 
b. Incubar por 48 hs a 37° C. 
 
c. Examinar a las primeras 24 hs. 
 
d. Salmonella sp alcalinizará el caldo dándole una tonalidad púrpura homogénea. 
En los casos (-), el medio continuará de color amarillo. 
 
3) Caldo DULCITOL ROJO FENOL 
 
a. Inocular el caldo con una colonia de Agar TSI. 
 
b. Incubar por 48 hs a 37° C. 
 
c. Examinar a las primeras 24 hs. 
 
1. Test (+): Salmonella sp dará formación de gas y una reacción ácida (color 
amarillo). 
2. Test (-): Reacción alcalina con un color rojo en todo el medio y sin formación 
de gas. 
 
4) Caldo TRIPTOFANO 
 
a. Inocular el caldo con material de Agar TSI. 
 
b. Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
c. Repicar en Caldo MALONATO 
 
1. Incubar por 48 hs a 37° C. 
 
2. Test (+): Vira el medio a color azul. 
 
3. Test (-): Continúa el medio de color verde. 
 
d. Repicar en Agar INDOL 
 
1. Inocular desde Caldo TRIPTOFANO. 
 
2. Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
3. Adicionar 2 – 3 gotas de Reactivo de KOVACS. 
 
4. Test (+): Formación de anillo rojo en la superficie del medio. 
 
5. Test (-): Ausencia del anillo. 
 
e. Repicar en Caldo RM – VP 
 
1. Inocular desdeAgar TSI. 
 
33 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
2. Incubar por 48 hs a 37° C. 
 
(a). Test VP 
 
(1) En 1 ml del cultivo anterior, agregar 0,6 ml del Reactivo de VP (alfa 
naftol) y agitar. 
 
(2) Agregar 0,2 ml de Na (OH) 40% y agitar. 
 
(3) Leer luego de 4 hs a temperatura ambiente; en los (+) habrá 
 
desarrollo de eosina con un color rojo, mientras que Salmonella sp dará 
(-), es decir que el medio no virará su coloración. 
 
(a). Test RM 
 
(1) En 1 ml del cultivo de e., 1., 2., agregar 5 – 6 gotas de Solución 
ROJO de METILO. 
 
(2) Leer inmediatamente; en los (+) habrá un color rojo persistente 
(Salmonella sp), mientras que en los (-) el medio no virará su coloración 
amarilla normal. 
 
f. Agar CITRATO de SIMMONS 
 
1. Inocular desde Agar TSI (flauta y culote). 
 
2. Incubar por 96 hs a 37° C. 
 
3. Test (+): El color verde del medio, vira al azul con formación de colonias. 
 
4. Test (-): No hay formación de colonias ni cambio de color en el medio. 
 
5. Salmonella sp, normalmente dará resultados (+). 
 
e) Resultados que indican ausencia de Samonella sp: 
1) Indol (+) y Test Serológico Flagelar (H) (-). 
 
2) Caldo KCN (+) y Lisina Descarboxilasa (-). 
 
3) Caldo KCN (+), VP (+) y RM (-). 
 
 
F. TEST SEROLOGICO PARA SALMONELLA SP 
 
a) Test en placa somática polivalente 
 
1) Con un lápiz de alcohol, se delimitará en un portaobjetos o en una placa de Petri, 
un área de 1 x 2 cm. 
 
2) En cada sección desleír una porción de colonia de la flauta de Agar TSI más una 
gota de solución salina isotónica. 
 
34 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
3) En una de las secciones, añadir 1 gota de antisuero somático polivalente (O) de 
Salmonella, mezclando bien por espacio de 1’. 
4) Observar inclinando el preparado con buena iluminación. 
 
5) Cualquier grado de aglutinación observada, se interpretará como resultado 
(+). (+): Aglutinación de la mezcla, no aglutinación del control salino. 
(-): No aglutinación de ninguna sección. 
 
No específica: Aglutinación de ambas secciones. 
 
b) Determinación de grupos somáticos 
 
1) Seguir lo indicado en los pasos anteriores. 
 
2) Continuar con lo indicado en la Sección 41.038 del Método Oficial de Análisis 
(AOAC – 1970). 
 
c) Test del Método en tubos para Antígeno Polivalente Flagelar (H) 
 
1) Ver E., c). 
 
d) Test en tubos para “Spicer – Edwards” flagelar (H) 
 
1) Ver E., c). 
 
