Espectrofotometría 2019 versión final-1

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Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
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ESPECTROFOTOMETRÍA 
 
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS 
En los métodos espectrofotométricos se mide la intensidad de luz (energía radiante 
o radiación electromagnética) para determinar la concentración del analito presente en una 
muestra. 
Podemos dividir los métodos espectrofotométricos en dos grandes grupos según 
qué es lo que medimos para cuantificar al analito: 
1- Espectrofotometría de absorción: 
En estos casos se mide la Absorbancia (A) del analito, esto es la luz absorbida por el 
analito, y esta magnitud se relaciona con la concentración (C). 
 A ∞ c (la absorbancia es directamente proporcional a la concentración) 
2- Espectrofotometría de emisión: 
En este caso se mide la luz emitida por un analito previamente excitado, la señal 
emitida se relaciona con la concentración de la especie que emite luz cuando vuelve desde 
un estado excitado (estado de mayor energía al que llegó absorbiendo energía) a su estado 
basal (estado de menor energía posible tal como se encuentra naturalmente). 
 
Señal emisión ∞ C (la emisión es directamente proporcional a la concentración) 
 
CONCEPTOS PREVIOS 
A) Luz o radiación electromagnética 
Dado que los métodos espectrofotométricos se basan en la medición de luz, repasamos las 
características de la radiación electromagnética y recordamos a que se denomina espectro 
electromagnético. 
La Física Clásica define a la luz como una radiación electromagnética y la describe como 
una onda trasversal a la dirección de propagación (Figura 1). 
 
Figura 1- Representación gráfica de una 
onda electromagnética en tres 
dimensiones. La flecha negra representa 
la dirección de propagación (dirección de 
avance de la onda). 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
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Cada onda electromagnética se caracteriza por un conjunto de parámetros que la definen: 
1- Longitud de onda (λ): es la distancia que existe entre dos máximos o dos mínimos de la 
onda, se mide en unidades de longitud (cm, µm, nm, etc) (Figura 2) 
2- Número de onda (ν): corresponde a la recíproca (o la inversa) de la longitud de onda, se 
mide en (unidades de longitud) -1: cm-1; nm-1 
3- Frecuencia de la onda (ν): representa cuantas veces pasa la onda completa por un punto 
fijo en la unidad de tiempo, se mide en Hercios (1 Hz= 1Hertz) que significa la inversa del 
segundo siendo 1 Hz = 1/s = s-1 
4- Amplitud de la onda (A): se mide desde la línea de avance hasta el máximo de la onda 
(Figura 2). 
 
 
 
 
 
Figura 2- Representación bidimensional de una onda electromagnética. El eje vertical puede ser el campo 
eléctrico o el magnético y el eje horizontal puede ser el tiempo o la distancia. 
 
Los parámetros que caracterizan a una radiación electromagnética están relacionados entre 
sí de la siguiente manera: 
 ν = c/λ 
La unidad de medida que se usa para la longitud de onda (λ) depende de la región del 
espectro electromagnético en la que se esté trabajando (Figura 3). Si estamos en la región 
visible y ultravioleta (las que se usan en los métodos que vamos a estudiar) la unidad de 
medida es nm (nanómetros, corresponde a 10-9 metros). La frecuencia (ν) se mide 
generalmente en Hertz (1/s) y c es la velocidad de la luz en el vacío, es una constante cuyo 
valor es 3 x 108 m/s o 3 x 1010 cm/s 
 
Para utilizar esta relación entre frecuencia y longitud de onda, las unidades 
de la constante c definirán en que unidades utilizaremos los otros parámetros. 
 
 
 
A partir de la Física Cuántica, se agregó el concepto de “dualidad onda partícula” y se 
comenzó a interpretar a la luz como una onda de “fotones” que se propagan. Dichos 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
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fotones representan paquetes discretos de energía denominados “cuantos”. Con este nuevo 
concepto, se interpreta a la luz como una onda que propaga energía y la energía de la 
onda (radiación electromagnética) queda definida como: 
 E = h x ν 
 h: constante de Planck , su valor es 6,63 x 10-34 J.s (J: Joules; J=kg·m2/s2) 
 
Si recordamos que, ν = c/λ, podemos reemplazar en la expresión de energía: 
 E = h x c/λ 
En esta expresión podemos observar claramente que cuanto mayor es la frecuencia de la 
luz mayor será su energía y que cuanto mayor sea la longitud de onda menor será la energía: 
 
 A mayor ν → mayor energía 
 A mayor λ → menor energía 
 
 B) ¿Qué es el espectro electromagnético? 
Una fuente de luz, por ejemplo el sol y las lámparas eléctricas, emiten un amplio espectro 
de radiaciones electromagnéticas, es decir que emiten luz de diferentes longitudes de onda: 
Espectro electromagnético (Figura 3). 
 Figura 3. Representación esquemática del espectro electromagnético. 
 
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Aquellas longitudes de onda que corresponden al rango entre 400-700 nm 
pertenecen a lo que se denomina región visible del espectro ya que estas longitudes de onda 
afectan nuestra retina y provocan que observemos colores. Además de la región visible 
existen en el espectro electromagnético longitudes de onda a las que nuestra retina no es 
sensible: por encima de la región visible se encuentra la región Infrarroja (λ mayores a 700 
nm) y por debajo de la región visible se encuentra la región Ultravioleta (λ menores que 350 
nm). 
Como ya hemos mencionado, la energía de una radiación electromagnética es 
inversamente proporcional a su longitud de onda (E = h x c/λ), por lo tanto los rayos 
visibles tienen menor energía que los ultravioleta, pero mayor energía que los infrarrojos. 
Por ejemplo, pensemos el siguiente concepto de cultura general: debemos cuidarnos de los 
rayos UV. Los rayos ultravioletas son perjudiciales para nosotros en comparación con los 
rayos de la región visible o infrarroja. Las longitudes de onda de la región ultravioleta son 
pequeñas (<350 nm), lo que significa alta frecuencia y alta energía. 
 
 
C) Interacciones de los analitos (átomos y moléculas) con la luz. 
 
 ¿Qué sucede cuando un átomo absorbe energía lumínica?: ÁTOMO EXCITADO. 
 
Cuando un átomo absorbe energía lumínica en una cantidad adecuada se producen 
transiciones electrónicas, esto quiere decir que los electrones que están en su condición de 
menor energía posible (estado fundamental) pasan a un estado de mayor energía (estado 
excitado) que resulta inestable y rápidamente buscarán la manera de volver al estado 
fundamental. 
 
