Espectrofotometría 2020-2

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Espectrofotometría
LUZ
MATERIA
Absorción 
atómica
Emisión 
molecular
Emisión 
atómica
Absorción 
molecular
Repasemos...
Se trata de una técnica analítica que se fundamenta en la 
espectroscopía de absorción molecular.
Utiliza la zona de UV - visible - IR cercano del espectro 
electromagnético.
Aplicaciones
- Identificación
- Detección y cuantificación 
- Análisis de pureza
Espectrofotometría
Implica la determinación cuantitativa de la intensidad 
absorbida de un haz de luz monocromática al atravesar 
una muestra.
Espectrofotometría
Io: intensidad incidente
It: intensidad transmitida
Ir: intensidad reflejada (despreciable 
en cubetas cuadradas)
Ia: intensidad absorbida
Espectrofotometría
TRANSMITANCIA (T)
Se la define como la fracción de intensidad de luz que se transmite (It) a través 
de la solución respecto de la intensidad de luz incidente (Io).
 T = It / Io
TRANSMITANCIA % (%T)
 %T = It / Io . 100
 
ABSORBANCIA (Abs)
Se define a partir de la transmitancia, mediante un cálculo matemático, como: 
Abs = - log T
Para hacer referencia a la intensidad de luz absorbida por 
una sustancia se pueden definir las siguientes magnitudes:
TRANSMITANCIA (T) T = It / Io
➔ se trata de una magnitud adimensional
➔ puede tomar valores entre 0 y 1 (0 ≤ T ≤ 1)
➔ mayores valores de T indicarán menor intensidad de 
luz absorbida por la muestra
ABSORBANCIA (Abs) Abs = - log T
➔ se trata de una magnitud adimensional
➔ puede tomar valores entre 0 e infinito (0 ≤ Abs ≤ ∞)
➔ mayores valores de Abs indicarán mayor intensidad 
de luz absorbida por la muestra
Espectrofotometría
Espectro de 
absorción ATÓMICA 
(líneas) Espectros de absorción MOLECULAR (bandas)
Espectro de Nitrato de Cobalto
Muestra
(soluciones)
Espectro de Sulfato de Cobre
¿Qué información brinda un espectro?
¿Qué representa cada línea o banda? 
Espectro 
continuo
Repasemos...
Nitrato de Cobalto
Barridos espectrales
Barrido espectral
Gráfico de absorbancia en función de la longitud de onda: 
¿Cómo se construye?¿Que representa?
¿Qué parámetros se mantienen constantes? 
¿Cuáles se modifican?
¿Para qué sirve este tipo de gráficos?
Nitrato de Cobalto Sulfato de Cobre
Barridos espectrales
Nitrato de CobaltoBarridos espectrales
¿Qué es lo que cambia a las distintas longitudes de onda?
 
Se define como la absorbancia que presenta una solución por 
unidad de concentración y unidad de longitud de paso óptico.
Básicamente depende de:
● El compuesto que se está analizando
● La longitud de onda con la que se ilumina a la muestra
Y se puede modificar dependiendo de:
● El disolvente
● La temperatura
● El pH
 entre otras cosas...
Espectrofotometría
 
ABSORTIVIDAD MOLAR (ℇ)
g/l mol/l
¿Qué pasaría si se midiera una solución de nitrato de 
cobalto de menor concentración?
Nitrato de CobaltoBarridos espectrales
¿Y cómo sería el espectro a una concentración mayor a 200mM?
Nitrato de CobaltoBarridos espectrales
Barridos espectrales Nitrato de Cobalto
¿Cómo podría cuantificarse la concentración en una muestra?
Fijemos una longitud de onda
por ejemplo 550 nm Concentración(mM)
Absorbancia
(550 nm)
0 0,000
100 0,470
200 0,940
300 1,410
Concentración
(mM)
Absorbancia
(550 nm)
0 0,000
100 0,470
200 0,940
300 1,410
Es una curva de 
calibración
¿Qué es lo que cambia para las 
distintas longitudes de onda?
¿A qué longitud de onda resulta mas 
ventajoso calibrar?
Barrido espectral
 
It I1
I2
I3
I4
I5
¿Cómo se relacionan los parámetros analizados?
Absorbancia, Transmitancia, concentración, etc.
Ley de Lambert - Beer
It I1
I2
I3
I4
I5
Ley de Lambert - Beer
 
