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Med. Vet. Dr. JOSÉ LUIS KONRAD Departamento de Producción Animal. Cátedra de Teriogenología Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional del Nordeste TRANSFERENCIA DE EMBRIONES Interés de su aplicación • Multiplicación de individuos de interés productivo y razas exóticas • Velocidad de cruzamientos • Intervalo generacional • Selección de las madres de toros PROGRAMA Organización y ejecución • Selección de donantes y receptoras • Elaboración del cronograma de trabajo • Sincronización de celos • Tratamiento superovulatorio • Detección de celos e IA • Colecta de embriones • Transferencia o congelación de embriones Selección de donantes y receptoras Selección de Donantes Anamnesis Revisación clínica Selección de Donantes • Ciclos estrales regulares y que hayan comenzado a temprana edad. • Dos o menos servicios por concepción en años anteriores. • Comportamiento individual superior en características de importancia económica. • Crías superiores a la media del rodeo. Especialmente comparado con sus hermanos/as (hijos del mismo toro). • Ningún problema al parto o irregularidades reproductivas. • Ningún defecto genético o de conformación detectable. • Entre 15 meses y 10 años de edad. Revisación Clínica Condición corporal Estado de los órganos genitales en general Estado de los ovarios en particular Prueba de enhebrado Selección de Receptoras Raza Categoría Condición corporal Empleo reiterado CATEGORÍA DE RECEPTORAS • Vaquillas - Mayor preñez que las vacas - Posibles problemas al parto - Competencia nutricional madre/feto • Vacas - Preñez ligeramente inferior a la vaq - Enfermedades infecciosas - Mejor aptitud materna (leche) Efecto de la condición corporal de la receptora sobre el porcentaje de preñez Condición corporal Receptoras transferidas n % de preñez 1 230 44a 2 460 53b 3 633 55b 4 175 47a a,b (p<0,05) Mapletoft y col., 1986 Porcentajes de preñez obtenidos luego de efectuar transferencias sucesivas. Autores Transferencias 1º 2da. 3ra. 4ta. Donaldson, 1985 58,8 52,6 56,4 50,2 Hasler y col., 1987 73 72 67 50 Liebrich, 1991• 56 46 37 - • Embriones PIV Requisitos en selección de RECEPTORAS - Sanitaria y nutricionalmente aptas - El tamaño de la receptora debe estar en función del embrión que gestará - Condiciones generales para gestar, parir y criar al ternero sin problemas - Constituyen una parte costosa del programa ya que tienen alto valor, mantenimiento caro y su estado de salud es crítico para el programa. DONANTES ¿Cuanto tiempo será mantenida en el programa de colecta? Hasta que el propietario decida retirarla o hasta que su producción de embriones no justifique nuevos tratamientos. En promedio, 7 tratamientos sin problemas RECEPTORAS - Deberán se manejadas junto a las donantes - No utilizar receptoras que no han quedado preñadas en dos oportunidades - Prever al menos 7 receptoras por donante - Manejo sanitario y nutricional similar al de las donantes - Evitar el estrés en particular el día de la transferencia PROGRAMA Organización y ejecución • Selección de donantes y receptoras • Elaboración del cronograma de trabajo • Sincronización de celos • Tratamiento superovulatorio • Detección de celos e IA • Colecta de embriones • Transferencia o congelación de embriones PRIMERA VISITA 1- SELECCIONAR DONANTES Y RECEPTORAS 2- REVISAR INSTALACIONES Y LUGAR DE TRABAJO 3- DETERMINAR EXPERIENCIA DEL PERSONAL 4- DEJAR CLARO TODO CON EL