Para comprender estos conceptos es necesario realizar un repaso de la estructura 
atómica estudiada en Química General e Inorgánica. Dentro de un átomo, los 
electrones ocupan niveles discretos de energía (concepto que deriva de la teoría 
cuántica) y para pasar de un estado a otro de mayor energía deben absorber 
cantidades determinadas de energía denominadas cuantos. Podemos recordar que 
los electrones ocupan orbitales(s, p d, etc) y que en cada orbital podemos ubicar 
como máximo dos electrones apareados. Los niveles de energía dentro del átomo 
los denominábamos 1,2, 3, etc y a medida que aumenta el nivel de energía, mayor 
es el número de orbitales presentes en cada nivel así, el primer nivel sólo tiene 1 
orbital (1s) el segundo nivel posee 4 orbitales (2s; 2p; 2p; 2p) y así sucesivamente. 
También podemos recordar que de acuerdo a la posición de un átomo en la tabla 
periódica podíamos deducir la estructura electrónica del mismo. Por ejemplo 
pensemos en el átomo de Na, que tiene número atómico 11, es del período 3 y del 
grupo I. Esto quiere decir que tiene 11 electrones en total, los que ocupan hasta el 
tercer nivel de energía electrónica y que tiene 1 sólo electrón en el último nivel: 
1s2; 2s2 y 2p6; 3s1 
 
Una vez que hemos recordado la estructura interna del átomo y donde se ubican los 
electrones, ahora podemos comprenderque cuando los electrones dentro del átomo 
absorben una cantidad de energía adecuada pueden pasar de un nivel energético a otro de 
R
E
P
A
S
O
 
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mayor energía (Figura 4). El resultado de esta transición es un átomo excitado que resulta 
inestable y rápidamente buscará la manera de regresar al nivel de menor energía 
eliminando el exceso de energía de alguna manera (liberando calor o emitiendo luz) (Figura 
4): PROCESO DE RELAJACIÓN. 
 
Figura 4- Representación esquemática de los niveles de energía en un 
átomo. E0, E1 y E2 representan los niveles electrónicos, E0 
corresponde al nivel fundamental y los otros niveles son de mayor 
energía. Para simplificar el esquema no se dibujaron los niveles 
energéticos de cada uno de los orbitales (s, p, etc) dentro de cada nivel 
energético. La flecha negra representa un salto electrónico entre el nivel 
fundamental y el primer nivel excitado. La flecha gris indica el regreso 
al estado fundamental. La diferencia de energía entre los niveles son 
cantidades discretas de energía (determinados valores de hν). 
 
¿Qué sucede cuando una molécula absorbe energía lumínica? : MOLÉCULA 
EXCITADA 
Una molécula está formada por la unión entre átomos, estas uniones no son 
estáticas ya que permanentemente vibran y rotan. Las uniones entre átomos se deben a 
enlaces entre sus electrones externos. Por lo tanto cuando hablamos de la energía interna 
(E) de una molécula estamos hablando de tres componentes: E rotacional, E vibracional y 
E electrónica. 
Tomando en cuenta esta estructura interna de una molécula tenemos que pensar 
que los electrones dentro de la molécula tendrán determinado nivel energético de vibración 
y de rotación además de su nivel electrónico (Figura 5). 
 
 
Figura 5- Representación esquemática de los niveles de 
energía en una molécula: electrónicos (E0, E1); vibracionales 
(0, 1, 2, 3) y rotacionales (0, 1, 2). Para simplificar el esquema 
los niveles rotacionales se dibujaron sólo en el nivel 
electrónico E0, pero este esquema se repite en todos los 
niveles energéticos. Los niveles de energía rotacional están 
separados entre sí por baja energía, los niveles de energía 
vibracional están separados entre sí por energía media y 
niveles electrónicos están separados entre sí por mayor 
energía. La excitación en la molécula puede ser sólo 
rotacional (flecha gris clara) vibracional (flecha gris más 
oscura) o electrónica (flecha negra). 
 
 
 
La separación entre los niveles de energía estará dada por cantidades discretas de 
energía, es decir “cuantos” de energía (E = h x ν). Esto quiere decir que para que un 
electrón pase de un nivel energético a otro dentro de la molécula debe absorber cantidades 
discretas de energía. La transición electrónica será la que alcance según la energía absorbida, 
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pero es un hecho que si la energía fue suficiente para hacer un salto electrónico, fue más 
que suficiente para hacer saltos vibracionales y rotacionales ya que son de menor energía. 
Las moléculas excitadas son inestables al igual que los átomos, por lo tanto también buscarán la 
manera de regresar a su nivel de menor energía posible liberando calor o emitiendo luz: 
PROCESO DE RELAJACIÓN. 
 
La energía de la radiación de microondas alcanza sólo para transiciones rotacionales. 
La energía de la radiación infrarroja alcanza para las transiciones vibracionales y rotacionales. 
La energía de las radiaciones visible y UV alcanza para producir transiciones electrónicas, 
vibracionales y rotacionales. 
 
 
PREGUNTAS Y PROBLEMAS SOBRE LOS CONCEPTOS PREVIOS 
 
1- ¿Qué es una radiación electromagnética? 
2- Definir los parámetros ondulatorios de la radiación electromagnética. 
3- ¿Cómo están relacionados la energía y la longitud de onda? 
4- ¿A qué se llama radiación monocromática? 
5- Ordene las regiones visible, infrarrojo y ultravioleta del espectroelectromagnético según 
la Energía que poseen y justifique. 
6- Calcular la longitud de onda () en cm y en nm correspondiente a cada una de las 
siguientes frecuencias: a) 1,97×1091/s, b) 4,86×10151/s, c) 7,32×10191/s y d) 1,42×10231/s 
Calcular la frecuencia (υ) en 1/s correspondiente a cada una de las siguientes longitudes de 
onda: a) 200 nm, b)15 Å, c) 1,50×10-6 cm y d) 6,10μm 
7- ¿Qué sucede cuando una molécula absorbe enrgía? ¿Qué sucede cuando un átomo 
absorbe enrgía? 
8- ¿Qué significa excitación y relajación de los analitos? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Métodos espectrofotométricos que vamos a estudiar en el curso de 
Análisis Químico: 
 
 
 
 
I- ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR 
UV-VISIBLE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
II- ESPECTROFOTOMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA: 
FOTOMETRÍA DE LLAMA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
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I- ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR 
UV-VISIBLE 
 
En esta espectrofotometría el equipo que se utiliza se denomina 
ESPECTROFOTÓMETRO UV-VISIBLE, es un instrumento que mide la 
ABSORBANCIA de una solución. Por lo tanto para medir la concentración de un analito 
por este método es necesario que el analito (o un producto de reacción del analito) tenga la 
propiedad de absorber radiación electromagnética (luz) en la región del UV-visible. 
¿Qué significa que el analito absorbe luz? 
Significa que cuando un haz de luz incide sobre la solución del analito, éste absorbe energía 
la que utiliza para pasar de su estado basal de energía (el más bajo, estado fundamental) a 
un estado excitado (de mayor energía). 
 Energía absorbida por átomos = E de transiciones electrónicas 
 Energía absorbida por moléculas = E de transiciones rotacionales, vibracionales y electrónicas. 
 
