Microbiología Resumen

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Clase 1
Historia de la microbiología:
Van Leeuwenhoek 1677: crea el primer microscopio y observa “animáculos”
Louis Pasteur: Demostró la eliminación de bacterias usando cambios en la temperatura;
altas y bajas temperaturas en periodos cortos de tiempo.
Pasteurización: proceso anaerobio, para la conservación del vino.
Martinus Beijernick: Asoció microorganismos y plantas con la fijación del nitrógeno.
N2 del ambiente: 78% en la naturaleza, indispensable para aminoácidos y proteínas,
no se puede usar sin fijarse.
Fixing (fijación) del nitrógeno; bacteria azotobacter, fija el N2 en NH4 que se puede
usar
Bacterias que crean nódulos en las raíces para fijar el N2
Otras que se unen a la superficie
Los microorganismos:
- Tienen una micro, gama genética, molecular increíble; que le permite al ambiente
tener una buena homeostasis (diversidad alta) ya que mantienen el ciclo de
nutrientes.
- No lo hacen individualmente, sino que se asocian con otros organismos vivos,
usualmente organismos mayores.
- Brindan diversidad de recursos de explotación como para la biotecnología,
biocatálisis y biodegradación.
Diversidad/Roles de microorganismos en el suelo y el mar.
Suelo:
Por cada gramo de suelo hay 10 billones de microorganismos: en total de 6 mil a 10 mil
diferentes genomas. Que cumplen miles de roles cada uno.
A través de estos microorganismos se obtienen nuevas drogas, fármacos (antibióticos o
antimicrobianos) y biocatalizadores.
Se usan para biodegradación, biocatálisis y biotransformación.
Actinobacterias: antibióticos (estreptomicina) purificado de estreptomicinas.
Biodegradación: de grande a pequeña
Biocatálisis: una molécula mediana a pequeña, se necesitan si no hay la de en medio, no
hay extremos.
Asociación:
- Neutral: no hay beneficio, ni perjuicio. Ex. hongos que degradan materia orgánica.
- Positiva:
- Mutualismo: los 2 se benefician
- Sintrofismo: ambos se ayudan para degradar sustancias que no pueden
solos.
- Comensalismo: 1 se beneficia pero no perjudica al otro
- Negativa:
- Antagonismo: 1 consumo algo que evita el desarrollo de otro.
- Competencia: consumen un mismo nutriente, compiten.
- Parasitismo: se alimenta de otro y lo enferma.
Interacción de dos o más organismos:
Simbiosis: convivencia de 2 organismos (perjuicio y beneficio). Hay tres tipos:
mutualismo, comensalismo y parasitismo.
Relación entre microorganismos e invertebrados: Riptia (gusano) sobrevive en
el mar, debido a una bacteria que usa sulfuro inorgánico y la ayuda.
Calamares: tienen órganos luminiscentes gracias a bacterias asociadas que emiten
luz, señales químicas.
Mar:
El azul del mar muestra un lugar adecuado para el desarrollo de microorganismos.
Bacterias, hongos y parásitos.
Alta diversidad genética, metabólica, etc. 10e6 - 10e9 en 1 ml de agua.
Los microorganismos según el ambiente en donde yacen se alimentan de diferentes
nutrientes, degradan diferentes sustancias y se asocian a seres vivos diferentes.
Perfectamente adaptados:
- Heterótrofo: usan fuentes de carbono orgánicas
- Autótrofo: usan fuentes de carbono inorgánicas
- Quimiotrofo: usan fuentes de carbono químicas.
Ambiente Halofílico, debido a la presencia alta de sal.
Foto-Trópicos: oxigénica y anoxigénica, fermentadores, reductores de fosfato y
metanógenos.
Dunaliella: síntesis de betacarotenos (vitamina A). Protección contra la luz solar.
Haloferax mediterranei: poli-B-hidroxibutirato, síntesis de bioplásticos que resistan a altas
temperaturas.
CRISPR: modificación genética. Mecanismo de defensa de las bacterias del mar
mediterráneo.
Hay muchos hongos y bacterias capaces de producir compuestos, en asociación con
plantas.
