TEMA_1_GII

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TEMA 1: INGENIERÍA GENÉTICA
Sumario…
• PCR
• Digestión con enzimas de restricción
• Electroforesis
• Clonación
• Secuenciación
• Marcadores Moleculares
Kary Mullis, inventor de 
la PCR. Premio Nobel 
de Química en 1993
http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993
/mullis-lecture.html
“One Friday night I was driving, as was my custom, from
Berkeley up to Mendocino where I had a cabin far away from
everything off in the woods. My girlfriend, Jennifer Barnett, was
asleep. I was thinking“
“In about a mile it occurred to me […] that I could make an
arbitrarily large number of copies of any sequence”
“Afternoon came, including new bottles of
celebratory red fluids from Jack's Valley Store, but I 
was still puzzled, alternating between being
absolutely pleased with my good luck and clever
brain, and being mildly annoyed at myself and
Jennifer Barnett, for not seeing the flaw that must
have been there”
• ADN monocatenario molde
• Un cebador (fragmentos monocatenarios
de 17 a 25 pb, complementarios a una 
región conocida)
• Nucleótidos
• Polimerasa
• Iones magnesio y otras sales
Reacción en cadena de la polimerasa PCR
Desnaturalización 90ºC
Extensión
CICLO 1
CICLO 2
Unión de los cebadores 40-65ºC
(annealing)
Reacción en cadena de la polimerasa PCR
Reacción en cadena de la polimerasa PCR
90ºC
45ºC
70ºC
Reacción en cadena de la polimerasa PCR
Termociclador
automático
Reacción en cadena de la polimerasa PCR
• Aislamiento de fragmentos concretos (filogenia, 
análisis,…)
• Diagnóstico de enfermedades hereditarias
• “Huella Genética” (Genética forense)
• Diagnóstico de enfermedades infecciosas
Reacción en cadena de la polimerasa PCR
…ATACTAAGCTTGAAA…
…TATGATTCGAACTTT…
Digestión con enzimas de 
restricción
Electroforesis en gel de agarosa
Electroforesis en gel de agarosa
Digestión con enzimas de 
restricción
Separación de 
fragmentos mediante 
electroforesis
Aislo y 
purifico la 
banda
AGCTT
TTCGAA
A
Clonación de fragmentos
Composición de un plásmido 
de clonación
LacZ
Amp R
Composición de un plásmido 
de clonación EcoRI
HindIII
PvuII
AluI
…
BclI
Polylinker
Amp R
Composición de un plásmido 
de clonación
LacZ interrumpido 
plásmido 
recombinante
Ligación de Fragmentos
Transformación
No son resistentes a la 
ampicilina y mueren
Son resistentes a la 
ampicilina y además 
poseen el gen lacZ intacto. 
Crecen y producen una 
coloración azul
Son resistentes a la 
ampicilina, pero su gen 
lacZ está roto. Crecen 
produciendo colonias 
blancas
Medio con IPTG, X-gal y Ampicilina
Digestión con enzimas de 
restricción
Clonación de 
fragmentos
Genotecas de ADN
Vectores de clonación
• Plásmidos (hasta 15kb)
• Bacteriófago λ (hasta 23kb)
• Cósmido (hasta 44kb)
• BAC (hasta 300kb)
• YAC (hasta 1000kb)
• HAC (>kb)
Vectores de expresión (!)
Método de Sanger MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN
Método de Sanger MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN
TACGTTATXXXXX
TACGTTATCATGA
ADN molde Nucleótidos ADN polimerasa Cebador (ATGCAATA)
ATGCAATA
ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
TACGTTATCATGA
ATGCAATAGTACT
TACGTTATCATGA
ATGCAATAGTACT
TACGTTATCATGA
ATGCAATAGTACT
TACGTTATCATGA
ATGCAATAGTACT
TACGTTATCATGA
ATGCAATAGTA
TACGTTATCATGA
ATGCAATAGTAC
TACGTTATCATGA
ATGCAATAG
TACGTTATCATGA
ATGCAATAGT
TACGTTATCATGA
ATGCAATAGTACT
1
2
3 4
5
Método de Sanger MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN
ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
ATGCAATAGTA
ATGCAATAGTAC
ATGCAATAG
ATGCAATAGT
ATGCAATAGTACT
GTACT
TACGTTATCATGA
Secuenciadores de ADN
Secuenciadores de ADN
Secuenciadores de ADN
• Secuenciación de fragmentos o regiones 
concretas
• Secuenciación de grandes porciones de 
ADN o genomas
Secuenciación de ADN
Marcador
4. m. Átomo o sustancia detectables con facilidad que permiten 
identificar procesos físicos, químicos o biológicos.