PROPIETARIO 5- ESTABLECER UN CRONOGRAMA DE TRABAJO 6- ELABORAR PLANILLA DE TRABAJO PROGRAMA Organización y ejecución • Selección de donantes y receptoras • Elaboración del cronograma de trabajo • Sincronización de celos • Tratamiento superovulatorio • Detección de celos e IA • Colecta de embriones • Transferencia o congelación de embriones Ciclo Estral de la Hembra Bovina Adulta Periodicidad del Ciclo (Poliéstrica Anual) Duración del Ciclo (17 - 23 días) Duración del Celo (6 - 18 hs) Intensidad del Celo (3 - 50 montas) Momento de Ovulación (24 - 30 hs) Sincronización de los celos de receptoras PROTOCOLO DE TRATAMIENTO CON PROSTAGLANDINA 2da. PGF 1ra. PGF Día 0 Días 11/14 Días 13/16 CELO PROTOCOLO DE TRATAMIENTO CON PROSTAGLANDINA 1ra. PGF Días 0 2 5 CELO EN AMBOS CASOS, BAJA SINCRONÍA Y MUCHAS TRATADAS NO PODRÁN SER UTILIZADAS Días 0 7 9 10 17 GnRH PGf2 GnRH CELO TE COMBINACIÓN GnRH- PGF SINCRONIZACIÓN CON PROSTAGLANDINAS 1- Una aplicación a un número alto de receptoras. Aproximadamente el 50% de las tratadas serán aptas para la transferencia. Dispersión de celos entre 2 y 7 días. 2- Doble aplicación a un número limitado. Entre el 70 y 90% de las tratadas será apta para la transferencia. Dispersión de celos entre 3 y 5 días 3- Combinación de GnRH y PGF con días de intervalo. Cerca del 90% de las tratadas serán aptas para la transferencia. Dispersión de celos entre 1 y 2 días SINCRONIZACIÓN CON PROGESTÁGENOS Hormonas utilizadas para corregirlo •Progesterona y progestágenos •Estradiol •Prostaglandina •ECG Gran sincronía de celo y ovulación CRONOGRAMA P4 + E2 P4 celo y ovul. APLICACIÓN EXTRACCIÓN E2 + PGF APLICACIÓN Día 0 Día 7 Día 9-10 Tratamiento Transferidas / Tratadas (%) Preñadas / Transferidas (%) Preñadas / Tratadas (%) PGF2 60,0 53,3 33,0 2 PGF2 28,9 44,5 12,9 Ovsynch 90,9 48,0 44,0 P4 ó progestágenos 85,0 57,6 48,7 Bó y col., 2004 RESULTADOS PROGRAMA Organización y ejecución • Selección de donantes y receptoras • Elaboración del cronograma de trabajo • Sincronización de celos • Tratamiento superovulatorio • Detección de celos e IA • Colecta de embriones • Transferencia o congelación de embriones Ondas Foliculares 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 16 14 12 10 8 6 4 F o ll ic u la r D ia m e te r( m m ) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Días después de la ovulación 1- Iniciado después de un celo natural o sincronizado con prostaglandinas ALTERNATIVAS 2- Iniciado en el curso de un tratamiento de inducción y/o sincronización del celo mediante control del desarrollo folicular PROGRAMA INICIADO DESPUÉS DE UN CELO NATURAL • Inicio del tratamiento: 8 a 12 días después de observado el celo natural o sincronizado • La detección del celo se lleva a cabo 3 veces al día (mañana, mediodía y tarde) • Cuando se trata de más de una hembra, se sincronizan los celos para iniciar el tratamiento a todas juntas SINCRONIZACIÓN DE CELOS DE LAS DONANTES • Por tratarse por lo general de hembras con actividad sexual cíclica, se procede a la sincronización de los celos mediante una doble aplicación de prostaglandinas. PGF 11-14 días PGF CELO Donantes Programa de superovulación después de un celo celo natural Días 21 1 Receptoras Día 10 2 7h FSH-p Día 0 1a. Dosis PGF 19h FSH-p 2a. Dosis PGF (celo natural sincronizado) Día 11 2 7h FSH-p 19h FSH-p Día 12 2 7h FSH-p 1 dosis PGF 2 19h FSH-p 1 dosis PGF 2 Día 13 2 7h FSH-p 19h FSH-p y detección de celo Día 14 1 detección de celo e IA Día 15 