1- DEFINICIÓN DE ABSORBANCIA 
Cuando un haz de luz monocromática, es decir de una determinada longitud de 
onda, atraviesa una solución que contiene una especie absorbente, la intensidad (o la 
potencia) de la radiación disminuye como consecuencia de la absorción de energía por 
parte de las especies absorbentes presentes en la solución (Figura 6 ). 
 
 
 
Figura 6- Dibujo que representa un haz de luz monocromática que incide en una solución que 
absorbe dicho haz. P0: potencia de la luz incidente y P: potencia luego de atravesar la muestra 
 
Se define TRANSMITANCIA de una solución a la fracción de luz que deja pasar dicha 
solución: 
 T= P/P0 
Se define la ABSORBANCIA de la solución a partir de la trasmitancia de la solución 
como: 
 A = -log T 
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De las expresiones matemáticas podemos deducir que cuanto mayor es la A menor 
será la T, es decir que si una solución absorbe mucho, transmitirá poco. Podemos observar 
además que de acuerdo a la definición de T y A, ambas propiedades son adimensionales, ya 
que se definen a partir de un cociente de la misma magnitud (P/P0). 
 
2- ¿CÓMO SE RELACIONA LA MEDIDA DE ABSORBANCIA CON LA 
CONCENTRACIÓN DEL ANALITO? 
 
ECUACIÓN DE LAMBERT Y BEER 
Cuando un haz de luz monocromática (de determinada longitud de onda) atraviesa una 
solución, la ABSORBANCIA es directamente proporcional a la distancia recorrida por la luz 
atravesando la solución absorbente y a la concentración del analito en la solución. La distancia 
recorrida por la luz atravesando la solución se denomina camino óptico y se mide generalmente en 
cm (Figura 7). 
 
 
 
 
 
 
Figura 7- Esquema que representa el fenómeno que describe la ley de Lambert y Beer. P0 
es la potencia de la luz monocromática incidente; P es la potencia de la luz luegode 
atravesar la solución de concentración c y b es el camino óptico. 
 
 A = ε x b x c 
 
A: absorbancia, adimensional. 
ε: coeficiente de extinción molar ó absortividad molar, se define como la unidad de 
absorbancia por unidad de concentración y por unidad de longitud de la trayectoria de luz; 
es una constante definida que depende de la solución y la longitud de onda, en general su 
unidad es la inversa de la molaridad por la inversa de cm, es decir (M x cm)-1 ó L/mol x cm 
b:es el camino óptico, en general se mide en cm. 
c: es la concentración del analito expresada en molaridad (M). 
P0 
P 
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Dado que la Absorbancia y la absortividad molar dependen de la longitud de onda 
de la luz incidente, muchas veces se expresa la ecuación de Lambert y Beer como una 
función de la longitud de onda: 
 A (λ) = ε (λ) x b x c 
 
Con cierta frecuencia se utiliza como constante de proporcionalidad en la Ley de Lambert y 
Beer la absortividad específica (a) en lugar de la absortividad molar. Las unidades de la 
absortividad específica son (L/g x cm) y por lo tanto en este caso la concentración del 
analito se debe expresar en g/L. 
 
 A = a x b x c 
 
La ley de Lambert Beer es una ley límite, es decir que sólo se cumple 
en determinadas condiciones: luz monocromática y soluciones diluidas. 
 
 
 
Representación gráfica de la Ley de Lambert y Beer. 
 
La Figura 8 representa la Absorbancia medida a una determinada longitud de onda 
en función de la concentración de analito. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Podemos observar que la representación gráfica de la ley de Lambert y Beer es una 
recta. En el eje de las ordenadas (eje Y) se representan los valores de A y en el eje de las 
abscisas (eje X) se representan las concentraciones del analito. La pendiente de la recta 
corresponde al producto ε x b. 
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Desviaciones de la ley de Lambert Beer (¿por qué se pierde la 
linealidad entre la A y c?) 
 
1- Si la solución del analito es concentrada (en general mayor a 0,010 M) se pierde la 
relación lineal entre la A y la c, las moléculas muy próximas entre si comienzan a interferir 
entre ellas en el proceso de absorción de energía. Decimos que la recta se “plancha” a altas 
concentraciones. 
2- Desviaciones químicas: 
Se pierde la relación lineal entre A y c cuando existen interferencias en la solución, tales 
como: - asociación o disociación del analito en solución 
 - reacciones del analito con el solvente 
 - presencia de otros componentes en la muestra que también absorben luz incidente. 
3- Desviaciones instrumentales: 
La ley de Lambert-Beer se aplica usando luz monocromática. Sin embargo en la práctica, el 
espectrofotómetro utiliza una fuente policromática de luz y mediante un sistema óptico 
adecuado (una red de difracción o un filtro) se selecciona un segmento de longitudes de 
onda centrado en la que se desea utilizar, a este segmento se lo denomina “banda”. Por este 
motivo es muy importante elegir adecuadamente la longitud de onda de trabajo. Para ello se 
utiliza el ESPECTROGRAMA o ESPECTRO DE ABSORCION que es un gráfico, 
característico para cada analito, en el que se grafican las absorbancias del analito en función 
de la longitud de onda incidente (Figura 9). 
 
 
Figura 9- Representación de un 
ESPECTROGRAMA o 
ESPECTRO de ABSORCIÓN 
de un analito. A es la banda de 
longitudes de onda centrada en 
λ1 y B es la banda de longitudes 
de onda centrada en λ2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Si analizamos la banda centrada en la longitud de onda λ2, vemos que no habrá gran 
variación en la lectura de absorbancia a lo largo de esa banda. Por el contrario la banda 
centrada en la longitud de onda λ1, muestra una variación importante en la lectura de 
absorbancia a lo largo de la banda. Concretamente, para tener un pequeño error debemos 
elegir una longitud de onda ubicada en una región plana del espectrograma correspondiente 
a fin de minimizar este error instrumental. 
λ1 λ2 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
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3- COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS 
 
1- Fuente de luz policromática (para el visible lámpara de Tungsteno y para UV lámpara de 
deuterio). 
 
2- Sistema óptico necesario para seleccionar una determinada longitud de onda (colimador, 
monocromador, selector de longitud de onda). 
 
3- Cubeta (recipiente donde se coloca la muestra a medir, para el visible debe ser de vidrio 
o de plástico; para UV de cuarzo). Muchas veces al camino óptico (b) se lo denomina 
ancho de la cubeta. 
 
4- Detector (Fototubo). 
 
5- Procesador y lector de la señal. 
 
 
 
Figura 10- Representación esquemática de los componentes del Espectrofotómetro. 
 
 
 
4- ¿CÓMO PUEDO DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE UN 
ANALITO UTILIZANDO LA ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN 
MOLECULAR UV-VIS? 
 
4.1- Utilizando la ley de Lambert y Beer 
Se aplica cuando se conoce el valor del coeficiente de Absortividad Molar para el 
analito que queremos cuantificar a la longitud de onda de trabajo y en la solución utilizada 
(datos de bibliografía). En estos casos medimos la absorbancia de la muestra a analizar y 
utilizando la Ley de Lambert Beer podemos despejar el valor de la concentración. Esta 
modalidad de trabajo es la que se utiliza para medir pigmentos en extractos vegetales o 
productos agroindustriales. 
 
