Biologia_Molecular_Tecnicas_basicas_de_b

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Biología Molecular 
Técnicas básicas de biología molecular (1) 
Pacheco López Rebeca, beqi_1928@gmail.com 
 
I. Enzimas de restricción 
También son llamadas nucleasas de restricción, endonucleasas de restricción, 
enzimas restrictivas o restrictasas, son un grupo de endodesoxirribonucleasas, es 
decir, enzimas que cortan el enlace fosfodiester (en 3´-P) de las dos cadenas de 
una molécula de DNA. Se caracterizan porque reconocen una secuencia específica, 
denominada secuencia de restricción y por lo tanto, el sitio en que realizan el corte 
es altamente específico. 
Su nomenclatura es de 4 letras y un número romano, las primeras 3 indican la 
abreviación de la especie en la que se encontraron, la cuarta el serotipo (R o H) y 
el número romano se usa para diferenciar las variantes de la misma enzima. 
 
Estas enzimas se clasifican en tres familias de acuerdo a sus propiedades: 
Características Tipo I Tipo II Tipo III 
Actividad 
enzimática 
Endonucleasa y metilasa 
en una misma proteína 
pero en distintas sub 
unidades 
Endonucleasa Endonucleasa y metilasa en 
una misma proteína pero en 
distintas sub unidades 
Coenzimas o 
cosustratos 
ATP, SAM, Mg2+ Mg2+ ATP, SAM, Mg2+ 
mailto:beqi_1928@gmail.com
Estructura 
proteica 
3 sub unidades: 
-S, reconocimiento 
-R, restricción 
-M, metilación 
1 sub unidad (aunque 
actúa como homodímero) 
2 sub unidades: 
-SM, reconocimiento y 
metilación 
-R, restricción 
Sitio de 
reconocimiento 
No palindrómico Palindrómico (4-8 pb) No palindrómico 
Punto de corte Corta 2 hebras en puntos 
cercanos entre sí pero 
lejanos al sitio de 
reconocimiento (100 pb) 
Corta las dos cadenas en 
el mismo punto y dentro 
del sitio de 
reconocimiento 
Corta las dos hebras en 
sitios distantes entre sí y a 
24-26 pb del sitio de 
reconocimiento 
 
De acuerdo a estas características, las enzimas de restricción tipo II son de interés 
en la ingeniería genética. 
Por otra parte, al hidrolizar el enlace fosfodiester, se generan dos fragmentos de 
restricción con extremos 3´-OH y 5´-P, que dependiendo del sitio de corte pueden 
ser extremos romos (cuando es simétrico) o cohesivos (corte asimétrico) (Herráez, 
n.d.). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
II. Vectores de clonación 
Los vectores son portadores, es decir, moléculas de DNA cuya función es unirse 
fragmentos de DNA que se quiere clonar para facilitar su entrada en la célula y su 
replicación (Herráez, n.d.). 
Tipos de vectores 
Vector Descripción Ventaja Desventaja 
Plásmidos Son moléculas circulares de 
DNA extracromosomal de de 
bacterias. En la práctica 
se utilizan plásmidos 
artificiales que ya incluyen 
genes marcadores para su 
fácil detección. 
Su replicación es autónoma, 
requieren de un OriC 
-Se purifica fácilmente a 
partir del cultivo celular 
-Tamaño pequeño (5-7 
kb), por lo que puede 
entrar fácilmente a la 
célula 
-Genera varias copias por 
célula 
- Incorporación de 
insertos pequeños (>10 
kb) 
Fagos Son virus modificados que 
infectan a células específicas 
(bacterias, en el caso del 
bacteriófago) para replicar su 
genoma. 
-Admite insertos más 
grandes que en los 
plásmidos (9-23 kb por 
substitución en el fago λ) 
-Alta eficiencia de 
infección 
-Su DNA es complejo 
para su manipulación in 
vitro 
-Dificultad para insertar el 
DNA de interés debido a 
que tiene múltiples sitios 
utilizados durante la 
clonación dentro de 
regiones esenciales para 
el crecimiento lítico 
-El sistema de 
encapsidación limita el 
tamaño del inserto 
Cósmidos Son vectores sintéticos, 
quimeras de plásmidos y fagos 
-Clona insertos de hasta 
45 kb 
- Se forma una gran 
proporción de moléculas 
que combinan sus 
características: 
- cos, región de DNA viral 
necesaria para su 
encapsidación 
-el origen plasmídico de 
replicación 
 
