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Vea discusiones, estadísticas y perfiles de autor para esta publicación en:https://www.researchgate.net/publication/341709836 Estudio metataxonómico e histopatológico de la enteropatía epizoótica del conejo en México ArtículoenAnimales · Mayo 2020 DOI: 10.3390/ani10060936 CITAS LEE 5 408 5 autores, incluido: Xiao-Haitzi Puon Peláez Universidad Autónoma de Querétaro Neil R Mcewan Colegio Rural de Escocia 5PUBLICACIONES10CITAS 189PUBLICACIONES4,269CITAS VER EL PERFIL VER EL PERFIL Andrea Margarita Olvera Ramírez Universidad Autónoma de Querétaro 27PUBLICACIONES433CITAS VER EL PERFIL Algunos de los autores de esta publicación también están trabajando en estos proyectos relacionados: Enfermedades digestivas del conejoVer Proyecto microbioma ruminalVer Proyecto Todo el contenido que sigue a esta página fue subido porAndrea Margarita Olvera Ramírezel 28 de mayo de 2020. El usuario ha solicitado la mejora del archivo descargado. Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.com https://www.researchgate.net/publication/341709836_Metataxonomic_and_Histopathological_Study_of_Rabbit_Epizootic_Enteropathy_in_Mexico?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_2&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/publication/341709836_Metataxonomic_and_Histopathological_Study_of_Rabbit_Epizootic_Enteropathy_in_Mexico?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_3&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/project/Rabbit-digestive-diseases?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_9&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/project/Rumen-microbiome?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_9&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_1&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/profile/Xiao-Haitzi-Puon-Pelaez?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_4&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/profile/Xiao-Haitzi-Puon-Pelaez?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_5&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/institution/Autonomous_University_of_Queretaro?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_6&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/profile/Xiao-Haitzi-Puon-Pelaez?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_7&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/profile/Neil-Mcewan-2?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_4&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/profile/Neil-Mcewan-2?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_5&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/institution/Scotlands_Rural_College?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_6&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/profile/Neil-Mcewan-2?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_7&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/profile/Andrea-Olvera-Ramirez?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_4&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/profile/Andrea-Olvera-Ramirez?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_5&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/institution/Autonomous_University_of_Queretaro?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_6&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/profile/Andrea-Olvera-Ramirez?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_7&_esc=publicationCoverPdf https://www.researchgate.net/profile/Andrea-Olvera-Ramirez?enrichId=rgreq-cfd5b7dfabb084fe2a46b4278aed07dc-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzM0MTcwOTgzNjtBUzo4OTYxOTc1MDYxMTM1MzZAMTU5MDY4MTU0NDI2Mg%3D%3D&el=1_x_10&_esc=publicationCoverPdf https://www.onlinedoctranslator.com/es/?utm_source=onlinedoctranslator&utm_medium=pdf&utm_campaign=attribution Artículo Estudio metataxonómico e histopatológico de la enteropatía epizoótica del conejo en México Xiao‐Haitzi Daniel Puón‐Peláez1, Neil Ross McEwan2, José Guadalupe Gómez‐Soto3, Roberto Carlos Álvarez‐Martínez4y Andrea Margarita Olvera‐Ramírez5,* 1 Doctorado en Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro, Avenida de las Ciencias S/N Juriquilla, Delegación Santa Rosa Jáuregui, Santiago de Querétaro, Qro. CP 76230, México; xh.puon@gmail.com Facultad de Farmacia y Ciencias de la Vida, Universidad Robert Gordon, Garthdee Road, Aberdeen AB10 7GJ, Escocia, Reino Unido; n.mcewan@rgu.ac.uk Cuerpo Académico de Nutrición y Reproducción Animal, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro, Avenida de las Ciencias S/N Juriquilla, Delegación Santa Rosa Jáuregui, Santiago de Querétaro, Qro. CP 76230, México; jose.gomez@uaq.mx Licenciatura en Microbiología, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro, Av. Junípero Serra, antiguo aeropuerto, Campus Aeropuerto S/N. Santiago de Querétaro, Qro. CP 76140, México; roberto.alvarez@uaq.mx Cuerpo Académico Salud Animal y Microbiología Ambiental, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro, Avenida de las Ciencias S/N Juriquilla, Delegación Santa Rosa Jáuregui, Santiago de Querétaro CP 76230, México * Correspondencia: andrea.olvera@uaq.mx ; Tel.: +52‐442‐192‐1200 Ext. 5316 2 3 4 5 Recibido: 21 de abril de 2020; Aceptado: 24 de mayo de 2020; Publicado: 28 mayo 2020 Resumen sencillo:La enteropatía epizoótica del conejo (ERE) es un síndrome disbiótico de