 1- 2- 3- 4- 5- 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
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4.2- Utilizando el procedimiento de la curva de calibración 
Se aplica cuando los valores del coeficiente de Absortividad Molar no se conoce y 
en los casos en los que se necesita realizar una reacción previa para lograr que el analito se 
transforme en una especie absorbente. En la práctica generalmente el analito no absorbe 
luz visible, pero es fácil transformarlo en una especie absorbente mediante una reacción 
previa que lo transforme en un compuesto coloreado (por lo tanto que absorbe en el 
visible). 
En este procedimiento es necesario preparar una serie de soluciones de 
concentración conocida del analito que queremos cuantificar, hacer la reacción previa para 
generar el compuesto absorbente y luego medir la ABSORBANCIA de estas soluciones 
coloreadas en el ESPECTROFOTOMETRO UV-Vis. Tendremos entonces una tabla de 
datos correspondientes a pares ordenados (x,y) conocidos, los que podremos representar 
en un gráfico de ejes cartesianos. En el eje de las X se representan las concentraciones 
conocidas de las soluciones y en el eje de las Y se representan las A medidas en el equipo 
(Figura 12). 
 
 
Tabla de datos conocidos 
(pares x,y) 
 
 
Figura 12- Representación gráfica de los datos de la tabla. La recta tiene una ecuación 
asociada que es la que figura en el gráfico. R2 es un control estadístico de la curva de 
calibración, debe ser lo más cercano a 1 posible. 
 
 
La recta de calibración (curva de calibración) obtenida será nuestra referencia para 
transformar la medida de A de cualquier muestra desconocida en un valor de concentración 
para el analito. Podemos hacerlo gráficamente (interpolando el valor de A medido en la 
gráfica) o bien despejando el valor de X que le corresponde a la medida Y (A), en la 
ecuación de la recta de calibración obtenida. 
 
 
Se utilizarán las dos formas de trabajo al resolver los problemas 
 del cuestionario y en el trabajo práctico de laboratorio. 
 
 
ppm analito Abs λx
0 0
2 0,0234
5 0,0578
8 0,0943
10 0,1443
15 0,1968
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
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5- APLICACIONES DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN 
MOLECULAR UV-VISIBLE.5.1- Seguimiento de la maduración de un fruto a través 
de la medida del contenido de pigmentos: Cuantificación 
de clorofilas, carotenoides y antocianinas. 
 
 
5.2- Seguimiento de la senescencia foliar que acompaña 
a la etapa de llenado de los granos a través de la medida 
de pigmentos y proteínas en las hojas. 
 
 
 
5.3- Análisis de la calidad de granos para diversos usos: 
determinación del contenido de hidratos de carbono y 
de proteínas. 
 
 
 
5.4- Determinación de compuestos nitrogenados y 
cloro libre en agua 
potable y en aguas 
residuales. 
 
 
 
 
5.5- Determinación del contenido de fósforo en un fertilizante 
o en suelo. 
 
 
 
 
5.6- Determinación de hierro en harinas y panificados. 
 
 
 
 
 
5.7- Análisis de la composición de nutrientes en alimentos 
para ganado. 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
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6- TRABAJO PRÁCTICO EN EL LABORATORIO 
 
Determinación del contenido de hierro en harinas 
por espectrofotometría de absorción molecular 
 
6.1- Funciones fisiológicas del Hierro 
 
El déficit de hierro (Fe) es un problema frecuente en la 
dieta humana. Es un elemento que cumple importantes 
funciones fisiológicas en nuestro organismo: forma parte de la 
hemoglobina (proteína transportadora de oxígeno ubicada en 
los glóbulos rojos) y es un componente estructural de la 
mioglobina (proteína muscular). El déficit de hierro en la dieta 
provoca Anemia Ferropénica, enfermedad muy común en niños 
con baja calidad alimentaria, y en las futuras madres durante las 
últimas semanas de embarazo ya que aumenta la demanda de 
hierro. El aporte mínimo de Fe recomendado es de 10 a 15 mg/día. Las principales fuentes 
de hierro son: carnes, hígado, verduras de hoja, cereales integrales, frutos secos y levaduras. 
Con el fin de contribuir a disminuir la frecuencia de la Anemia Ferropénica en 
Argentina, en el año 2002, se sancionó la ley 25630 que establece el enriquecimiento de las 
harinas con Fe, ácido fólico y vitaminas del grupo B. Por dicho motivo, las harinas y los 
productos elaborados con ellas (galletitas, fideos, etc.) están enriquecidos en Fe. Además, 
algunas industrias alimentarias han incorporado el agregado de Fe en sus formulaciones 
como un “valor agregado” para sus productos. En la actualidad, es frecuente encontrar 
leche fortificada en Fe. Por lo tanto, en la industria alimentaria la determinación de Fe para 
rotular los alimentos se ha transformado en un análisis de rutina. 
 En cuanto a las plantas, el hierro también es un 
elemento muy importante que forma parte de los 
citocromos, moléculas que intervienen en funciones 
vitales como la respiración y la fotosíntesis. El Fe 
participa de muchas reacciones de óxido-reducción 
involucradas en procesos metabólicos de las plantas 
que se llevan a cabo en mitocondrias, cloroplastos y 
peroxisomas. Este elemento es uno de los 
denominados micronutrientes para las plantas, es decir 
que es necesario en pequeñas cantidades pero dado que 
cumple funciones indispensables para la vida no debe 
estar ausente. El Fe es un ión poco móvil dentro de la 
planta, por lo que la deficiencia de Fe en plantas se 
pone en evidencia en las hojas jóvenes pequeñas y 
cloróticas (se ven amarillas o blancas). 
 
6.2- Medida de la concentración de Fe en alimentos y plantas 
 
 Uno de los métodos de referencia para la determinación de Fe en alimentos, plantas 
y suelos es Espectrofotometría de absorción molecular en la región del visible. El 
fundamento del método es la reacción, en medio clorhídrico, entre el ión férrico (Fe +3) 
y el ión tiocianato (SCN-1) para formar un complejo soluble rojo denominado 
tiocianato férrico: 
 
HCl 
Aumenta la deficiencia de hierro
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
16 
Fe+3 + 6 SCN- Fe (SCN)6 
-3 
 
El equilibrio de esta reacción se desplaza hacia la formación del complejo rojo en 
presencia de un exceso de ión tiocianato. Las posibles interferencias de esta reacción 
corresponden a iones que normalmente están ausentes o en cantidades muy pequeñas 
(trazas) en los alimentos por lo que este método resulta específico. Las condiciones de 
reacción utilizadas deben ser tales que el ión Fe+3 sea el reactivo limitante ya que en estas 
condiciones la cantidad de complejo coloreado que se forma estará determinada por el 
contenido de Fe+3. En estas condiciones la medida de la absorbancia a una determinada 
longitud de onda (luz monocromática) y la concentración del complejo tiocianato férrico se 
relacionan de acuerdo a la ley de Lambert Beer: 
 A (λ)= ε (λ) x b x c 
 