Marcadores Moleculares
Marcador Molecular (Genético)
Es un segmento de ADN cuya localización física en el genoma se 
puede identificar y su herencia rastrear a lo largo de las generaciones. 
El marcador molecular puede ser un gen que confiere una 
característica en cuestión, o más a menudo, fragmentos que se 
encuentran próximos al mismo. Dado que dos segmentos próximos en 
un cromosoma tienden a heredarse en conjunto, éstos se utilizan a 
menudo para rastrear de forma indirecta el patrón hereditario de un 
gen que todavía no ha sido identificado, pero cuya ubicación 
aproximada se conoce. En un cruzamiento genético, las características 
de interés seguirán generalmente unidas a los marcadores 
moleculares. Por lo tanto, se pueden seleccionar individuos en los que 
el marcador molecular esté presente, ya que el marcador debería 
indicar la presencia de la característica deseada.
• Fácil aislamiento e identificación 
• Herencia predecible (Mendeliana)
• Polimorfismo
• Específicos
Características Principales de los Marcadores Molec ulares
CACACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGTGT
Región flanqueante Región flanqueante
Repeticiones de 2 a 6 pb
en número variable
Microsatélites o SSRs
(simple sequence repeats )
• Alto grado de polimorfismo (numerosas repeticiones 
en tándem)
• Específicos
• Distribuidos al azar por todo el genoma
• Herencia co-dominante
• Cálculo de frecuencias
• Neutrales
Características Principales de los Microsatélites
DNA Fingerprinting o “ Huella Genética ”
Muestra 2
Muestra 1
Muestra 3
EQUIPO DE INVESTIGACIÓN 1
Muestra 4
Control
Muestras de 
Semen
EQUIPO DE INVESTIGACIÓN 2
Control
Muestras de 
Tejido
EQUIPO DE INVESTIGACIÓN 3
Control
Control
Muestras de 
posibles Padres y 
Madres
Pero… ¿Quién es la víctima?
185181187185188185185181187185Locus 4
130130144140145141130130144140Locus 3
265250260256265256265250260256Locus 2
140127134134140130140127134134Locus 1
Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1
MANCHA DE 
SANGRE 4
MANCHA DE 
SANGRE 3
MANCHA DE 
SANGRE 2
MANCHA DE 
SANGRE 1
ADN DE LA 
VÍCTIMA
Procedencia de la Muestra
EQUIPO DE INVESTIGACIÓN 1
Sospechoso 
1
Sospechoso 
1
Sospechoso 
2
ADN de la 
Víctima
188182188182185181187185187185Locus 4
145155145155130130144140144140Locus 3
260280260280265250260256260256Locus 2
135135135135140127134134134134Locus 1
Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1
MUESTRA DE 
SEMEN 4
MUESTRA DE 
SEMEN 3
MUESTRA DE 
SEMEN 2
MUESTRA DE 
SEMEN 1
ADN DE LA 
VÍCTIMA
Procedencia de la Muestra
EQUIPO DE INVESTIGACIÓN 2
Sospechoso 
1
Sospechoso 
3
Sospechoso 
3
ADN de la 
Víctima
188182188185185181187185187185Locus 4
145155145141130130144140144140Locus 3
260280265256265250260256260256Locus 2
135135140130140127134134134134Locus 1
Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1
MUESTRA DE 
PIEL 4
MUESTRA DE 
PIEL 3
MUESTRA DE 
PIEL 2
MUESTRA DE 
PIEL 1
ADN DE LA 
VÍCTIMA
Procedencia de la Muestra
EQUIPO DE INVESTIGACIÓN 3
Sospechoso 
1
Sospechoso 
2
Sospechoso 
3
ADN de la 
Víctima
189180187187187182180185187185Locus 4
145140140140144144145140144140Locus 3
260256258252260256260260260256Locus 2
134134134134134134132134134134Locus 1
Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1
ADN MADRE 2ADN PADRE 2ADN MADRE 1ADN PADRE 1ADN DE LA 
VÍCTIMA
Procedencia de la Muestra
EQUIPO DE INVESTIGACIÓN 4
¡CRIMEN RESUELTO!