- Es empaquetado e 
infecta a las células como 
un fago, pero dentro de 
ellas se replican y se 
mantienen como un 
plásmido 
indeseables durante la 
reacción con la ligasa 
-Inestabilidad de las 
secuencias de DNA 
insertadas 
-Alta variabilidad en el 
crecimiento de las 
colonias 
 
III. Transfección y transformación 
La transfección hace referencia a la introducción de material genético (ADN 
plasmídico, ARNm, etc.) a una célula de mamífero mediante métodos físicos o 
químicos. (“Transfección | Thermo Fisher Scientific - MX,” n.d.). 
La transformación es un proceso natural por el que las bacterias adquieren DNA 
exógeno, normalmente ocurre a baja frecuencia, por lo que se han manipulado a las 
bacterias para mejorar su capacidad competente. Actualmente existen 
comercialmente células competentes hechas con diferentes métodos de 
transformación, eficiencias de transformación, genotipos y empaquetamiento. 
Técnicas de transformación 
Para transformar a las bacterias existen métodos físicos y químicos: 
 La primera transformación química fue descrita por Mandel y Higa en 1970, 
donde trataron a las células con Ca2+ seguido de un golpe de calor, 
observando un aumento de la permeabilidad al DNA. Aunque el mecanismo 
funcional se desconoce, se cree que la carga positiva del Ca2+ neutraliza la 
carga negativa del DNA, permitiendo así su paso a través de la membrana 
(“Bacterial Transformation and Competent Cells–A Brief Introduction | 
Thermo Fisher Scientific - MX,” n.d.). 
 La electroporación es un método físico que crea poros temporales en la 
membrana a través de un pulso eléctrico para permitir la entrada de algún 
material exógeno a cualquier tipo celular, sin embargo, tiene la desventaja de 
tener un alto porcentaje de muerte debido al pulso de alto voltaje, pues 
aunque solo dura micro a milisegundos, las células pueden fallar en reparar 
su membrana. El protocolo indica que primero se deben preparar las células 
suspendiéndolas en un buffer de electroporación y adicionando el ácido 
nucleico que se desea introducir, después se aplica el pulso eléctrico y por 
último se regresan las células a condiciones de crecimiento para su 
recuperación (“Electroporation | Thermo Fisher Scientific - MX,” n.d.). Este 
método físico es utilizado tanto en transformación como en transfección. 
 
 
 
Técnicas de transfección 
Al igual que en la transformación, existen métodos físicos y químicos: 
 Lipofección. Es un método químico que utiliza lípidos cargados positivamente 
para facilitar la entrada de DNA a la célula; estos lípidos forman un liposoma 
de superficie positiva que media la interacción entre la carga positiva de los 
fosfatos del DNA y la membrana celular. Primero se debe crear un complejo 
liposoma-proteína, el cual será internalizado por endocitosis y una vez dentro 
de la célula el DNA es capaz de escapar de la vía endosomal y entrar al 
núcleo para expresarse (figura 8) (“How Cationic Lipid Mediated Transfection 
Works | Thermo Fisher Scientific - MX,” n.d.). 
 
