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1 CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS DEPÓSITOS LOCALIZADOS EN LA PARED DE LOS VASOS DEL HIPOCAMPO EN MATERIAL DE AUTOPSIA PARA OBTENER EL GRADO EN LA ESPECIALIDAD DE ANATOMÍA PATOLÓGICA PRESENTA SALAZAR MORALES MIGUEL FERNANDO DIRECTOR DE TESIS: DRA. MARÍA DEL ROCÍO ESTRADA HERNÁNDEZ JULIO DEL 2013 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 Este trabajo fue realizado en el Hospital General “Dr. Manuel Gea González” División de Anatomía Patológica del Curso de Especialidades Médicas de la Facultad de Medicina UNAM bajo la Dirección de la Dra. Sara Parraguirre Martínez 3 Este trabajo de Tesis con No. PROT-01-65-2013, presentado por el alumno Salazar Morales Miguel Fernando se presenta en forma con visto bueno por el Tutor principal de la Tesis Dra. María del Rocío Estrada Hernández, y la División de Investigación Clínica a cargo de la Dra. María de Lourdes Suárez Roa y con fecha del 23 de Julio del 2013 para su impresión final. Dra. María de Lourdes Suárez Roa Dra. María del Rocío Estrada Hernández División de Investigación Clínica Tutor principal 4 Hospltal G{~JleriJl Dr. l-..tanuel Gea Gonzálcz SALUD Comitt''í tic Innstig.l"lci6n y de t~~til'¡l cu Innsli¡::arióll ~I.:CRUARíA DE SAlUD "2013, Año de la Lealtad Institucional y Centenario del Ejército Mexicano". Julio 23 de 2013. Oficio No. CIEI/170/13. ORA. MARiA DEL Rocio ESTRADA HERNÁNDEZ. INVESTIGADOR RESPONSABLE PRESENTE. Comunicamos a usted que el protocolo, "Caracterización estructural de los depósitos localizados en la pared de los vasos del hipocampo en material de autopsia" fue presentado en la Décima Segunda Sesión Ordinaria de los Comités de Investigación y de Ética en Investigación, llevada a cabo el dia 3 de julio de este año, y los integrantes de las mismas consideran que los documentos entregados el dia 22 de julio con los cambios solicitados, cumplen con lo requerido y le otorgan el dictamen Aprobado El registro de este proyecto es el 01-65-2013. Le informamos que este fallo tiene vigencia hasta febrero de 2014. Si se requiriera ampliar el período, solicite la renovación anual con 45 días de anticipación a su fecha de vencimiento, por medio de una carta donde se expongan los motivos correspondientes. Al realizar este proyecto adquiere el compromiso ineludible de informar cada tres meses el avance del estudio a la División de Investigación Clinica por medio del formato establecido, disponible en la página electrónica del Hospital , de igual forma se debe incluir la información de las presentaciones a congresos o las publicaciones que se han generado. Le recordamos que cualquier cambio o actualización en los integrantes o procedimientos de este estudio deberá ser notificado por escrito a estos Comités. Sin otro particular por el momento, es grato enviarle un ~ cord.ial saludo. Calznda de TI[llp~J1 4sno. ('oL Secciól1 X V J. C. P. 14030. Deltgacióll Tlalp(lll. Méxic\l. D.F., Ttl. ('(,nmutado!" {55) 4000-30ÜO. cxt. 3365, w\,"w.hospitalgea.salud.gob.mx 5 Autorizaciones Dra. María Elisa Vega Memije Subdirección de Investigación Hospital General “Dr. Manuel Gea González” __________________________________- Dr. Octavio Sierra Martínez Director de enseñanza Hospital General “Dr. Manuel Gea González” ___________________________________ Dra. Sara Parraguirre Martínez Jefe de la División de Anatomía Patológica Hospital General “Dr. Manuel Gea González” ______________________________________ Dra. María del Rocío Estrada Hernández Médico Adscrito de la División de Anatomía Patológica Hospital General “Dr. Manuel Gea González” ______________________________________ 6 CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS DEPÓSITOS LOCALIZADOS EN LA PARED DE LOS VASOS DEL HIPOCAMPO EN MATERIAL DE AUTOPSIA Colaboradores: Nombre: Salazar Morales Miguel Fernando Firma: ______________________________________________ Nombre: María del Rocío Estrada Hernández Firma: ______________________________________________ 7 ÍNDICE Glosario .................................................................................................................................... 8 Relación de figuras y tablas ...................................................................................................... 9 Resumen ................................................................................................................................. 10 Abstract ................................................................................................................................... 11 1. Introducción ....................................................................................................................... 12 2. Antecedentes ....................................................................................................................... 15 3. Justificación ......................................................................................................................... 17 4. Objetivos ............................................................................................................................. 18 5.1. Objetivo General ...................................................................................................... 18 5.2. Objetivos Particulares .............................................................................................. 18 6. Material y Métodos ............................................................................................................. 19 6.1. Tipo de estudio ........................................................................................................ 19 6.2. Ubicación temporal y espacial ................................................................................. 