A (λ): absorbancia a determinada longitud de onda (adimensional) 
 
ε (λ): coeficiente de absortividad molar a esa misma longitud de onda (L x mol-1 x cm-1) 
 
b: camino óptico (cm) 
 
c: concentración (M (mol x L-1) 
 
Para realizar esta determinación, la muestra debe ser acondicionada previamente. El 
procedimiento general consiste en secar la muestra en estufa a 60 °C hasta perder la 
humedad (peso constante). Luego se pesa en balanza analítica una cantidad determinada de 
la muestra seca y se reduce a cenizas en una mufla a 500 °C durante 2 h. Las cenizas 
obtenidas se disuelven en HCl 0,3 N y se llevan a un volumen final de 100 mL con agua 
destilada. La solución clorhídrica de las cenizas de la muestra será utilizada para realizar la 
medida espectrofotométrica del Fe+3. 
 
6.3- Actividades en el laboratorio 
 Se analizará el contenido de Fe de una muestra de harina 
para definir si cumple con la ley 25630, para lo cual el contenido de 
Fe debe ser por lo menos 30 mg de Fe cada 100 g de harina. 
Recibimos una solución de cenizas de harina, la que fue preparada 
de la siguiente manera: 3 g de harina seca se calcinaron en una mufla 
a 500 °C durante 2 h, las cenizas obtenidas se disolvieron en HCl y 
se llevaron a un volumen final de 100 mL. 
 Para determinar el contenido de Fe en la muestra de harina, 
una porción adecuada de esta solución clorhídrica de cenizas, donde 
se encuentra el analito (Fe+3), se hará reaccionar con el tiocianato en 
medio clorhídrico para obtener el complejo coloreado tiocianato 
férrico cuya absorbancia será medida a una determinada longitud de 
onda. 
 Ahora bien, para transformar la lectura de absorbancia en concentración del analito, 
es necesario realizar primero lo que se denomina CURVA de CALIBRACIÓN. Para ello se 
preparan soluciones del analito (Fe+3) de concentración conocida, las que se utilizan para 
obtener el complejo coloreado. A continuación se mide en el espectrofotómetro, para cada 
concentración conocida de analito la absorbancia del complejo obtenido a una determinada 
longitud de onda. En resumen, obtendremos una serie de pares de valores conocidos 
(concentración conocida de Fe+3 y su absorbancia correspondiente). Cuanto mayor sea la 
concentración de Fe+3 utilizada mayor será la intensidad del color obtenido y por lo tanto 
mayor la absorbancia medida en el espectrofotómetro. 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
17 
 Con los datos obtenidos se podrá graficar la curva de calibración que utilizaremos 
para transformar los datos de absorbancia medidos en muestras desconocidas en sus 
valores correspondientes de concentración del analito. 
 
Materiales y reactivos necesarios: 
 7 tubos de plástico tipo Falcon para realizar la curva de calibración y 1 tubo extra 
para cada muestra que se va a analizar; gradilla porta tubos; 1 bureta cargada con solución 
patrón 0,0005 M (0,5 mM) de Fe+3; 1 bureta cargada con solución 1,5 M KSCN ; 1 bureta 
cargada con solución 2 M de HCl. 
 
Procedimiento: 
 Para la curva de calibración: rotular una serie de tubos de 15 mL de plástico 
(denominados tipo Falcon), con los siguientes números: 0, I, II, III, IV, V 
 En cada tubo colocar los siguientes reactivos: 
Tubo Volumen de Patrón 
Fe+3 0,5 mM (ml) 
Volumende 
HCl (ml) 
Volumen de 
KSCN (ml) 
Volumen final 
(ml) 
0 0 5 2,5 7,5 
I 0,5 4,5 2,5 7,5 
II 1 4 2,5 7,5 
III 1,5 3,5 2,5 7,5 
IV 2 3 2,5 7,5 
V 2,5 2,5 2,5 7,5 
 
 De manera similar se procederá con las muestras desconocidas (muestras de harina 
a analizar). Para ello se rotularán adecuadamente tubos de plástico tipo Falcon y se 
agregarán los siguientes reactivos: 
Tubo Volumen de solución de cenizas 
correspondiente (ml) 
Volumen 
de HCl 
(ml) 
Volumen 
de KSCN 
(ml) 
Volumen 
final 
(ml) 
M1 5 0 2,5 7,5 
M2 5 0 2,5 7,5 
 
 Esperar 15 min y medir la absorbancia del complejo obtenido a la longitud de onda 
adecuada. 
 Para elegir la longitud de onda de medida, se utiliza una de las soluciones 
coloreadas obtenidas para realizar la curva de calibración, por ejemplo el tubo II o III. Se 
obtiene el espectro de absorción (espectrograma) en el espectrofotómetro y en base al 
espectro de absorción obtenido se define la longitud de onda que utilizaremos para 
cuantificar. Una vez que el espectrofotómetro se “setea” en la longitud de onda 
seleccionada, con la solución 0, se pone el espectrofotómetro en lectura de absorbancia 0 y 
luego se mide la absorbancia de las soluciones restantes (0, I, II, III, IV, V). 
 Con los datos obtenidos se armará una tabla de 
pares de valores (x,y) = (concentración de Fe+3; Abs) y se 
realizará un gráfico en papel milimetrado para obtener la 
CURVA DE CALIBRACIÓN. Ésta será la herramienta 
que utilizaremos para transformar cualquier dato de 
absorbancia en concentración de analito. 
 
A continuación se miden las muestras desconocidas, 
verificando que los valores de absorbancia obtenidos estén 
comprendidos en el rango de valores de la curva de 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
18 
calibración. Si alguna muestra presenta un valor de absorbancia por encima del rango de la 
curva de calibración, debe ser diluída y se debe repetir la medida con la muestra diluída. El 
dato de la dilución realizada debe tenerse en cuenta en el momento de realizar los cálculos 
correspondientes. Los resultados obtenidos deben expresarse como mg de Fe /kg de 
harina. 
 
7- PROBLEMAS Y CUESTIONARIO PARA RESOLVER SOBRE LOS 
CONCEPTOS TEÓRICOS Y PRÁCTICOS DE ESPECTROFOTOMETRÍA DE 
ABSORCIÓN MOLECULAR UV-VIS. 
 
