Analisis Espectrofotométrico

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ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO
La ingeniería de alimentos es la rama multidisciplinaria de la ingeniería que tiene como función el estudio de la transformación y procesos de materias primas de consumo humano en la innovación de productos con una vida útil más prolongada fundamentada en la comprensión de fenómenos de la química de los alimentos, la biología y la física. Esto se realiza con distintos fines, siendo el más importante que el producto pueda conservarse el mayor tiempo posible, sin que pierda su valor nutritivo, reduciendo costos de elaboración y transporte; deshidratación es el ejemplo más común: leche, frutas. 
Dentro de este ámbito, la Química Analítica se vale del análisis espectrofotométrico para identificar y cuantificar los componentes de los alimentos. Para ello, el método óptico de análisis cuantitativo implementa técnicas espectroscópicas y no espectroscópicas para lograr el propósito de los estudios. En este particular, como objeto de estudio de la presente investigación se planteó el referido método, para lo cual se formuló el objetivo general de determinar teóricamente el contenido de una especie química mediante el análisis espectrofotométrico.
	En esta perspectiva, se consultaron fuentes impresas y digitales especializadas en la química analítica y sus aplicaciones en el ámbito de la Ingeniería Agroindustrial, consultando referentes teóricos vinculados a los fundamentos del análisis espectrofotométrico, los instrumentos empleados en dicho análisis, cómo determinar el contenido de una sustancia, así como la Ley de Lambert-Beer. Los referidos tópicos aportaron una visión conceptual e interactiva de las bases teóricas con una proyección de lo que en la práctica puede constituirse mediante análisis espectrofotométrico.
ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO
	La Espectrofotometría en términos de Brunatti y Martin (2015), “es la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe o transmite un sistema químico en función de la longitud de onda; es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones químicas y bioquímicas” (p. 1). Según los citados autores, constituye un método de análisis de interacción entre la materia y la energía radiante la cual por intermedio de ondas electromagnéticas se propagan y transportan sin transferencia de materia. En todo caso, el análisis espectrofotométrico se refiere a métodos cuantitativos de análisis químico que utilizan la luz para medir la concentración de las sustancias químicas. 
	Según los planteamientos de los citados autores, los métodos espectrométricos son de tipo instrumental empleados en procedimientos de la química analítica basados en la interacción de la radiación electromagnética, u otras partículas, con un elemento, compuesto o ion (analito) de una muestra, de donde se pretende identificar y cuantificar la presencia o contenido específico mediante medición química. Otros conceptos a que refieren Brunatti y Martin (ob. cit.) se enmarcan dentro de la metrología química, en la cual destacan los siguientes conceptos:
	El Mensurado: Se refiere a una magnitud, es decir, la cantidad del objeto de medida, equivalente a la concentración del analito, porción que se somete a medición cuantitativa en comparación con un patrón que aporta la información requerida; La cantidad se corresponde con el atributo aritmético de una sustancia que puede ser captado cuantitativa o cualitativamente. Por su parte, el objeto es la entidad que debe describirse químicamente mediante los resultados analíticos; la muestra conforma una parte representativa del objeto contentiva de una parte que se toma del volumen (alícuota líquida) o de una masa (alícuota sólida) para ser usada en el análisis químico.
	En síntesis, el objeto, muestra, mensurando y analito conforman elementos tangibles de cualquier análisis. En conjunto con los elementos intangibles son necesarios para la definición y la solución del problema analítico. Los elementos intangibles requieren planificación del diseño, su evolución y corrección. La información que se obtiene de la muestra de analito puede ser: (a) cualitativa: si existe analito en determinada cantidad en la muestra; (b) cuantitativa: es la proporción de la sustancia; (c) estructural. Para Brunatti y Martin (2015) el analito que se determina en una muestra puede ser de naturaleza inorgánica, orgánica o bioquímica. Según su concentración en ésta se clasifica como macro-componente (más de 1%), microcomponente (entre 0,01% y 0,1%) o trazas (menos de 0,01%). El análisis químico de la muestra puede utilizarse diferentes procedimientos, tales como el método electro-analítico o los métodos espectrométricos.
	Fundamentalmente, a través de los métodos espectrométricos se absorbe radiación electromagnética en la zona del ultravioleta y visible del espectro. La absorción electromagnética es la interacción de los fotones con los electrones de una sustancia; en este proceso se transfiere energía a la molécula que genera una disminución en la intensidad de la radiación electromagnética incidente. En otras palabras, el proceso espectrofotométrico tiene como propósito la detección específica de las moléculas. Este análisis se efectúa mediante el espectrofotómetro, el cual es un instrumento que permite medir la cantidad de radiación visible, ultravioleta o infrarrojo que absorbe una solución a una longitud de onda específica.
	Para Brunatti y Martin (ob. cit.), la espectrofotometría se fundamenta en los principios de la Ley de Beer y la Ley de Lambert, las cuales, de manera general teorizan el proceso de espectrofotometría, a través del cual una muestra absorbe parte de la radiación incidente en el espectro y promueve la transición del analito hacia un estado excitado, emitiendo un haz de menor energía radiante. En consecuencia, se mide cuantifica la luz absorbida producto de la longitud de onda empleada. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica de cada materia química.
Para Brunatti y Martin (2015) las principales aplicaciones de la espectrofotometría son: determinar la cantidad de concentración en una solución de algún compuesto mediante el empleo de ecuaciones (leyes de Beer y Lambert); contribuir en la determinación de estructuras moleculares; identificación de unidades estructurales específicas; determinar constantes de disociación de indicadores ácido-base. Para los referidos autores, existen diferentes tipos de espectrofotometría: Espectrofotometría de absorción molecular VIS-UV; Espectrofotometría de absorción molecular IR.15; Espectrofotometría de absorción y emisión atómica; Espectrofotometría con atomizadores electro-térmicos; Espectrofotometría de emisión con plasma; Espectrofotometría de fluorescencia molecular: 
Métodos Ópticos de Análisis Cuantitativo
En el marco de la Química Analítica los métodos ópticos de análisis se enmarcan dentro de las técnicas espectroscópicas. En este sentido, Menéndez (2009) refiere que las técnicas analíticas espectrométricas se basan en los fenómenos de emisión, absorción y dispersión producida por los átomos o moléculas cuando se encuentran a niveles energéticos suficientes” (p. 150). Para el citado autor, la espectrofotometría incluye métodos cuantitativos de análisis químico que emplean la luz para medir la concentración de las sustancias químicas. Para el citado autor existen variadas técnicas y métodos de análisis cuantitativo, los cuales pueden clasificarse en: (a) Gravimétricos; (b) Volumétricos; (c) Ópticos: espectroscópicos y no-espectroscópicos; (d) Electroanalíticos; (e) Otros métodos. En el caso de la presente investigación, se estudiaran los métodos ópticos de análisis cuantitativo, espectroscópicos y no espectroscópicos.
Métodos Ópticos Espectroscópicos
	Para Menéndez (ob. cit.) “los métodos espectrométricos son métodos instrumentales empleados en química analítica basados en la interacción de la radiación electromagnética, u otras partículas, con un analito para identificarloo determinar su concentración” (p. 145). Para el citado autor, estos métodos emplean técnicas divididas en técnicas espectroscópicas y en técnicas no espectroscópicas. Las técnicas espectroscópicas son aquellas en las que el analito sufre procesos de absorción, emisión o luminiscencia. El resto corresponde a técnicas no espectroscópicas. Las técnicas espectroscópicas se diferencian también según la forma en la que se encuentra el analito en el momento en el que sufre el proceso espectroscópico, dando lugar a la espectroscopia atómica y a la espectroscopia molecular. 
En términos generales, para Menéndez (2009) el método óptico de análisis cuantitativo mide la radiación electromagnética (Figura 1) que emana o interactúa con la materia. Dichos métodos tienen como objeto la medida de la radiación que es emitida, absorbida o transmitida al interactuar el campo eléctrico o magnético de la radiación con los campos eléctricos o magnéticos de la materia, o por la medida de la radiación reflejada, refractada, difractada, polarizada o dispersada cuando interactúa con la materia. Para el citado autor, los métodos espectroscópicos se basan en la propiedad que poseen las moléculas, los átomos y los iones, de absorber o emitir radiación electromagnética a una determinada longitud de onda, la cual implica la medida de la radiación que es emitida, absorbida o transmitida al interactuar el campo eléctrico o magnético de la misma con los campos eléctricos o magnéticos de la materia.
Figura 1. Radiación electromagnética.
Fuente: http://image.slidesharecdn.com/quimsem2electron2012-.
Según Menéndez (2009), los métodos espectroscópicos “se caracterizan por la obtención de espectros debidos a las transiciones electrónicas originadas entre distintos niveles energéticos” (p. 161). Estos métodos se pueden basar en procesos de absorción o de emisión, y las transiciones entre los niveles energéticos se pueden dar a nivel atómico o molecular. A efecto de la presente investigación, se sintetizan las principales técnicas espectroscópicas y no espectroscópicas en el siguiente cuadro:
Cuadro 2.
Método óptico de análisis cuantitativo y principales técnicas.
	MÉTODO ÓPTICO DE ANÁLISIS CUANTITATIVO
	ESPECTROMÉTRICO
	TÉCNICA
	NIVEL
	INSTRUMENTO/
EQUIPO
	