 
 
La Absorbancia y la concentración se relacionan 
a través de la Ley de Lambert-Beer
Ley de Lambert - Beer
 
Si mezclamos la solución de Nitrato de Cobalto y de Sulfato de Cobre 
en iguales proporciones.
¿Cómo será el barrido espectral de la mezcla?
Nitrato de Cobalto Sulfato de Cobre
Mezclas de soluciones coloreadas
 
 
 
Y si cambiamos las proporciones Nitrato de Cobalto y de Sulfato de 
Cobre en la mezcla: 2 partes y 1 parte respectivamente.
¿Cómo será el barrido espectral de la mezcla?
 
Portacubeta
Haz de luz
Detector
Espectrofotómetro
Espectrofotómetro
Espectrofotómetro - Componentes
Fuente 
de luz
Ranura de 
entrada
Sistema de 
monocromación 
Selector de 𝜆
Ranura de 
salida
Cubeta con 
muestra
Detector
Actividad práctica (Espectrofotometría II)
PARTE 1: CONTROLES DE UN ESPECTROFOTÓMETRO
Objetivo
Analizar los siguientes controles espectrofotométricos:
1- Luz espuria
2- Volumen mínimo
3- Cubetas
4- Centro de Banda
5- Linealidad fotométrica
6- Veracidad
7- Precisión
Luz 
espuria
Volumen 
mínimo
Cubetas
Centro de 
banda
Linealidad 
fotométrica
Precisión Veracidad
Controles espectrofotométricos
Fuente de 
luz
Ranura de 
entrada
Sistema de 
monocromación 
Selector de 𝜆
Ranura de 
salida
Cubeta con 
muestra
Detector
Objetivo
Comprobar que no llegue luz al detector sin haber pasado por 
la muestra.
¿Por qué puede ocurrir?
-Reflexiones internas dentro de la cubeta.
-Luz que pase por arriba de la muestra cuando el volumen 
cargado es insuficiente.
-Entrada de luz externa (“gotera”).
-Mal diseño de cubetas o uso de cubetas incorrectas.
-Otras.
Control de luz espuria accidental
¿Cómo procedemos?
Colocamos una cubeta de obstrucción entre la 
fuente de luz y el detector y observamos la 
transmitancia obtenida.
Control de luz espuria accidental
Luz 
espuria
Volumen 
mínimo
Cubetas
Centro de 
banda
Linealidad 
fotométrica
Precisión Veracidad
Controles espectrofotométricos
Fuente de 
luz
Ranura de 
entrada
Sistema de 
monocromación 
Selector de 𝜆
Ranura de 
salida
Cubeta con 
muestra
Detector
Objetivo
Verificar el mínimo volumen de muestra necesario para que 
pase todo el haz de luz, de modo que ésta no pase por encima 
del menisco.
Por otro lado, se busca minimizar el volumen de muestra a 
utilizar al mínimo necesario, con el fin de ahorrar muestra y 
reactivo.
Control de volumen mínimo
¿Cómo procedemos?
Colocamos volúmenes crecientes de una 
solución coloreada y medimos la 
absorbancia del tubo. El volumen en el cual 
la lectura se estabiliza es el volumen 
mínimo.
El volumen de trabajo será un 20% mayor 
al volumen mínimo.
Control de volumen mínimo
Control de volumen mínimo
Luz 
espuria
Volumen 
mínimo
Cubetas
Centro de 
banda
Linealidad 
fotométrica
Precisión Veracidad
Controles espectrofotométricos
Fuente de 
luz
Ranura de 
entrada
Sistema de 
monocromación 
Selector de 𝜆
Ranura de 
salida
Cubeta con 
muestra
Detector
Objetivo
Comprobar la similitud de las cualidades ópticas entre 
cubetas, de modo de poder utilizar varias en el proceso de 
medida sin que este se vea afectado.
Control de cubetas
¿Cómo procedemos?
Llenamos una cubeta con solución coloreada 
(con el volumen seleccionado para trabajar) y 
registramos el % de transmitancia obtenido. 
Luego procedemos de igual manera con el resto 
de las cubetas a testear.
Para poder utilizar indistintamente las cubetas, la 
diferencia de T% entre ellas debe ser menor o 
igual al 1%.
Control de cubetas
Cubeta T (%)
Cubeta con agua 100
A 70,2
B 69,3
C 72,4
D 69,8
E 65,4
Control de cubetas
Luz 
espuria
Volumen 
mínimo
Cubetas
Centro de 
banda
Linealidad 
fotométrica
Precisión Veracidad
Controles espectrofotométricos
Fuente de 
luz
Ranura de 
entrada
Sistema de 
monocromación 
Selector de 𝜆
Ranura de 