1- Calcular la absorbancia que corresponde a cada valor de transmitancia porcentual: 
a) 20%, b) 35,3 %, c) 75,5 %, d) 4,5 % y e) 100% 
Rta.: a) 0,69, b) 0,452; c) 0,122; d) 1,346 y e) 0,00 
2- Dados los valores de absorbancia, calcular las transmitancias porcentuales 
correspondientes a cada uno: a) 0,60, b) 0,177, c) 0,472 y d) 1,346. Rta: a) 25,12; b) 66,53; c) 
33,73 y d) 4,51 
3- Calcular la absorbancia que corresponde a cada valor de transmitancia porcentual: a) 
36,8%, b) 22,0 %, c) 82,3 % y d) 4,2 %. Rta.: a) 0,434; b) 0,657; c) 0,084 y d) 1,376 
4- Calcular la T% que corresponde a cada uno de los siguientes valores de absorbancia: a) 
0,800, b) 0,115, c) 0,585 y d) 0,057. Rta.: a) 15,84; b) 76,73; c) 26,00 y d) 4,20 
5- En una determinación fotométrica, el instrumento dio una T% de 24,7 usando una 
cubeta de 5 cm de camino óptico. ¿Cuál será la T% de la misma solución si se usan celdas 
de: a)1,00 cm, b) 10,00 cm y c)1,0 mm? Rta.: a) 75,61; b) 6,10 y c) 97,24 
6- Una solución 0,0500 M, cuyo soluto tiene un peso molecular de 230, da una lectura de 
transmitancia de 35 % cuando se usa una cubeta de 1 cm de camino óptico y una longitud 
de onda de 270 nm. Calcular la absortividad (a). Rta.: 0,0396 g l-1cm-1 
7- Calcular la molaridad de una solución, si la absortividad molar es de 1,27 M-1cm-1. La 
absorbancia leída de la muestra es de 0,140 a 450 nm y el camino óptico de la cubeta es de 
5 cm. Rta.: 0,0220M 
8- Calcular la absortividad de una solución al 0,25% m/v que da una lectura de absorbancia 
de 0,180 a 615 nm, el peso molecular es 60 y el espesor de la cubeta es de 2 cm. Rta.: 2,15 
9- Una solución de concentración 0,004% m/v tiene una transmitancia del 57% cuando se 
lee a 550 nm, usando una cubeta de 5 cm. El PM del soluto es 100. Calcular la absortividad 
molar. Rta.: 122 
10- En una cubeta de 2 cm de espesor se colocan 5 g (microgramos) de soluto en 5 ml de 
solución. La absortividad molar de 5000 M-1cm-1, la medida se efectúa a 640 nm y el peso 
molecular del soluto es 22. Calcular la transmitancia porcentual a esa longitud de onda. 
Rta.: 35,11 % 
11- Un fotómetro portátil, de respuesta lineal a la radiación registró un valor de 84,2 A 
con una solución del blanco en la trayectoria de la luz. Al reemplazar el blanco por una 
solución absorbente dio una respuesta de 23,9 A. Calcular: a) la transmitancia porcentual, 
b) la absorbancia, c) la transmitancia esperada para una solución en la que la concentración 
de la especie absorbente es la tercera parte de la correspondiente a la solución original de 
muestra y d) la transmitancia esperada para una solución cuya concentración es el doble de 
la correspondiente a la solución original de muestra. Rta.: 28,38; b) 0,547; c) 0,657 y d) 
0,080 
12- Una serie de soluciones patrón del complejo Fe(II)-1,10-fenantrolina se midieron a 510 
nm obteniéndose las siguientes lecturas de absorbancia cuando se empleó una cubeta de 
1,00 cm. 
 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
19 
Concentración de Fe(II)-
1,10-fenantrolina en mM 
2,00 5,00 8,00 12,00 16,00 20,00 
Absorbancia 510nm 0,164 0,425 0,628 0,951 1,260 1,582 
 
Construir la curva de calibración a partir de estos datos. 
El método anterior se aplicó a la determinación rutinaria de hierro en alícuotas de 25,00 ml 
de aguas naturales que se diluyeron a 50,00 ml antes de llevar a cabo las medidas 
espectrofotométricas a 510 nm. Determinar la concentración (en mM de Fe) de muestras 
que dieron los siguientes datos de absorbancia: a) 0,107, b) 0,721 y c)1,538. Rta.: a) 2,36 
mM; b) 18,08 mM y c) 38,98 mM. 
13- Se hace una determinación espectrofotométrica de una sustancia en solución. Se 
realizan dos lecturas, la primera con una cubeta de 1 cm de espesor obteniéndose una 
transmitancia de 35 %; la segunda lectura se realiza usando una cubeta de 2 cm de espesor. 
Calcular la transmitancia porcentual (T%) de ésta última medida. Rta.: 12,25 
14- ¿Cuál es la absorbancia de una solución 0,0500M si la cubeta de medida tiene 1 cm de 
camino óptico, el peso molecular del soluto es 130, la absortividad molar es de 1,60 lmol-
1cm-1 y la lectura se efectúa 280 nm? Rta.: 0,08 
15- Calcular la concentración en moles por litro de una solución que tiene una absortividad 
molar de 1,39 lmol-1cm-1 a 533 nm y que leída en cubeta de 2,00 cm da una absorbancia 
de 0,167. Rta.: 0,0600 M 
16- Una solución 0,00005 % m/v de un soluto de peso molecular 120, transmite 68 % de 
luz de 533 nm cuando se mide en una cubeta de 2,00 cm. Calcular la absortividad molar. 
Rta.: 20072 l mol-1cm-1 
17- Una solución de un compuesto de peso molecular 215, cuya concentración es 0,0010 
M, se midió en una cubeta de 1,5 cm obteniéndose una lectura de 18,4 % T a 470 nm. 
Calcular la absortividad y la absortividad molar.Rta.: a)3,42 l g-1 cm-1 y b) 490 l mol-1 cm1 
18- La absortividad molar de una sustancia es 6,22103 lmol-1cm-1. En una cubeta de 
1,05 cm de espesor se colocaron 3 ml de una solución que contenía 0,2 moles. Calcular la 
T% a 340 nm. Rta.: 36,67 
- CUESTIONARIO 
1- ¿A qué se denomina transmitancia (T) de una solución? 
2- ¿A qué se denomina absorbancia de una solución? 
3- ¿Qué expresión matemática relaciona la transmitancia y la absorbancia? 
4- Enuncie y explique la ley de Lambert-Beer. ¿Cuáles son las limitaciones de la ley de 
Lambert-Beer? 
5- ¿Qué es un espectro de absorción y para qué se utiliza? 
6- ¿Qué criterio emplea para seleccionar la longitud de onda óptima para efectuar una 
determinación espectrofotométrica? 
7-¿Cuáles son los componentes más importantes de un espectrofotómetro de absorción 
molecular UV-Vis? 
8-¿Cómo puedo obtener luz monocromática a partir de una fuente deluz policromática? 
9- ¿De qué material deben estar construidos los recipientes que contienen la muestra es 
decir las cubetas del espectrofotómetro? 
10- ¿Cómo puede determinar experimentalmente la concentración de una solución por 
espectrofotometría? 
 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
20 
II- ESPECTROFOTOMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA: 
FOTOMETRÍA DE LLAMA 
***Se recomienda repasar los conceptos previos que están en el comienzo de la guía de los métodos 
espectrofotométricos. 
 