	
Espectroscopia de absorción atómica.
	Atómico
	
Espectrofotómetro de absorción atómica.
	
	
Espectroscopia de emisión atómica.
	
Atómico
	Espectrofotómetro de emisión atómica.
	
	
Espectroscopia de fluorescencia atómica.
	
Atómico
	
Fluorómetro o fluorímetro.
	
	
Espectroscopia de rayos x
	Atómico
	
Equipo rayos X
	NO ESPECTROMÉTRICO
	
Espectroscopia infrarroja.
Espectroscopia ultravioleta-visible.
Espectroscopia de fluorescencia
	Molecular
	
Equipo rayos X
Espectrofotómetro UV
Espectrofotómetro de fluorescencia
Fuente: Autoras (2015).
Espectroscopia de Absorción Atómica
	Estos tipos de métodos, según la radiación absorbida, se conocen como métodos de absorción de rayos X, absorción en el ultravioleta visible, absorción en el visible, absorción infrarroja, entre otros. Pueden ser atómicos y moleculares. Para Hernández y González (2002), este tipo de método se basa en “la absorción selectiva de radiación por la misma especie a determinar o por un producto de transformación de dicha especie” (p. 40). Este proceso de absorción emplea una variedad de técnicas fundamentadas en la interacción de la radiación electromagnética con la materia. 
	En la espectrometría de absorción, se compara la intensidad de un haz de luz medida antes y después de la interacción con una muestra. Las palabras transmisión y remisión se refieren a la dirección de viaje de los haces de luz medidos antes y después de la absorción. Las descripciones experimentales por lo general asumen que hay una única dirección de incidencia de la luz sobre la muestra, y que un plano perpendicular a esta dirección pasa por la muestra. En la transmisión, la luz es dispersada desde la muestra hacia un detector en el lado opuesto de la muestra. En la remisión, la luz es dispersada desde la muestra hacia un detector en el mismo lado de la muestra. La radiación remitida puede estar formada por dos clases de radiación: reflexión especular (cuando el ángulo de reflexión es igual al ángulo del frecuencia) y reflexión difusa (en todos los demás ángulos).
	La espectrometría de absorción se basa en la absorción de fotones por una o más sustancias presentes en una muestra (solida, líquida, o gas), y la promoción subsiguiente del electrón (o electrones) desde un nivel de energía a otro en esa sustancia. La muestra puede ser una sustancia pura, homogénea o una mezcla compleja. La longitud de onda en la cual el fotón incidente se absorbe es determinada por la diferencia en los niveles de energía disponibles de las diferentes sustancias presentes en la muestra. Esta es la selectividad de la espectrometría de absorbancia, la capacidad de generar fuentes de fotones (luz) que son absorbidas sólo por algunos componentes en una muestra. En los métodos de absorción molecular las transiciones se producen entre niveles electrónicos, vibracionales y rotacionales, por absorción de radiación ultravioleta, visible, infrarroja y de microondas
Espectroscopia de Emisión Atómica
	Según Hernández y González (2002), la espectroscopia de emisión atómica “es un método de análisis químico que emplea la intensidad de la luz emitida desde una llama, plasma, arco o chispa en una longitud de onda particular para determinar la cantidad de un elemento en una muestra” (p. 31). En este proceso, la longitud de onda de la línea espectral atómica da la identidad del elemento, mientras que la intensidad de la luz emitida es proporcional a la cantidad de átomos del elemento. Para el citado autor, este método se fundamenta en la radiación electromagnética generada por la materia, independientemente de las causas que originan dicha emisión.
	En los instrumentos de espectroscopia de emisión en flama, la flama atomiza y excita los componentes de las muestras. Estos emiten radiación electromagnética de diferentes longitudes de onda que son separadas en el monocromador; luego la línea de interés llega al detector, al amplificador y por último al sistema de lectura. La muestra de un material (analito) se ubica en la llama, sea como gas, solución pulverizada o directamente insertado en la llama por el uso de un pequeño bucle de alambre, comúnmente de platino. El calor que transmite la llama evapora el disolvente y se rompen los enlaces químicos para crear átomos libres. La energía térmica también excita los electrones a estados electrónicos de mayor energía que posteriormente emiten luz cuando vuelven al estado fundamental. Cada elemento emite luz a una longitud de onda característica, que se dispersa por una rejilla o un prisma y se detecta en el espectrómetro.
	Por su parte, la espectroscopia de emisión atómica de plasma utiliza plasma acoplado inductivamente para generar electrones excitados e iones que emiten radiación electromagnética en longitudes de onda característica de un elemento particular. El plasma de acoplamiento inductivo es una fuente de ionización. En esta técnica, la introducción continua de la muestra líquida y un sistema de nebulización forma un aerosol que es transportado por el Argon a la antorcha del plasma, acoplado inductivamente por radio frecuencia. En el plasma, debido las altas temperaturas generadas, los analitos son atomizados e ionizados generándose los espectros de emisión atómicos de líneas características. Los espectros son dispersados por la red de difracción y el detector sensible a la luz se encarga de medir las intensidades de las líneas. La información es procesada por el sistema informático.
Espectroscopia de Fluorescencia Atómica
	El análisis espectroscópico de fluorescencia atómica es de tipo electromagnética, por medio de la cual se analiza la fluorescencia de una muestra. El proceso hace uso de un haz de luz comúnmente de luz ultravioleta, que excita a los electrones en las moléculas de ciertos componentesy causa entonces la emisión de luz; típicamente, pero no necesariamente, luz visible. Su técnica complementaria es el espectro de absorción. La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética y al relajarse al estado basal liberan el exceso de energía en forma de fotones. El equipamiento que mide la fluorescencia es llamado fluorómetro o fluorímetro.
	La espectrofotometría visible ultravioleta, en términos de Menéndez (2009), “implica la espectroscopia de fotones en la región de radiación ultravioleta-visible. Utiliza la luz en los rangos visible y adyacentes (el ultravioleta (UV) cercano y el infrarrojo (IR) cercano. En esta región del espectro electromagnético, las moléculas se someten a transiciones electrónicas” (p. 165). Este método emplea radiación electromagnética (luz) de las regiones visible, ultravioleta cercana (UV) e infrarroja cercana (NIR) del espectro electromagnético, en un rango de longitud de onda entre 380nm y 780nm. Para ello, instrumentalmente se vale de un espectrofotómetro ultravioleta-visible cuyo proceso se esquematiza en la figura 1. Entre ellos se pueden referir el espectrofotométrico de doble haz y el espectrofotómetro de haz simple.
Monocromador
Tubo
de referencia
Fuente
Generadora
 de la radicación
RESULTADOS
Y REGISTROS
Tubo
de muestra
Haz emitido
Fotómetro
Figura 2. Esquema básico de un espectrofotómetro de radiación visible y ultravioleta.
Fuente: Menéndez (2009).
	En el esquema espectrofotométrico visible-ultravioleta la fuente emisora de radiación ultravioleta es, normalmente una lámpara de descarga de hidrógeno o deuterio. La muestra debe colocarse en un medio vacío exento de oxígeno y dióxido de carbono, debido a que el cuarzo y el aire absorben energía muy intensamente; las cubetas contenedoras de las muestran han de ser de cuarzo, debido a que el vidrio posee una absorbencia muy elevada por debajo de los 300 nm.; el flujo generado por la fuente de generación de radiación se divide en dos haces: uno atraviesa la muestra ubicada en el interior de una cubeta transparente a la radiación. 
	El paso de la radiación por la materia contenida en la cubeta produce una reducción de flujo. El otro haz circula paralelo al anterior y pasa una cubeta de las mismas características con una muestra en blanco. Ambos haces ingresan por el monocromador y al lector; la diferencia de lectura entre el haz correspondiente a la muestra en blanco y la muestra cargada indica la absorbencia de la muestra-problema. Finalmente, el valor leído se lleva a la recta de calibración para la determinación de la concentración de la muestra-problema. 