 
TABLA VIII – 1: CARACTERISTICAS de SALMONELLA y NO SALMONELLA 
 
Test o Substrato Salmonella A Samonella B No Salmonella Arizona 
 
Ureasa - - + - 
 
Lisina Descarboxilasa + + - + 
 
Rojo Fenol Dulcitol AG AG/A/- - - 
 
Caldo KCN - - + - 
 
Caldo Malonato - - +/- + 
 
Indol - - + - 
 
Test flagelar poliv. + + - +/- 
 
Test somático poliv. + + - +/- 
 
Caldo lactosa rojo fenol - - AG AG/A/- 
 
Caldo sucrosa rojo fenol - - AG - 
 
VP - - + - 
 
RM + + - + 
 
Agar Citrato + +/- +/- + 
 
35 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
CAPITULO IX: SHIGELLA 
 
Son sospechosos los alimentos que requieren un procesado manual o un mínimo calentamiento 
antes de su consumición. Pueden ser productos animales o productos frescos listos para ser 
consumidos. Es altamente probable en aquellos productos con bruscas variaciones de pH (5,5 a 
7,5). En general, los alimentos con elevada incidencia de Coliformes, Escherichia coli y 
Salmonellas, serán también sospechosos de Shigella. 
 
A. EQUIPAMIENTO y MATERIALES (Semejantes a Samonella, en Capítulo VIII, A.) 
 
 
B. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 
 
1. Antisuero somático de Shigella poligrupos: A, A1, B, C, C1, C2, D y AD. 
 
2. Caldo CEREBRO CORAZON. 
 
3. Caldo para fermentación de carbohidratos. 
 
4. Agar CITRATO DESOXYCHOCOLATE. 
 
5. Caldo GRAM (-). 
 
6. Agar CITRATO DE KOSER. 
 
7. Caldo RM – VP. 
 
8. Caldo TRIPTONA. 
 
9. Caldo KCN. 
 
10. Agar EMB de Levine. 
 
11. Caldo MALONATO. 
 
12. Agar SIM. 
 
13. Agar NUTRITIVO. 
 
14. Caldo NUTRITIVO. 
 
15. Caldo SELENITO CISTINA. 
 
16. Agar TSI. 
 
17. Caldo UREA. 
 
18. Agar XLD. 
 
19. Solución ALFA NAFTOL. 
 
20. Buffer fosfato para dilución. 
 
21. Reactivo de KOVACS. 
 
36 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
22. Solución de ROJO de METILO. 
 
23. Solución salina estéril. 
 
24. Reactivo de VOGES – PROSKAUER. 
 
 
C. PROCEDIEMIENTO PARA EL ENRIQUECIMIENTO DE SHIGELLA 
 
1. Enriquecimiento con Caldo GRAM (-): 
 
a. Pesar asépticamente 10 grs de la muestra. 
 
b. Añadir a 20 ml de Caldo GRAM (-) y dispersar completamente. 
 
c. Completar a 240 ml con ese mismo caldo. 
 
d. Tapar y mezclar la solución. 
 
e. Incubar por 16 hs a 37° C. 
 
f. Sembrar en medios selectivos (XLD, DC, EMB. . .) y continuar con el exámen. 
 
g. Reincubar por otras 24 hs a 37° C. 
 
2. Enriquecimiento con Caldo SELENITO CISTINA: 
 
a. Pesar asépticamente 25 grs de la muestra y completar a 225 ml con Caldo 
 
SELENITO CISTINA. 
 
b. Incubar por 16 hs a 37° C. 
 
c. Sembrar en medios selectivos (XLD, DC, EMB. . .) y continuar con el exámen. 
 
d. Reincubar por otras 24 hs a 37° C. 
 
 
D. AISLAMIENTO DE SHIGELLA 
 
1. Mezclar suavemente y sembrar los medios selectivos con ansa de platino de 3 mm de 
diámetro. 
2. Incubar las placas por 24 hs a 37° C. 
 
3. En todos los medios selectivos, Shigella aparecerá con colonias gris pizarra 
completas, con reflejos a la luz y con el tamaño acorde al medio inhibitorio utilizado. 
Las colonias en Agar XLD, aparecen también de color rosa y rodeadas de un halo 
rosado cuando se ven a luz transmitida. 
4. Repicar las colonias sospechosas en Agar TSI en pico de flauta, en toda la superficie 
y en el culote. 
 
 
 
37 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
5. reincubar las placas por otras 24 hs a 37° C si el crecimiento no fuese francamente 
visible. 
6. Incubar el Agar TSI por 24 hs a 37° C. Los cultivos (+) a Shigella darán flautas 
alcalinas rojas y culotes ácidos amarillos sin producción de gas SH2. 
 
7. Si no hubiera reacciones típicas, reincubar los tubos de TSI por otras 24 hs a 37° C. 
 
8. Cultivos mixtos: 
 
a. Realizar una suspensión liviana con solución fisiológica estéril. 
 
b. Sembrar en estrías sobre Agar BHI. 
 
c. No usar medios inhibidores. 
 
d. Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
e. Sembrar en Agar TSI. 
 