MARCADORES 
MOLECULARES
CACACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGTGT
Región flanqueante Región flanqueante
Repeticiones de 2 a 6 pb
en número variable
Microsatélites o SSRs (Simple Sequence Repeats)
• Alto grado de polimorfismo (numerosas repeticiones 
en tándem)
• Específicos
• Distribuidos al azar por todo el genoma
• Herencia co-dominante
• Cálculo de frecuencias
• Neutrales
Características Principales de los Microsatélites
Southern-blot
Hibridación
Extracción de ADN
Detección de Clones Enriquecidos en 
Microsatélites ( p.ej. transferencia a 
membrana e hibridación )
Análisis de la Genoteca y Genotipado
de IndividuosDigestión con Enzimas de 
Restricción
Ligación, Transformación, Clonación
DNA Fingerprinting o “ Huella Genética ”
Locus 4Locus 3Locus 2Locus 1
950949812012412313425225210
5700102941371371231232552509
2000100981241371201452422528
18001021021241241261452382387
1000102941241401501232322386
250094941421371451452382505
650094981371371241232552504
15001021021421421221232422383
1000941021421401221222462482
5000981001371371451342552501
Producción 
de leche 
(litros/mes)
Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Alelo 2Alelo 1Individuo
P M
9 repeticiones
5 repeticiones
7 repeticiones
3 repeticiones
Loci de rasgos cuantitativos (QTLs: Quantitative Traits Loci) 
Limami A M et al. Plant Physiol. 2002;130:1860-1870
©2002 by American Society of Plant Biologists
Minisatélites o VNTRs (Variable Number Tandem Repeats)
RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
Madre Padre
alelo 1 alelo 2
11 22 12
Southern-blot
Análisis del ligamiento 
al locus D
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)
GTGAGGCGCTNTCGCATTC
CACTCCGCGA
Detección de un SNP
N
Transgénesis 
(Organismos Modificados 
Genéticamente)
según la RAE,
transgénico, ca.
1. adj. Biol. Dicho de un organismo vivo: 
Que ha sido modificado mediante la 
adición de genes exógenos para lograr 
nuevas propiedades.
Ciclos de cruzamiento y 
selección
AA BBTriticum monococcum
2n=14
Aegilops sp. 2n=14
AB
A BX
Híbrido interespecífico
2n=n1+n2=14
AABB
Duplicación Natural
Trigo Duro 2n=28 DD
ABD
AB DX
Aegilops squarrosa
2n=14
Híbrido interespecífico
2n=n1+n2+n3=21
Trigos Harineros 
(hexaploides)
AABBDD Duplicación Natural
según la RAE,
transgénico, ca.
1. adj. Biol. Dicho de un organismo vivo: 
Que ha sido modificado mediante la 
adición de genes exógenos para lograr 
nuevas propiedades.
según la Directiva 90/220/CEE , 
Organismo Modificado Genéticamente (OMG) .
1. Un organismo cuyo material genético ha sido 
modificado de una manera que no acaece en el 
apareamiento y/o recombinación naturales. 
1) la obtención de moléculas de ADN recombinante 
mediante la utilización de vectores ,
2) la incorporación directa en un organismo de ADN 
extraño, incluyendo las técnicas de microinyección , 
macroinyección y microencapsulación , 
3) técnicas de fusión o hibridación celular , incluyendo 
la fusión de protoplastos. 