19 6.3. Criterios de selección de la muestra ........................................................................ 19 6.4. Variables ................................................................................................................... 20 6.5. Tamaño de la muestra ............................................................................................. 20 6.6. Procedimiento .......................................................................................................... 21 6.7. Análisis estadístico .................................................................................................... 22 6.8. Descripción operativa del estudio ........................................................................... 22 7. Resultados ........................................................................................................................... 23 8. Discusión............................................................................................................................ 27 9. Conclusiones ....................................................................................................................... 29 10. Bibliografía ........................................................................................................................ 30 11. Anexos .............................................................................................................................. 33 11.1. Anexo No. 1 (Hoja de Captura de datos) .............................................................. 33 8 GLOSARIO Hipocampo: Invaginación de la quinta circunvolución temporal constituida histológicamente por tres láminas (molecular, piramidal y polimórfica). De acuerdo a su citoarquitectura, conectividad sináptica y vulnerabilidad a la hipoxia es dividido en cuatro sectores: CA1, CA2, CA3 y CA4. Concreción: Acumulación de partículas en una masa compacta por depósito, precipitación o desecación. Mineralización: Acreción de compuestos minerales (fosfatos, carbonatos u oxalatos de calcio, magnesio, etc) debido a un proceso degenerativo o por un aumento en la concentración de los mismos en solución. Calcificación: Presencia de depósitos constituidos por precipitados de calcio. Ferruginización: Presencia de depósitos constituidos por precipitados de hierro. Siderocalcinosis: Presencia de depósitos constituidos por mezcla de calcio y hierro. Tinción: También llamada coloración, es una técnica auxiliar utilizada en histología para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Hematoxilina y eosina (HyE): Método de tinción ampliamente difundido en histología el cual emplea el colorante hematoxilina, que por ser catiónica tiñe estructuras ácidas en tonos azul ó púrpura (como por ejemplo los núcleos celulares) combinado con el uso de eosina que tiñe componentes básicos en tonos de color rosa gracias a su naturaleza aniónica (como el citoplasma). Ácido periódico de Schiff (PAS): Tinción que detecta polisacáridos o mucinas neutras presentes en el glucógeno, en las secreciones mucosas y membranas basales. Azul alciano (aa): Tinción que detecta hidratos de carbono asociados a grupos sulfato o carboxilos. Se utiliza para detectar glucosaminoglicanos, glucoproteínas sulfatadas o carboxiladas, compuestos muy comunes en algunas secreciones glandulares y en la matriz extracelular. Azul de Perls (azul de Prusia): Tinción empleada para la detección de hierro trivalente. von Kossa (vK): Método basado en reacciones de argirofilia para la detección de fosfato de calcio. https://es.wikipedia.org/wiki/Histolog%C3%ADa https://es.wikipedia.org/wiki/Azul https://es.wikipedia.org/wiki/P%C3%BArpura https://es.wikipedia.org/wiki/Rosa 9 RELACION DE FIGURAS Y TABLAS Figura 1. Gráfico de pastel para los hallazgos de reactividad histoquímica en los depósitos vasculares del hipocampo ...................................................................................... 23 Figura 2. Reactividad histoquímica en los depósitos vasculares del hipocampo (CA4). ... 24 Figura 3. Arreglo morfológico de los precipitados vasculares en la formación hipocámpica.. ................................................................................................................................. 25 Figura 4. Gráfica de barras con la distribución de acuerdo al sexo de la muestra poblacional con depósitos vasculares a nivel del hipocampo. .............................................. 26 Figura 5. Gráfica de barras con la distribución por grupos de edad de la muestra poblacional con depósitos vasculares a nivel del hipocampo. .............................................. 26 10 RESUMEN Se presenta un trabajo de tesis que describe la composición, de acuerdo a su reactividad histoquímica, de los depósitos murales observados a nivel del hilio del giro dentado en material de autopsia. Procedimiento. Se seleccionaron protocolos de autopsia de hombres y mujeres mayores de 20 años con enfermedades crónico degenerativas cuyo fallecimiento ocurrió durante el periodo 2004-2012 en el Hospital General “Dr. Manuel Gea González”; posteriormente se recuperaron las laminillas de aquellos con diagnóstico de calcificación de los vasos del hipocampo en la hoja de neuropatología, solicitando nuevos niveles HyE así como tinciones especiales (von Kossa, azul de Perls, PAS y azul alciano). Hallazgos. De 27 casos que cumplieron con los criterios de selección, 24 (89%) fueron positivos para PAS, 7 (26%) para azul de Perls, 5 (19%) para azul alciano, 3 (11%) para von Kossa y solamente 1 negativo para las cuatro tinciones. Del mismo modo se observaron las siguientes combinaciones: Perls/PAS/aa (2 casos), Perls/PAS (5 casos), vK/PAS (3 casos) y PAS/aa (1 caso). Conclusión. Pese a ser un fenómeno poco frecuente, la aparición de precipitados murales en los vasos de pequeño y mediano calibre del hipocampo parece corresponder a un proceso degenerativo de la lámina basal asociada al proceso de envejecimiento o con enfermedades crónico degenerativas que predisponen al desarrollo de lesión microangiopática. La demostración por PAS de un componente de matriz orgánica podría conllevar una función como factor de acreción primordial favoreciendo la adhesión y aglutinación progresiva hasta la formación de una concreción bien organizada. Palabras Clave: Formación hipocámpica, calcificaciones intracraneales, mineralización, histoquímica, esclerosis mesial. 