 
E. IDENTIFICACION DE SHIGELLA 
 
1. Tests preliminares 
 
a. Test de Ureasa: 
 
1) Transferir con ansa de 3 mm una porción de colonias de TSI a Caldo UREA, 
incubando por 24 hs a 37° C. 
2) Descartar Ureas (+) de color rojo. 
 
3) Retener para futuros estudios las Ureas (-) de color amarillo anaranjado. 
 
b. Caldo NUTRITIVO: 
 
1) Inocular tubos con colonias de TSI. 
 
2) Utilizar éste medio para control de inóculo y chequear su movilidad. 
 
c. Agar NUTRITIVO: 
 
1) Sembrar desde cultivos en TSI. 
 
2) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
3) Utilizar éste crecimiento para obtener cultivos puros. 
 
4) Testear con Coloración de GRAM: Shigella es Gram (-); Bacilo de 1 – 3 micras x 
0,4 – 0,6 micras; no capsulado, no esporulado y por lo general solo y separado. 
 
d. Test de Movilidad: 
 
1) Inocular un tubo de Agar SIM tomando material de Agar TSI con un ansa 
puntiforme, de manera vertical y con una profundidad de aproximadamente 5 mm. 
 
38 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.comhttp://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
2) Incubar durante 48 hs a 37° C. 
 
3) Un crecimiento circular a la columna de siembre, se considera como movilidad 
 
(+) y debemos tener en cuenta que Shigella en no móvil o movilidad (-). 
 
2. Otras pruebas bioquímicas 
 
El microorganismo sospechoso, es Gram (-), inmóvil, ureasa (-) y debe seguir siendo 
 
sembrado en éstos medios de cultivo: 
 
a. Caldo KCN: 
 
1) Inocular el Caldo KCN con ansa de 3 mm según E, 1, h. 
 
2) Incubar por 48 horas a 37° C. 
 
3) El Caldo KCN (+) dará turbidez en el tubo, mientras que se mantendrá límpido en 
el caso de Shigella. 
 
b. Caldo MALONATO: 
 
1) Inocular según 1) del paso anterior. 
 
2) Incubar por 48 horas a 37° C. 
 
3) Una reacción (+) se indica por el cambio en el color del indicador que pasará del 
verde al azul oscuro; mientras que Shigella es (-), o sea, sin cambios de color. 
 
c. Test del INDOL: 
 
1) Ídem a b., 1). 
 
2) Incubar por 48 horas a 37° C. 
 
3) Agregar 0.5 ml del Reactivo de KOVACS y agitar el tubo suavemente. 
 
4) La prueba (+) se indica por un anillo superior de color rojo profundo; Shigella 
puede causar la prueba positiva o negativa. 
d. Test RM y VP: 
 
1) Inocular un tubo con Caldo MR – VP de acuerdo a c., 1). 
 
2) Incubar 48 a 37° C. 
 
3) Realizar Test de VOGES PROSKAUER (Capítulo VIII, E.) y Test de ROJO de 
METILO (Capítulo VIII, E.) 
e. Utilización del Citrato: 
 
1) Inocular un tubo con Agar CITRATO de KOSER en pico de flauta y llegando al 
culote según d., 1). 
2) Incubar 4 – 5 días a 37° C. 
 
39 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
3) Una prueba (+) consistirá en un visible crecimiento que enturbiará el medio y lo 
pasará a color azul, mientras que Shigella será (-). 
 
3. Reacciones de fermentación en medios carbohidratados 
 
a. Inocular en Caldos con distintos azúcares desde el cultivo madre. 
 
b. Incubar 4 – 5 días a las 35'C. 
 
c. Examinar diariamente producción de ácido y de gas. 
 
d. Shigella no produce el ácido en: lactosa, sucrosa, salicina, inositol, y adonitol; el 
ácido se produce en glucosa, y puede o no producirse en: maltosa, arabinosa, xylosa, 
y manitol. Asimismo, Shigella no produce gas en éstos hidratos de carbono. 
 
4. Identificación serológica presuntiva de Shigella (Test de aglutinación en placa) 
 
a. Pruebe un crecimiento de 24 hs de Shigella en Agar NUTRITIVO con el 
agregado de poligrupos somáticos: A, A1, B, C, C1, C2, D y Alkalescens – Dispar 
(A – D). 
 
b. Emulsionar el crecimiento en 2 ml de solución salina al 0.85% para lograr una 
suspensión algo pesada. 
c. Marque ocho zonas de 10 mm en una placa de Petri con un lápiz de cera. 
 
d. Localizar una gota de la suspensión de b. en cada borde superior izquierdo de 
cada zona dibujada. 
 
e. Colocar en la 1ra zona, 0,05 ml de antisuero A, la misma cantidad pero de A1 en 
la segunda y así sucesivamente. 
f. Colocar una zona extra con una gota de solución salina al 0,85% como control de 
autoaglutinación. 
 
g. Mezclar cada zona con los respectivos antisueros ayudados con una aguja. 
 
h. Usualmente la aglutinación no será rápida, sino que podrá demorarse entre 3 a 4’, 
dando casi siempre una floculación total rodeada de líquido clarificado. 
i. Una aglutinación (+) con los grupos: A, A1, B, C, C1 y C2, es presuntiva 
evidencia de presencia de Shigella, no obstante, deberá esperase el tiempo máximo 
para una interpretación final en cada reacción. 
 