Interacción planta-microorganismo:
Endófitos: está dentro de la planta y no le hacen daño
Epífitos: están sobre la planta, en sus raíces.
Patógenos: causan enfermedades.
Cumplen algún rol sobre la planta y son usados con fines agrícolas.
Son productores de fitohormonas; sintetasas para regular procesos metabólicos
(como el crecimiento, germinación). Son controladores biológicos
Ácido acético, kinetina, leatina :
Rizósfera: zona del suelo con relación directa con una raíz.
Las raíces no solo absorben nutrientes, también son capaces de secretar patógenos.
Endosimbiontes: Dentro
ectosimbiontes: Fuera
Patógenos: Dañan
Interacción microbio-microbio
Evitar o regular la colonización con otros microorganismos.
Raíz colonizada por hongos o bacterias (mutualismo) así otro microorganismo no
puede ingresar.
Interacción animal-microbio
- Microorganismos que colonizan (habitan) en animales. Como los del estómago para
la síntesis de vitaminas.
- Pueden ser: endosimbiontes, ectosimbiontes, patógenos.
- Simbiontes puede ser: primario y secundario.
- El microorganismo proporciona una fuente de enzimas para usar en diferentes
áreas.
- Ayuda a la digestión de nutrientes y degradación de celulosa.
Simbionte:
Primario: A lo largo se adapta con el hospedador y existe un beneficio mutuo (tiene
donde vivir y el otro recibe nutrientes). Asociado al hospedador
Secundario: Temporal, efecto positivo o negativo y tienen carácter facultativo.
Transitorio, asociado a la comida o piel.
Utilidad de microorganismos: biotecnología y tecnología microbial.
Comúnmente se usa para alimentos: alcohol, panificación y preservación de alimentos
(como la fermentación).
Metabolitos: sustancias producidas durante el metabolismo:
- Primario: indispensable
- Secundario: no indispensable, suelen ser usados por los seres humanos.
Se puede mejorar la producción a través de modificaciones genéticas.
GMMO's microorganismos genéticamente modificados:
Está prohibido en el país con fines comerciales.
Métodos moleculares:
Clonación (uso de vector con inserto de adn)
Marcadores genéticos para la identificación de microorganismos recombinantes.
Promotores de control de expresión del gen deseado. Hay inductivos y constitutivos.
Transferencia de genes para el “delivery” de genes específicos en un hospedador
deseado.
CRISPR (manipulación directa)
Se usan para:
Obtener mayor rendimiento de un compuesto.
Tener el producto de la expresión del gen que busco (Sobreexpresión)
Alterar el blanco de una proteína.
Eliminar definitivamente un gen
Agricultura: Bacillus thuringiensis (Gram positiva), endotoxina, vit CRY. Introduce el
gen CRY en plantas. Ex maíz. Se desarrolla inmunidad al ataque de nemátodos a
las plantas.
Bacteria capaz de captar nitrógeno: gen Nit con diferentes isoformas que expresan
la
enzima nitrogenasa
NitA: aumenta la capacidad de fijar nitrógeno.
Ejemplo de clonación:
- Planta con el gen de interés -- aislamos la célula con el gen de interés -- ahora
obtenemos el adn, es decir el gen -- clonamos en 1 primer (plásmido con marcador -
antibiótico) para amplificar -- la bacteria usada para amplificar crece en el antibiotico
-- ocurre una segunda transformación, uso de bacteria capaz de infectar la planta.
Se usa Ti (plásmido) -- se permite el ingreso del gen a la nueva planta.
GMMO’s y industria del cuidado de la salud.
Se han usado vectores y microorganismos tanto eucariotas como procariotas para producir
diferentes medicamentos: insulina, inmunoglobulinas, hormonas, interleuquinas, etc.
GMMO’s en la agricultura.
Ex: Bacillus thuringiensis, es una endotoxina contra insectos. Las plantas son capaces de
presentar resistencia a infección por nemátodos. El gen de la bacteria introducida hace que
la planta produzca la toxina BT toxina.