	En dicho proceso, la radiación absorbida por las moléculas desde esta región del espectro genera transiciones electrónicas potencialmente cuantificadas. Este método de espectroscopia UV-visible regularmente se utiliza para detectar algunos grupos funcionales de moléculas; igualmente permite determinar el contenido y fuerza de una sustancia. Del mismo modo, determina cuantitativamente los componentes de soluciones de iones de metales de transición y compuestos orgánicos altamente conjugados. 
	El principio físico de la espectroscopia ultravioleta-visible implica la absorción de radiación ultravioleta – visible por una molécula, produciendo la promoción de un electrón de un estado basal a un estado excitado, liberándose el exceso de energía en forma de calor. La longitud de onda (\lambda) comprende entre 190 y 800 nm. La luz visible o UV es absorbida por los electrones de valencia, éstos son promovidos a estados excitados (de energía mayor). Al absorber radiación electromagnética de una frecuencia correcta, ocurre una transición desde uno de estos orbitales a un orbital vacío. Las diferencias entre energías varían entre los diversos orbitales. Algunos enlaces, como los dobles, provocan coloración en las moléculas ya que absorben energía en el visible así como en el UV, como es el caso del β-caroteno.
	Cuando un haz de radiación UV-Vis atraviesa una disolución conteniendo un analito absorbente, la intensidad incidente del haz (Io) es atenuada hasta I. Esta fracción de radiación que ha logrado traspasar la muestra es denominada transmitancia (T) (T = I/Io). Por aspectos prácticos, se utilizará la absorbancia (A) en lugar de la transmitancia (A = -logT), por estar relacionada linealmente con la concentración de la especie absorbente según la Ley de Beer-Lambert: A = \epsilon·l·c (\epsilon: coeficiente de absortividad molar, l: camino óptico, c: concentración de la especie absorbente).
Absorción Visible (colorimetría)
	Los métodos espectrofotométricos tienen por objeto determinar la absorción de luz visible por una muestra. Este método fundamentado en la ley de Lambert-Beer. Según Menéndez (2009), la técnica hace uso de la espectrometría de absorción para evaluar la concentración de un analito en una muestra. Se basa en gran medida en la ley de Beer-Lambert, cuya esencia explica que los electrones de los átomos en el atomizador pueden ser emitidos a orbitales más altos por un instante mediante la absorción de una cantidad de energía (es decir, luz de una determinada longitud de onda). Dicha cantidad de energía (o longitud de onda) es producto de una transición de electrones en un elemento particular, y en general, cada longitud de onda corresponde a un solo elemento. Este fenómeno se puede verificar en un equipo de espectrofotometría de absorción química, regularmente compuesto de una fuente de radiación, atomizador, mono-cromador, detector, amplificador y sistema de presentación.
	Este método, a partir de una fuente de radiación que hace llegar a la muestra un haz de radiación de longitud, de longitud de onda previamente seleccionada, cuya potencia es P0, la muestra de espesor b absorbe una parte de la radiación incidente, de forma que la potencia del haz disminuye luego de atravesar la muestra siendo su nueva potencia P. En consecuencia, el cociente entre la potencia de la radiación que egresa de la muestra y la que incidió sobre ella, se define como transmitancia. En ecuación se expresaría de la siguiente manera: T=P/P0.
	Para Menéndez (2009) “la transmitancia también puede expresarse en tanto por ciento, multiplicando el cociente anterior por 100” (p. 159). Según el citado autor, el concepto de absorbencia o densidad óptica mediante el siguiente logaritmo: A=log (P0/P)= - log T. De acuerdo con estas expresiones, si la muestra no absorbe radiación, P y P0 coinciden, en consecuencia, A=0 y se transmite toda la radiación T=1 (100 % de la transmitancia). En otro caso, se transmite solo 1 % de radiación (T=0.01), P=P0 /100, la absorción de radiación generada será de A=2.
	Según el planteamiento anterior, al incidir radiación electromagnética visible sobre la materia puede ser totalmente absorbida o totalmente reflejada. En el primer caso, el objeto se percibirá de color negro, y en el segundo de color blanco, puesto que el ser humano percibe los objetos por medio de la luz reflejada, al hacer incidir un haz de luz blanca (que contiene todas las longitudes de onda) sobre un objeto, éste absorberá ciertas longitudes de onda y reflejará otras, siendo éstas últimas las responsables del color. Este color (observado) es complementario del que se percibiría si la luz absorbida se pudiera detectar. La espectrofotometría visible atiende a una longitud de onda con una capacidad máxima de absorción, tal como se describe en el siguiente cuadro.
Cuadro 2. 
Colores de la luz visible.
	COLORES DE LA LUZ VISIBLE
	Longitud de onda de máxima absorción (nm)
	Color abosrbido
	Color observado
	380-420
	Violeta
	Amarillo-verde
	420-440
	Azul-violeta
	Amarillo
	440-470
	Azul
	Anaranjado
	470-500
	Verde-azul
	Rojo
	500-520
	Verde
	Púrpura
	520-575
	Amarillo-verde
	Violeta
Fuente: Menéndez (2009).
En síntesis, la absorbancia está relacionada con la concentración de la sustancia, c, por la ley de Lambert-Beer, que se resume con la ecuación: A = ε b c , dondec se expresa en mol/L, b es la longitud del camino óptico (anchura de la célula que contiene la disolución de la sustancia) y se expresa en cm, y ε es la absortividad molar, propiedad característica de cada sustancia correspondiente a la cantidad de radiación que absorbe a una longitud de onda determinada por unidad de concentración, siendo sus unidades L mol-1 cm-1 Para poder aplicar la ley de Lambert-Beer es necesario seleccionar previamente una longitud de onda puesto que tanto A como ε varían con ella. Para ello se obtiene previamente el espectro de absorción de la sustancia, que consiste en una representación de los valores de absorbancia frente a la longitud de onda expresada en nanometros (nm). Del espectro de absorción puede seleccionarse el valor de longitud de onda para el cual la absorbancia es máxima. 
Espectrofotometría Visible Infrarroja
	De los planteamientos teóricos expuestos por Serrano (2008), la espectrofotometría visible infrarroja “se obtiene al pasar la radiación a través de una muestra y determinar que fracción de esta radiación incidente ha sido absorbida. La energía particular a la que aparece cada pico en un espectro guarda relación con la frecuencia de vibración de una parte de la molécula” (p. 3). Este método se ejerce en la mayoría de las aplicaciones analíticas tradicionales; es empleado en el análisis de compuestos orgánicos, inorgánicos u órgano-metálicos contentivos de átomos pesados con masa atómica superior a 19. Una de sus ventajas es que permite estudiar prácticamente cualquier muestra con independencia del estado en que se encuentre. Por ejemplo, líquidos, disoluciones, polvos, pastas, gases, entre otros. 
	En este particular, Menéndez (2009) refiere: “la región infrarroja del espectro electromagnético abarca desde la radiación visible hasta la región de las microondas” (p. 155). Según el citado autor, al igual que por espectrofotometría ultravioleta visible, la energía irradiada se divide por intermedio de un espejo en dos rayos con idéntica intensidad; el rayo incidente que atraviesa la muestra y el rayo de referencia a través de la muestra en blanco. La diferencia de intensidad del rayo de referencia y la del rayo transmitido constituye una medida de la cantidad de radiación absorbida. Igualmente, la frecuencia de la radiación se varía automática y continuamente por medio de un monocromador y las intensidades relativas de los rayos de referencia y transmitido se comparan en un fotómetro. Por último, en el registro aparece un porcentaje de transmisión en función de la longitud de onda.
	La espectrofotometría infrarroja trata con la parte infrarroja del espectro electromagnético. Este método de espectroscopia de absorción puede emplearse para identificar un compuesto e investigar la composición de una muestra. Se fundamenta en el hecho de que las moléculas poseen frecuencias a las cuales rotan y vibran, es decir, los movimientos de rotación y vibración moleculares tienen niveles de energía discretos (modos normales vibracionales). Las frecuencias resonantes o frecuencias vibracionales son determinados por la forma de las superficies de energía potencial molecular, las masas de los átomos y, eventualmente por el acoplamiento vibrónico asociado. 
	