 
 
40 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
j. En los casos (-), puede calentarse la suspensión celular de b. por un lapso de 30’ a 
efectos de destruir al antígeno K que puede interferir en la reacción. Repetir 
nuevamente el Test de aglutinación. 
 
5. Características del Grupo Shigella 
 
a. Bacilo Gram (-) inmóvil. 
b. Reacción negativa a: Urea, SH2, VP y Citrato. 
 
c. No desarrolla en Caldos KCN ni MALONATO. 
 
d. Indol (-) o (+). 
 
e. Reacción ácida (-) en: Lactosa, Sucrosa, Salicina, Inositol y Adonitol. 
 
f. Reacciones ácidas negativas o positivas pero sin producción de gas en: Glucosa, 
Maltosa, Arabinosa, Xylosa y Manitol. 
 
g. No produce gas en caldos carbohidratados. 
 
h. Presuntiva evidencia con aglutinaciones (+) en grupos de antisueros: A, B, C y D. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
CAPITULO X: AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE VIBRIO 
 
PARAHEMOLYTICUS 
 
 
Vibrio parahemolyticus es un microorganismo marino cuya identidad fue establecida en 1963, 
por Sakasaki y colaboradores. Es un germen enteropatogénico, halófilo, Gram (-), anaerobio 
facultativo y presente en todos los mares del mundo. En Japón, donde la dieta diaria es en base a 
pescados, es la bacteria con mayor clínica de epidemias de gastroenteritis. Está presente de 
manera natural en muchas especies marinas y de hecho en los EEUU, se lo ha podido encontrar 
tanto en peces como en crustáceos provenientes del Golfo de México, y de los Océanos Atlántico 
y Pacífico. 
 
En el verano de 1971, ocurrió en Maryland una sucesión de casos de intoxicaciones atribuidas a 
V. parahemolyticus en cangrejos hervidos y salados, que constituyeron la primera evidencia 
epidemiológica de intoxicación en dichos alimentos por ésta bacteria dentro de los EEUU, ya que 
la misma fue aislada tanto en pacientes como en las comidas contaminadas. 
A. EQUIPAMIENTO y MATERIALES 
 
1. Semejantes a Samonella, en Capítulo VIII, A. 
 
2. Hisopos de algodón. 
 
 
B. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS (Todos los medios de cultivo utilizados, 
deberán tener al menos un 2 – 3% mas de lo normal en concentraciones de ClNa). 
1. Agua peptonada alcalina. 
 
2. Medio de cultivo nutritivo para HALOFILISMO (Caldo HSCM). 
 
3. Caldo RM – VP. 
 
4. Caldo (TSB) y Agar TRIPICASE SOYA (TSA) con 3% de ClNa. 
 
5. Caldo SALINO GLUCOSADO (GSTB). 
 
6. Caldo GLUCOSADO HUGH – LIEFSON. 
 
7. Agar SIM. 
 
8. Gelatina. 
 
9. Medio carbohidratado. 
 
10. Caldo ARGININA – LISINA – DESCARBOXILASA. 
 
11. Caldo TRIPTICASE SALADO. 
 
42 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
12. Medio de transporte CARY – BLAIR. 
 
13. Agar TCBS (TIOSULFATO – CITRATO – BILIS – SUCROSA – SALADO). 
 
14. Agar TSI. 
 
15. Caldo TRIPTONA. 
 
16. Medio salino en gradiente. 
 
17. Coloración de GRAM. 
 
18. Reactivo de KOVACS. 
 
19. Solución de Fenildiamina. 
 
20. Solución de ClNa 3% en agua destilada. 
 
21. Reactivo para VOGES – PROSKAUER. 
 
22. Creatina en cristales. 
 
23. Aceite de Parafina estéril. 
 
24. Agar Test KANAGAWA – WAGATSUMA. 
 
 
C. PROCEDIMIENTO PARA AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE V. 
PARAHEMOLYTICUS 
 
1. Muestra de deyecciones: La importancia de de obtener al germen desde hisopados 
anales, materia fecal o vómitos de personas enfermas, no debe ser subestimada. Es 
altamente probable hallar organismos Kanagawa (+) que son responsables en 
definitiva de dichos brotes. La muestra deberá obtenerse de forma rápida al igual que 
su transporte al laboratorio, pues la sobrevida es corta. 
 
a. Primer día 
 
1) Si el tránsito será de más de 8 horas: 
 
a) Colocar la muestra de la deyección en el Medio de transporte de CARY – 
 
BLAIR. 
 
b) En el laboratorio, sembrar en estrías sobre Agar TCBS. 
 
c) Proceder según D., 1. (Identificación Bioquímica) de éste mismo Capítulo. 
 
