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ResistaBrasileira de Toxicologia, 13( 1), 55-62, 2000 
Acumulación de Zn en Ovocitos de Sapo Bufo 
arenarum. Efecto sobre el Metabolismo de 
Carbohidratos 
Teresa M. Fonovich de Schroeder'; Ana F. Preller2; Fabián Naab'-3; María E. 
Caraballo3; Alejandro Burlón3; María A. Cardona3; Mario Debray3; Daniel 
Hojman3; Mabel Ozafrán3; Mónica Vázquez3; Ana M. Pechen de D 'Angelo4 
Resumen 
La exposición de hembras de sapo Bufo arenarum a aguas del río Reconquista (Provincia de Buenos Aires, Argentina) 
conduce a la acumulación de zinc (Zn) en sus ovarios. Las hembras tratadas de esta forma son capaces de ovular cuando son 
inyectadas con macerado de hipófisis, al igual que hembras controles. Los ovocitos obtenidos de hembras tratadas son 
capaces de fertilizar y desarrollar normalmente hasta el estadio de gástrula, mientras que presentan un 27% de inhibición del 
desarrollo embrionario a partir del estadio denominado respuesta muscular. In vivo la microinyección de Zn en ovocitos 
controles simultáneamente con [U-NC]Glucosa evidenció disminución en la síntesis de glucógeno y en la oxidación de la 
glucosa a través de la vía de las pentosas. La actividad de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en ausencia de agrega-
do de Zn fue de 371,8 x 10'3 U/ml.min. La enzima fue inhibida in vitro por el metal en forma dependiente de la concentración. 
Utilizando una concentración igual a 1,53 mM de Zn, similar a la incorporada en ovario y a la microinyectada en los ensayos 
con glucosa radiactiva, se alcanzó un 62% de la máxima inhibición correspondiente a 3 mM de Zn (248,7 x 10 3 U/ml.min). 
Estos resultados concuerdan con un efecto inhibitorio del Zn sobre el desarrollo embrionario, mediado probablemente por 
una deficiente producción de NADPH, ribosa-5-fosfato y ATP en los ovocitos. 
Palabras clave: Zinc, desarrollo embrionario, metabolismo de carbohidratos. 
Resumo 
A exposicáo de fémeas de sapo Bufo arenarum a aguas do rio Reconquista (Provincia de Buenos Aires, Argentina) 
leva á acumulacáo de Zn em seus ovarios. As fémeas tratadas desta maneira sao capazes de ovular quando sao injetadas com 
macerado de hipófise, da mesma forma que as fémeas controle. Os ovocitos obtidos de fémeas tratadas sao capazes de 
fertilizar e desenvolver normalmente até a fase de gástrula, enquanto que apresentam inibicáo do desenvolvimento embrio-
nario (27%) a partir da fase de resposta muscular. In vivo a microinjecáo de Zn em ovocitos controles simultáneamente com 
[ U - 1 4 C] Glicose evidenciou diminuicao na síntese de glicogénio e na oxidacáo da glicose através da via das pentoses. A 
atividade da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase foi inibida in vitro por 1,53 mM de Zn, concentracáo similar á incorpo-
rada em ovario e á microinjetada nos ensaios com glicose radiativa. Estes resultados concordam com um efeito inibitório do 
Zn no desenvolvimento embrionario, mediado provavelmente por urna deficiente producáo de NADPH, ribose-5-fosfato e 
ATP nos ovocitos. 
1. Escuela de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de General San Martin, Calle 91 (ex San Lorenzo) n° 3391, Villa Ballester. Buenos Aires, 
Argentina, Tel/fax: 541 1-4512-5151, e-mail: Teresa.Fonovich@unsam.edu.ar 
2. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Santiago, Chile. 
3. Comisión Nacional de Energía Atómica, Centro Atómico Constituyentes, Buenos Aires, Argentina. 
4. Laboratorio de Investigaciones Bioquímicas, Químicas y de Medio Ambiente (LIB1QU1MA). Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional del 
Comahue, Neuquén, Argentina. 