Condiciones para Realizar un Análisis Espectrofotométrico
	Las técnicas espectrofotométricas permiten realizar variados tipos de análisis cuantitativos. Para Hernández y González (2002), de manera general, se deben considerar condiciones básicas para un análisis espectrofotométrico. En este sentido, en el ámbito de la Ingeniería Agroindustrial, junto a fundamentos teórico-práctico que aportan conocimientos referentes los métodos y técnicas de análisis espectrofotométrico de productos agroalimentarios, en conveniente la formación del pensamiento complejo, reflexivo y crítico desde el cual se analizan las características de calidad en productos alimentarios (frutas, hortalizas, cereales, lácteos, productos cárnicos, entre otros), los cuales requieren la determinación de la calidad de dichos productos, control de calidad, inspección y muestreo. Según los referidos autores, es necesario un conjunto de condiciones para el análisis espectrofotométrico:
· Identificar los equipos utilizados en espectrofotometría, así como los métodos y equipos necesarios. Esto supone un conocimiento absoluto de los equipos instrumentales y herramientas según el tipo de análisis.
· Mantener en condiciones de higiene las cubetas con material apropiado antes de introducirlas en el equipo. Por ello, es conveniente manipular las cubetas con pañuelos para evitar dejar huellas de los dedos en sus caras.
· Asegurar que las reacciones que determinan la formación de la especie a analizar se lleven a cabo cuantitativamente. Esto implica la optimización de las cantidades de algunos reactivos o alícuotas de muestra.
· Determinar la onda de longitud. Longitud de onda (l): es la distancia entre dos máximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, según el S.I. en nanómetros (nm) y sus equivalencias son: 1nm = 1mm =10 A0 = 10-9 m.
· Preparar los patrones de la curva de calibración dentro del intervalo de concentración que corresponda al tipo de instrumento a emplear, a efecto de disminuir el error fotométrico, para ello, es conveniente revisar la teoría correspondiente.
· Realizar un análisis de la muestra por triplicado. El objetivo de hacer la prueba por triplicado) es reforzar la confianza en que la prueba dio resultados confiables. La repetición de los datos que están en consonancia es una buena medida del método y de la reproducibilidad del objeto de prueba, pero no demuestra la exactitud (validez) de los datos. 
· Se debe desarrollar un proceso de muestreo confiable. Por intermedio del muestreo se encuentran diferentes variables importantes a tener en cuenta ya que es la representatividad de una muestra tiene que ver con las variaciones de concentración de una sustancia dentro del volumen total de la muestra y la homogeneidad de su concentración dentro de la muestra tomada. 
· Las soluciones preparadas deben ser límpidas y transparentes.
· Mantener las cubetas limpias y secas en su lugar, una vez usadas.
Fundamentos del Análisis Espectrofotométrico
	Entre los fundamentos del análisis espectrofotométrico, Harris (2007) refiere la absorbancia, transmitancia y ley de Lambert-Beer, luminiscencia. Entre los referentes teóricos expuestos por el citado autor, destacan principios espectrofotométricos visibles en fenómenos de emisión, absorción y dispersión producida por los átomos o moléculas cunado se encuentran a niveles energéticos suficientes. Dichos fundamentos se vinculan a técnicas espectroscópicas, las cuales se describen considerando los criterios del referido autor.
Absorbancia (A)
	Se define como la cantidad de energía radiante absorbida por una sustancia pura o en solución. La medida de absorbancia se usa con frecuencia en química analítica; es proporcional al grosor de una muestra y a la concentración de la sustancia en ésta, en contraste con la transmitancia I / I0, que varía exponencialmente con el grosor y con la concentración. En espectrofotometría se define como:
I, es la intensidad de la luz con una longitud de onda específica \lambda \, tras haber atravesado una muestra (intensidad de la luz transmitida); I0, es la intensidad de la luz antes de entrar a la muestra (intensidad de la luz incidente). La medida de absorbancia se usa con frecuencia en química analítica y en bioquímica, ya que la absorbancia es proporcional al grosor de una muestra y a la concentración de la sustancia en ésta, en contraste con la transmitancia I / I0, que varía exponencialmente con el grosor y con la concentración.
Transmitancia (T)
	La transmitancia se define como la cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en determinada cantidad de tiempo. En otros términos, es la cantidad de luz transmitida a través de una solución. Esta es la relación entre la energía de la luz transmitida a través de una solución problema(I) y la energía transmitida a través de una solución de referencia (I0), también llamada Blanco de referencia, que generalmente es el solvente utilizado en la solución problema. Dado que el compuesto a ensayar no está presente en el blanco de referencia, la transmitancia de la pieza de referencia se define como el 100 % de T. Se puede escribir de dos maneras diferentes.
T = I/Io
  