2) Si el tránsito será de 8 horas o menos: 
 
a) Colocar la muestra de la deyección enAgua peptonada alcalina. 
 
b) En el laboratorio, incubar por 8 horas a 37° C y sembrar en estrías sobre 
Agar TCBS. 
 
43 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
c) Proceder según D., 1. (Identificación Bioquímica) de éste mismo Capítulo. 
 
3) Hisopado rectal: 
 
a) Colocar el hisopo con la muestra de la deyección en 7 ml de los medios de 
 
1), a) o de 2), a). 
 
b) En el laboratorio, sembrar en estrías sobre Agar TCBS. 
 
c) Proceder según D., 1. (Identificación Bioquímica) de éste mismo Capítulo. 
 
 
2. Muestra de alimentos: 
 
a. Primer día 
 
1) Pesar 50 grs de la muestra del producto marino (peces, mariscos o crustáceos) 
eligiendo de preferencia las partes blandas y comestibles de los mismos. 
 
2) Adicionar 450 ml de solución salina al 3% de ClNa. 
 
3) Llevar ésta dilución de 1:10 a centrifugadora de 8.000 rpm durante 1’. 
 
4) Preparar diluciones hasta 1:10.000 o mayores, utilizando la más conveniente de 
acuerdo al grado de contaminación alcanzado. 
 
5) Inocular 3 tubos de Caldo GSTB doble concentración con 10 ml de la dilución 
1:10 (constituye una porción de 1 gramo). 
6) Inocular 1 ml de la dilución 1:10 en diluciones 1:100, 1:1.000 y 1:10.000 sobre 
Caldo GSTB concentración simple. 
 
7) Incubar por 18 hs a 37° C. 
 
b. Segundo día 
 
1) De cada tubo incubado en a., 5) y 6), sembrar con ansa de 3 mm en sendas 
placas con Agar TCBS. 
2) Incubar por 18 hs a 37° C. 
 
c. Tercer día 
 
1) Apariencia de las colonias de V. parahemolyticus en placas de Agar TCBS: 
 
a) Colonias redondas de 2 – 3 mm de diámetro, con centro verde o azul. 
 
b) Las colonias de V. alginolyticus aparecerán más alargadas y de color 
amarillo. 
 
c) Si se presentan Coliformes como Proteus y Enterococos, sus colonias serán 
pequeñas y translúcidas. 
 
44 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
d) Cuando las colonias verde azuladas sean confirmadas como de V. 
parahemolyticus con pruebas bioquímicas y/o serológicas (Ver D. a 
continuación), se aplicará la Tabla del NMP (Apéndice C) para la enumeración 
final de microorganismos/gramo de alimento. 
 
D. PROCEDIMIENTO PARA LA IDENTIFICACION BIOQUIMICA 
 
1. Tercer día (Test diferencial I) 
 
a. Repicar con ansa puntiforme en la colonia sospechosa y sembrar en los siguientes 
medios: 
1) Agar TSI 
 
a) Sembrar en superficie y en profundidad. 
 
b) Incubar toda la noche a 37° C. 
 
c) V. parahemolyticus produce flauta alcalina y culote ácido; asimismo es gas 
y SH2 (-). 
 
2) Agar TSA y Caldo TSB con 3% de ClNa 
 
a) Sembrar en superficie y en profundidad, incubando toda la noche a 37° C. 
 
b) Usar como base éstos cultivos para futuros exámenes y coloraciones. 
 
c) V. parahemolyticus es un bacilo Gram (-) pleomórfico (curvado o derecho), 
con un flagelo polar. 
 
3) Agar SIM (Teste de Movilidad) 
 
a) Sembrar en profundidad y perpendicularmente por aproximadamente 5 mm. 
 
b) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
c) Un test (+) será cuando haya un crecimiento circular alrededor de la línea de 
siembra. 
 
2. Cuarto día (Test diferencial II) 
 
a. Este será otro test a partir de gérmenes móviles, Gram (-), productores de 
ácido en culotes y álcalis en flautas de Agar TSI, así como (-) en formación de 
gas y de SH2. Se seguirán las siguientes marchas: 
 
1) Caldo HLGB 
 
a) Sembrar 2 tubos de éste medio a partir de Agar TSA con ansa. 
 
b) Sellar uno de los tubos con un anillo de parafina estéril. 
 