La espectroscopia de emisión atómica es un método analítico basado en la medida 
de la luz emitida por átomos o iones de un elemento que se encuentran en estado de vapor. 
A temperatura ambiente, todos los átomos se encuentran en el estado de menor energía 
posible, esto es su estado fundamental. La excitación de los átomos en estado de vapor 
puede realizarse de diferentes maneras, en el caso particular de la técnica FOTOMETRÍA 
DE LLAMA, la excitación se logra mediante el calor de una llama (energía térmica). El 
tiempo de vida del átomo excitado es breve y rápidamente vuelve al estado fundamental 
emitiendo luz de una longitud de onda característica (fotón: h c/λ). La señal de emisión que 
se mide en el FOTÓMETRO DE LLAMA es directamente proporcional a la 
concentración del átomo que emite. 
 
 Señal de emisión = k x c 
 
k: es la constante de proporcionalidad. 
c: concentración del analito cuya emisión se mide en el Fotómetro de llama. 
 
1- COMPONENTES DEL FOTÓMETRO DE LLAMA 
 
1- Nebulizador: sistema que toma 
la muestra a analizar y la coloca 
directamente como pequeñas gotas 
sobre la llama a través de un capilar. 
2- Entrada de aire y entrada de 
gas natural, ambas con regulador 
de presión: comburente y 
combustible con el que se formará 
la llama. 
3- Llama: lugar donde la muestra 
pasa por una serie de procesos que 
terminarán con la emisión de luz 
por parte de los componentes de la 
muestra que logren excitarse. 
4- Sistema óptico: es un filtro que 
permitirá seleccionar la longitud de onda que llegue al detector; es decir seleccionará de todas las 
emisiones que se producen en la llama, aquella que corresponde al analito que queremos cuantificar. 
Por ejemplo el Fotómetro de llama que se usará en el práctico tiene un filtro para medir Sodio, otro 
para medir Potasio y otro para medir Litio. 
5- Detector: fototubo 
6- Procesador y lector de la señal. 
 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
21 
2- PROCESOS QUE OCURREN EN LA LLAMA 
 
 1- Introducción y pulverización de la muestra sobre la llama. 
 2-Evaparación del solvente, quedando las sales secas. 
 3-Fusión y evaporación de las sales. 
 4-Formación de vapor atómico. 
 5-Excitación de los átomos en estado de vapor (por absorción de energía térmica). 
 6-Emisión de luz cuando los átomos excitados vuelven al estado basal (relajación). 
 
Pensemos los 6 pasos para una muestra de salmuera diluida (agua con sal NaCl) en la que 
queremos determinar el contenido de sodio por fotometría de llama: 
 1- Pequeñas gotitas de agua sobre la llama. 
 2- Evaporación del agua dejando un residuo de sal (NaCl) seca. 
 3- La sal se funde, pasa al estado líquido y luego el líquido se evapora. 
 4- Se forma vapor atómico: átomos de Na y átomos de Cl en estado de vapor. 
 5- Los átomos de sodio que poseen un electrón en su capa de valencia, se excitan 
fácilmente pasando el electrón a un estado de mayor energía (átomos de sodio excitados). 
 6- Los átomos de sodio en estado de vapor y excitados vuelven al estado 
fundamental emitiendo luz de 589 nm (línea amarilla del sodio). 
 
¿Qué pasa con los átomos de cloro? 
 Dado que es un elemento del grupo 7 de la tabla periódica (muchos electrones en la 
última capa) el calor de la llama aire-gas natural no es suficiente para excitarlo. 
 
¿Qué pasa si en la muestra hay átomos de potasio y de calcio? 
 Dado que son del grupo I y II respectivamente en la tabla periódica, estos átomos 
también se excitan con la energía de la llama aire-gas natural y emitirán luz para regresar al 
estado basal, pero utilizando el filtro adecuado el detector del fotómetro sólo recibirá la 
señal del sodio. 
 
3- REQUISITOS QUE DEBE CUMPLIR LA LLAMA 
 
Debe ser una llama de temperatura uniforme y combustión completa. La manera 
práctica de controlar que se cumplen estas condiciones es la observación de conos azules 
en la llama. Estos se logran mediante la regulación del caudal de combustible (gas natural) y 
comburente (aire). 
La temperatura que alcanza la llama, y por lo tanto la energía térmica lograda, 
depende del sistema de combustión utilizado (tabla). 
 
Combustible Comburente Temperatura lograda 
Gas natural Aire 1700-1900 °C 
Gas natural Oxígeno 2700-2800 °C 
Acetileno Oxígeno 3050-3150 °C 
 
La temperatura lograda define para qué tipo de analitos podemos utilizar la técnica. La 
llama lograda en el FOTÓMETRO DE LLAMA es de temperatura relativamente baja, 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
22 
por lo tanto sólo permite analizar analitos cuyos átomos tengan pocos electrones en la capa 
de valencia como los elementos del grupo I y II de la tabla periódica, esto hace que sean 
fácilmente excitables. Si por el contrario queremos excitar metales que tienen muchos 
electrones en su capa de valencia (Fe, Cu, Ni, Pb, As, etc) necesitamos un sistema de 
combustión diferente que alcance las temperaturas adecuadas. 
 
 La fotometría de llama es utilizada sólo para 
metales alcalinos (grupo I) y alcalino térreos (grupo II). 
 
 
4- ¿CÓMO PUEDO DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE UN 
ANALITO UTILIZANDO EL FOTÓMETRO DE LLAMA? 
 
En este caso se utiliza el método de la curva de calibración en un procedimiento 
similar al que se explicó para el caso de Espectrofotometría de absorción. Se preparan 
soluciones de concentración conocida del analito que queremos cuantificar. Las soluciones 
preparadas se miden en el Fotómetro de llama, registrando la señal de emisión 
correspondiente para cada concentración conocida. Tendremos entonces una tabla de 
datos correspondientes a pares ordenados (x,y) conocidos, los que podremos representar 
en un gráfico de ejes cartesianos. En el eje de las X se representan las concentraciones 
conocidas de las soluciones y en el eje de las Y se representan las Señales de emisión 
obtenidas en el equipo (Figura 1). 
 
 
ppm 
analito (X) 
Señal de 
emisión (Y) 
0 0 
2 22 
4 39 
6 59 
8 74 
10 96 
 
 
 
Figura 1- Representación gráfica de los datos de la tabla. La recta tiene una ecuación 
asociada que es la que figura en el gráfico. R2 es un control estadístico de la curva de 
calibración, debe ser lo más cercano a 1 posible. 
 