distribución mundial que afecta a los conejos jóvenes. En México, la ERE representa el 32% de las enteropatías que se presentan en las granjas cunícolas. La etiología de este síndrome aún no ha sido aclarada; sin embargo, se ha asociado con factores nutricionales, ambientales y microbianos. Se realizó un estudio metataxonómico e histopatológico de ERE para comparar las lesiones y la microbiota gastrointestinal de conejos sanos y ERE positivos. Los resultados revelaron una diferencia en la diversidad y abundancia de la microbiota gastrointestinal en conejos con ERE. el géneroClostridiumy la especie. Cloacibacillus porcorumyAkkermansia muciniphilaestuvieron asociados a la presentación de ERE. El análisis histopatológico mostró tamaños de criptas más pequeños en el colon de conejos ERE. Abstracto:La enteropatía epizoótica del conejo (ERE) afecta a los conejos jóvenes y representa el 32%de las enteropatías en las granjas cunícolas de México. La etiología de este síndrome aún no ha sido aclarada. Se realizó un estudio metataxonómico e histopatológico de ERE para comparar la microbiota gastrointestinal y las lesiones histopatológicas de conejos sanos y ERE positivos. El estudio metataxonómico se realizó con un Illumina MiSeq (MiSeq®system, Illumina, San Diego California, EE. UU.) plataforma de segmentación masiva, y se utilizó un Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2 (algoritmo DADA2) para obtener los índices de diversidad de Shannon y Simpson, así como la abundancia relativa de las comunidades identificadas. Para el estudio histopatológico se tiñeron con eosina y hematoxilina cortes en parafina de ciego, válvula ileocecal y colon. Se utilizó el software AxioVision 4.9 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Alemania) para medir las profundidades de las criptas. El análisis estadístico se realizó mediante análisis PERMANOVA para el estudio metataxonómico y ANOVA para el estudio histopatológico. El análisis histopatológico mostró tamaños más pequeños de criptas en el colon de conejos ERE. Se observaron diferencias en la diversidad y abundancia de la microbiota gastrointestinal entre los grupos analizados. el géneroClostridiumy la especie Cloacibacillus porcorumyAkkermansia muciniphilase asociaron con ERE.Los resultados obtenidos de este estudio pueden aportar información para el esclarecimiento futuro de la etiología y propuestas de tratamientos efectivos. animales2020,10, 936; doi:10.3390/ani10060936 www.mdpi.com/journal/animals animales2020,10, 936 2 de 15 Palabras clave:conejos; ANTES DE; etiología 1. Introducción La enteropatía epizoótica del conejo (ERE) es un síndrome digestivo que ha tenido un impacto negativo en la producción de conejos desde la década de 1990 [1,2]. La ERE puede afectar hasta al 95% de los animales en cualquier sistema de producción y puede alcanzar niveles de morbilidad de aproximadamente 90% y mortalidad de 80% [3]. Los conejos de entre 3 y 7 semanas son altamente susceptibles a la ERE y reducen su consumo diario de alimento durante aproximadamente 2 semanas, lo que provoca una disminución del crecimiento y ganancia diaria de peso [3,4]. En México, la ERE se observó por primera vez a fines de 2001 o principios de 2002, afectando diferentes centros de producción, pero principalmente en conejos de 5 a 7 semanas de edad [5]. Se ha reportado una incidencia de abundancia del 32% con ERE [6], presentando tasas de mortalidad muy variables que van del 30% al 70% [7]. La alimentación no especializada en sistemas semiintensivos en cunicultura aumenta el riesgo de desarrollar ERE en México. Además, el perfil microbiano del tracto digestivo de la coneja determina el perfil de su camada [8], es decir, si la madre tiene una disbiosis en su perfil microbiano, toda la camada se verá afectada. La ERE puede ser difícil de diagnosticar debido a la similitud de signos entre esta y otras enteropatías [9]. Durante los brotes de ERE, los conejos reducen la ingesta de comida y agua, y en casos extremos, dejan de comer y beber. Los conejos afectados pueden mostrar diarrea leve y mucosidad translúcida [7,10]. Sin embargo, los signos más comunes son distensión abdominal, dilatación generalizada del tracto gastrointestinal, parálisis cecal en algunos casos y presencia de mucosidad abundante [11]. Después de la necropsia, los animales pueden mostrar un estómago e intestino delgado distendidos con presencia de contenido gaseoso y acuoso. En el ciego hay moco translúcido y prominente [10,12,13]. La ERE se caracteriza por la ausencia de lesiones inflamatorias o congestivas; sin embargo, se ha descrito hiperplasia de células caliciformes en el intestino delgado [4,9,14]. Además, ciertas alteraciones químicas provocan cambios en el pH del íleon y el colon [10]. Hay una disminución en el pH del estómago, así como en parte del duodeno y la orina. Se cree que esta disminución del pH se debe a la falta de alimento en el estómago, mientras que el aumento del pH en el colon se debe a la disbiosis microbiana [4,15]. Los primeros estudios metataxonómicos sobre ERE reportaron cambios en las abundancias de ciertos microorganismos, tales como:Clostridiumspp.,Bacteroidesspp.,ruminococospp. [dieciséis],Akkermansia muciniphila, Bacteroides‐Prevotella,Clostridium coccoides,Bacteria metanobrevi[15],Bacteroides,Blautia, Dorea, Clostridia, y una serie de organismos no clasificados [17]. Estos estudios utilizaron la plataforma de pirosecuenciación 