También hay bacterias capaces de captar N2 y convertirlo en amonio NH4 (meliloti) , pero
se los mejoró introduciendo nifA y se observó que las plantar con S.meliloti se desarrollaron
mejor (debido a que fijaban más nitrógeno).
GMMO’s en la industria química:
Polímeros para la producción de bioplásticos (eco-friendly).
Las bacterias que tienen inclusiones en su interior, constituidos por alcanoatos-polímeros,
pueden ser reemplazados por hidrocarburos (por ahora costoso). Compuestos / polímeros:
análogos al plástico. E. coli
Compuestos antimicrobianos: se usan GMMO’s para producir varios a la vezo aumentar su
producción. Se puede optimizar combinando genes de 2 bacterias productoras.
Se optimiza para que una misma cepa de dos antibióticos.
Incrementar la producción: Transformar una bacteria para producir más cantidad.
Producir varios antibióticos: Transformar una bacteria que produce penicilina, para producir
además otro antibiótico. Usando ingeniería genética para la introducción de genes.
Industria textil:
Síntesis de enzimas que degradan diferentes proteínas, como la celulasa, pectinasa,
proteasa. Son genes introducidos en microorganismos de crecimiento rápido.
Se puede usar para: papel, textiles.
Aplicaciones ambientales:
Pseudomonas: herramienta biotecnológica que se usa para biorremediación (en ambientes
contaminados para limpiarlos, de derrames de petróleo, reducir pesticidas, plaguicidas).
Biorremediación:
- Bio Aumentar: Aumento de población microbiana. Herramienta: sustrato de
transporte.
- Bio Estimular: Permitir que un microorganismo sea estimulado para favorecer su
desarrollo. Colocar factores que incrementen su desarrollo.
Optimizar cepas que se pueden usar en degradación.
Existen problemas en la biorremediación:
- Al colocar bacterias en otro ambiente, pierden sus propiedades.
- Las comunidades microbianas externas tiene influencia
- Fitness en la naturaleza
- Su contenido
Industria alimenticia:
Quimosina: producida en el intestino de los bovinos, para hacer el queso, se tomó el gen y
se lo introduce en una levadura
Bioetanol: enzima capaz de producir bioetanol a partir de hexosas. Vía de
entner-doudoroff -glucosa
- A través de la fermentación de azúcares: de la caña, microalgas, sustrato o restos
de producción agrícola.
- Lignocelulosa: Degradar
- Zymomonas mobilis: Usa vía alterna en la cual usa regulosa fosfato para producir
etanol. Se pueden clonar las vías en E.coli para optimizar. Limitada por sustratos
definidos.
Microorganismos en la ingeniería biotecnológica:
Video
Requerimientos individuales:
E.coli Yeast Insect Mammal
Temp 37 28-30 27 37
Agitation High High Low Low
Shear
sensitivity
Low Low High High
PH óptimo 6.5-7.5 5.0-6.0 6.2 - 6.4 7.0-7.4
El propósito de biorreactores y shakers (agitador).
Proveer condiciones óptimas para el crecimiento:
Optimizar:
Suministro de nutrientes
Suministro de oxígeno/agitación y sparging /espumado
Estabilización de la temperatura y control
¿Qué más controla el biorreactor?
pH, feed, Do.
Bioprocessing - scale up (que se va escalando)
Parámetros para controlar:
Parámetros biológicos: Temperatura, pH, DO, CO2
Mecánicos: Foaming, agitación
Estrategia: Batch, feed batch, perfusión.
Continuo: Medio inicial es transferido dentro de vasos y es inoculado
Después de la reducción de la fuente de carbono inicial, se agrega alimentación adicional y
se recolecta con la misma tasa de flujo
Fijo - Estado de funcionamiento
La tasa de dilución es el parámetro crítico del proceso.
Recuperación del producto durante la cosecha continua.
Perfusión: como el continuo pero con un dispositivo de retención de células.
El sistema de retención de células para lograr una mayor densidad celular y evitar la
extracción de células del sistema.
Existen diferentes tipos de retención de células disponibles: Filtro de giro, ATF, Packed-bed
vessels.
Fed-Batch/Lote de alimento:
El medio inicial se transfiere al recipiente y se inoculará.