45 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
c) Incubar al menos por 48 hs o más de ser necesario, a 37° C. 
 
d) El cambio de color que puede producirse será de púrpura a amarillo por 
fermentación de los carbohidratos presentes en el medio. 
 
e) Si el cambio ocurriera solamente en el tubo abierto, será por oxidación 
de los carbohidratos. 
f) V. parahemolyticus es (+) a la fermentación de glucosa, sin producción 
de gas. 
 
2) Test de la Citocromo oxidasa 
 
a) Sembrar un pico de flauta de Agar TSA del control D., 1., a., 2), b). 
 
b) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
c) Agregar 2 – 3 gotas de la solución de alfa naftol sobre la colonia 
desarrollada en el pico de flauta. 
 
d) Seguidamente hacer lo mismo con la solución de fenildiamina. 
 
e) La reacción (+) será un rápido desarrollo (dentro de los 2’ siguientes) de 
un color azul obscuro. 
 
f) V. parahemolyticus es (+) a dicho test. 
 
3) Caldo ARGININA DESCARBOXILASA 
 
a) Sembrar un tubo de esteclado según Agar TSA del control D., 1., a., 2), 
 
b) . 
 
b) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
c) Examinar cada 24 hs durante los siguientes 4 días. 
 
d) El medio virará al amarillo por acidificación de la glucosa. 
 
e) V. parahemolyticus es (-) a dicho test. 
 
4) Caldo LISINA DESCARBOXILASA 
 
a) Sembrar un tubo de esteclado según Agar TSA del control D., 1., a., 2), 
 
b) . 
 
b) V. parahemolyticus es (+) a dicho test. 
 
5) Nutriente de GELATINA (Hidrólisis de la Gelatina) 
 
a) Sembrar un tubo gelatina según Agar TSA del control D., 1., a., 2), b). 
 
b) Incubar por 1 – 7 días a 37° C. 
 
 
 
46 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
c) Enfriar a 20 º C para proteólisis; si el medio no solidificara, la gelatina 
ha sido licuada. Para una mayor certeza, deberá existir un buen desarrollo 
de gérmenes. V. parahemolyticus, es un rápido licuefactor de gelatina. 
 
6) Caldo STB (Tripticase salado para halofilismo) Es una de las 3 
alternativas válidas y la elección de la técnica, dependerá de la capacidad del 
laboratorio. 
 
a) Utilizando cepas según Agar TSA del control D., 1., a., 2), b)., 
sembraremos 4 tubos de Calo STB conteniendo ClNa a las siguientes 
concentraciones: 0%, 6%, 8% y 10%. 
 
b) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
c) V. parahemolyticus desarrollará en concentraciones de 6% y 8% de 
ClNa, mientras que no crecerá en las de 0% ni en las e 10% de ClNa. 
 
7) Medio de cultivo para Halófilos (Caldo HSCM) – Test de alternativa para 
gérmenes tolerantes a la sal. 
a) Utilizar cuatro matraces con 25 ml de Caldo HSCM, a los cuales se le 
agregarán las siguientes concentraciones de ClNa: 0%, 6%, 8% y 10%. A 
cada uno se le sembrarán 0,1 ml de solución madre de Caldo TSB 
concentración 1:10. 
b) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
c) V. parahemolyticus desarrollará en concentraciones de 6% y 8% de 
ClNa, mientras que no crecerá en las de 0% ni en las e 10% de ClNa. 
 
8) Medio Salado en gradiente con Técnica de Szybalski – Test de alternativa 
para gérmenes tolerantes a la sal. 
a) Sumergir un hisopo de algodón estéril por 2h hs en Caldo TSB. 
 
b) Escurrir el hisopo en el borde del tubo y sembrar la placa del medio en 
estrías siguiendo e gradiente salino, dejando 1 cm entre las siembras. 
c) Incubar por 24 hs a 37° C las placas invertidas. 
 
c) V. parahemolyticus desarrollará hasta los límites de la zona roja 
concentraciones de 6% y 8% de ClNa, mientras que no crecerá en las de 
0% ni en las e 10% de ClNa. 
 
9) Crecimiento a 42° C. 
 
47 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
a) Sembrar un tubo de Caldo TSB, repicando con un ansa desde otro 
semejante con inóculo de 24 hs realizado desde el control D., 1., a., 2), b). 
b) Incubar en baño de agua a 42° C durante 24 hs. 
 
c) Considerar como (+) a un profuso crecimiento. 
 
d) V. parahemolyticus es (+) a ésta prueba. 
 