Autor para correspondencia: Teresa M. Fonovich de Schroeder 
55 
Schroeder, T. M. F. e col. Revista Brasileira de Toxicologia, 13(1), 55-62, 2000 
Abstract 
Females of the toad Bufo arenarum accumulate Zn when they are maintained in a cage besides the Reconquista river 
(Province of Buenos Aires, Argentina). Ovulation occurs normally when these animáis are injected with homologous hipophysis, 
as compared to control ones. Oocytes from these females can not only be fertilized but also develop until they reach the 
gástrula stage. Significant inhibition (27%) of embryonic development can be observed from the muscular response stage on. 
In vivo simultaneous microinjection with Zn and [U-'4C]Glucose rendered a decrease in the incorporaron of the label in 
glycogen as well as in the oxidation of glucose through the pentose phosphate pathway Glucose-6-phosphate dehydrogenase 
activity was inhibited in vitro by Zn at 1,53 mM, a concentration similar to the ones accumulated in the ovary and microinjected 
into the oocytes in the previous experiments. Our results are in agreement with an inhibitory effect of Zn on early developmental 
stages of the embryos, probably due to deficient production of NADPH, ribose-5-phosphate and ATP in the oocytes. 
Introducción 
Los organismos acuáticos que habitan aguas altamen-
te contaminadas son capaces de acumular sustancias 
xenobióticas de carácter lipofílico en sus órganos, así como 
diversos metales pesados ( K A N N A N et col., 1995; 
F A VERO et col.; 1996). 
Los metales se acumulan en diversos tejidos, a tra-
vés de su unión a proteínas denominadas metalotioneínas. 
Algunos elementos, ya sean oligoelementos o xenobióticos 
son capaces de inducir la síntesis de metalotioneínas, una 
de cuyas funciones es secuestrar metales para brindar 
protección a las células que los han incorporado. 
Recientemente se ha descripto la adaptación de organismos 
acuáticos a los metales pesados, con una base genética que 
podría obedecer en algunos aspectos al cambio evolutivo 
en los genes de las metalotioneínas (MARTINEZ e 
LEVINTON, 1996). Este y otros mecanismos de protección 
celular no mediados por metalotioneínas, son inducidos por 
Cd y Zn respectivamente en células de hígado porcino y 
músculo liso aórtico bovino en cultivo (MISHIMA e col.; 
1997), así como por Zn en embriones de ratón CD-1 (BLAIN 
e col.; 1998). Bajas concentraciones de Zn inducen tolerancia 
al Cd en las células citadas a través de un mecanismo que 
involucra una disminución en la incorporación del metal 
(MISHIMA e col.; 1997). Por otra parte, concentraciones 
elevadas de Zn resultan tóxicas en células Fa32 de hepatoma 
de rata (DIERICKX, 1996). 
Se ha demostrado recientemente que el glutatión 
endógeno cumple un rol fundamental en la protección de la 
célula contra la toxicidad de los metales. Dierickx 
(DIERICKX, 1996) describió un aumento en la citotoxicidad 
de Cd, Zn, Hg, Ni y Cu en células Fa32 en cultivo tratadas 
previamente con 200 m M L-buthionina-(S,R)-sulfoximina 
(BSO), concentración que reduce el contenido de glutatión 
endógeno hasta un 5% respecto del nivel presente en las 
células controles. Los estadios embrionarios y larvales del 
sapo Bufo arenarum evidencian actividad de la enzima 
glutatión-S-transferasa (GST) e inducción de la misma me-
diada por diversos plaguicidas (ANGUIANO e col.; 1998). 
Las GSTs cumplen tres funciones cruciales para las células 
en presencia de sustancias tóxicas: conjugan xenobióticos 
con glutatión, unen ligandos no-sustratos y poseen actividad 
de peroxidasa. De este modo, el glutatión podría ejercer 
también un efecto protector contra la toxicidad de los metales 
en el sistema de nuestro interés: ovocitos y embriones de 
sapo Bufo arenarum. 
El mantenimiento de adecuados niveles de glutatión 
reducido (GSH) se logra mediante la actividad de la enzima 
glutatión reductasa en presencia de NADPH como cofactor. 
La concentración de NADPH es crítica no solo por su 
participación como cofactor de la enzima glutatión reductasa 
sino por participar también en diversos procesos celulares 
de biosíntesis reductiva. En ovocitos de anfibios el NADPH 
es producido a través de la vía de las pentosas, activa tanto 
en sus fases oxidativas como no oxidativas. Radojkovic y 
Ureta (RADOJKOVIC e URETA, 1996) describieron esta 
vía y la síntesis de glucógeno como las principales vías 
operativas para la utilización de glucosa en ovocitos de 
Calyptocephalellacaudiverbera. Recientemente Kessi et al. 