salida
Cubeta con 
muestra
Detector
Objetivo
Verificar la concordancia entre la longitud de onda fijada 
con el selector en el equipo (aquella que se lee en el 
display) y la longitud de onda que efectivamente llega a la 
muestra.
Control de centro de banda
Realizamos el barrido espectral de una sustancia de 
referencia, cuyo espectro de absorción es conocido. 
Luego verificaremos que la longitud de onda de máxima 
absorbancia leída con el espectrofotómetro se 
correspondacon la longitud de onda de máxima 
absorbancia teórica de la sustancia de referencia utilizada.
¿Cómo procedemos?
Control de centro de banda
Control de centro de banda
- Sustancias conocidas
- Espectro conocido con uno o más picos de absorción 
estrechos y bien definidos que correspondan con la zona 
que se va a trabajar
Se deben conocer de antemano las longitudes de onda 
de máxima absorción
¿Qué condiciones debe cumplir la sustancia de referencia?
Control de centro de banda
Otras longitudes de onda de 
referencia se pueden obtener a partir 
de:
Puntos isosbésticos empleando 
indicadores de pH
Cristales con óxido de holmio o 
bien de didimio con picos 
definidos 
Luz 
espuria
Volumen 
mínimo
Cubetas
Centro de 
banda
Linealidad 
fotométrica
Precisión Veracidad
Controles espectrofotométricos
Fuente de 
luz
Ranura de 
entrada
Sistema de 
monocromación 
Selector de 𝜆
Ranura de 
salida
Cubeta con 
muestra
Detector
Objetivo
Comprobar que el equipo responda linealmente y evaluar 
hasta qué valores de absorbancia la respuesta del equipo 
es lineal.
Control de linealidad fotométrica
La detección (fotodetección) debe ser concordante con el 
valor de Abs esperado.
¿Cómo procedemos?
Empleamos una sustancia de referencia que sabemos “cumple 
con la ley de Lambert-Beer”. Realizamos distintas diluciones y 
las medimos en el espectrofotómetro que estamos testeando.
Con estos datos, realizamos un gráfico de absorbancia medida 
en función de la concentración (expresada,por ejemplo, en % de 
dilución respecto de la SM) y observamos la correlación.
Control de linealidad fotométrica
Control de linealidad fotométrica
¿Responde linealmente el instrumento? 
¿Cuál es el rango de linealidad fotométrica?
¿Hasta qué valor de Abs se puede medir en este equipo?
Luz 
espuria
Volumen 
mínimo
Cubetas
Centro de 
banda
Linealidad 
fotométrica
Precisión Veracidad
Controles espectrofotométricos
Fuente de 
luz
Ranura de 
entrada
Sistema de 
monocromación 
Selector de 𝜆
Ranura de 
salida
Cubeta con 
muestra
Detector
Objetivo
Analizar la veracidad del método espectrofotométrico.
Causas posibles que afectan la veracidad:
- Envejecimiento de la lámpara
- Agotamiento del fototubo
- Defecto en sistema de monocromación
- Elevada absorción por parte de las cubetas
- Muestra mal centrada respecto del sistema óptico del 
instrumento
Control de veracidad fotométrica
Medimos la absorbancia de una solución estándar de referencia en un 
espectrofotómetro calibrado y comparamos dicho valor con la 
absorbancia obtenida para esa solución en el equipo que queremos 
controlar.
También se emplean filtros 
calibrados con valores de 
absorbancia que se toman como 
referencia.
Calculamos la veracidad fotométrica a través del error fotométrico 
porcentual:
Se considera aceptable un error fotométrico de ± 5%.
Control de veracidad fotométrica ¿cómo se procede?
Absorbancia
0,192
0,192
0,192
0,192
0,192
0,191
0,191
0,191
0,190
0,192
¿Cuál es el EF% en estos 
casos?
Absorbancia
0,169
0,170
0,173
0,173
0,173
0,172
0,169
0,171
0,172
0,171
DATOS:
Absorbancia de referencia del 
cloruro de cobalto: (0,197 ± 0,014)
Control de veracidad fotométrica
¿Qué requisitos deben cumplir las soluciónes estándar?
- Tener un valor de absorbancia estable