11 ABSTRACT We present a thesis project describing the histochemical composition of the mural deposits identified at the apex of the dentate gyrus in autopsy material. Procedure. Autopsy files of men and women older than 20 years with chronic degenerative diseases who died during the interval 2004-2012 in Hospital General “Dr. Manuel Gea González” were selected. Hippocampal formation slides were retrieved from all those cases diagnosed as hippocampal vessels calcification in the neuropathology report, requesting for new H&E levels as well as special stains (von Kossa, Perls Prussian blue, PAS and alcian blue). Findings. From 27 cases selected, 24 (89%) were positive for PAS, 7(26%) for Perls Prussian blue, 5(19%) for alcian blue, 3(11%) for von Kossa and only 1 case negative for all-four stains. The next combinations were brought into view: Perls/PAS/aa (2 cases), Perls/PAS (5 cases), vK/PAS (3 cases) y PAS/aa (1 case). Conclusion. Although an unusual event, mural deposits in small and medium sized hippocampal vessels may represent an aging-related degenerative change in the basal lamella or an effect linked to chronic diseases that predispose to microvascular damage. PAS demonstration of an organic matrix component may indicate a role as a primal accretion factor promoting continuous agglutination until a well-organized concretion is established. Key Words: Hippocampal formation, intracranial calcifications, mineralization, histochemistry, mesial sclerosis. 12 INTRODUCCIÓN A fines del siglo XVI el anatomista Arantio encontró una estructura en el piso del cuerno temporal del ventrículo lateral, le asignó el nombre de hipocampo por su similitud con un caballo de mar. Un siglo más tarde se usó el término pes hippocampus y dos siglos después los anatomistas lo compararon con un cuerno de carnero o los cuernos de la antigua deidad egipcia Ammon 1 . La formación hipocámpica corresponde a una invaginación de la quinta circunvolución temporal constituida por tres regiones: hipocampo propiamente dicho, fascia dentada y subículo; los tres segmentos están conformados histológicamente por tres láminas o capas: molecular,piramidal y polimórfica 1-3 . En cortes coronales el cuerno de Ammon (comúnmente abreviado CA) se divide en cuatro sectores con base en la arquitectura citológica, en su conectividad sináptica y en la vulnerabilidad a la hipoxia: CA1, CA2, CA3 y CA4. La región CA1 (también conocida como sector de Sommer) es la zona más sensible al daño ocasionado por isquemia, convulsiones y enfermedad de Alzheimer; su exquisita sensibilidad a la hipoxia e hipoglucemia se torna evidente en procesos como la esclerosis mesial del hipocampo, una forma reactiva de proliferación astrocítica (gliosis) que sustituye la pérdida neuronal en este territorio 1,2 . La irrigación del hipocampo depende del flujo sanguíneo carotídeo y basilar. El tercio anterior del hipocampo se irriga por la arteria coroidea anterior (rama de la arteria carótida interna) en tanto que los dos tercios posteriores dependen de la arteria coroidea posterior (rama de la arteria cerebral posterior); ésta suele originarse de la arteria basilar en la mayoría de individuos, lo que se denomina origen adulto, y únicamente en un 10% de los casos proviene directamente de la arteria carótida interna, lo que se conoce como origen fetal 4 . Tanto los vasos sanguíneos cerebrales como del resto de la circulación sistémica sufren profundos cambios relacionados con la edad y otras enfermedades crónicas degenerativas como hipertensión, diabetes mellitus e insuficiencia renal, condiciones en que la microvasculatura experimenta engrosamiento de la membrana basal, fibrohialinosis en la capa media de músculo liso, disminución de la elasticidad y aumento de la tortuosidad. Los cambios que ocurren en la pared del vaso relacionados con el endurecimiento arterial son: depósito de calcio, aumento en la cantidad de fibras de colágena y en la fragmentación de elastina 5 . 13 Se denomina concreción a la acumulación de partículas en una masa compacta formada por un proceso de depósito, precipitación o desecación. En el área de la biología y disciplinas afines, una concreción se refiere a la acreción de compuestos minerales (fosfatos, carbonatos u oxalatos de calcio, magnesio, etc) debido a un proceso degenerativo o por un aumento en la concentración de los mismos en solución 6-8 . Dicho fenómeno también es conocido con el término mineralización 9 . Los depósitos minerales se reconocen con facilidad en los cortes histológicos teñidos con hematoxilina y eosina (HyE) ya que se tiñen de azul intenso; su composición, sin embargo, es incierta ya que pueden tener cantidades variables de iones metálicos (compuestos minerales) o de moléculas orgánicas (glucoproteínas) por lo que en éstos la histoquímica contribuye a determinar la composición del material en la pared de los vasos 10 . La mineralización se puede presentar como pequeños depósitos intensamente basófilos que demuestran positividad para tinciones de calcio (von Kossa) o de hierro (azul de Perls) 9 . La presencia de precipitados de