454 de segunda generación. Recientemente, Jin et al. [18] utilizó una plataforma de segunda generación Illumina, sistema MiSeq. Informaron un cambio en seis géneros (Bacteroides, Rikenella, Akkermansia, Escherichia, Lysinibacillus, yClostridium), lo que significa que se vieron afectados organismos de cinco familias (Bacteroidaceae, Verrucomicrobiaceae, Enterobacteriaceae, Planococcaceae y Clostridiaceae) y tres filos (Bacteroidetes, Verrucomicrobia y Firmicutes). También reportaron la presencia del filo Sinergetes, principalmente del géneroCloacibacillus porcorum, que está relacionado con el microbioma gastrointestinal en cerdos [19] y problemas orales (periodontitis) en bovinos [20]. En el presente trabajo se realizó un estudio histopatológico y análisis metataxonómico mediante secuenciación Illumina MiSeq de segunda generación [21] de la región V3-V4 del gen ribosomal 16s para obtener el perfil microbiano de conejos sanos y ERE de una granja intensiva de conejos. en Mexico. 2. Materiales y métodos El estudio fue aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de Querétaro (número 93FCN2016). El estudio se realizó en una granja comercial de producción de conejos de carne ubicada en los 19°45′ de latitud norte y 101°03′ de longitud oeste, a una altitud de 1900 m sobre el nivel del mar (Jaripeo, municipio Charo, Morelia Michoacán, México). Esta granja normalmente tiene 100 animales reproductores (80 hembras y 20 machos) y los animales para la producción de carne se alojan a una densidad típica de 7 animales por 0,54 m2. Normalmente, en total, normalmente hay 660 animales alojados en una habitación individual (100 reproductores y 560 animales2020,10, 936 3 de 15 para carne). Los animales fueron alimentados con una dieta comercial estándar (proteína bruta: 16 %, fibra bruta: 17 %) y tuvieron acceso a agua ad libitum..La dieta no contenía compuestos anticocódicos ni antibióticos. Todos los conejos fueron destetados a los 35 días de edad. Se eligieron seis conejos de 42 días con ERE (peso medio: 449,16 g); El diagnóstico de ERE se determinó en función de los signos clínicos, como diarrea, abdomen distendido, excreción de moco, impactación cecal, disminución de la ingesta de alimentos y bruxismo [7,11]. Además, se eligieron seis conejos sanos (peso medio de 483,5 g) del mismo grupo de alimentación y manejo. Los conejos seleccionados se colocaron en jaulas individuales (60 × 90 × 40 cm) en 2 grupos: sanos y ERE positivos. Los grupos fueron alojados en la zona de cuarentena de la misma finca en Morelia. La eutanasia se realizó el mismo día para todos los animales según la NOM-062-ZOO-1999 [22], mediante dislocación cervical por tracción mecánica y exanguinación yugular. El grupo sano fue sacrificado y muestreado primero en el área del sendero de la granja. Posteriormente se limpiaron y desinfectaron las instalaciones y materiales. El grupo ERE luego fue sacrificado usando el mismo protocolo. Inmediatamente después de la eutanasia, se hizo una incisión en el abdomen para exponer el estómago, el intestino delgado, el ciego y el intestino grueso. Se realizó una ligadura con hilo de cáñamo en la porción final del intestino delgado y otra en el final de la válvula ileo-ceco-cólica. Posteriormente se realizaron 2 ligaduras para el corte, una 0,5 cm antes de la ligadura del intestino delgado y otra 0,5 cm después de la ligadura de la válvulaileo-ceco-cólica, realizándose el corte entre ambas ligaduras. Para la obtención de tejido intestinal se realizó una ligadura al inicio de la válvula ileo-ceco-cólica, otra a los 10 cm de la ligadura del intestino delgado (comienzo del colon) y 3 cm más de la ligadura anterior. Se realizaron cortes para obtener el área en válvula íleo-ceco-cólica ligada y colon, los cuales se limpiaron con solución tamponada de fosfato (PBS) y luego se infiltraron con formalina tamponada con PBS al 10% (pH 7) y se sumergieron en frascos con la misma formalina. composición. En el caso del ciego, se realizó un corte longitudinal y se lavó con PBS, luego se fijó con alfileres sobre círculos de corcho de 2 cm de diámetro y se sumergió en frascos con formalina tamponada al 10% (pH 7). De esta forma, se obtuvieron muestras de ciego, íleon y colon para análisis histopatológico. Los frascos se almacenaron a temperatura ambiente y se trasladaron al Laboratorio de Nutrición Animal de la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de Querétaro (FCN, UAQ) para su posterior análisis. Además, todo el contenido del ciego se vertió en un tubo de plástico libre de RNasa y DNasa de 15 ml, seguido de la liberación de la ligadura del intestino delgado. Una vez llenado el tubo, este se congeló inmediatamente en un congelador a -20 °C para su almacenamiento y transporte al Laboratorio de Microbiología Veterinaria, FCN, UAQ, Para el análisis histopatológico, las muestras de tejido se lavaron con solución salina y se incluyeron en parafina, luego se cortaron secciones de 5 μm de cada muestra. La tinción se realizó mediante la técnica de hematoxilina y eosina. Los portaobjetos teñidos se analizaron mediante microscopía óptica (Vert. A1, CarlZeiss Microscopy, Gottingen, Alemania). La profundidad de la cripta se midió en las criptas cuando había una sección longitudinal completa, una vellosidad y su cripta asociada. La profundidad de la cripta se midió desde la unión cripta-vellosidad hasta la base utilizando el software AxioVision 