(KESSI e Col.; 1996) describieron en estas células la 
existencia de una vía indirecta para la síntesis de glucógeno, 
que involucra la degradación de la glucosa a través de la 
glucól is is y su posterior res íntes is a t ravés de la 
gluconeogénesis, antes de ser utilizada para la síntesis de 
glucógeno. 
El objetivo del presente trabajo es estudiar la probable 
acumulación de Zn en ovario de hembras de sapo Bufo 
arenarum que viven en las aguas del río Reconquista 
(provincia de Buenos Aires), en una zona altamente indus-
trializada. Se investiga además el probable efecto de la pre-
sencia de altas concentraciones de este metal en dichas cé-
lulas, sobre la fertilización de las mismas y el desarrollo 
embrionario temprano, así como su efecto en el metabolis-
mo de hidratos de carbono. 
Materiales y métodos 
La glucosa uniformemente marcada ([U-I4C]Glucosa) 
fue provista por Amersham Radiochemical Centre. El ácido 
nítrico fue INSTRA-ANALYZED de BAKER, de calidad "para 
determinación de trazas de metales". El resto de los reactivos 
utilizados fueron de calidad proanálisis. 
56 
Revista Brasileira de Toxicologia, 13(1), 55-62, 2000 Schroeder, T. M. F. e col. 
Incorporación y determinación de la concentración de Zn 
en ovocitos 
Hembras adultas de sapo Bufo arenarum fueron 
mantenidas en cautiverio a orillas del río Reconquista, a la 
altura del Partido de General San Martín, durante distintos 
períodos de tiempo. Se tomaron muestras de ovarios medi-
ante cirugía utilizando instrumental quirúrgico recubierto 
con teflón. Se colocaron las muestras en tubos de vidrio 
perfectamente limpios y enjuagados con HN0 3 concentra-
do (de igual calidad que el utilizado durante la digestión) y 
se pesaron en balanza analítica. Se realizó la digestión de 
las mismas sometiéndolas a calor en presencia de HNOi de 
calidad "para determinación de trazas de metales". Se 
determinó la concentración de Zn en las muestras por el 
método PIXE (Particle Induced X-ray Emission) 
(OZOFRAN e Col.; 1995) en la Comisión Nacional de 
Energía Atómica, Centro Atómico Constituyentes. 
Fertilización y desarrollo embrionario temprano 
Hembras mantenidas durante 60 días en cautiverio 
según se describió, fueron trasladadas al laboratorio e 
inyectadas con macerado de hipófisis homologa. Hembras 
controles fueron tratadas de igual forma. Aproximadamente 
16 horas posteriores a la inyección, cuando las hembras 
comenzaban a deponer los ovocitos, los mismos se extrajeron 
de los ovisacos mediante cirugía. Los ovocitos fueron 
inseminados en cajas de Petri conteniendo aproximadamente 
100 cada una, mediante agregado de suspensión fresca de 
espermatozoides. Al cabo de 45 minutos posteriores a la 
inseminación se agregaron 40 mi de solución Ringer 
modificada a cada caja. Se contó, con el uso de una lupa 
estereoscópica, el número total de ovocitos inseminados y 
el número de embriones correspondiente en cada caja, en 
los estadios de gástrula y respuesta muscular (FONOVICH 
e Col ; 1993). El medio de incubación (solución Ringer) fue 
renovado y los embriones muertos fueron retirados cada 48 
h. Se calculó el porcentaje de sobrevida como: 
Sobrevida % = (n° de embriones / n° de ovocitos inseminados 
o embriones en el estadio anterior) x 100 
Síntesis de glucógeno y desprendimiento de CO2 
Los ovocitos recién obtenidos fueron desprovistos 
de su cubierta gelatinosa mediante tratamiento con solución 
al 1% de ácido tioglicólico neutralizado con KOH 2 N y 
posteriores enjuagues. Cada ovocito fue microinyectado con 
50 nL de solución de Barth modificada conteniendo 
aproximadamente 50000 cpm de [U-1 4C]Glucosa y 0,5 
mmoles de glucosa fría, en presencia o ausencia de 0,15 ó 
0,03 mg de Zn (ZnS0 4 H 2 0) (para alcanzar en el ovocito 
concentraciones iguales a 1,53 y 0,31 mM respectivamente. 