- Presentar un pico ancho de absorción.
- Poseer un alto coeficiente de extinción molar.
En el caso de los filtros sólidos se trata de dispersiones de 
negro de humo en el cristal, con lo cual se aseguran 
bandas de absorción tan anchas como todo el espectro 
visible.
Control de veracidad fotométrica
Luz 
espuria
Volumen 
mínimo
Cubetas
Centro de 
banda
Linealidad 
fotométrica
Precisión Veracidad
Controles espectrofotométricos
Fuente de 
luz
Ranura de 
entrada
Sistema de 
monocromación 
Selector de 𝜆
Ranura de 
salida
Cubeta con 
muestra
Detector
Objetivo 
Evaluar la repetibilidad de una serie de medidas de 
absorbancia realizadas con una misma solución.
Control de precisión fotométrica
¿Cómo procedemos?
Utilizamos la serie de datos obtenidos en el control de 
veracidad y calculamos el coeficiente de variación 
porcentual:
Se considera aceptable un CV% menor al 1% 
Control de precisión fotométrica
PARTE 2
Aplicaciones de la espectrofotometría - Determinación 
cuantitativa de proteínas mediante la técnica de Biuret.
Objetivo
Diseñar el protocolo de trabajo.
Calcular la concentración de proteínas de una solución 
empleando la reacción con el reactivo de Biuret como 
técnica espectrofotométrica.
Actividad práctica (Espectrofotometría II)
¿Qué condiciones debe cumplir una muestra para 
poder medirse por espectrofotometría?
Método Fundamento Rango 
Espectrofotometría UV
Absorbancia a 280 nm 
Proteínas con aminoácidos aromáticos (Tirosina y Triptofano) presentan 
absorción máxima a 280 nm.
50 𝛍g/mL a 2 
mg/mL
Espectrofotometría UV 
Absorbancia a 
205-210 nm
Absorción de la unión peptídica, no dependiente de los aminoácidos que 
componen la proteína.
10 a 50 𝛍g/mL
Lowry La reducción de una mezcla de ácidos que forman el reactivo cromógeno de 
de Folin-Ciocalteau por la oxidación de los aminoácidos aromáticos de las 
proteínas. 
Se utiliza cobre como catalizador de la reacción ya que este último forma un 
quelato con la estructura peptídica que facilita la transferencia de electrones 
a la mezcla cromogénica de ácidos, produciendo una o más especies 
reducidas las cuales tienen un característico color azul con una λmáx 
745-750 ηm y una λmin a 405 ηm. 
El cambio en el color de la muestra que puede ser cuantificado determinando 
la absorbancia a 660 nm. 
5 a 100 𝛍g de 
proteína. 
 Método de Biuret: Bajo condiciones alcalinas, sustancias conteniendo dos o más uniones 
peptídicas forman un complejo púrpura con sales de cobre. 
0,25 a 200 mg/ml
 Método de Bradford Los grupos ácidos o básicos de las proteínas pueden interaccionar con 
grupos orgánicos de el colorante Coomassie Brillant Blue. 
Se basa en la conversión de la forma leuco del colorante (marrón-naranja) a 
una de color azul cuando los grupos aniónicos del colorante interaccionan 
con los grupos amino de las proteínas. Dicha reacción se mide por 
absorbancia a 595nm.
20 a 140 𝛍g para el 
ensayo estándar y 
de 1 a 50 𝛍g para 
el microensayo. 
Ensayo de Biuret
En condiciones alcalinas, las moléculas que posean dos o más 
enlaces peptídicos (al menos tripéptidos) forman un complejo 
azul violáceo con las sales de cobre.
Reacciones colorimétricas
El reactivo de Biuret contiene:
Sulfato de cobre hidratado. Provee los iones de Cu(II) 
para formar el complejo. Es el Cu(II) quien otorga el color 
característico. 
Hidróxido de potasio. No participa de la reacción pero 
brinda el medio alcalino.
Tartrato de sodio y potasio. Estabiliza el complejo.
Reacciones colorimétricas
La reacción de Biuret puede usarse para medir concentración 
de proteínas, ya que la formación del complejo coloreado es 
proporcional a la cantidad de enlaces peptídicos.
La intensidad del color desarrollado a la longitud de onda 