10) Test de VOGES – PROSKAUER 
 
a) Inocular un tubo con Caldo RM – VP del control D., 1., a., 2),b). 
 
b) Incubar por 48 hs a 37° C. 
 
c) Procedimiento para Test de VP: 
 
(1) Transferir 1 ml del caldo cultivado a 48 hs a un tubo limpio. 
 
(2) Añadir 0,6 ml de α – naftol y mezclar. 
 
(3) Agregar 0,2 ml de Na (OH) 40% y mezclar nuevamente. 
 
(4) Opcionalmente agregar algunos cristales de creatina. 
 
(5) Leer resultados luego de 4 hs a temperatura ambiente. 
 
(6) Test (+) a VP, será aquél que desarrolle una coloración rosa – eosina. 
 
(7) V. parahemolyticus, será (-) a VP. 
 
11) Test del INDOL 
 
a) Inocular un tubo con Caldo TRIPTONA del control D., 1., a., 2), b). 
 
b) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
c) Agregar 0,5 ml de Reactivo de KOVACS y mezclar. 
 
d) El test (+) será cuando se forme un anillo de color rojo profundo en la 
superficie del tubo. 
e) V. parahemolyticus será Indol (+). 
 
12) Fermentación de Carbohidratos (Celobiosa, Sucrosa, Maltosa, Manitol y 
Trialosa) 
 
a) Inocular un tubo con cada uno de dichos carbohidratos a partir del 
control D., 1., a., 2), b). 
b) Incubar por 4 – 5 días a 37° C. 
 
c) Una reacción ácida se verificará por el viraje del color púrpura del caldo 
carbohidratado al amarillo. 
 
 
 
48 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
d) V. parahemolyticus no producirá una reacción ácida en celobiosa dentro 
de las primeras 24 hs; no fermentará la sucrosa, pero sí fermentará a 
maltosa, manitol y a trialosa. 
 
13) Fenómeno KANAGAWA (Agar WAGATSUMA) 
 
La División Microbiología de la FDA – Washington DC, ofrece éste Test de 
Fenómeno Kanagawa para el aislamiento de V. parahemolyticus en brotes 
sospechosos. Se evidencia por un fenómeno específico de hemólisis en el 
Agar WAGATSUMA. Ha sido encontrada una reacción (+) como correlato 
de cierra a casos de aislamiento del germen en cuestión, y por lo general 
aquellos que dan reacciones (+) en pacientes enfermos, dan reacciones (-) en 
aislamiento de productos de mar contaminados. 
 
a) Partiendo de un cultivo de 18 hs en Caldo TRIPTICASE SOYA con 3% 
de ClNa, se repicará con ansa en estrías, sobre una placa de Petri con Agar 
sangre WAGATSUMA. 
 
b) Incubar por 24 hs a 37° C. 
 
c) Un test (+) se considerará cuando exista β hemólisis, es decir se 
producirá una zona transparente alrededor de la colonia sospechosa. 
d) Es muy importante recordar que la no observación más allá de 24 hs 
será muy importante en éste test. 
 
13) Serología: La identificación de los variados serotipos de V. 
parahemolyticus llevada a cabo por medio de antisueros específicos aún no 
se encuentran comercialmente avalables en los EUA. La FDA a través de su 
División Microbiología, ofrece el servicio de identificación serológica en 
aislamientos de productos marinos, así como de brotes producidos. 
 
E. CARACTERISTICAS PARA LA IDENTIFICACION DE V. PARAHEMOLYTICUS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
49 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
TEST RESULTADOS 
 
Coloración de Gram Gram (-) 
 
Morfología Bacilo curvado a derecho 
 
Movilidad Móvil 
 
Hugh – Liefson glucosa Fermentación (+) sin gas 
 
Citocromo oxidasa (+) 
 
Arginina descarboxilasa (-) 
 
Lisina descarboxilasa (+) 
 
Gelatina Licuefacción 
 
Tolerancia al ClNa (+) 6%, 8%; (-) 0% y 10% 
 
Crecimiento a 42° C (+) 
 
Voges – Proskauer (-) 
 
Indol (+) 
 
Celobiosa Fermentación (-) dentro de las 24 hs 
 
Sucrosa No fermenta 
 
Maltosa Fermenta 
 
Manitol Fermenta 
 
Trialosa Fermenta 
 
 
1. Esta será una lista mínima de control rápido con características específicas para V. 
parahemolyticus, cuya presunción podrá definirse simplificando en las siguientes: 
a. Morfología: bacilo curvo Gram (-). 
 
b. Citocromo oxidasa: (+). 
 
c. Test de Hugh – Liefson: Glucosa (+) y gas (-). 
 
d. Apariencia de colonias en Agar TCBS: Típico color azul verdoso. 
e. Agar TSI: Flauta alcalina, culote ácido, gas y SH2 (-) 
 
f. Crecimiento a 42° C: (+). 
 
g. Test de halofilismo: (+) a 8% de ClNa y (-) al 10%. 
 
h. Test de Lisina descarboxilasa: (+). 
 
i. Voges – Proskauer: (-). 
 
j. Sucrosa: (-). 
 