Los ovocitos microinyectados fueron incubados en 2 grupos 
de 4 cada uno durante 15 minutos bajo corriente suave de 
oxígeno. El C0 2 desprendido durante la incubación se recogió 
en viales conteniendo una mezcla de NaOH 0,3 N y 0.01 % de 
Tritón. Dos ovocitos por grupo fueron procesados a tiempo 
0. Una vez finalizada la incubación se agregó solución 
centelleadora a los viales conteniendo 1 4 C0 2 y se contó la 
radiactividad presente en los mismos en contador de 
centelleo líquido Packard 1600 TR. Después del período de 
incubación cada ovocito fue digerido individualmente 
durante 30 minutos mediante tratamiento con KOH 30% en 
baño de agua a ebullición. El glucógeno fue purificado por 
precipitación con alcohol en presencia de solución de sulfato 
de sodio al 2% y 0,25 mg de glucógeno frío utilizado como 
coprecipitante. Se centrifugaron los tubos y los pellets fueron 
resuspendidos en agua y precipitados nuevamente con 
etanol. Los precipitados se recolectaron en filtros de fibra 
de vidrio (Whatman GF/C), se secaron bajo lámpara 
infrarroja y se contó la radiactividad presente en los mismos 
como se describió antes (GUIXE e Col.; 1997). 
Actividad de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 
Se preparó un extracto de ovocitos en buffer TRIS 25 
mM, EDTA 6 mM, MgCl 2 6 mM, KC1100 mM, pH=7,4. La 
actividad de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en 
el extracto de ovocitos se midió en el mismo buffer, en un 
volumen final de 1 mi. El NADP +, la glucosa-6-fosfato y el 
Zn 2 ' (ZnS0 4 .H 20) fueron preparados en el buffer de ensayo 
(RADOJKOVIC e URETA, 1996). La formación de NADPH 
se midió espectrofotométricamente a través del incremento 
en la absorbancia a 340 nm durante 2 minutos a 25 °C. Cuando 
se agregó Zn 2 + a la mezcla de reacción, el extracto fue 
preincubado en presencia del catión durante 1 minuto previo 
al agregado de los sustratos. 
Resultados y discusión 
Una vez que los metales ingresan al organismo, son 
transferidos hacia tejidos en los que se acumulan. En los 
animales que poseen sistema circulatorio los metales son 
transportados asociados a una variedad de componentes de 
la hemolinfa. El almacenamiento posterior ocurre en tejidos 
particularmente ricos en ligandos que unen metales 
(metalotioneínas), o capaces de sintetizarlos, por ejemplo 
hepatopáncreas, hígado, riñon (ROESIJADI, 1992; SALEH 
e Col.; 1988). Debido a variaciones en las características de 
incorporación, acumulación y eliminación de diferentes 
especies, la concentración de metales en organismos 
acuáticos varía en un amplio rango, observándose 
acumulación aún en ausencia de contaminación del medio 
acuático (LANGSTON e SPENCE, 1995). 
La figura 1 muestra la curva de incorporación de Zn 
en los ovarios de las hembras de sapo expuestas a aguas del 
río Reconquista. El Zn se acumuló en este tejido en forma 
dependiente del tiempo de permanencia de las hembras en 
cautiverio a orillas del río. Hembras controles (tiempo 0) 
mostraron niveles siempre inferiores. A partir de los 20 días 
de exposición la concentración de Zn alcanzó una meseta 
que se mantuvo a tiempos superiores. Durante la permanencia 
57 
Schroeder, T. M. F. e col. Revista Brasileira de Toxicologia, 13(1), 55-62, 2000 
300 
50 
Tiempo de exposición (días) 
Figura 1 . Incorporación de Zn en ovario de hembras mantenidas en cautiverio a orillas del río Reconquista. Los resultados 
son los promedios ± SD de muestras procesadas por duplicado y son representativos de otro experimento realiza-
do bajo idénticas condiciones. La concentración de Zn se midió por el método PIXE, como se indica en Métodos 
y se expresa en ng de Zn por mg de tejido (peso húmedo). 