4.9 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Alemania). En total, se midieron 10 criptas para cada muestra [23]. Para la comparación entre muestras se utilizó un diseño completamente al azar y una prueba de Tukey [24] con el software SAS 2008 (Statistical Analysis System, SAS Institute, Cary, North Carolina, EE. UU.). Para el análisis metataxonómico, el contenido cecal de cada muestra se liofilizó de la siguiente manera: se colocó 1,5 mL del contenido cecal de cada muestra en un tubo de 2 mL libre de DNasas y RNAsas. Los tubos se cubrieron con Parafilm y se hicieron algunos agujeros en el Parafilm con una aguja estéril. El tubo se colocó en un matraz (Fast‐Freeze™ Flasks, Labconco™, Kansas MO, EE. UU.). El matraz se enfrió durante 24 h a 0 °C. El matraz refrigerado se colocó en el liofilizador (FreeZone™ Freeze‐Dry Systems 4.5 L, Labconco™, Kansas MO, EE. UU.) durante 48 h de secado. La extracción de ADN de muestras cecales liofilizadas se realizó con un kit QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen, Venlo, Países Bajos) siguiendo las instrucciones del fabricante de la siguiente manera. La disrupción de las células se realizó utilizando 200 mg de perlas de sílice (0,1 mm) colocadas en un tubo de 2 ml libre de DNasas y RNAsas. Posteriormente, se agregaron 50 mg de muestra de cecal liofilizada y 1,4 mL de tampón de lisis de heces (ASL). Se homogeneizó con un vortex durante 1 min y la muestra se animales2020,10, 936 4 de 15 calentado durante 5 min a 95 °C, homogeneizado por vortex durante 15 s y centrifugado durante 1 min a 14 000 ×gramo. Luego, se transfirieron 1.2 mL de muestra a un tubo nuevo de 2 mL y se agregó 1 tableta InhibitEX. La homogeneización se realizó durante 1 min y se incubó a temperatura ambiente durante 1 min. La centrifugación se realizó durante 5 min a 14.000×gramo. El sobrenadante se colocó en un tubo nuevo de 1,5 mL junto con 15 μL de proteinasa K, 200 μL de sobrenadante y 200 μL de solución Lysis Buffer (AL), que se mezcló durante 15 s. Esto se incubó durante 10 min a 70 °C. Después de esto, se realizó la purificación y elución como se describe en las instrucciones del fabricante, y el ADN eluido se almacenó en − 20 °C. Se realizó una estandarización de la concentración de ADN de cada muestra para dar una concentración de 50 ng/μL, y la secuenciación del ADN del contenido cecal se realizó con la plataforma de secuenciación de ADN de segunda generación (MiSeq®system, Illumina, San Diego California, EE. UU.), donde se utilizó la región V3-V4 del gen 16S rRNA (Zymo Research Corp Irvine California EE. UU.). La secuenciación se realizó usando ADN genómico, es decir, sin una ronda previa de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) antes de la secuenciación. La secuenciación de MiSeq™ usó un kit de reactivos v3 con 600 ciclos y >10 % de adición de PhiX y química de 2 × 250 pb. El protocolo después de la secuenciación fue el siguiente: filtrado, identificación de secuencias únicas (desreplicación), construcción de tablas de unidades taxonómicas operativas, eliminación de secuencias quiméricas, asignación de identificación taxonómica y determinación de abundancia y diversidad. Las secuencias se procesaron filtrando las lecturas de baja calidad y recortando los adaptadores de secuenciación, lo que se determinó con la función de puntuación de calidad y la función de recorte y filtro del paquete DADA2, que también eliminó las secuencias quiméricas. Este corte se utilizó para lograr un máximo de 2 errores por lectura y un tamaño de 540 en lecturas hacia adelante y 150 en lecturas hacia atrás, dejando aproximadamente 480 pb de lecturas con el software Trimmomatic Bolger [25], y se realizó una inspección de la calidad de los datos. con FastQC (Babraham Bioinformatics, Babraham, Cambridge, UK), y posteriormente utilizando el software R Project para Computación Estadística siguiendo la guía de trabajo propuesta por Callahan et al. [21]. Se utilizaron los siguientes paquetes: Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2 (DADA2), DECIPHER (DECIPHER Project Manage, Cambrige, Reino Unido), Phyloseq Microbiome, Vegan, y Ggplot2 (paquetes R, Wellignton Nueva Zelanda). La asignación de taxonomía se realizó utilizando Uclust de Qiime v.1.9.1 (Quantitative Insights Into Microbial Ecology, Colorado, EE. UU.) y se comparó con la base de datos de investigación Zymo 16S diseñada y seleccionada internamente (Zymo Research California, EE. UU.). Los análisis de visualización de composición, diversidad alfa y diversidad beta se realizaron con Qiime v.1.9.1. Para la comparación de las secuencias identificadas por DADA2 se realizó una prueba PERMANOVA siguiendo la metodología descrita en el manual del paquete Vegan [26]. Se produjo una curva de rarefacción con el script rarefy: Rarefaction Species Richness in Vegan: Community Ecology Package [26]. En el caso del análisis de diversidad bacteriana, esta se evaluó calculando el índice de Shannon, el índice de Simpson, Las unidades taxonómicas operativas (OTU) y las tablas de abundancia se utilizaron para el cálculo del tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe). Se utilizó la información de los metadatos comparados (ERE vs. sano). Posteriormente se generaron los biomarcadores de cada clase y la visualización de las UTO representativas. 