hierro es referida como ferruginización, la de precipitados de calcio como calcificación, en tanto que la mezcla de ambos compuestos se denomina siderocalcinosis 9 . No obstante, el análisis químico de las concreciones minerales ha demostrado no sólo la presencia de calcio y hierro sino también de magnesio, cobre, zinc, manganeso, plomo y aluminio sin existir explicación para la acumulación de esta variedad de metales 11 . La mineralización del cerebro es común, especialmente a nivel de los núcleos basales (globo pálido, putamen y núcleo caudado), cápsula interna, porción lateral del tálamo, núcleo dentado, hipófisis y glándula pineal, mismos que muestran mineralización vascular en 1% a 2 % de la población general, siendo mayor su incidencia conforme a la edad y a la existencia de afección concomitante por enfermedades como diabetes mellitus, hipertensión arterial, alteraciones en el metabolismo del calcio, trastornos neurodegenerativos, encefalopatías mitocondriales, infecciones parasitarias y virales 9,12,13 . Los cambios en los vasos del hipocampo, tales como fibrosis y calcificación, constituyen una forma de patología vascular menos común con origen en los capilares de la capa molecular del giro dentado y extensión progresiva en dirección del sector hipocámpico de Sommer (CA1) 14 . Se desconoce su relación precisa con alguna patología en particular 2 , sin embargo, suele observarse con mayor frecuencia en padecimientos como la enfermedad de Alzheimer, en 14 alteraciones del metabolismo del calcio y fósforo o en asociación con el proceso normal de envejecimiento 14 . Aunque las calcificaciones cerebrales son un hallazgo relativamente frecuente en estudios de neuroimagen (0.3% a 0.6% de las tomografías practicadas en la población general), los estudios de autopsias revelan un porcentaje todavía mayor, encontrando que en determinadas zonas como el globo pálido o el núcleo dentado las calcificaciones microscópicas aparecen en el 40% a 70% de las ocasiones 9,13 . 15 ANTECEDENTES En el 2002 Wegiel y cols 14 examinaron 82 muestras histológicas de la formación hipocámpica en material de autopsia de personas con edades entre 33 a 83 años; de ellas, 34 personas padecían enfermedad de Alzheimer, 23 sujetos síndrome de Down y 25 individuos únicamente fueron tomados como controles. La finalidad del estudio fue comparar los hallazgos en las tres poblaciones, encontrando fibrosis y calcificación de los vasos del hipocampo en los siguientes porcentajes: 40% en los controles, 59% en la enfermedad de Alzheimer y 4% en síndrome de Down. Observaron también que este proceso inicia en los capilares de la capa molecular del giro dentado con expansión progresiva hacia la capa de células granulares y células polimórficas del giro dentado, así como al estrato molecular en el sector CA1 extendiéndose desde la cola al cuerpo y, en algunos casos, a la cabeza de la formación del hipocampo. La topografía de los vasos afectados y los patrones de la pérdida neuronal reflejaban la distribución de la arteria hipocámpica media y sus tributarias. Los autores concluyeron que la fibrosis y calcificación del hipocampo constituye una forma de patología vascular que se manifiesta con pérdida neuronal irregular en sujetos moderadamente afectados y como pérdida neuronal casi total en aquellos afectados gravemente. Dichas observaciones sugieren un vínculo causal entre la fibrosis y calcificación de los vasos del hipocampo y la esclerosis hipocámpica. En 1994, Yanai y cols 15 realizaron un estudio con 134 monos (Macaca fascicularis), entre 3 y 18 años de edad, cuyo objetivo fue describir la mineralización de los vasos cerebrales observada a través de microscopía óptica y electrónica. Se tomaron muestras de corteza cerebral, hipocampo, ganglios basales y tallo cerebral; se tiñeron con hematoxilina y eosina (HyE), ácido periódico de Schiff (PAS), azul alciano, von Kossa, rojo de alizarina, azul Berlín, Turnbull azul, rojo Congo, hematoxilina ácida fosfotúngstica (PTAH), Verhoeff-van Gieson e impregnación de plata de Watanabe. Se encontraron diversos grados de mineralización en 79 (59%) de 134 monos. Aunque se observó una ligera diferencia entre ambos sexos, in vivo no fueron detectadas anomalías en el crecimiento ni signos neurológicos. Las alteraciones histológicas encontradas fueron: depósitos basófilos intensamente positivos para PAS y von Kossa en las paredes vasculares del globo pálido, mismas que correspondían a dos tipos: cuerpos globosos con estructuras laminares 16 concéntricas alrededor de la pared arteriolar y venular (tipo A) y gránulos finos en las arterias comunicantes pequeñas y medianas arterias (tipo B). Por microscopía electrónica se encontraron depósitos densos en las paredes engrosadas de las arteriolas. En este estudio predominóla mineralización globosa (Tipo A). A nivel de las arteriolas del tálamo, éstas estructuras laminares concéntricas fueron PAS positivas sugiriendo la presencia de mucopolisacáridos, demostrándose por microscopía electrónica que la presencia de los mismos es secundaria a cambios degenerativos de la pared del vaso. De acuerdo a los hallazgos encontrados, los autores concluyeron que son similares a los descritos en seres humanos, ya que su incidencia y severidad son dependientes de la edad y su morfología e histoquímica son indistinguibles de las del humano. En el año 2012, Martínez y cols 16 , realizaron un estudio experimental cuya finalidad era describir la mineralización del cerebro en ocho caballos de diferentes razas, entre 15 y 32 años de edad, seis de ellos con historia neurológica (cuatro de etiología desconocida). El examen macroscópico de los cerebros en cuatro animales mostró focos de leucomalacia simétrica en el cerebelo, en tanto que histológicamente