de los animales en el jaulón, estuvieron en contacto con 
sedimentos en ausencia de columna de agua (hacia la parte 
más externa del jaulón) y agua con sedimentos hacia la 
porción que se internaba en el lecho del r ío . Durante lluvias 
abundantes el lugar quedaba casi completamente cubierto 
con agua durante períodos cortos (horas). La concentración 
de Zn en diversas muestras de agua tomadas en el lugar fue 
siempre inferior a 20 ng/g, valor igual a nuestro límite dedetección. Tomando en cuenta este último valor como la 
concentración de Zn más elevada probable de hallar en el 
agua, el factor de bioconcentración (BCF) para el Zn en 
nuestro sistema es >14000. Un análisis de la concentración 
del metal en los sedimentos podría reflejar una situación 
distinta de la del agua (concentraciones por encima de 
nuestro límite de detección). 
El presente estudio fue realizado durante los meses 
de invierno, cuando el ovario de esta especie aumenta 
notablemente de tamaño e incrementa su composición 
porcentual en ovocitos de estadio V (dimensiones y 
pigmentación semejantes a los hallados en ovocitos 
ovulados), mientras se produce la maduración de los ovocitos 
(ECHEVERRIA, 1987). Durante ese período el metabolis-
mo del ovario es muy activo, y es seguramente responsable 
de la acumulación de Zn encontrada. Estos resultados 
concuerdan con los descriptos por Coimbra y CarraVa 
(COIMBRA e CARRACA, 1990) para la acumulación de 
Zn durante diferentes estadios del ciclo reproductivo en 
Mytilus edulis, quienes hallaron acumulación hasta niveles 
muy elevados durante el estadio correspondiente a la 
maduración de las células gonadales. 
Las hembras trasladadas al laboratorio e inyectadas 
con macerado de hipófisis ovularon de manera aparentemente 
normal, sus ovocitos fueron capaces de fertilizar y 
desarrollaron en forma similar a los obtenidos a partir de 
hembras controles, hasta alcanzar el estadio de gástrula. En 
el estadio de respuesta muscular se observó en cambio, una 
disminución significativa en el porcentaje de sobrevida de 
los embriones provenientes de hembras que acumularon Zn 
en sus ovarios (figura 2). 
El activo metabolismo de carbohidratos presente en 
los ovocitos de anfibios refleja los cambios en energía me-
tabólica que ocurren en estas células durante la 
diferenciación. No se conoce aún la importancia de la síntesis 
de glucógeno a través de la "vía indirecta" citada anterior-
mente, pero la glucólisis, operativa en estas células, es la 
única vía a través de la cual obtienen energía en forma de 
ATP, ya que el ciclo del ácido cítrico no es operativo(GUIXE 
e col., 1994). La figura 3 muestra que tanto la síntesis de 
glucógeno como la liberación de C0 2 a través de la vía de 
las pentosas se encuentran disminuidas en los ovocitos 
microinyectados con Zn, a las dos concentraciones 
estudiadas. Una concentración igual a 1,53 mM de Zn fue 
seleccionada porque corresponde a aquella presente en el 
ovario de las hembras expuestas, una vez realizados los cál-
culos teniendo en cuenta el volumen y la masa en mg de los 
ovocitos. 
El estudio preliminar de la actividad de la enzima 
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa in vitro permite eviden-
ciar inhibición de la misma en presencia de Zn 2 + , dependiente 
de la concentración del metal agregada (figura 4). Esta enzima 
58 
Revista Brasileira de Toxicologia, 13(1), 55-62, 2000 Schroeder, T. M. F. e col. 
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Hembras control 
Hembras tratadas 
Gástrula (% to) R.M. (% gast.) 
Estadio del desarrollo 
Figura 2 . Desarrollo embrionario temprano de ovocitos obtenidos de hembras expuestas y controles, inseminados y 
desarrollados en el laboratorio. Los resultados son los promedios ± SD de muestras procesadas por triplicado 
para duplicado de animales y se expresan en % de sobrevida en los estadios de gástrula y respuesta muscular 
(R.M.) (ver Materiales y Métodos). ANOVA: * = p<0.01 entre tratamientos. 