 Mediante DEAE dextrán. El dietilaminoetil (DEAE)-dextrán es un derivado 
poli catiónico del dextrán, que debido a su gran carga positiva se une al 
esqueleto cargado negativamente del DNA y permite su paso a la célula ya 
sea por endocitosis o por choque osmótico inducido por glicerol o DMSO. Es 
de los primeros agentes químicos usados en la transfección, es de bajo costo 
y fácil de usar, sin embargo, puede inducir citotoxicidad y tiene eficiencias de 
transfección muy bajas (<10%), por lo que este método se usa 
preferentemente para las transfecciones transitorias (“DEAE-Dextran-
Mediated Delivery | Thermo Fisher Scientific - MX,” n.d.). 
 Mediante fosfato de calcio. En esta técnica se forman precipitados de fosfato 
de calcio-DNA, los cuales serán introducidos a la célula. Para ello, primero 
debe mezclarse el DNA con cloruro de calcio en un buffer de fosfatos, 
después incubar dicha mezcla a temperatura ambiente para generar los 
precipitados y finalmente agregarlos a la célula para que pueda 
internalizarlos por endocitosis.Este método es fácil, de bajo costo y se puede 
utilizar para transfecciones transitorias y estables en varios tipos de cultivo 
celular, sin embargo, el co-precipitado es sensible a cambios en el pH, 
temperatura y concentraciones de sal del buffer, además de ser citotóxico 
para algunos cultivos celulares primarios (“Calcium phosphate 
co‑precipitation | Thermo Fisher Scientific - MX,” n.d.). 
Por otra parte, la transfección puede clasificarse como transitoria y estable. En 
la primera el DNA no se integra en el genoma de la célula huésped, por lo que 
permanece solo de forma transitoria dentro de la célula y no se transmite a las 
células hijas, debido a esto el DNA recombinante se va diluyendo el cultivo 
celular conforme se dividen las células y éste puede ser detectado solo de 1-7 
días después de la transfección. Normalmente, se lisan las células después de 
24-96 horas post transfección para la extracción de RNA o proteína. La 
transfección transitoria es más eficiente cuando se utiliza DNA plasmídico súper 
enrollado, aunque también se pueden utilizar miRNAs, siRNAs, mRNAs, e 
incluso proteínas (“Transient Transfection | Thermo Fisher Scientific - MX,” n.d.). 
Por el contrario, en la transfección estable el DNA persiste por un largo plazo y 
es heredado a las células hijas, ya sea por su integración al DNA genómico o 
por herencia estable del DNA no genómico. La transfección estable es más 
efectiva cuando se utiliza DNA linear, aunque solo aproximadamente 1 de 104 
células lo integre. Además, se debe añadir un marcador de selección o 
cotransfectar las células con un vector que lo tenga, para posteriormente 
someterlas a una presión de selección (por ejemplo a un antibiótico) y 
seleccionar únicamente aquellas células que han integrado el DNA y por lo tanto 
expresan la proteína de interés (“Stable Transfection | Thermo Fisher Scientific 
- MX,” n.d.). 
Algunos antibióticos utilizados como presión de selección y su mecanismo de 
acción son: 
Antibiótico Mecanismo de acción 
Puromicina Afecta la etapa de elongación de la transcripción. Es un análogo estructural 
del aa-tRNA por lo que forma un enlace con el péptido que se está 
sintetizando y provoca una terminación prematura de la proteína 
Neomicina 
 
Es un aminoglucósido que inhibe la elongación de la transcripción en la 
etapa de translocación. Interacciona con el rRNA 16S de la subunidad 
mayor 50S, impidiendo la asociación con el factor de elongación G 
(análogo del eEF2 en eucariotas) 
Higromicina 
 
Es un aminoglucósido que inhibe la síntesis de proteínas al irrumpir la 
translocación y promover una anómala traducción en el ribosoma 80S 
Ácido 
micofenólico 
 
Es un derivado del ácido fólico que funciona como inhibidor competitivo de 
la enzima dihidrofolato reductasa, bloqueando la síntesis de 
tetrahidrofolato. Esto tiene como resultado la reducción de la síntesis de 
purinas y pirimidinas, necesarias a su vez para la síntesis de DNA y RNA 
Metotrexate 
 