se encontró en los ocho caballos mineralización de moderada a grave en las vénulas, arteriolas, y capilares de los pedúnculos cerebelosos, sustancia blanca del cerebelo y núcleos del techo del cerebelo (dentado e interpósito). La túnica media de las arteriolas y vénulas afectadas presentaron grados variables de depósitos minerales los cuales se tiñeron positivamente en todos los casos con PAS, von Kossa y azul de Perls, confirmando la presencia de mucopolisacáridos, calcio, y sales de hierro respectivamente. La conclusión del estudio fue que la aparición de áreas de encefalomalacia era secundaria al proceso de siderocalcinosis, dado que el depósito gradual de sales a manera de capas concéntricas podría haber conducido a una oclusión vascular lenta con el consiguiente daño isquémico del parénquima (malacia) y mínima reacción inflamatoria. Del mismo modo, la localización, causa y patogénesis de la mineralización en los caballos son poco conocidas y muy similares a los observados en los ganglios basales de los seres humanos. 17 JUSTIFICACIÓN Todos los vasos de la circulación sistémica sufren cambios importantes relacionados con la edad y otras enfermedades crónicas degenerativas. En el cerebro son los capilares de la corteza cerebral y núcleos basales los que se afectan con mayor frecuencia, resultando en rigidez vascular progresiva debido al depósito de colágena y concreciones minerales. En relación a la composición estructural de estos depósitos, se ha encontrado que existe una gran cantidad de sales diferentes al calcio que afectan la pared y que pueden estar asociados o no a éste, razón por la cual varía el término empleado según el tipo de mineral encontrado. Por otro lado, existe no solamente precipitación de metales sino que además hay presencia de mucopolisacáridos, de los cuales se piensa que corresponden a cambios degenerativos de la pared vinculados con la edad del paciente y a enfermedades concomitantes. Sólo existe un estudio realizado en material de autopsia en humanos y enfocado a la región del hipocampo donde se compararon tres poblaciones: una sana, otra con síndrome de Down y otra con enfermedad de Alzheimer. Esta última población mostró fibrosis y calcificación de los vasos del hipocampo en casi un 60% seguida del grupo control (40%); no detalla, sin embargo, la composición de los depósitos observados. En este estudio se pretende saber cuáles son los cambios morfológicos que ocurren en la calcificación de los vasos del hipocampo, qué materiales están involucrados en la afección de la pared vascular (apoyados por tinciones de histoquímica), además de saber qué enfermedades están asociadas a dichos cambios y si la edad también juega un papel determinante. 18 OBJETIVOS 5.1. OBJETIVO GENERAL: Describir, mediante el empleo de histoquímica, la composición estructural de los depósitos encontrados en la pared de los vasos del hipocampo en material de autopsia de seres humanos en el Hospital General “Dr. Manuel Gea González”. 5.2. OBJETIVOS PARTICULARES: Marcar la positividad observada en los depósitos vasculares para las reacciones de histoquímica empleadas (von Kossa, Perls, PAS/azul alciano). -Organizar los casos en función de la reactividad mostrada por los depósitos. Identificar algunas variables secundarias que complementen la interpretación del objetivo principal: -Describir la morfología que adopta la precipitación (concéntrica, granular fina, concreciones aisladas) de los depósitos vasculares del hipocampo en cortes teñidos con HyE. -Registrar las edades de la población en que se observan los depósitos. -Registrar el sexo de los casos que demuestran presencia de depósitos. -Registrar los diagnósticos clínicos y/o anatomopatológicos (enfermedades crónico degenerativas) de los casos con presencia de depósitos. 19 MATERIAL Y METODOS 6.1. Tipo de Estudio Descriptivo, abierto, observacional. 6.2. Ubicación Temporal y Espacial Prolectivo transversal. 6.3. Criterios de Selección de la Muestra 6.31. Criterios de Inclusión Casos con protocolo de autopsia completo en pacientes mayores de 20 años de edad hombres o mujeres. Casos que tengan enfermedades crónico degenerativas como diagnóstico clínico o anatomopatológico final (principal, concomitante o independiente). Casos que tengan laminillas teñidas con hematoxilina y eosina y bloques de parafina con material suficiente (formación hipocámpica completa) para llevar a cabo los estudios de histoquímica. 6.33. Criterios de Exclusión Estudios de autopsia con historia clínica de trastorno demencial o neurodegenerativo. Estudios de autopsia que se hayan realizado con toma de tejido por aguja de corte. 6.34. Criterios de Eliminación Casos con que sufran pérdida de material durante el proceso de elaboración de histoquímica. Cortes histológicos de hipocampo que presenten lesión neoplásica Cortes histológicos de hipocampo que presenten hemorragia reciente o antigua Cortes histológicos de hipocampo con tejido multifragmentado que impida su estudio y análisis. Cortes histológicos de hipocampo que presenten desparafinización, que tengan aire, que estén rotas y que no cuenten además con bloques de parafina. 20 6.4. Variables 6.41. Variables Principales COMPOSICIÓN ESTRUCTURAL (Nominal Dicotómica) PRESENTE (+) AUSENTE (-) Von Kossa ( Fosfato de calcio) Azul de Perls (Hierro trivalente) PAS (polisacáridos y mucinas neutras) Azul alciano (glucosaminoglucanos y glucoproteínas sulfatadas o carboxiladas) 6.42. Variables Secundarias Morfología de la Precipitación Nominal (tipo A/ tipo B, tipo 1/tipo 2/tipo 3) Sexo (cualitativa) Nominal (Hombre/Mujer) Edad (cuantitativa) Cuantitativa Enfermedades crónico degenerativas asociadas (HTA, DM, IR, otras) Cualitativa Nominal, politómica 6.5. Tamaño de la Muestra Estudios de autopsia de pacientes que cumplan con los criterios de selección (27 de 479 casos). 