3. Resultados 3.1. Estudio Histopatológico Los hallazgos en la necropsia fueron consistentes en todos los conejos infectados con ERE. El estómago estaba lleno de líquido, sin presencia de alimentos y levemente isquémico. También presentaban acumulación de líquido, mucosidad y gas en intestino delgado y colon, provocando distensión intestinal y pérdida de visibilidad de las austras intestinales. El ciego tenía una acumulación de líquido y gas, así como alimento; en dos casos la comida estaba impactada y el líquido escaseaba. En el caso de conejos sanos no se observó cambio patológico (Figura 1A, B). animales2020,10, 936 5 de 15 Las secciones histológicasde conejos ERE fueron de menor tamaño que las criptas en la sección de colon (Figura 1C, D). En las secciones sanas no se reportó cambio en las criptas (Cuadro 1). No se observaron otros cambios histológicos en el epitelio. Figura 1.Estudio histopatológico de tractos digestivos de conejo. (A) Imagen de necropsia de un conejo sano; (B) Imagen de la necropsia de un conejo infectado con enteropatía epizoótica del conejo (ERE); (C) Sección de vellosidades del colon de un conejo sano; (D) Sección de vellosidades de un colon de conejo infectado con ERE. Para (C,D), las líneas rojas muestran la longitud de las criptas. Tabla 1.Profundidades medias de las criptas en tres regiones del intestino del conejo. Los valores mostrados son la media de 10 criptas de los 6 animales por tratamiento; ERE+ (infectados) versus ERE− (sanos). Profundidad de las criptas (μm) ERE+ ERE− SEMpagValor 199 136 173 Sitio Válvula ileo-ceco-cólica Ciego Colon 187 121 308 16,21 0,73 5,55 0,22 10,51 0,0004 3.2. Estudio metataxonómico 3.2.1. Abundancia bacteriana Las muestras de los conejos positivos para ERE produjeron más secuencias en relación con las de los animales sanos (Figura 2). Tras el análisis de la curva de rarefacción, se obtuvo una curva asintótica casi horizontal para casi todos los individuos (Figura 3). Esto indica que el número de especies (basado en el número de OTU) ya no aumentaba en relación con el número de amplicones secuenciados incluidos en la identificación de especies. Además, a nivel de animales individuales, hubo más UTO por conejo en animales sanos que en aquellos que habían tenido previamente la enfermedad. Los detalles completos de la abundancia respectiva de cada filo, clase, orden, familia y género se muestran en la Tabla complementaria S1. En los conejos positivos para ERE, los filos más abundantes fueron: Firmicutes, Bacteroides y Verrucomicrobia. Los filos menos abundantes detectados fueron Tenericutes, Cyanobacteria y Euryachaeota. En conejos sanos, los filos más abundantes fueron Firmicutes, Verrucomicrobia y Bacteroides, con Saccharibacteria, Cyanobacteria y Tenericutes como los filos detectables menos abundantes. El filo Synergistetes solo se observó en conejos con ERE. Además, había una serie de secuencias no identificadas (media de 3505 para el grupo positivo para ERE y animales2020,10, 936 6 de 15 media de 2366 para el grupo sin enfermedad) reportadas (Tabla 2). En cuanto a la abundancia relativa, en conejos con ERE obviamente había más Verrucomicrobia y Bacteroides, mientras que en animales sanos obviamente había más Firmicutes (Figura 4). Figura 2.Abundancia de géneros bacterianos en muestras cecales de conejos sanos y ERE. ERE+: Conejos positivos para enteropatía epizoótica. ERE−: Conejos sanos. Figura 3.Curva de rarefacción para análisis de secuencias. El eje vertical muestra el número de especies diferentes (Unidades taxonómicas operativas, OTU) que se esperaría encontrar después de muestrear el número de secuencias que se muestran en el eje horizontal. La curvatura hacia la horizontal indica animales2020,10, 936 7 de 15 el mayor esfuerzo de secuenciación requerido para observar nuevas especies. La curva se obtuvo con el script Rarefaction Species Richness del paquete Vegan en la plataforma Rstudio [27]. Figura 4.Abundancia relativa de géneros bacterianos en muestras cecales de conejos sanos y ERE. ERE+: Conejos positivos para enteropatía epizoótica. ERE−: Conejos sanos. Tabla 2.Abundancia media (n = 6 relativa al estado de salud) con error estándar y porcentaje de filos bacterianos del contenido cecal de conejos con y sin ERE. Cuando no se observó un filo, se denota con “‐“. Filo Actinobacteria Bacteroides cianobacterias Euryarchaeota Firmicutes No identificado proteobacteria sacaribacterias Sinergistetes Tenericutes Verrucomicrobia ERE+ 538 ± 108,5 7327 ± 2934,8 286 ± 88,3 400 ± 97,3 30320 ± 4856.3 3504 ± 1402,1 697 ± 225,8 683 ± 224,3 1287 ± 680,6 39 ± 18,3 6075 ± 1334,6 % 1.05 14,32 2300 ± 1020,4 0,56 0.78 59.26 6,85 2366 ± 260,9 1,36 521 ± 58,5 1,34 121 ± 95,3 2.52 0.08 11,87 2642 ± 1012,8 ERE− 312 ± 217,9 % 0.73 5.36 0.50 0.90 78.88 5.51 1.22 0.28 ‐ 0.46 6.16 pagValor 0.138 0.137 0.508 0.951 0.544 0.443 0.468 0.044 0.088 0.012 0.068 214 ± 58,1 387 ± 194,2 33848 ± 2811.8 ‐ 196 ± 47,3 Después del análisis estadístico, los conejos positivos para ERE mostraron una abundancia significativamente mayor de algunos microorganismos identificables. Estos dieron una indicación de los organismos que podrían usarse como biomarcadores. En concreto, estos fueron:Akkermansia(15,22% frente a 5,62%);Clostridium(3,56% frente a 0,61%); Bacteroides(2,67% frente a 0,92%);cloacibacillus(1,72% frente a 0%);Saccharimonas(1,27% frente a 0,22%); Sinergistas (0,71 % frente a 0 %); yerisipelatoclostridio(0,49% frente a 0,03%). En el caso de las arqueas,metanosfera (0,58% vs. 0,09%) fue el único género que aumentó significativamente. Además, tener la enfermedad ERE redujo significativamente la abundancia relativa de los géneros.subdoligránulo(3,64% frente a 7,49%) y animales2020,10, 936 8 de 15 Eisenbergiella(0,03% vs 1,27%) y las familias Ruminococcaceae (26,34% vs 34,12%) y Lachnospiraceae (8,14% vs 23,49%) (Figura 5). Figura 5.Biomarcadores identificados mediante la prueba del tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe) en conejos con ERE. (f): familia, (e): especie, (o): orden, (g): género. 