% T = I/Io ×100
  
Cuando se determina el logaritmo negativo de la T se obtiene un nuevo término llamado Absorbancia (A) se identifica: A = - log_10⁡T                    
Ley de Lambert-Beer
	Al realizar una medición de absorción espectral típica por medio de luz monocromática, la muestra que se desea analizar se introduce dentro de un contenedor adecuado llamado cubeta de muestra, de tal manera que una parte de la radiación es reflejada, una parte es absorbida, y una parte se transmite. Por lo tanto, la intensidad de la radiación original (Po) es igual a la suma de las intensidades de radiación reflejada (Pr), absorbida (Pa) y transmitida (Pt), como se expresa en la siguiente ecuación: Po = Pr + Pa + Pt
 
En este proceso el fenómeno de reflexión es despreciable con respecto al fenómeno de absorción y transmitancia, por lo cual se puede expresar de la siguiente manera: Po =Pa + Pt. La intensidad de la luz transmitida medida (Pt) depende del espesor del medio absorbente y la concentración de la sustancia cromófora (que absorbe), además de la intensidad de la radiación incidente (Po). Esta dependencia constituye la base de determinaciones por espectrometría y se da en términos de dos leyes fundamentales. Una es la ley de Lambert, que expresa la relación entre la capacidad de absorción de la luz de la muestra y el espesor del medio absorbente y la otra es la ley de Beer, que expresa la relación entre la capacidad de absorción de la luz de la muestra y su concentración. Las dos leyes se combinan en la ley de Lambert-Beer.
Luminiscencia
	El fenómeno de luminiscencia ocurre debido a la emisión de luz por una sustancia determinada y esto ocurre cuando un electrón regresa a su estado inicial después de haber sido excitado y libera una energía como un fotón. Es todo proceso de emisión de luz cuyo origen no radica exclusivamente en las altas temperaturas sino que, por el contrario, es una forma de "luz fría" en la que la emisión de radiación lumínica es provocada en condiciones de temperatura ambiente o baja. Cuando un sólido recibe energía procedente de una radiación incidente, ésta es absorbida por su estructura electrónica y posteriormente es de nuevo emitida cuando los electrones vuelven a su estado fundamental.
	