6.6. Métodos de Laboratorio Histoquímica: También llamada tinción o coloración, es una técnica auxiliar utilizada en histología para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Ácido periódico de Schiff (PAS): Tinción que detecta polisacáridos o mucinas neutras presentes en el glucógeno, en las secreciones mucosas y membranas basales. Azul de Perls (azul de Prusia): Tinción empleada para la detección de hierro trivalente. Von Kossa: Método basado en reacciones de argirofilia para la detección de fosfato de calcio. Azul alciano: Tinción que detecta hidratos de carbono asociados a grupos sulfato o carboxilos. Se utiliza para detectar glucosaminoglicanos, glucoproteínas sulfatadas o carboxiladas, compuestos muy comunes en algunas secreciones glandulares y en la matriz extracelular. 21 6.6. Procedimiento1) Se buscarán en los registros de patología los números de autopsia de hombres y mujeres a partir de 20 años que fallecieron en el periodo del 01 de Enero del 2004 al 31 de Diciembre del 2012 en el Hospital General “Dr. Manuel Gea González” 2) Se revisarán los protocolos de autopsia identificando aquellos que tengan enfermedades crónico degenerativas ya sea como diagnóstico clínico, anatómico final principal, concomitante o independiente y se eliminarán aquellos que no cumplan con los criterios de inclusión y exclusión descritos anteriormente. El investigador principal será el responsable de incorporar la información de las variables secundarias en la hoja de captura de datos. 3) Guiándonos con la hoja de neuropatología del protocolo de autopsia, se revisarán los que tengan como diagnóstico neuropatológico “calcificación de los vasos del hipocampo”, posteriormente se verá en la relación de cortes de cerebro, cuál letra es la que corresponde a hipocampo, recuperándose la laminilla correspondiente. En caso de no encontrarse la laminilla se buscará el bloque de parafina de la misma y se solicitará un nivel en hematoxilina y eosina. De no encontrarse ninguno de los dos se descartará el estudio de autopsia. 4) Una vez obtenido lo anterior se revisarán las laminillas utilizando un microscopio óptico con los siguientes requerimientos: ocular 5x y objetivos 4x, 10x y 40x. Para verificar que la laminilla etiquetada como hipocampo corresponda, constatar la calcificación de los vasos y solicitar en el laboratorio de histología las tinciones de histoquímica necesarias para el estudio. 5) Con el material idóneo (hipocampo completo con calcificaciones y tinciones de histoquímica). Los investigadores principal y responsable se dividirán los casos por partes iguales para llenar las hojas de captura de datos, registrando los resultados de las variables principales. 6) Ambos investigadores se coordinarán para analizar la información y presentación de datos. Se empleará estadística descriptiva (medidas de tendencia central) para la simplificación y manejo de la información recolectada. Una vez obtenidas las medidas de tendencia central se presentarán los datos a modo de tablas y gráficos. 22 6.8. Análisis Estadístico Se utilizará estadística descriptiva para caracterizar a la población y para las variables de interés según la escala: medidas de tendencia central y dispersión: rango, media, mediana, moda, desviación estándar, proporciones o porcentajes. También se usarán tablas o gráficas (pastel, barras, histogramas, líneas, puntos). 6.9. Descripción Operativa del Estudio Las laminillas de los casos seleccionados se examinarán con un microscopio óptico de las especificaciones ya señaladas buscando depósitos vasculares en los sectores hipocámpicos CA1, CA2, CA3 y CA4. Se indicará su morfología según Yanai 15 (tipo A. cuerpos globoidales basófilos alrededor de arteriolas o vénulas y tipo B. gránulos basófilos finos en la media y adventicia de arterias de pequeño y mediano calibre) así como según Bottcher 18 (tipo 1. difuso en la capa media de vasos de pequeño y mediano calibre, tipo 2. concreciones esféricas lobuladas coalescentes y tipo 3. líneas de calcosferitas en capilares). Una vez se tengan a la mano los estudios especiales de histoquímica para cada caso (von Kossa, Perls, PAS, azul alciano) se explorarán las mismas áreas analizadas en los cortes en HyE buscando la positividad de los precipitados para dichas reacciones. Finalmente, se recuperarán las variables secundarias (edad, sexo y enfermedades crónico degenerativas concomitantes) a partir de los protocolos de autopsia previamente consultados. 23 7. RESULTADOS De los 479 casos acontecidos durante el periodo especificado (2004-2012), únicamente 27 casos cumplieron con los criterios de selección (5.6%) evidenciando depósitos en los capilares y vasos de mediano calibre a nivel del ápex (hilio) del giro dentado en transición con el sector hipocámpico CA4. De dichos 27 casos, 24 (89%) fueron positivos para PAS, 7 (26%) para azul de Perls, 5 (19%) para azul alciano y únicamente 3 (11%) para calcio de von Kossa con las siguientes combinaciones: Perls/PAS/aa=2 casos, Perls/PAS=5 casos, vK/PAS=3 casos, PAS/aa=1 caso y para ninguna de las tinciones en uno solo de los casos (Figuras 1 y 2). Figura 1. Gráfico de pastel para los hallazgos de reactividad histoquímica en los depósitos vasculares del hipocampo. **NOTA: Los 24 casos que en el gráfico se muestran reactivos para PAS incluyen aquellos con las combinaciones Perls/PAS/aa, Perls/PAS, vK/PAS y PAS/aa. A B 24 Figura 2. Reactividad histoquímica en los depósitos vasculares del hipocampo (CA4). A. Hematoxilina y eosina (HyE). B. Ácido Peryódico de Schiff (PAS). C.Azul Alciano. D. Azul de Perls. E. von Kossa. Nótese su aparición casi constante en los vasos apicales del giro dentado. Respecto a su