3.2.2. Diversidad bacteriana La diversidad y riqueza de la microbiota de los conejos sanos fue mayor en todos los índices calculados en comparación con los conejos EEC positivos (Tabla 3). Tabla 3.Resumen de secuencias identificadas y comparación de índices de diversidad microbiana en contenidos cecales de conejo de animales con y sin ERE. ERE+: Conejos positivos para enteropatía epizoótica. ERE−: Conejos sanos. Secuencias e Índice. Número de secuencias Número de unidades taxonómicas operativas (OTU) Número de géneros identificados Índice de Shannon Índice de Simpson Índice inverso de Simpson índice de pescador Índice Chao1 ERE+ 115,534 317 76 6,24 (0,18) 0,95 (0,04) 30,12 (0,09) 66,20 (2,19) 304,98 (6,70) ERE− 99,863 279 81 6,54 (0,04) 0,97 (0,01) 43,54 (0,06) 81,40 (0,80) 275,86 (2,50) pag-Valor 0.001 0.001 0.001 0.001 0.002 3.2.3. Biomarcadores La prueba LEfSe reportó 11 biomarcadores en animales con enfermedad ERE; sin embargo, se informaron 6 biomarcadores en conejos sanos (Figuras 5 y 6). animales2020,10, 936 9 de 15 Figura 6.Biomarcadores identificados mediante el test LEfSe en conejos sanos. (f): familia, (e): especie, (o): orden, (g): género, (p): filo. 4. Discusión Las lesiones macroscópicas observadas fueron similares a las mencionadas previamente en varios estudios [4, 9, 11, 28], lo que nos da confianza de que aquellos que se suponía que eran ERE positivos al principio en realidad padecían ERE. Curiosamente, sin embargo, observamos atrofia de las criptas intestinales en este estudio. Esto podría estar asociado a dos aspectos provocados por el síndrome: (1) la ausencia de alimento en el colon por impactación del ciego, y (2) la proliferación de comunidades microbianas pertenecientes a la familia Clostridiaceae. En el caso de la proliferación microbiana que conduce a problemas digestivos, esto se ha documentado en pollos de engorde [29] y niños [30]. La impactación cecal promueve un ambiente para la proliferación de varias comunidades patógenas,ruminococospp. [31]. El número medio de secuencias obtenidas durante este análisis fue de alrededor de 14.500 para animales ERE+ y alrededor de 12.500 para animales ERE‐. Estos valores son ligeramente más bajos que algunos ejemplos de trabajos anteriores con conejos, por ejemplo, una media de alrededor de 37500 por muestra [32] y 48700 por muestra [33]. Sin embargo, todavía son más altos que trabajos similares publicados sobre otros sistemas de herbívoros, por ejemplo, alrededor de 5500 por vaca [34] y alrededorde 10,000 por venado [35]. Sin embargo, la curva de rarefacción mostró una buena cobertura y la depuración realizada por el algoritmo DADA2 refuerza la precisión de las OTU identificadas y reduce el error bioinformático [21]. La comparación de los perfiles metataxonómicos mostró una diferencia entre los grupos (pag<0,04), lo que apoyó la clasificación de esta enteropatía como disbiosis. Se ha informado que la disbiosis ERE afecta la microbiota de un conejo, porque aumenta la abundancia de los filos Bacteroidetes, Proteobacteria y Verrucomicrobia [15,17]. Sin embargo, disminuye la abundancia del filo Firmicutes [15,17,18]. Además, se ha reportado un efecto sobre la diversidad, principalmente sobre los géneros.ButyricimonasyAnaerotruncus [17]. En este estudio, se observó un aumento en la abundancia de los filos Bacteroidetes, Saccharibacteria, Tenericutes y Verrucomicrobia en animales infectados con ERE, pero disminuyó el filo Firmicutes. Sin embargo, debido a la variación dentro del grupo en los números, solo Saccharibacteria y Tenericutes mostraron resultados significativos (pag<0.05) aumenta, con Verrucomicrobia mostrando una tendencia hacia un aumento (pag=0,068). Además, el filo Synergistetes solo se encontró en conejos ERE. animales2020,10, 936 10 de 15 Sin embargo, el presente estudio no registró la presencia deEscherichia–Shigellao un cambio significativo en el filo Proteobacteria. Abecia et al. [17] ya informaron que el filo Synergistetes solo se ha visto en conejos con ERE; sin embargo, más recientemente se ha demostrado que también puede aparecer en conejos sanos [18]. Además, un estudio reciente no informó sobre el filo Synergistetes en conejos jóvenes [33]. En el caso de Escherichia–Shigella, este género no ha sido reportado en algunos animales con ERE [17,33]; sin embargo, otros estudios mostraron que el género puede estar presente en conejos sanos o ERE [15,18]. El trabajo aquí presentado muestra algunas diferencias en cuanto a las secuencias detectadas en relación con informes anteriores. A diferencia de muchas de las investigaciones anteriores sobre el microbioma de los animales infectados con ERE en relación con los animales sanos, no usamos una ronda de PCR antes de la etapa de secuenciación, sino que secuenciamos directamente del ADN genómico. Este enfoque se utilizó porque potencialmente ha habido diferencias entre los estudios en el perfil microbiano, lo