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glucógeno C02 
Fracción 
l [LM4C]glucosa sola 
] [lM4C]glucosa-Zn 0.31 mM 
rrrm [U-i4C]glucosa-Zn 1.53 mM 
Figura 3 . Incorporación de [U-14C]glucosa en glucógeno y C0 2 en ovocitos microinyectados in vivo con el trazador solo o 
simultáneamente con el trazador y Zn como catión bivalente, en concentración 0,31 mM o 1,53 mM. Los resulta-
dos son los promedios ± SD de muestras procesadas por replicado (n=8), son representativos de otro experimento 
diseñado bajo idénticas condiciones y se expresan en pmoles por ovocito. ANOVA: a) p<0.0001 y b) p<0.01 
entre tratamientos. 
59 
Schroeder, T. M. F. e col. Revista Brasileira de Toxicologia, 13(1), 55-62,2000 
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Zn2+ (mM) 
Figura 4 . Actividad de la enzima glucosa-6-P deshidrogenasa, medida in vitro según se describió, en función de la 
concentración de Zn agregada al medio de reacción. 
cataliza la primera reacción de la vía de las pentosas, el paso 
limitante de la velocidad de la vía. De esta manera la 
acumulación de Zn provoca importantes alteraciones meta-
bólicas en los ovocitos in vivo, a través de una deficiente 
utilización de la glucosa tanto destinada a la síntesis de 
glucógeno como a decarboxilación oxidativa a través de la 
vía de las pentosas. Se ha demostrado recientemente que el 
glucógeno juega un importante papel en la formación de un 
intermediario de cromatina altamente condensado y el 
ensamble del núcleo in vitro en huevos de Xenopus laevis, 
probablemente secuestrando a la proteína fosfatasa 1 (PP-1) 
hacia el intermediario observado in vitro y hacia los 
cromosomas mitóticos in vivo (HARTL e Col., 1994). La 
deficiente utilización de la glucosa a través de la vía de las 
pentosas conduce en primer lugar a una disminución en la 
producción de NADPH necesario para: a) el mantenimiento 
del estado redox de la célula a través de adecuados niveles 
de glutatión reducido (GSH) y b) los procesos de síntesis 
que requieren este cofactor. Otra importante consecuencia 
es la reducción en la producción de ribosa-5-fosfato, pre-
cursor de la síntesis de nucleótidos. 
Los resultados de nuestros experimentos realizados 
in vitro e in vivo (figuras 3 y 4) utilizando concentraciones 
de Zn, como catión bivalente, en el rango de las que se 
encuentran en los ovarios de las hembras expuestas, sugieren 
que la disminución en la sobrevida de los embriones 
mostrada en la figura 2, podría obedecer en gran parte a los 
efectos del metal sobre el metabolismo de carbohidratos de 
los ovocitos..,, 
La concentración de Zn en ovocitos ovulados 
provenientes de hembras expuestas se pudo medir solo en 
dos muestras. La concentración del metal no fue elevada en 
dichas muestras, respecto de las concentraciones encontradas 
en ovocitos controles (resultados no mostrados). Si estos 
resultados se repitieran en nuevos estudios, nuestros 
presentes hallazgos podrían obedecer a los efectos causados 
por el Zn sobre estas células con anterioridad a la ovulación, 
probablemente durante la maduración, etapa durante la cual 
se ha demostrado que la vía de las pentosas cumple un rol 
central (DOWNS e Col., 1998), aunque no se podría 
descartar un efecto de la disminución en la síntesis de 
glucógeno sobre la mitosis, que se sumaría al anterior. 
La exposición de las hembras se realizó durante 
períodos no muy prolongados y en un recurso natural de la 
provincia de Buenos Aires. Otros resultados de nuestro 
laboratorio aún no publicados demuestran además que la 
totalidad de los embriones obtenidos a partir de ovocitos 
controles (provenientes de hembras no expuestas) e 
incubados en agua de río sin diluir, mueren antes de alcanzar 
el estadio de respuesta muscular. Nuestros resultados 
permiten acercarnos hacia el conocimiento de los mecanismos 
de toxicidad del Zn, a la vez que reflejan la alarmante situación 
para la reproducción de la especie Bufo arenarum en esta 
zona de nuestro país. 
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Agradecimientos: 
Este trabajo fue financiado en parte por la Universidad 
Nacional de General San Martín y la Comisión Nacional de 
Energía Atómica (CNEA). Alejandro Burlón, María A. 
Cardona, Mario Debray, Daniel Hojman, Mabel Ozafrán, 
Mónica Vázquez son personal de la CNEA, que colaboran 
durante las irradiaciones (método de PIXE). 
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