1) la obtención de moléculas de ADN recombinante 
mediante la utilización de vectores ,
2) la incorporación directa en un organismo de ADN 
extraño, incluyendo las técnicas de microinyección , 
macroinyección y microencapsulación , 
3) técnicas de fusión o hibridación celular , incluyendo 
la fusión de protoplastos. 
Plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens
1) la obtención de moléculas de ADN recombinante 
mediante la utilización de vectores ,
2) la incorporación directa en un organismo de ADN 
extraño, incluyendo las técnicas de microinyección , 
macroinyección y microencapsulación , 
3) técnicas de fusión o hibridación celular , incluyendo 
la fusión de protoplastos. 
Inserción del ADN deseado en células 
embrionarias o directamente en tejidos
1) la obtención de moléculas de ADN recombinante 
mediante la utilización de vectores ,
2) la incorporación directa en un organismo de ADN 
extraño, incluyendo las técnicas de microinyección , 
macroinyección y microencapsulación , 
3) técnicas de fusión o hibridación celular , incluyendo 
la fusión de protoplastos. 
“Gene Gun”: Pistola de Genes
1) la obtención de moléculas de ADN recombinante 
mediante la utilización de vectores ,
2) la incorporación directa en un organismo de ADN 
extraño, incluyendo las técnicas de microinyección , 
macroinyección y microencapsulación , 
3) técnicas de fusión o hibridación celular , incluyendo 
la fusión de protoplastos. 
Clasificación de Organismos 
Transgénicos
Resistencia a Enfermedades o Condiciones Ambientales
Sesamia nonagrioides
Taladro del Maíz
Trasgen procedente de Bacillus 
turingensis (proteína tóxica 
para insectos). 
Virus de la Mancha Anular ( Ringspot Virus)
Trasgen de coliflor 
que codifica para 
dos genes que 
confieren 
resistencia al virus
Resistencia a Enfermedades o Condiciones Ambientales
Mejora Calidad del producto o de las Propiedades Productivas
El Arroz Dorado Dos genes que promueven la 
acumulación de β-caroteno en el 
grano.
http://www.goldenrice.org/
Resistencia a Enfermedades o Condiciones Ambientales
Mejora Calidad del producto o de las Propiedades Productivas
Resistencia a Herbicidas
http://www.youtube.com/watch?v=o-BQq2aBdYo
Resistencia al herbicida Glufosinato
Gen que 
confiere 
resistencia 
al 
Glufosinato
de Amonio
Resistencia a Enfermedades o Condiciones Ambientales
Mejora Calidad del producto o de las Propiedades Productivas
Resistencia a Herbicidas
Biorreactores
Ratones Knockout
¿Qué es Natural ? ¿Qué es Ecológico ? 
¿Qué es Modificado ?
-No todo lo Natural es Inocuo : ribotoxinas fúngicas, 
neurotoxinas, toxina antrácica, botulínica,…
-No todo lo Artificial es Nocivo : “Ninguno de los 
conservantes autorizados llega a ser tan peligroso 
como las toxinas que pueden producir las bacterias y 
los hongos que el conservante evita”
“Si los científicos se obcecan en modificar el equilibrio y la 
biodiversidad de la flora y la fauna del planeta, caminamos 
hacia un horizonte de consecuencias imprevisibles: para 
obtener un solo ejemplar en óptimas condiciones muchos de 
los experimentos genéticos en el mundo animal han dado 
como resultado miles de seres amorfos y enfermizos”.
“Iniciar investigaciones genéticas puede tener también una 
vertiente más positiva en su utilización para erradicar o ralentizar 
el proceso destructivo de una enfermedad, como es el caso del 
cáncer, y es la línea por la que deberíamos discurrir los avances 
en un campo ennoblecido por ilustres figuras que han ido 
desarrollando sus estudios con posterioridad a Mendel, el padre 
del gen”.
Algunas DESinformaciones aparecidas en la prensa…