que puede estar relacionado con el tipo de amplificación por PCR utilizada antes de realizar la secuenciación. Por ejemplo, se ha demostrado que una ronda previa de PCR puede presentar diferentes formas de sesgo en cuanto a las secuencias generadas. Los cebadores, que se describen como "universales", no siempre son tan universales como se describió por primera vez y es posible que no amplifiquen todos los objetivos previstos [36,37]. Además, aunque la PCR se considera un proceso fiable, no está libre de errores, por lo que los errores de amplificación pueden a su vez conducir a errores de secuenciación en el futuro [36,37]. Por esta razón, algunos documentos han sugerido que, si es posible, puede ser prudente prescindir de cualquier paso previo a la secuenciación, incluidas las rondas iniciales de PCR [38]. Además, en el caso de que la PCR se realice antes de la secuenciación, se ha demostrado que esto tiene un efecto distorsionador cuando se utilizan plataformas de segunda generación, lo que incluye afectar los cálculos de diversidad y abundancia relativa [39–41]. Por las razones expuestas anteriormente, decidimos que era apropiado considerar una ronda de PCR previa a la secuenciación como un requisito opcional. Al hacerlo, creemos que los datos actuales evitan problemas asociados con el sesgo de la PCR y, por lo tanto, deberían proporcionar un reflejo más preciso del ADN genómico disponible para el análisis en el punto de extracción del ADN. Dado el hecho de que logramos identificar secuencias de organismos no reportados previamente en el tracto digestivo del conejo, creemos que esta decisión ha sido reivindicada. Otros factores que podrían contribuir a las diferencias en relación con trabajos anteriores podrían incluir la dieta experimental, que puede contribuir a la estabilidad del filo Proteobacteria. En el presente estudio, la dieta no contenía ningún tipo de antibiótico, otro factor que se diferenciaba del trabajo de Abecia et al. [17], donde la dieta ofrecida contenía antibióticos (bacitracina y robenidina). Otras variables dietéticas entre experimentos también incluyen el nivel de fibra cruda (FC) y proteína cruda (CP), que se sabe que son factores importantes en términos de prevención o reducción del problema de ERE. El aumento en la abundancia y disminución en los índices de diversidad observados en este estudio corrobora lo reportado en algunos estudios previos [15,17]. El índice de Simpson difiere del informado por Jin et al. [18], quienes no detectaron una diferencia. Este índice no discrimina entre especies con poca población y la diversidad se confirma al observar otros índices de diversidad, en los que se pueden observar diferencias, como mostramos en este estudio. En este estudio, la abundancia relativa de organismos en aquellos con ERE fue mayor que en animales sanos, y el índice Chao1 fue de 304,98. Anteriormente, el índice ERE Chao1 se informó como 180,01 [17] y 191,4 [18]. Sin embargo, la abundancia relativa en conejos sanos fue similar a la de estudios anteriores [17,18]. Las diferencias en los valores obtenidos en este estudio pueden estar asociadas a la procedencia de los conejos y al tipo de alimentación ofrecida; los conejos se obtuvieron de granjas de producción y no se ofreció ningún tipo de antibiótico en la dieta a diferencia de Abecia et al. [17], que tenían antibióticos en la dieta, lo que puede tener un efecto sobre el perfil microbiano [8,42]. En el caso de Jin et al. [18], no se ofrecieron antibióticos, pero los conejos estaban libres de patógenos específicos y se mantuvieron en condiciones de laboratorio, lo que podría tener un fuerte efecto en el establecimiento de la colonización de microorganismos y puede afectar la diversidad y abundancia de la microbiota. lo que puede tener un efecto sobre el perfil microbiano [8,42]. En el caso de Jin et al. [18], no se ofrecieron antibióticos, pero los conejos estaban libres de patógenos específicos y se mantuvieron en condiciones de laboratorio, lo que podría tener un fuerte efecto en el establecimiento de la colonización de microorganismos y puede afectar la diversidad y abundancia de la microbiota. lo que puede tener un efecto sobre el perfil microbiano [8,42]. En el caso de Jin et al. [18], no se ofrecieron antibióticos, pero los conejos estaban libres de patógenos específicos y se mantuvieron en condiciones de laboratorio, lo que podría tener un fuerte efecto en el establecimiento de la colonización de microorganismos y puede afectar la diversidad y abundancia de la microbiota. Los miembros de los filos Verrucomicrobia (familia Verrucomicrobiaceae), Firmicutes (familias Clostridiaceae, Familia_XIII, Defluviitaleaceae, Peptostreptococcaceae, Erysipelotrichaceae, Lachnospiraceae) y Synergistetes (familia Synergistaceae) se asociaron con la presencia de animales2020,10, 936 11 de 15 Análisis ERE por LEfSe (Figura 5). Además, también se encontró que los siguientes organismos estaban asociados con ERE:Akkermancia muciniphila,Clostridiumspp., yCloacibacillus porcorum. El filo Firmicutes es el más abundante en la microbiota cecal de conejos sanos y representa entre el 65 % y el 75 % de la abundancia [43–45]. En el presente estudio, los Firmicutes fueron los organismos más abundantes en ambos grupos, aunque la abundancia relativa fue mayor en conejos sanos con un 78,88 %, en relación con aquellos con ERE con un 59,26 %, en consonancia con estudios previos [15,17,18]. Observamos la familia Lachnospiraceae tanto en conejos sanos como ERE, de acuerdo con los estudiosde Bäuerl et al. [15] y Abecia et al. [17], pero a diferencia de Jin et al. [18], quienes solo encontraron esta familia en conejos sanos. Clostridiumspp. se han relacionado con ERE, principalmenteC.perfringensyC. cuniculli[7,31,46,47]. Djukovic et al. [31] identificaron algunas cepas deC. cuniculliy propuso que en asociación con otros Clostridiumspp., estuvieron implicados en el desarrollo de ERE, aunque la inoculación con ellos no ha producido enteropatía. En este estudio, encontramos queClostridiumcomo género se asocia a la presentación de ERE. El filo Verrucomicrobia, aunque presente en animales sanos [43,44], se ha relacionado con la presencia de ERE cuando se ha incrementado entre un 6 % y un 9,5 % [15,18]. En el presente estudio, el phylum Verrucomicrobia tuvo un aumento del 9,6 % en animales infectados con ERE y una especie dentro del phylum se identificó como biomarcador de ERE:Akkermansia muciniphila. Akkermansia muciniphilase ha asociado previamente con ERE [15,17,18], y se sabe que degrada las mucinas y estimula la producción de mucina en el tracto gastrointestinal [48]. Por lo tanto, su presencia puede estar relacionada con el aumento de la producción de moco en el intestino delgado y la acumulación de moco en el ciego. Curiosamente, los estudios de disbiosis en humanos [49,50] mostraron que una baja presencia de esta bacteria se asocia con la presentación de colitis ulcerosa, síndrome del intestino irritable y obesidad. Además, se ha comprobado el papel que juega este microorganismo en la preservación de la barrera física del intestino al estimular la producción de mucinas [51–53]. Sin embargo, El filo Synesrgistetes es un habitante común del suelo, así como en sistemas anaeróbicos, como el tracto gastrointestinal de los cerdos [19,54]. Se ha asociado con ser un patógeno oportunista en cerdos [19] y un agente asociado con disbiosis oral en bovinos [20]. Normalmente, degradan la mucina y muestran resistencia a la vancomicina [20].Cloacibacillus porcorumpertenece al filo Synergistetes y puede fermentar aminoácidos y utiliza moco como fuente de carbono [55]. En el presente estudio,C. porcorumse identificó únicamente en conejos ERE. Jin et al. [18] también informóC. porcorumen conejos ERE pero lo encontró en menor porcentaje en conejos sanos. Algunos estudios no encontraron ningún miembro de este filo [5,17], mientras que otros [33,43,44] no lograron identificar este filo en la microbiota cecal de conejos sanos, y otros [56] lo informaron en las heces duras de conejos sanos. conejos sanos. La presencia del género puede estar asociada con la producción de moco.. Los estudios metataxonómicos pueden generar información que permita teorizar y probar ideas de tratamiento específicas para ERE. En este estudio, se identificaron algunas bacterias como posibles biomarcadores de ERE, que parecen estar fuertemente relacionadas con la enfermedad. Recientemente, Read et al. [33] demostraron que el desarrollo de la microbiota cecal comienza desde una edad temprana bajo diferentes condiciones de alimentación (lactancia y alimentos sólidos), y la duración del tiempo de lactancia tiene un efecto directamente proporcional con la salud cecal de los conejos. El manejo potencialmente deficiente durante la lactancia y el amamantamiento puede tener un alto impacto en la microbiota cecal y puede contribuir al desarrollo del síndrome ERE. Por lo tanto, es necesario realizar algunos experimentos de interacción y más estudios metataxonómicos para dilucidar la etiopatología de este síndrome y, posteriormente, proponer tratamientos alternativos. animales2020,10, 936 12 de 15 5. Conclusiones La enteropatía epizoótica del conejo es una disbiosis que presenta un tamaño principalmente menor de las criptas en el colon. Los daños por desequilibrio microbiano están relacionados con la proliferación de comunidades pertenecientes al phyla Verrucomicrobia; (Akkermansiamuciniphila), Firmicutes (Clostridiumspp.) y Synergestes (p. ej.,Cloacibacillus porcorum). Esta es la primera vez queCloacibacillus porcorumse ha informado que tiene una asociación con la enfermedad ERE. Materiales complementarios:Los siguientes están disponibles en línea en www.mdpi.com/xxx/s1, Table S1; título: Abundancia relativa de Phyla, Clases, Órdenes, Familias y Géneros en las muestras cecales y fecales. Los valores con un valor de abundancia inferior a 0,001 se indican como "bajos". Contribuciones de autor:Conceptualización AMO‐R.; metodología, X.‐HDP‐.P., JGG‐S., análisis bioinformático y estadístico, X.‐HDP‐.P., RCA‐M. recursos, AMO‐R., JGG‐S.; redacción—preparación del borrador original X.‐ HDP‐.P.; redacción—revisión y edición, AMO‐R., NRM Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito. Fondos:Esta investigación fue financiada por la Beca Universitaria número (Foper‐2018‐00212). Expresiones de gratitud:Agradecimiento a Laura Escobar‐Salazar, quien cedió instalaciones para hacer el experimento. Conflictos de interés: Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio; en la recopilación, análisis o interpretación de datos; en la redacción del manuscrito, o en la decisión de publicar los resultados. Los autores declaran no tener conflicto de intereses. Referencias 1. Licois, D.; Vautherot, JF; Couert, P.; Dambrine, G. 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