óptima es directamente proporcional a la concentración de 
proteínas, de acuerdo a la Ley de Lambert-Beer.
¿A qué longitud de onda medimos? 
Debemos primero preguntarnos:
● Si nos informan “a secas” la longitud de onda 
recomendada…¿puede nuestro equipo seleccionarla 
adecuadamente?
● Si nos presentan un espectro ya hecho en otro equipo….
¿tiene nuestro equipo una resolución similar o mejor aún?
● También podemos (y es muchas veces recomendable) 
realizar un barrido espectral con nuestro equipo para 
poder elegir la longitud de onda de trabajo.
Lo antes dicho guarda estrecha relación con el llamado 
“ancho de banda” que el monocromador del equipo posea, ya 
que de ese parámetro dependerá la “resolución” de un 
espectro.
¿Por qué importa el ancho de banda?
Aquí abajo presentamos los espectros 
de una misma sustancia en igual 
concentración, pero hecho empleando 
dos anchos de banda diferentes.
No seríaadecuado trabajar a longitudes 
de onda que nuestro equipo no pueda 
“resolver”
¿Cómo diseñamos el protocolo de trabajo?
¿Qué pasos deberíamos seguir para llegar a determinar la 
concentración de una proteína presente en una muestra 
por el método de Biuret?
TUBO MUESTRA
Es el tubo en el que se genera la reacción entre el analito 
cuya concentración se desea determinar y el reactivo.
En el protocolo diseñado lo preparamos por triplicado. 
¿Por qué se utiliza exceso de reactivo en la reacción? -hay 
más de una razón-
¿Por qué cree que se toma la decisión de preparar por 
triplicado el tubo muestra en lugar de preparar un solo tubo y 
medirlo tres veces?
Protocolo de trabajo
TUBO BLANCO DE MUESTRA
Se utiliza para medir la posible absorbancia 
correspondiente a todo aquello que no constituye nuestro 
analito y que está formando parte de la muestra (matriz). 
¿Cómo se procederá una vez conocida la absorbancia de este 
tubo?
Protocolo de trabajo
TUBO TESTIGO
Contiene el analito en concentraciones conocidas. 
Suelen hacerse varios tubos testigo con distintas 
concentraciones.
¿Con qué propósito se preparan estos tubos?
Protocolo de trabajo
TUBO BLANCO DE REACTIVO 
Contiene al reactivo solamente, sin presencia de analito.
El reactivo presenta absorbancia aún en ausencia del 
analito.
¿A qué tubos le restaremos su absorbancia?
Protocolo de trabajo
TUBO DE REFERENCIA O BLANCO DE SOLVENTE
Contiene agua o el solvente que se haya utilizado en la 
reacción. 
Se utiliza para llevar a cero de absorbancia. Contra este 
tubo se leen todos los demás tubos del protocolo.
Protocolo de trabajo
Protocolo de trabajo
¡Diseñemos el protocolo de 
trabajo!
Análisis de resultados
Discusión
● ¿Qué diferencias encuentran entre controlar un espectro- 
fotómetro y medir una muestra en estudio con un 
espectrofotómetro? 
● ¿Cuál es la diferencia conceptual entre realizar el control de 
centro de banda de un espectrofotómetro y realizar el barrido 
espectral de un analito? ¿Qué información brinda cada uno?
● ¿Qué entienden por linealidad instrumental y linealidad por 
Lambert-Beer? ¿Qué implica la pérdida de linealidad de los 
gráficos obtenidos en cada caso?
 
Discusión
● Si durante la segunda parte de la actividad práctica no 
hubiesen contado con el barrido espectral que permitiera 
determinar la longitud de onda óptima de trabajo, pero 
suponiendo que conocían de antemano el lambda óptimo 
teórico de absorción del complejo coloreado formado con el 
Reactivo de Biuret ¿cómo hubiesen procedido? ¿Qué control 
del equipo debían tener en cuenta?
● ¿Qué sucede si medimos muestras cuyo valor de absorbancia 
supere el límite máximo del rango de linealidad del equipo? 
¿Qué estrategia metodológica podemos emplear para que la 
absorbancia de la muestra entre en el rango de respuesta 
lineal?