	La luminiscencia es la emisión de luz por una sustancia sin ser motivada por el calor, por lo que es una forma de radiación en frío, es el proceso de emisión de luz cuyo origen no radica exclusivamente en las altas temperaturas Puede ser causada por reacciones químicas, energía eléctrica, movimientos subatómicos, o el estrés en un cristal. Esto distingue la luminiscencia de la incandescencia, que es la luz emitida por una sustancia, como resultado de su calentamiento. La luminiscencia se usa también para realizar mediciones de precisión, como la Fósforo termometría, medición de la temperatura con la fosforescencia, y la espectrografía luminiscente y fluorescente.
	
Instrumentos Usados en el Análisis Espectrofotométrico
	En términos de Harris (2002), la espectrofotometría “es un método de análisis que hace uso de la interacción entre la materia y la energía radiante la cual se refiere a como las ondas electromagnéticas se propagan y transportan sin transferencia de materia” (p. 21). En tal sentido, para el análisis cuantitativo es necesaria la implementación de instrumentación específica, como es el caso del Espectrofotómetro, el cual, según Harris (ob. cit.) “es un instrumento en que puede medirse la cantidad de radiación visible, ultravioleta o infrarrojo que absorbe una solución a una longitud de onda dada” (p. 32). 
	El espectrofotómetro es un instrumento regularmente usado en el análisis químico para cuantificar, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra. Existen varios tipos de espectrofotómetros: de absorción atómica, de absorción molecular (que comúnmente se conoce como espectrofotómetro UV-VIS). Posee la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto permite: Aportar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra; e indicar indirectamente qué cantidad de la sustancia está presente en la muestra. A continuación se describen los espectrofotómetros más comunes:
Espectrofotómetro de Absorción Atómica
	El espectrofotómetro de absorción atómica (Figura 3) empleado en el análisis instrumental de laboratorio. Está compuesto de una fuente de radiación, quemador nebulizador, monocromador, detector, amplificador y sistema de lectura. Este instrumento permite la cuantificación de la concentración de metales alcalinos, alcalinotérreos, de transición y de otros elementos en disolución acuosa. El espectrómetro de absorción atómica se basa en la medida de la absorbancia de una radiación electromagnética a una longitud de onda característica del elemento a medir. Es necesario para la medida que el elemento se encuentre en su forma atómica. Para ello se realiza una excitación con una llama de acetileno/aire o acetileno/N2O.
Figura 3. Espectrofotómetro de absorción atómica.
Fuente: http://pendientedemigracion.ucm.es/info/iqpapel/equipos/absorcion-atomica.htm
	Para analizar los constituyentes atómicos de una muestra es necesario atomizarla. La muestra debe ser iluminada por la luz. Finalmente, la luz es transmitida y medida por un detector. Con el fin de reducir el efecto de emisión del atomizador (por ejemplo, la radiación de cuerpo negro) o del ambiente, normalmente se usa un espectrómetro entre el atomizador y el detector. Este proceso se esquematiza en la figura 3.
Figura 4. Componentes de un espectrofotómetro de absorción atómica.
Fuente: Autoras (2015).
Espectrómetro Infrarrojo
	El espectrómetro infrarrojo (Figura 3), instrumento de laboratorio permite la caracterización de compuestos orgánicos en muestras líquidas, acuosas o sólidas. Un espectro infrarrojo es característico de cada sustancia, por ello es muy útil para caracterizar compuestos. Este instrumento técnico se puede aplicar para la identificación como para el control de calidad de diferentes materiales, de materias primas como de productos elaborados. 
	Este tipo de instrumento permite la identificación de los grupos funcionales de un compuesto, debido a que cuando una molécula absorbe radiación infrarroja, la vibración intra-molecular con frecuencia igual a la de la radiación, aumenta en intensidad, lo que genera señales con frecuencias que corresponden a la vibración de un enlace específico. La región infrarroja se divide en tres regiones denominadas infrarrojo cercano (NIR), infrarrojo medio (MIR) e infrarrojo lejano (FIR). El espectrómetro de IR con transformada de Fourier permite la obtención de espectros de forma rápida, precisa y con relaciones Señal/Ruido (S/N) elevadas.
Figura 5. Espectrofotómetro de Infrarrojo.
Fuente: http://www.cciqs.uaemex.mx/index.php?option=com_content&view
Espectrofotómetro UV-Visible
	El espectrofotómetro UV-Visible (Figura 5) es un equipo que mide la luz absorbida por una muestra en una longitud de onda determinada. También permite hacer barridos entre dos longitudes de onda (espectros). Este proceso instrumental de espectrometría ultravioleta-visible o espectrofotometría UV-Vis implica la espectroscopia de fotones en la región de radiación ultravioleta-visible. Utiliza la luz en los rangos visible y adyacentes (el ultravioleta (UV) cercano y el infrarrojo (IR) cercano. En esta región del espectro electromagnético, las moléculasse someten a transiciones electrónicas. Esta técnica es complementaria de la espectrometría de fluorescencia, que trata con transiciones desde el estado excitado al estado basal, mientras que la espectrometría de absorción mide transiciones desde el estado basal al estado excitado.
Figura 6. Espectrofotómetro UV-Visible.
Fuente: http://www.cciqs.uaemex.mx/index.php?option=com_content&view.