configuración morfológica, catorce (52%) fueron tipo A/B y trece (48%) fueron tipo B de acuerdo a los criterios de Yanai, en tanto que ocho (30%) fueron tipo 1/2/3, cinco (19%) tipo 1/3, uno (3.7%) tipo 2/3, doce (44%) tipo 3 y uno (3.7%) tipo 1 según los criterios de Bottcher (Figura 3). C D E 25 Figura 3. Arreglo morfológico de los precipitados vasculares en la formación hipocámpica. A. Tipo 1 de Bottcher/Tipo B de Yanai. B. Tipo 2 de Bottcher/ Tipo A de Yanai C.Tipo 3 de Bottcher/Tipo B de Yanai. Obsérvese su equivalencia en ambas clasificaciones. En cuanto al sexo, diez fueron varones (37%) y 17 mujeres (63%) con una edad promedio para ambos grupos de 64 años abarcando un rango entre los 41 y 89 años de edad (Figuras 4 y 5). A B C 26 Figura 4. Gráfica de barras con la distribución de acuerdo al sexo de la muestra poblacional con depósitos vasculares a nivel del hipocampo. Figura 5. Gráfica de barras con la distribución por grupos de edad de la muestra poblacional con depósitos vasculares a nivel del hipocampo. Finalmente, las enfermedades crónico degenerativas más frecuentes fueron diabetes mellitus tipo 2 (100%) e hipertensión arterial sistémica (48%), además de cuatro casos de insuficiencia cardiaca congestiva, un caso con insuficiencia hepática, uno con hepatocarcinoma variante histológica tubular así como dos casos con meningioma fibroblástico. 27 8. DISCUSIÓN La mineralización subcortical suele ser un hallazgo incidental observado a través de estudios de imagen o durante el análisis póstumo que no en pocas ocasiones adolece de alguna interpretación significativa; más aún, la trascendencia de dicho cambio depende esencialmente del contexto clínico en el cual es descubierto. A pesar de que el fenómeno de calcinosis subcortical fue documentado por algunos autores antes de 1930 (Delacour en 1850, Virchow en 1854 y Bamberger en 1855)19-21, es a Theodor Fahr a quien se atribuye la primera descripción de “calcificación no aterosclerótica de los vasos cerebrales y ganglios de la base” en un hombre de 81 años con crisis epilépticas quien muy probablemente padecía hipoparatiroidismo22-24. Por algún motivo el primer sitio en mineralizarse con mayor frecuencia es el segmento interno del globo pálido (70% de las veces asociado a hipoparatiroidismo postquirúrgico20,25). El hallazgo de calcificaciones es común a nivel del pálido, hipocampo y núcleo dentado, particularmente en personas mayores de 60 años26,27, sin embargo, cuando se detecta en individuos con edad menor de 40 años invariablemente representa un cambio anómalo12,13. Laaparición de depósitos minerales obedece a circunstancias heterogéneas entre las cuales se pueden enlistar trastornos metabólicos (hipoparatiroidismo, pseudohipoparatiroidismo, hiperparatiroidismo, hipervitaminosis D), infecciosos (VIH, cisticercosis, toxoplasmosis, tuberculosis, sífilis, brucelosis) neoplásicos (astrocitomas, linfomas), autoimunes (lupus eritematoso sistémico), leucodistrofias, encefalomiopatías mitocondriales (síndrome de Kearns-Sayre/enfermedad neuromuscular oculocraneosomática), síndrome de Down, intoxicación por xenobióticos (monóxido de carbono, plomo, metotrexato), infartos, malformaciones vasculares, hipoxia neonatal, etc28-31. La patogénesis del proceso de mineralización no se halla dilucidada por completo, sin embargo, parece implicar una perturbación del equilibrio electrolítico fosfocálcico al igual que cambios gliovasculares con disfunción de la barrera hematoencefálica y precipitación de solutos plasmáticos28,32. A pesar de que las concreciones están constituidas en su mayor parte por fosfato de calcio amorfo (95%), se han detectado en ellas trazas de otros metales (e.g. cobre, magnesio, manganeso, aluminio, cobalto, arsénico, zinc, molibdeno, plata, plomo) mismos que se encuentran adheridos entre sí por una matriz conectiva de mucopolisacáridos ácidos11,12. Al respecto, llama la atención la falta de reactividad observada para la histoquímica de von Kossa en la mayoría de nuestros casos, sin embargo, ello únicamente indica la presencia de sales de fosfato o carbonato sin llegar a ser plenamente demostrativo de la 28 ausencia de calcio, mineral que se confirma con el empleo de otras tinciones como el rojo de Alizarina. Asimismo, los precipitados presentaban ferruginización en únicamente siete de los casos. De igual manera, la constante y marcada positividad exhibida por los depósitos vasculares para el ácido peryódico de Schiff es consistente con la hipótesis de Yanai et.al.15 propuesta en 1994 acerca de que constituye un cambio degenerativo temprano de la lámina basal. Por otra parte, más que la hipercalcemia crónica, la hiperfosfatemia per se induce el depósito heterotópico de calcio al fungir como una señal que activa la mineralización tisular a través de proteínas morfogenéticas del hueso (BMP-2 y BMP-4) propiciando la diferenciación osteoblástica33. Así, la mineralización puede producirse a partir del depósito de hidroxiapatita (fosfato de calcio cristalino) (Ca10(PO4)6(OH)2) e incluso en la forma de metaplasia ósea12,23. Muchos de nuestros casos contaban con diagnóstico clínico de diabetes mellitus tipo 2 o de hipertensión arterial sistémica, mostrando además cambios morfológicos por una u otra enfermedad (aterosclerosis aórtica, coronaria, cerebral, arteriolosclerosis hialina, calcificación de la túnica media de Möckenberg, angionefrosclerosis, pielonefritis crónica y nefropatía diabética). Ambas condiciones predisponen tanto a la degeneración de vasos de pequeño y mediano calibre como al deterioro del parénquima renal (con una consecutiva hiperfosfatemia), por lo que resulta plausible la aparición de precipitados vasculares en ambos contextos. Conviene hacer hincapié en que los depósitos vasculares pueden