50 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
F. SUPLEMENTO AL METODO DE DETECCION DE V. PARAHEMOLYTICUS 
Recientemente (1971), Twedt R. M. y Novelli R. M., propusieron una modificación al 
método selectivo y diferencial para el aislamiento de V. parahemolyticus. Posteriormente, 
hubo modificaciones sobre el mismo, realizadas por Vanderzant y Nickerson, quienes 
trabajaron en el marco de la Universidad de Texas. A continuación detallaremos éstos 
procedimientos que demuestran la presencia del germen en muestras sospechosas de 
alimentos. Para cualquier comentario al respecto, favor de dirigirse al Dr. M. Fishbein, 
División Microbiología, FDA, 200 C Street, S. W., Washington D C 20204 (teléfono: 202 
– 962 – 7209). 
 
1. Medio de Cultivo: MT (Modificado por Twedt): 2% de peptona, 0,2% de extracto 
de levadura, 1% de almidón de maíz, 7% de ClNa y 1,5% de agar, a pH 8.0. 
 
2. Apariencia de las colonias en Agar MT: Color blancas a cremas, circulares, lisas y 
amilasa (+). 
3. Procedimiento: 
 
a. Mezclar 50 grs del alimento con 450 ml de ClNa 7% por 2’. 
 
b. Realizar diluciones seriales en ClNa 7% estéril. 
 
c. Extender sobre placas de Agar MT, 0,1 ml de cada dilución e identificar a dichas 
placas. 
 
d. Incubarlas aeróbicamente por 24 – 48 hs a 42° C. 
 
e. Repicar aquellas colonias sospechosas con las siguientes características: colonias 
blancas o cremas, circulares, lisas y amilasa positivas. 
f. Completar aislamiento con la identificación correspondiente. 
 
g. Cada enriquecimiento estará identificado con la dilución efectuada en b. (10, 1 y 
0,1 ml del homogenado del Caldo TRIPTICASE SOYA con ClNa 7%). 
 
h. Luego de 18 hs a 42° C, repicar los tubos de caldo en estrías, sobre placas de 
Agar MT. 
i. Incubarlas por 24 – 48 hs a 42° C. 
 
j. Identificar las colonias aisladas. 
 
 
 
 
 
51 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
CAPITULO XI: CLOSTRIDIUM BOTULINUM 
 
NOTA: NO REALIZAR ESTOS ANALISIS HASTA NO CONTAR CON LAS DEBIDAS 
PROTECCIONES Y LOS CORRESPONDEINTES TOXOIDES. 
 
A. EQUIPAMIENTO y MATERIALES 
 
1. Jeringas de 1 – 2 ml con aguja de 5/8”. 
 
2. Filtro Millipore UF o similar. 
 
3. Centrífuga refrigerada. 
 
4. Mortero y licuadora o mezcladora, estériles. 
 
5. Estufas de cultivo de 26° C y de 37° C. 
 
6. Baño María a 37° C. 
 
7. Tubos estériles para centrífuga. 
 
8. Agujas estériles. 
 
10. Pipetas graduadas y estériles de: 1, 5 y 10 ml. 
 
11. Tubos de test estériles. 
 
12. Bolsas plásticas impermeables con cierre hermético. 
 
13. Ratas blancas de laboratorio de aproximadamente 20 grs: 14 para análisis de 
screening y 24 para positivos. 
 
B. Medios de cultivo y reactivos. 
 
1. Antitoxinas A, B y E liofilizadas. 
 
2. Tripsina DIFCO (Actividad 1:250) solución al 10% filtrada en agua destilada. 
 
3. Alcohol etílico absoluto y al 70%. 
 
4. Na (OH) 1 N. 
 
5. Solución fisiológica estéril. 
 
6. Diluyente de gel fosfato. 
 
7. Caldo TRIPTICASE PEPTONA GLUCOSA LEVADURA con agregado de 
Tripsina estéril (TPGYT). 
8. Caldo de Hígado triturado. 
 
9. Agar HUEVO ANAEROBICO. 
 
 
 
52 
 
 
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 
http://www.pdffactory.com/
MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS 
 
 
 
C. Detección de toxinas preformadas en alimentos. 
 
1. Al tratar con alimentos sospechosos, las superficies serán bien fregadas con 
cepillos, agua, jabón y mucho enjuague.