Determinar el Contenido de una Sustancia por Espectrofotometría
	Para determinar el contenido de una sustancia por espectrofotometría, por ejemplo, en alimentos, se emplea como fuente luminosa la luz blanca natural o artificial (espectro continuo entre el rojo y el ultra violeta). Las mediciones o cuantificación se realizan por medio de un instrumento identificado como espectrofotómetro, el cual funciona según la Figura 7. Con este tipo de instrumentación se pueden identificar y medir con exactitud y de una manera simple, trazas de sustancias en cuyo caso los procedimientos gravimétricos y volumétricos aportarían errores relativamente mayores, debido a que las cantidades absolutas de las sustancias que se van a determinar son demasiado pequeñas. Por lo tanto, el método espectrofotométrico es particularmente adecuado para la determinación de micro cantidades de componentes. Para ello, considerando los criterios de Harris (2002), de manera general, se deben desarrollar las siguientes acciones de laboratorio:
Figura 7.
Proceso dentro de un espectrofotómetro.
Fuente: http://www.cciqs.uaemex.mx/index.php?option=com_content&view.
	1° Enchufar y encender el espectrofotómetro; dejar funcionar el equipo de cinco a diez minutos para permitir que se caliente. Esto es necesario para que el equipo funcione correctamente. Dejar que se caliente durante 15 minutos. Con esto se inicia la fuente de luz que ilumina la muestra. Debe cumplir con las siguientes condiciones: estabilidad, direccionabilidad, distribución de energía espectral continua y larga vida. Las fuentes empleadas son: lámpara de wolframio (también llamado tungsteno), lámpara de arco de xenón y lámpara de deuterio que es utilizada en los laboratorios atómicos.
	2° Busca la perilla de longitud de onda que se encuentra al lado del compartimento de la muestra y gírala para establecer la longitud de onda. Este paso ajusta a la longitud de onda deseada. Pulsar el selector de porcentaje T/A para seleccionar el modo de porcentaje de transmitancia o porcentaje de absorbancia. Localizar el dial de longitud de onda que se encuentra al lado del compartimento de la muestra y colócalo a la longitud de onda deseada, para que el monocromador síles las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz monocromática.
	Está constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersión. El colimador se ubica entre la rendija de entrada y salida. Es un lente que lleva el haz de luz que entra con una determinada longitud de onda hacia un prisma el cual separa todas las longitudes de onda de ese haz y la longitud deseada se dirige hacia otra lente que direcciona ese haz hacia la rendija de salida.
 	3° Revisar el compartimento de la muestra para asegurar que esté vacío y cerrado. Ajustar la perilla de control de cero girándola hasta que la lectura sea cero, esta se encuentra ubicada al frente a la izquierda del espectrofotómetro. Girar la rueda de filtros para seleccionar el filtro correspondiente. Utiliza el violeta para longitudes de onda entre 300 y 375 nm, el azul para longitudes de onda entre 375 y 520 nm, el amarillo para longitudes de onda entre 520 y 740 nm, y el rojo para longitudes de onda de 740 a más de 900 nm. Colocarse los guantes y limpieza de una cubeta con una toallita de laboratorio para limpiarla y eliminar las posibles huellas dactilares. Insertar en el compartimento de muestra la cubeta limpia y llena con solvente y cierra la puerta.
	En la celda es el recipiente donde se depositan las muestras líquidas a analizar. El material del cual están hechas varía de acuerdo a la región que se esté trabajando; son de vidrio o plástico si se trabaja en la región visible, de cuarzo si se trabaja en la ultravioleta y de NaCl si se trabaja la región de infrarrojo. Se caracterizan por tener dos paredes correspondientes a los lados ópticos por donde cruza el haz de luz.
	4° Pulsar el botón de modo que se encuentra al frente del espectrofotómetro para seleccionar el modo que muestra simultáneamente porcentajes de transmitancia y absorbancia. Ajustar el dial que se encuentra al frente a la derecha al 100 por ciento, si se encuentra en el modo porcentaje de transmitancia, o al 0 por ciento, si está en modo Absorbancia.
	5° Girar el dial frontal derecho hasta que se lea 100 por ciento T; quitar la cubeta con el solvente, sustituyéndola por una cubeta con la muestra y cerrar el compartimento. Observar el medidor para determinar la lectura y anotar los registros. Anotar la absorbancia que se lee en la pantalla. Con esto se observará el compartimiento de muestra mediante la interacción con la materia (debe producirse donde no haya absorción ni dispersión de las longitudes de onda). Es importante destacar, que durante este proceso, se aplica la ley de Lambert-Beer en su máxima expresión, con base en sus leyes de absorción, en lo que concierne al paso de la molécula de fundamental-excitado.
	En síntesis, el análisis espectrofotométrico se fundamenta en la medición de la absorbancia de un extracto muestral presentes en el alimento y luego mediante el uso de una curva de calibración o la aplicación se calcula el contenido específico que se desea obtener en la muestra. Para ello, se pueden emplear diversos reactivos. Mediante tubos de ensayo se disponen cantidades de reactivos, los cuales serán agitados para determinar la absorbancia de cada solución a la longitud de onda máxima. Luego se debe construir la curva de calibración trazando un gráfico de la absorbancia contenida en cada una de las soluciones.
	