Tras el agotamiento de la fuente de carbono inicial, se añade alimentación adicional.
El producto se recupera durante la cosecha.
Batch / lote:
El medio inicial se transfiere al recipiente y se inocula con un cultivo y se deja un periodo de
tiempo.
La fuente de carbono inicial de agota por el consumo del cultivo
El producto se recupera durante la cosecha.
Estrategias del proceso:
Depende de la estrategia del proceso, la densidad de células viables evoluciona diferente.
La optimización del suministro de nutrientes es clave en el desarrollo de bioprocesos.
En el transcurso del proceso, se consumen nutrientes y se acumulan metabolitos.
Alimentación del cultivo y la eliminación de los metabolitos tóxicos influyen en la densidad y
la viabilidad de las células y en consecuencia en el rendimiento y el coste del título del
producto.
Foam control / control de espuma:
Agitación y turbidez crea espuma.
Agente químico usado para mitigar la espuma: a base de aceite o a base de silicona.
No es dañino cuando se introduce
El exceso de espuma podría ensuciar los filtros y provocan la pérdida del cultivo.
DO/control:
Fermentación: Aumenta la tasa de agitación solo.
Aumenta la agitación + aumenta la reserva de aire.
Aumenta agitación + aumenta la reserva de aire + O2 enriquecimiento
Aumento de agitación + O2 puro (reserva)
Oxígeno:
La agitación con diferentes impulsores aumenta la transferencia de oxígeno en el medio.
El control automático del flujo de gas y la mezcla, garantizan un entorno óptimo de abajo o
nulo oxígeno para el proceso.
Microbial: 6 sL / h * L to 120 sL / h * L
Set up and inoculate a bioreactor
Ejemplo: E.coli
Transferir el precultivo del shaker a un beaker esteril
Inocular el cultivo principal a un OD 600 d 0.3 - 0.4
Máximo 5% del volumen inicial
Extraer el volumen necesario en una jeringa esteril e inocular el cultivo principal a través del
puerto (port) de muestreo del biorreactor.
Tipo de impulsor + tasa de agitación
Fermentación:
Buena oxigenación
Mezcla moderada
High shear
Agitación a altas rpms
Cell culture:
Palas más aerodinámicas para minimizar la rotura de burbujas
Velocidad de agitación más baja
Oxigenación baja
Buena mezcla (up flow y downflow)
Low shear (cizalla)
Fuerzas físicas: Agitación:
Shear stress (SS): remolinos de turbulencia / colisión de portadores
Suspensión homogénea: medianos / microcarriers. La agitación e impresión
(velocidad /diseño) son parámetros cruciales. Para cada sistema específico la agitación
debe ser optimizada.
Set up your bioreactor:
Calibrar el sistema
Bombas Sensores Analizadores
Esterilizar todo
Programar el controlador
Concentraciones típicas / volúmenes
Inoculación baja “density lonely”, células no crecen
Inocular el cultivo principal de OD600 de 0.3 - 0.4
Precultivo OD 600 de 2-4
Inoculación volumen 2% - 5% del volumen inicial
Preparación del inóculo óptimo:
Empezar con una colonia 10-50 ml cultivo.
Expandir depende del volumen requerido para inocular
Evitar enriquecimiento de contaminantes
Mejor sincronización de cadenas.
Debe estar disponible en:
-log phase (vital)
-Volumen suficientemente largas
-Libre de contaminantes
-Calidad consistente
Considerar en bioproceso:
Expresión del hospedador
Medio seleccionado
Cultivo y estrategia
Inóculo del biorreactor:
Generador en un shake flask (matraz de agitación)
Objetivo: fase de latencia corta, crecimiento reproducible
Componentes de un biorreactor:
Agitación: motor, impeller (impulsor)
Aireación: flujo de gas y mezcla de gas
Sparger: rociador
Sensores: pH, HO, Temperatura, Turbidez
Temperatura: Calentador (water jacket y heating blanket). Enfriador (cooling finger and water
jacket)
Fermentación de sustrato sólido
La SFF se realiza generalmente sobre un soporte sólido con poca o ninguna agua libre en
condiciones no sépticas y en estado natural.