1 IA Recolección de embriones detección de celo TE o C • Ablación Folicular• GnRH • Progesterona y estradiol Control del desarrollo folicular Transvaginal ultrasound-guided follicle ablation Bergfelt et al., 1994 Ablación ~ 1,5 días Nueva onda Bergfelt et al., 1994 T a m a ñ o f o li cu la r Días Ablación folicular Programa iniciado en el curso de un tratamiento de inducción y sincronización 2- Evita tratamientos de sincronización de celos previo con prostaglandinas 3- El tratamiento puede ser iniciado independientemente del momento del ciclo en que se encuentra la hembra 4- Programas más cortos 1- Implica el uso de progestágenos Be 2 mg P4 50 mg Disp P4 Día 0 - Disp P4 GnRh Día 15 lavaje IATF 24 hs FSH en dosis decrecientes 4 5 8 6 7 9 PGF2a Control del desarrollo Folicular Dispositivos con Progesterona + Estradiol Progestágenos utilizados en Superovulación de Bovinos Implantes subcutáneos SMB o Crestar Dispositivos intravaginales PRID CIDR-B DIB TRIU-B CUE-MATE 17 estradiol Benzoato de estradiol Valerato de estradiol Cipionato de estradiol Dias pos tratamiento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 10 8 6 4 L H Progestágenos y estradiol-17 ~ 4.días nueva onda folicular Bo et al., 1994 D iá m e tr o F o li cu la r (m m ) Días Sincronización del desarrollo folicular F S H Programa de superovulación durante un tratamiento con progestágenos Colocación del dispositivo intravaginal o implante+ BE+P4 Día 4 7h FSH-p 19h FSH-p Día 5 7h FSH-p 19h FSH-p Día 6 7h FSH-p 1 dosis PGF 2, retiro de dispositivo o implante 19h FSH-p 1 dosis PGF 2 Día 7 7h FSH-p 19h FSH-p y detección de celo Día 8 detección de celo e IA Día 0 Día 9 IA Día 16 recolección de embriones. TE o Cong. FSH-p vida media corta Dosis total: hasta 400 unidades 8 dosis decrecientes cada 12 hs 1º día 40% 2º día 30% 3º día 20% 4º día 10% Vida media larga 1500 a 3000 UI En una sola aplicación Inconvenientes • Debido a la vida media larga es conveniente utilizar anti-PMSG al cuarto día • Como es de otra especie se crean anticuerpos y en los siguientes tratamientos decae la respuesta 400 mg de FSH-P1 diluidos en 20 ml de solución fisiológica Tratamiento con Folltropin-V® Día 1 08,00 hs: 2,5 ml 18,00 hs: 2,5 ml Día 2 08,00 hs: 2,5 ml 18,00 hs: 2,5 ml Día 3 08,00 hs: 2,5 ml 18,00 hs: 2,5 ml Día 4 08,00 hs: 2,5 ml 18,00 hs: 2,5 ml 500 UI de FSH y LH diluidas en 20 ml de solución fisiológica Tratamiento con Pluset® Día 1 08,00 hs: 3 ml 18,00 hs: 3 ml Día 2 08,00 hs: 2,5 ml 18,00 hs: 2,5 ml Día 3 08,00 hs: 2 ml 18,00 hs: 2 ml Día 4 08,00 hs: 1,5 ml 18,00 hs: 1,5 ml Día 5 08,00 hs: 1 ml 18,00 hs: 1 ml En síntesis, las dosis promedio son Dosis respuesta superovulatoria Dosis obtención de ovocitos y embriones • Retención de ovocitos en folículos luteinizados • Retención de ovocitos y embriones en oviducto • Disminución de captación de las fimbrias • Aumento de lavajes sin éxito en animales problema Relación FSH/LH Una cantidad excesiva de LH provoca: - tasa de ovulación - tasa de fertilización - número y porcentaje de embriones transferibles Tratamiento de Superovulación Día 0 CIDR-B + 5 mg E-17 + 100 mg P4 Día 4 am 4 ml Folltropin pm 4 ml Folltropin Día 5 am 3 ml Folltropin pm 3 ml Folltropin Día 6 am 2 ml Folltropin + PGF pm 2 ml Folltropin + Sacar CIDR-B + PGF Día 7 am 1 ml Folltropin pm 1 ml Folltropin (observar Celo) Día 8 am Celo + IA pm IA Día 9 am IA Día 16 Colección de embriones Tratamiento de Superovulación en Vacas de Carne