La recta de calibración (curva de calibración) obtenida será nuestra referencia para 
transformar la Señal de emisión de cualquier muestra desconocida en un valor de 
concentración para el analito estudiado. Podemos hacer la transformación del dato medido 
en el equipo gráficamente (interpolando el valor de A medido en la gráfica) o bien 
despejando el valor de X que le corresponde a la medida Y (señal de emisión) en la 
ecuación de la recta de calibración obtenida. 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
23 
 
 
Concepto general de la curva de calibración: 
Se aplica a varios métodos instrumentales y es un procedimiento que 
permite transformar lo que mide el equipo en la concentración del 
analito presente en la muestra desconocida. 
 
 
5- FUENTES DE ERROR EN LA FOTOMETRÍA DE LLAMA 
 
En este método medimos la luz emitida por analitos en estado de vapor 
previamente excitados con el calor de una llama. 
Las posibles fuentes de error pueden ser de dos tipos: 
1- Factores instrumentales: tipo de mechero, características de la llama, presión de 
combustible y comburente, etc. Porlo tanto cada vez que se procesen muestras debo 
hacer la curva de calibración correspondiente. 
2- Factores de la muestra (Interferencias): los aniones que forman la sal determinan la 
facilidad de la disociación en vapor atómico (cloruros y nitratos se disocian fácil, sulfatos y 
fosfatos son más difíciles); componentes de la muestra que emiten fotones de λ cercanas; 
componentes que se ionizan más fácilmente que el analito. 
 
6- APLICACIONES AGRONÓMICAS DE LA FOTOMETRÍA DE LLAMA 
 
6.1- Determinación de sodio en muestras de agua y suelos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6.2- Determinación de potasio en un 
análisis foliar. 
 
 
 
 
 
 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
24 
 
 
6.3- Determinación de dureza de agua. 
 
 
 
 
 
6.4- Determinación de litio 
 
 
 
 
 
7- TRABAJO PRÁCTICO EN EL LABORATORIO 
 
Determinación del contenido de sodio en una muestra de agua 
El sodio es uno de los seis elementos en orden de abundancia en la naturaleza y está 
presente en las aguas naturales. El nivel puede variar entre 1ppm a 500ppm. Las 
concentraciones relativamente altas de sodio se encuentran en aguas salobres. La 
determinación de la relación de sodio al contenido de cationes totales es importante en la 
agricultura. Los suelos permeables pueden dañarse por una alta relación de sodio. 
Trazas de sodio pueden ser determinadas empleando fotometría de llama a una longitud de 
onda de 589 nm. La intensidad de la luz emitida a esa longitud de onda es proporcional a la 
concentración de sodio 
Las interferencias posibles: 
1- grandes cantidades de sulfatos, bicarbonatos 
2- potasio si se encuentra en una relación potasio/sodio > 5:1 
3- calcio si se encuentra en una relación calcio/sodio > 10:1 
 
Importante: todas las soluciones empleadas en el análisis, deben guardarse en frasco de 
plástico. Utilizar agua destilada o bidestilada libre de sodio para preparar todas las 
soluciones, incluidas las soluciones patrón. 
 
Procedimiento: 
1- Preparar 500,00 ml de una solución madre de NaCl de 100,00 ppm en Na. 
2- Patrones para la curva de calibración de Na. 
Se utilizarán patrones de 2,00; 4,00; 8,00 y 10,00 ppm de Na+. Las mismas se prepararán 
tomando el volumen correspondiente de la solución madre anterior y llevándolo a 100,00 
ml. 
3- Medida: 
a) encender el equipo 
b) Colocar el filtro para sodio 
c) Abrir el paso de gas 
d) encender la llama 
Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica 
 
25 
e) abrir el paso de aire 
f) regula el caudal de aire y gas hasta observar los conos azules en el mechero 
g) con agua bidestilada ajustar el cero 
h) con la solución patrón más concentrada llevar la señal a 100% 
i) registrar la lectura de las soluciones patrón. Antes de cada solución colocar 
agua bidestilada en el capilar para limpiar todo el conducto. 
 
4- Determinación de sodio en una muestra de agua. 
Tomar una alícuota de 10,00 ml de la muestra de agua y diluir a 250,00 ml con agua 
bidestilada, leer su señal y determinar la concentración de sodio. 
5- Gráfico de la curva de calibración: a partir de las señales obtenidas con cada una de las 
soluciones patrón de sodio construir la gráfica señal (eje Y) vs. concentración de sodio en 
ppm (eje X), el gráfico debe dar una recta. A partir del gráfico y del valor de la señal de la 
muestra desconocida encontrar la concentración de sodio en la muestra. 
 
8- CUESTIONARIO Y PROBLEMAS PARA RESOLVER SOBRE LOS 
CONCEPTOS TEÓRICOS Y PRÁCTICOS DE ESPECTROFOTOMETRÍA DE 
EMISION ATOMICA (FOTOMETRIA DE LLAMA). 
 
1- ¿Qué procesos ocurren en la llama cuando se introduce la solución con el analito? 
2- ¿Qué tipo de átomos pueden analizarse por fotometría de llama? ¿Por qué? 
3- ¿Cuáles son los componentes de un fotómetro de llama? 
4- ¿Qué características debe tener la llama? 
5- ¿Cuáles son las posibles fuentes de error en la fotometría de llama? 
6- Una serie de soluciones patrón de K se midieron en un fotómetro de llama. Las lecturas 
obtenidas a 404,3 nm fueron las siguientes: 
 
g/ml de K 0,00 5,00 10,00 20,00 30,00 
Lectura de emisión 0,00 12,4 24,3 48,6 71,2 
Determinar la concentración de K en una muestra si la lectura de emisión fue de 41,7. Rta.: 
17,37 g/ml 
7- Para determinar el contenido de sodio en agua de río por espectroscopia de emisión de 
llama se prepararon una serie de soluciones patrón cuyas lecturas de emisión fueron las 
siguientes: 
g/ml de Na 0,0 0,20 0,40 0,60 0,80 
Lectura de emisión 0,0 21,5 40,9 57,7 77,3 
Para medir la muestra de agua de río se tomaron 25,00 ml de la misma y se diluyeron con 
agua bidestilada hasta un volumen final de 100,00 ml. La lectura obtenida fue de 41,2. 
Calcular la concentración de sodio en la muestra. Rta.: 1,64 
8- Para determinar el contenido de potasio (K) en una solución de fertirriego se realizó una 
curva de calibración en base a ppm de K cuya ecuación de la recta resultó: 
 y = -0,023 + 0,044 x ;con un r2 de 0,999. Calcular la concentración de Ken g/L en la 
solución de fertirriego si una dilución de 5 ml de la misma en 250 ml finales dio una señal 
de emisión de 5. Rta: 5,7 g/L. 
 
Bibliografía consultada: 
Química Analítica Cuantitativa. R.A. Day y A.L. Underwood. 5ª Ed. Prentice Hall, 1995 
Análisis Químico Cuantitativo. Daniel C. Harris. 2ª Ed. Reverté, 2001 
Química Analítica. Skoog, West, Holler y Crouch. 7ª Ed. Mc Graw Hill, 2001