adoptar tres patrones histológicos distintos, de acuerdo con Bottcher et.al.18, que no se excluyen mutuamente entre sí11: difuso a nivel de la capa media de vasos de pequeño y mediano calibre (tipo 1), concreciones esféricas lobuladas coalescentes (tipo 2) y líneas de calcosferitas a lo largo de capilares (tipo 3). Dicha categorización se solapa con aquella propuesta en el estudio de Yanai et.al.15: cuerpos globoides basófilos alrededor de arteriolas o vénulas (tipo A) o gránulos basófilos finos en la media y adventicia de arterias de pequeño y mediano calibre (tipo B). En nuestro estudio pudimos verificar la existencia simultánea de varios patrones pudiendo constatar incluso un solapamiento y equivalencia entre ambas clasificaciones (con el tipo A de Yanai correspondiendo al tipo 2 de Bottcher y el tipo B de Yanai al tipo 3 de Bottcher (estadio temprano) o al tipo1 de Bottcher (estadio avanzado). La mineralización condiciona a la larga degeneración neuronal y gliosis por efecto de isquemia crónica con alteración de la fosforilación oxidativa y generación de especies reactivas de oxígeno –los iones cuproso (Cu+) y ferroso (Fe+2) son acarreadores electrónicos que catalizan la reacción de Fenton en dirección del radical hidroxilo 29 (OH∙)11,33–. La extensión del área afectada no siempre parece correlacionar con la expresión clínica, motivo por el cual no es posible establecer una relación directamente proporcional entre el grado de precipitación y la sintomatología. El sustrato anatómico de este amplio espectro clínico yace en la compleja red de relevos neuronales establecida en los núcleos y circuitos subcorticales22. Es indispensable insistir en que el pronóstico de la precipitación vascular subcortical es variable y difícil de predecir; la mayoría de las veces hay tendencia a la neurodegeneración con escasas opciones de tratamiento. Hasta ahora ninguna intervención ni agente farmacológico ha demostrado reducir la mineralización vascular21,22. 9. CONCLUSIONES A pesar de tratarse de un evento poco frecuente, la aparición de precipitados murales en los vasos de pequeño y mediano calibre a nivel cerebral parece corresponder a un proceso degenerativo de la lámina basal asociada al proceso de envejecimiento o con enfermedades crónico degenerativas que predisponen a la lesión microangiopática continua (e.g. diabetes mellitus e hipertensión arterial sistémica). Aunque la formación hipocámpica es una zona del lóbulo temporal raramente comprometida por el depósito de precipitados vasculares, la aparición de los mismos constituye un cambio morfológico vinculado a la esclerosis (gliosis) mesial. Si bien, no se observó una reacción de astrocitosis severa, ello no descarta su desarrollo como parte de la pérdida neuronal ocasionada en forma secundaria al daño vascular. Que tan rápidamente progresa hasta establecerse dicho proceso queda como una incógnita. Pese a no se haberse probado fehacientemente la existencia de un componente mineral en los precipitados murales, la presencia de los mismos no se puede excluir de manera categórica, empero, la demostración de un componente de matriz orgánica puede interpretarse como un factor de acreción primordial que favorece la adhesión y conglomeración progresiva del resto de los constituyentes hasta la formación de una concreción bien organizada. Así, el conocimiento de la composición de los depósitos murales en los vasos del hipocampo permiten explorar nuevas rutas fisiopatológicas a priori a la aparición de la concreción como a posteriori al establecimiento del daño vascular. 30 10. BIBLIOGRAFÍA 1) Afifi AK, Bergman RA. Sistema límbico. En: Afifi AK, Bergman RA. Neuroanatomía funcional: texto y atlas. 2da edición McGraw-Hill Interamericana 2006. Capítulo 21. pp 284-287. 2) Fuller GN, Burger PC. 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ANEXOS 11.1 HOJA DE CAPTURA DE DATOS MINERALIZACIÓN DE LOS VASOS DEL HIPOCAMPO Variables Secundarias TINCIONES No. Caso Sexo Edad Enfermedades Crónico Degenerativas Von Kossa PAS Azul de Perls Azul alciano Positivo (+) Negativo (-) Positivo (+) Negativo (-) Positivo (+) Negativo (-) Positivo (+) Negativo (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 … 34 MINERALIZACIÓN DE LOS VASOS DEL HIPOCAMPO Variables Secundarias No. Caso Sexo Edad Enfermedades Crónico Degenerativas Morfología de los Precipitados Clasificación Clasificación Yanai Bottcher 1 (A03- 04) H 54 DM2(a,pnc)/HAS A,B 1,2,3 2 (A07- 04) F 58 DM2(a,pnc) A,B 1,2,3 3 (A15- 04) H 62 DM2(a)/HAS A,B 1,2,3 4 (A35- 04) H 74 DM2 A,B 1,2,3 5 (A49- 04) H 64 DM2 A,B 3 6 (A03- 07) F 66 DM2(a-Möck)/Meningioma Fibroblástico A,B 1,3 7 (A13- 07) F 47 DM2(pnc)/HAS(nas) A,B 1,3 8 (A30- 07) H 52 DM2(a-Möck) A,B 3 9 (A34- 07) H 84 DM2(a,pnc)/HAS B 3 10 (A11- 08) F 38 DM2 B 3 11 (A12- 08) F 89 DM2 B 3 12 (A13- 08) F 89 DM2/HAS (IRC) A,B 3 13 (A22- 08) F 41 DM2(pcn)/HAS B 3 14 (A41- 08) F 56 DM2(pcn)/ICCG B 3 15 (A45- 08) F 69 DM2/ICC B 3 16 (A16- 09) H 58 DM2/HAS B 3 17 (A34- 09) F 69 DM2 B 1,3 18 (A38- 09) F 62 DM2(a,pnc)/HAS/IH/Meningioma Fibroso A,B 1,3 19 (A25- 10) F 78 DM2(a,pnc)/HAS/HepCaTub B 1 20 (A60- F 82 DM2(a,nd)/ICCI (IRC) A,B 1,2,3 35 10) 21 (A63- 10) H 62 DM2(a,nd)/HAS A,B 1,2,3 22 (A08- 11) F 61 DM2(a,nd)/ICCG A,B 1,2,3 23 (A13- 11) F 62 DM2(a)/HAS (IRC) B 1,3 24 (A20- 11) F 56 DM2(a,pnc)/HAS B 3 25 (A32- 11) F 73 DM2 A,B 1,2,3 26 (A63- 11) H 47 DM2(a,nd)/ICCG B 2,3 27 (A14- 11) H 64 DM2(a)/HAS/Tabq B 3 TINCIONES Von Kossa Azul de Perls PAS Azul alciano Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 36 X X X X X X X X X X X X X X Hombres 10 Mujeres 17 Promedio edad 63.5925926 30-39 1 40-49 3 50-59 6 60-69 10 70-79 3 80-89 4 Rango de edad 38 a 89 años Portada Índice Texto
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