Británicas Día 0 CIDR-B + 5 mg E-17 + 100 mg P4 Día 4 am 3,5 ml Folltropin pm 3,5 ml Folltropin Día 5 am 2,5 ml Folltropin pm 2,5 ml Folltropin Día 6 am 1,5 ml Folltropin + PGF pm 1,5 ml Folltropin + Sacar CIDR-B + PGF Día 7 am 0,5 ml Folltropin pm 0,5 ml Folltropin (ver Celo) Día 8 am Celo + IA pm IA Día 9 am IA Día 16 Colección de embriones Tratamiento de Superovulación en Brangus y Braford Día 0 CIDR-B + Día 4 am 2,0 ml Folltropin pm 2,0 ml Folltropin Día 5 am 1,5 ml Folltropin pm 1,5 ml Folltropin Día 6 am 1,0 ml Folltropin + PGF pm 1,0 ml Folltropin + Sacar CIDR-B + PGF Día 7 am 0,5 ml Folltropin pm 0,5 ml Folltropin +Celo Día 8 am Celo + IA pm IA Día 9 am IA Día 16 Colección de embriones 2,5 mg E-17 + 50 mg P4 PGF2 2 6 10 14 Dia 8 Dia 7 mm Dia 0 Dia 4 BE + P4 LH o GnRH P4 FSH Tratamiento de Superovulación Día 0 DISP P4 + Día 4 am 3,5 ml Folltropin pm 3,5 ml Folltropin Día 5 am 2,5 ml Folltropin pm 2,5 ml Folltropin Día 6 am 1,5 ml Folltropin + PGF pm 1,5 ml Folltropin + PGF Día 7 am 0,5 ml Folltropin + sacar disp. P4 pm 0,5 ml Folltropin Día 8 am GnRH pm IA Día 9 am IA Día 16 Colección de embriones 2,5 mg EB + 50 mg P4 Distribución de las ovulaciones evaluando la aplicación de GnRH (%). 0 10 20 30 40 50 60 70 56 64 72 80 88 96 104 hs. después de la 1er Pgf Control Gnrh IA GnRH: 95,5 % Control: 81,3 % P < 0,0001 12 y 24 hs de detectado el celo o de colocada la GnRh 1º I.A.: dos dosis de semen de buena calidad y fertilidad probada (una dosis en cada cuerno si es posible) 2º I.A.: una dosis I.A. normal (algunos recomiendan 2 dosis incluso una tercera I.A.) Característica general en la respuesta a un tratamiento superovulatorio (Donaldson, 1994) * 70% son colectadas y producen embriones transferibles * 30% no producen embriones transferibles: • 7% sin respuesta • 7% falta ovocitos y embriones • 17% sin embriones transferibles • 1% no se realizó el lavaje Performance de vacas Angus tratadas cada 40 días, durante 18 meses n 24 Tratamientos, (X), [rango] 332 (13,8) [11-16] Embriones totales, (X), [rango] 1812 (76) [26-162] Embriones / Tratamiento [rango] (5,5) [0-35] Hasler, 2000 Producción estimada (en base a 5,8 embriones transferibles por vaca) 365 días / 40 días = 9 colecciones por año 9 col. x 5,8 emb. transf. = 52,2 emb. por vaca por año 52 emb. x 60 % preñez = 31 preñeces por vaca por año Programación de Donantes PROGRAMA Organización y ejecución • Selección de donantes y receptoras • Elaboración del cronograma de trabajo • Sincronización de celos • Tratamiento superovulatorio • Detección de celos e IA • Colecta de embriones • Transferencia o congelación de embriones Colecta de embriones METODOS NO QUIRÚRGICOS Introducción del catéter a través del cuello del útero - Rígido (Modelo francés) - Semirrígido (Modelo de Rasbech) - Flexible (Sistema actual) CATÉTER RÍGIDO DE ORIGEN FRANCÉS (3 vías) DETALLE DEL CATÉTER RÍGIDO DE ORIGEN FRANCÉS DETALLE DEL CATÉTER RÍGIDO DE ORIGEN FRANCÉS CATÉTER FLEXIBLE TIPO FOLEY CON PUNTA METÁLICA DETALLE DE PUNTA METÁLICA DE LA SONDA TIPO FOLEY CATÉTER FLEXIBLE TIPO FOLEY Frascos de vidrio CATETERES SEGÚN EL TIPO DE CIRCUITO UTILIZADO 1- Cerrado con flujo continuo (francés, frasco colgante) 2- Cerrado con flujo discontinuo 3- Abierto con flujo discontinuo (jeringa) SISTEMA ABIERTO SISTEMA CERRADO Jeringa 60 ml Mejor control de la cantidad de liquido que se coloca y se extrae Posible contaminación El ayudante es el que ingresa el liquido Tubo en Y No hay contaminación ?? Menor control del liquido recuperado Mas practico un solo operador Es el mas usado. PREPARACIÓN DE LA DONANTE Y COLECTA AYUNODETERMINACIÓN DE LA RESPUESTA OVÁRICA APLICACIÓN DE TRANQUILIZANTE APLICACIÓN DE ANESTESIA EPIDURAL HIGIENE PERINEAL DILATADOR CERVICAL COLOCACIÓN DEL CATÉTER Y LAVADO DEL ÚTERO Medio de lavaje 500 ml por cuerno aprox. Medios comerciales • Dulbeco`s • Ringer lactato PBSS PBS Dulbecco Suero fetal bovino MANIPULACIÓN DEL MEDIO OBTENIDO Y BÚSQUEDA DE EMBRIONES Tipo Em-con Tipo Minitub Evaluar las receptoras • Separar las que tienen CL • Anotar en que ovario se encuentra el CL • Mejor si se marca el anca del lado del CL Embretar la donante • Tranquilizante • Sacar bosta y evaluar respuesta superovulatoria (CL en cada ovario) • Epidural baja sin sacar el brazo para que no se abalone el recto Lavar la zona peri-anal (cepillar bien) Introducir la sonda Foley con estilete Atravesar el cérvix Ingresar en uno de los cuernos lo mas craneal posible Retirar 5 cm aprox el estilete Empujar nuevamente Inflar el balón (con jeringa sin intermediario de goma) Comprobar que quedo bien sujeto Retirar el estilete Conectar tubo en Y Dejar pasar liquido al interior del útero hasta sentir la distención del mismo Masajear Abrir el clamp hacia el filtro o tubo colector Controlar volumen recolectado Una vez que pasaron unos 500 ml cambiar de cuerno Desinflar el balón Sacar la sonda y armar de nuevo Colocar ídem anterior pero en el otro cuerno y repetir el lavado. IMPORTANTE: el ayudante debe controlar que el filtro tenga siempre liquido Lupa con platina térmica Platina térmica de mesa BÚSQUEDA Y MANIPULACIÓN DE EMBRIONES Tubuladura Plástica y capilar Jeringa de insulina y unopette Capilares de vidrio Transferpetor Día 0 Celo Día 1 Ovulación Día 2 2 células Día 3 4 células Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 8 8 células 4 células 16 células Mórula Mc Bt B Be Bp Mc= Mórula compacta Bt= Blastocisto temprano B= Blastocisto Be= Blastocisto expandido Bp= Blastocisto protruido DESCENSO DE LOS EMBRIONES OVULO Y EMBRIONES Óvulos sin fertilizar Embriones de 8 células Mórula Compacta Bt Mc Ovulo sin fertilizar Mc Bt O sf Be IETS (SOCIEDAD INTERNACIONAL DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES CRITERIO Grado I, II, III, IV EXCELENTE BUENO REGULAR MALO (no transferible) Forma Simetría Apariencia Tonalidad Uniformidad Proporcionalidad Zona pelucida Usar pajuelas de 0,25 ml irradiadas Cargar PBSS 4cm Burbuja Embrión 1cm Burbuja PBSS 4cm Comprobar la presencia del embrión bajo la lupa Las burbujas son para que no se desplace el embrión hacia los extremos La primer columna cargada para que lo empuje fuera de la vaina. Colocar la pajuela unida al intermediario de la vaina Introducir la pajuela en el pistolete Desplazar la vaina hacia caudal Ajustarla con el anillo plástico Colocar dentro de la camisa sanitaria Dejar siempre en posición horizontal. Punta roma con los orificios laterales pajuela Pistolete Estilete Embretar la receptora Vaciar el recto Con el brazo adentro epidural baja Introducir pistolete con camisa sanitaria Al llegar a la entrada del cérvix el ayudante retira la camisa sanitaria Enhebrar Introducir en el cuerno ipsilateral al CL DEPOSITAR LO MAS CRANEAL POSIBLE LENTAMENTE. ESTADIO EMBRIONES TRANSFERIDOS Preñez Mt 586 359 61% Mc 1178 792 67% B 600 402 67% Be 139 99 71% total 2503 1652 66% Schneider y col. 1980
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