Es un derivado del ácido fólico que inhibe la síntesis de nucleótidos al 
inhibir a las enzimas: dihidrofolato reductasa, timiditalo sintasa, 
minoimidazol caboxamida ribonucleótido transformilasa y amido 
fosforibosiltransferasa 
Aminopterina 
 
Es un derivado del ácido fólico que se une competitivamente a la 
dihidrofolato reductasa para bloquear la síntesis de tetrahidrofolato 
 
 
IV. Sistema del doble híbrido 
 Y2H (yeast two hybrid) es una técnica que sirve para conocer la interacción 
entre dos proteínas a través de la transcripción de un gen reportero; se llama 
sistema del doble híbrido porque solo al interaccionar las dos proteínas (formar 
un híbrido de proteína) se transcribe el gen. Esta técnica fue inicialmente 
desarrollada en 1989 y actualmente es muy útil para generar datos en el área de 
interactómica y proteómica. 
 Su principio está basado en la estructura de los factores de transcripción, 
quienes necesitan de dos regiones para ser funcionales: un dominio de unión al 
DNA y otro dominio de activación, por lo tanto se deben generar dos plásmidos 
por separado: 
-Uno que contenga la proteína de interés + dominio de activación + gen reportero 
-Otro que contenga otra proteína (que se cree que interacciona con la anterior) 
+ dominio de unión a DNA + gen reportero diferente. 
Ambos plásmidos deben ser transfectados en las mismas células (cultivada con 
su correspondiente presión de selección) para que se expresen las proteínas y 
se realice un análisis de actividad del gen reportero. Si este gen se expresa 
quiere decir que ambas proteínas están interactuando ya que se acercan los dos 
dominios necesarios para iniciar la transcripción, mientras que si no se observa 
alguna señal significará que no hay interacción entre las proteínas de interés 
(Vidal & Fields, 2014). 
Este método descrito se denomina Y2H forward, y existe una variante llamada 
Y2H reverse donde la presión selectiva no permite la interacción proteína- 
proteína. Esta variante es útil para aislar alelos mutantes donde una de las dos 
proteínas impide la interacción, o para detectar moléculas pequeñas que 
igualmente irrumpen la asociación (Gang Choi, Richardson, Lambourne, Hill E, 
& Vidal, 2018). 
 
Referencias 
Bacterial Transformation and Competent Cells–A Brief Introduction | Thermo 
Fisher Scientific - MX. (n.d.). Retrieved April 3, 2020, from 
https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/cloning/cloning-
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Calcium phosphate co‑ precipitation | Thermo Fisher Scientific - MX. (n.d.). 
Retrieved April 3, 2020, from 
https://www.thermofisher.com/mx/es/home/references/gibco-cell-culture-
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April 3, 2020, from 
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Electroporation | Thermo Fisher Scientific - MX. (n.d.). Retrieved April 3, 2020, 
from https://www.thermofisher.com/mx/es/home/references/gibco-cell-culture-
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Gang Choi, S., Richardson, A., Lambourne, L., Hill E, D., & Vidal, M. (2018). 
PROTEIN INTERACTOMICS BY TWO-HYBRID METHODS. Methods Mol 
Biol, 1794, 1–14. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7871-7 
Herráez, Á. (n.d.). Texto ilustrado e interactivo de biología molecular e ingeniería 
genética (2a ed.). Elsevier. 
How Cationic Lipid Mediated Transfection Works | Thermo Fisher Scientific - MX. 
(n.d.). Retrieved April 3, 2020, from 
https://www.thermofisher.com/mx/es/home/references/gibco-cell-culture-
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Vidal, M., & Fields, S. (2014). The yeast two-hybrid assay: Still finding connections 
after 25 years. Nature Methods, 11(12), 1203–1206. 
https://doi.org/10.1038/nmeth.3182