Ley de Beer. Aplicaciones. Desviaciones
Aplicaciones
	En óptica, la Ley de Lambert-Beer es una relación empírica que relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado. La ley de Beer-Lambert relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente después de que en dicho medio se produzca absorción. Las aplicaciones principales de la Ley De Beer son: Determinar la cantidad de concentración en una solución de algún compuesto utilizando las fórmulas ya mencionadas; ayudar en la determinación de estructuras moleculares; la identificación de unidades estructurales específicas, ya que estas tienen distintos tipos de absorbancia (grupos funcionales o isomerías); determinar constantes de disociación de indicadores ácido-base.
	 La Ley de Beer afirma que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución. Ejemplo de esto, en un vaso de vidrio contentivo de agua con azúcar disuelta y en otro vaso la misma cantidad de agua, pero con mayor cantidad de azúcar en solución. El detector es una celda fotoeléctrica, y lo que se mide es la concentración de la solución de azúcar. Según esta ley, si se hace que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldría del otro lado sería mayor que si se repitiera en el segundo, ya que en este último las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos.
	Por su parte, la Ley de Lambert expresa que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz. Retomando el ejemplo de los vasos, ambos tienen la misma cantidad de agua y la misma concentración de azúcar; pero el segundo tiene un diámetro mayor que el otro. Según la ley de Lambert, si rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldría del otro lado seria mayor que si repitiese en el segundo, ya que en este último las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número de átomos o/y moléculas yson absorbidos por estos, tal como se explicó en la ley de Beer.
	Por las leyes mencionadas anteriormente, al hacer pasar una cantidad de fotones o de radiaciones hay una pérdida que se expresa con la ecuación:
It/Io=T-kdc'', donde It es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoeléctrica (llamada radiación o intensidad transmitida); Io es la intensidad con la que sale al atravesar la celda (radiación intensidad incidente), y la relación entre ambas (T) es la transmitancia. En el exponente, el signo negativo se debe a que la energía radiante decrece a medida que el recorrido aumenta. El superíndice k es la capacidad de la muestra para la captación del haz del campo electromagnético, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometría que recorre la radiación, y c es la concentración del soluto en la muestra ya ubicada en la cubeta. La ecuación simplificada de la ley de Beer-Lambert: 
A = ε.d.c
	Esta ecuación relaciona la concentración (c), la absorbencia de la muestra (A), el espesor recorrido por la radiación (d) y el factor de calibración (ε). El factor de calibración relaciona la concentración y la absorbancia de los estándares. La absorción (o absorbancia) es igual a A, que es el logaritmo recíproco de la transmitancia: A= log 1/T, lo que es igual a: A= -log T. Las ecuaciones mencionadas de las leyes son válidas solo y solo si: la radiación incidente es monocromática; las especies actúan independientemente unas de otras durante la absorción; la absorción ocurre en un volumen de sección trasversal uniforme.
Desviaciones
	Las desviaciones a la Ley de Beer caen en tres categorías: reales, instrumentales y químicas. Dichas desviaciones pueden ser positivas -- si la absorbancia medida es mayor que la real -- o negativas -- si la absorbancia medida es menor que la real -- y llevan a que no se obtengan relaciones lineales entre la absorbancia y la concentración. Las desviaciones reales provienen de los cambios en el índice de refracción del sistema analítico, pues como e depende del índice de refracción de la muestra, la ley de Beer sólo se cumple para bajas concentraciones, en donde el índice de refracción es esencialmente constante, ya que no es la absortividad la que es constante sino la expresión: e = e verdadero h /(h 2+2)2 donde h es el índice de refracción de la solución.
	Las desviaciones instrumentales provienen, en primer lugar de la utilización de luz no monocromática, ya que la pureza espectral del haz de radiación proveniente de la fuente, depende del ancho de banda espectral del monocromador. La deducción de la ley de Beer supone radiación monocromática y los monocromadores en realidad proporcionan una banda de longitudes de onda. Cuando se hace una medida de transmitancia con luz de varias longitudes de onda, l' ,l'' ... la intensidad del haz que emerge de la solución de muestra será ( Il' + Il'' ...) y la intensidad del haz que emerge de la celda de referencia será ( I0l' + I0l '' ...) por lo que la transmitancia leída será : 
T = ( Il' + Il'' ...) / ( I0l ' + I0l'' ...) = ( Il' + Il '' ...) / ( I0l '10-e'bc + I0l ''10-e''bc...)
	En consecuencia, la ley de Beer puede cumplirse con pequeños intervalos de error, si la variación de la absortividad con la longitud de onda es constante en el intervalo de longitudes de onda que el selector del instrumento deja pasar, siempre que el ajuste de la longitud de onda nominal sea muy reproducible. En el máximo de la curva del espectro de absorción, el coeficiente de absortividad cambia más lentamente que en el resto de la banda, igualmente la sensibilidad a la concentración es mayor en el máximo de la banda de absorción, porque la absortividad tiene el valor máximo en ese punto. Es por esto, que normalmente se selecciona la longitud de onda en el máximo de la banda para realizar las medidas espectrofotométricas cuantitativas.
	Se presentan también desviaciones instrumentales por luz desviada, entendiendo por esta, la luz de otras longitudes de onda que se superponen a la banda de luz utilizada. Cuando en los instrumentos se fija una longitud de onda nominal, lx, el ancho de banda espectral del monocromador condiciona la banda de luz que pasa, que corresponderá a la región lx ± D l llamada región de la luz útil. La intensidad de esta banda de luz disminuirá cuando ocurra la absorción de luz por parte de la muestra, al igual que puede disminuir la intensidad de la luz desviada, particularmente para l Ð 230 nm. La luz que proviene de la celda de referencia induce una corriente fotoeléctrica en el detector al igual que la luz que proviene de la muestra pero la luz desviada también induce una corriente adicional en el detector, lo que lleva a una transmitancia falsa, T'' , que tiene el valor:
T'' = ( I + If ) / ( I0 + If ) donde If es la intensidad de la luz desviada.
	Las desviaciones químicas a la ley de Beer también se llaman desviaciones aparentes porque dependen de la naturaleza química del sistema en estudio y si se trabaja bajo ciertas condiciones (pH, concentración de reactivos, entre otras) es posible hacer que el sistema cumpla dicha ley. Las desviaciones son causadas, generalmente, por equilibrios en solución que involucran a la especie absorbente y alteran su concentración originando desviaciones positivas o negativas. Si alguna reacción química que ocurra en el sistema origina un producto que absorba más fuertemente que la sustancia ensayada, a la longitud de onda a la cual se hace la medida o longitud de onda analítica, se producirá una desviación positiva. Si, al contrario, se origina un producto que no absorbe a la longitud de onda analítica, la concentración de la sustancia se verá disminuida y se originará una desviación negativa. Entre los tipos de reacciones químicas que llevan a desviaciones de la ley de Beer están: reacciones de asociación-disociación, reacciones ácido-base, reacciones de polimerización, reacciones de formación de complejos y reacciones con el solvente.
CONCLUSIÓN
	En Química, el método óptico de análisis cuantitativo permite la determinación de la abundancia absoluta o relativa (muchas veces expresada como concentración) de una, varias o todas las sustancias químicas presentes en una muestra. En este sentido, una vez conocida la presencia de cierta sustancia en una muestra, la cuantificación o medida de su abundancia absoluta o relativa puede ayudar en la determinación de sus propiedades específicas.
	En relación a las condiciones para realizar un análisis espectrofotométrico, tales como: identificar los equipos utilizados en espectrofotometría, así como los métodos y equipos necesarios; mantener en condiciones de higiene instrumentos y equipos; asegurar que las reacciones que determinan la formación de la especie a analizar se lleven a cabo cuantitativamente; determinar la onda de longitud; preparar los patrones de la curva de calibración dentro del intervalo de concentración que corresponda al tipo de instrumento a emplear; realizar un análisis de la muestra por triplicado; se debe desarrollar un proceso de muestreo confiable. 
	La espectrofotometría se sustenta en la Ley de Lamber-Beer, la que sostiene que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución. Es decir, al efectuar una medición de absorción espectral típica por medio de luz monocromática, la muestra que se desea analizar se introduce dentro de un contenedor adecuado llamado cubeta de muestra, de tal manera que una parte de la radiación es reflejada, una parte es absorbida, y una parte se transmite. Por lo tanto, la intensidad de la radiación original (Po) es igual a la suma de las intensidades de radiación reflejada (Pr), absorbida (Pa) y transmitida (Pt), como se expresa en la siguiente ecuación: Po = Pr + Pa + Pt.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Hernández, L. y González, C. (2002). Introducción al análisis instrumental. Barcelona, España: Ariel Ciencia.
Menéndez, F. (2009). Higiene Industrial: Manual para la formación del especialista. Valladolid, España: Lex Nova, S.A.
Serrano, J. (2008). Espectroscopia infrarroja: Fundamentos. Espectroscopia_infrarroja.pdf.
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