Verificación_de_las_Características_Analíticas_de_Biosensores_PEPTIR_Para_la_Detección_y_Cuantificación_de_Escherichia_Coli_O157

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BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 1 
 
Verificación de las Características Analíticas de Biosensores PEPTIR Para la Detección y 
Cuantificación de Escherichia Coli O157:H7 en Aguas Naturales 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lozano Cadena Jhon Jairo 
 
 
 
 
 
 
Universidad de Santander 
Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias 
Microbiología Industrial 
Bucaramanga 
2022 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 2 
 
Verificación de las Características Analíticas de Biosensores PEPTIR Para la Detección y 
Cuantificación de Escherichia Coli O157:H7 en Aguas Naturales 
 
 
 
 
Lozano Cadena Jhon Jairo 
 
 
Trabajo de Grado para Optar el título de 
Microbiólogo Industrial 
 
 
Director 
Ropero Vega José Luis 
Químico, Ph. D en Química 
 
 
Codirector 
Valdivieso Quintero Wilfredo 
M. sc Ciencias Básicas Biomédicas 
 
 
 
Universidad de Santander 
Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias 
Programa de Microbiología Industrial 
Bucaramanga 
2022 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 3 
 
 
 
En cumplimiento de los requisitos exigidos según el acuerdo 010 de 2014 por medio 
del cual se reglamenta el Trabajo de Grado y expedido por el Consejo Académico, se 
llevó a cabo la evaluación del trabajo de grado titulado “Verificación de las 
características analíticas de biosensores PEPTIR para la detección y cuantificación de 
Escherichia coli O157:H7 en aguas naturales” desarrollado en la modalidad de 
Investigación por la estudiante: 
 
Código Primer apellido Segundo Apellido Nombre(s) 
01170331006 Lozano Cadena Jhon Jairo 
 
Este trabajo estuvo dirigido por el Ph.D. Jose Luis Ropero Vega, y codirigido por el M.Sc 
Wilfredo Valdivieso Quintero Y cumpliendo lo dispuesto por el Acuerdo 031 de 2014, el 
cual se modifica el Reglamento Académico y Estudiantil, y en particular lo referente 
al capítulo 5, artículos 80 y 85, parágrafo 1 referente al proceso de evaluaciones, 
calificaciones y aprobación de los cursos; el jurado evaluador estuvo conformado por 
la M.Sc Gina Patricia Parra Aparicio y el M.Sc Alvaro Andrés Amaya Vesga, los cuales 
emitieron la respectiva calificación para el trabajo de grado en mención, el cual recibe 
el concepto de Aprobado con una calificación de cuatro coma siete (4,7). 
 
En constancia firman 
 
 
 
 
MICROBIOLOGÍA 
INDUSTRIAL COMITÉ 
DE TRABAJO DE 
GRADO 
ACTAS SUSTENTACIÓN 
TRABAJO DE GRADO 
MIIFT001BUC 
 
Versión: 00 
No. de Acta: 0042022A Fecha: 21 de Julio de 2022 
Lugar: Aula Virtual Teams Hora Inicio: 2:00 
pm 
Hora Final: 3:00 
pm 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 4 
 
Dedicatoria 
Para mis papas que siempre me dieron su apoyo, me guiaron para tomar el mejor camino 
y me dieron su mejor educación. A mi hermano óscar que siempre estuvo conmigo en todo este 
proceso. A Laura mi novia por siempre creer en mí y aconsejarme. 
 A mi compañera Laura que hizo parte de estos 5 años de carrera y siempre me brindo su 
ayuda. 
 Al profesor José Luis Ropero y al profesor Wilfredo Valdivieso que me dieron su 
confianza desde el principio para ser parte de este proyecto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 5 
 
Agradecimientos 
Quiero agradecer a DIOS por permitirme vivir esta experiencia durante estos 5 años, 
guiándome y mostrándome el mejor camino. 
Quiero agradecer a mi director de tesis José Luis Ropero Vega, Ph. D y co-director 
Wilfredo Valdivieso por orientarme en la realización del proyecto, además por brindarme de su 
conocimiento para poder hacer las cosas de la mejor manera. También quiero agradecer a mis 
compañeras leidy Albiares y Yuly Galvis, que son estudiantes de maestría de la universidad de 
Santander que fueron una parte importante de mi aprendizaje en el laboratorio. De igual forma 
quiero agradecer a mi compañero Santiago Morales por ser parte en esta experiencia del 
laboratorio. 
En gran medida agradecer a mis papas y mi hermano por ser ese gran apoyo día a día, 
quienes me aconsejaron y estuvieron siempre a mi lado, dándome su gran cariño y afecto. Por 
ultimo quiero agradecer a mi novia Laura Cárdenas por brindarme su amor por apoyarme en 
cada momento de mi vida y por estar en los buenos y malos momentos durante estos 5 años. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 6 
 
Tabla de Contenido 
 
Capítulo 1 ...................................................................................................................................... 15 
Introducción .................................................................................................................................. 15 
Capítulo 2 ...................................................................................................................................... 20 
Objetivos ....................................................................................................................................... 20 
Objetivo General ........................................................................................................................... 20 
Objetivos Específicos.................................................................................................................... 20 
Capítulo 3 ...................................................................................................................................... 21 
Marco de Antecedentes ................................................................................................................. 21 
Contaminación Microbiana ........................................................................................................... 21 
Escherichia coli. ........................................................................................................................... 22 
Métodos de Detección................................................................................................................... 22 
Capítulo 4 ...................................................................................................................................... 30 
Marco Teórico ............................................................................................................................... 30 
Contaminación de Fuentes Hídricas ............................................................................................. 30 
Escherichia coli O157:H7 ............................................................................................................ 31 
Métodos de Detección. .................................................................................................................. 32 
Biosensores ................................................................................................................................... 37 
Capítulo 5 ...................................................................................................................................... 44 
Marco Legal .................................................................................................................................. 44 
Capítulo 6 ...................................................................................................................................... 47 
Metodología .................................................................................................................................. 47 
Materiales y Equipos Utilizados ...................................................................................................
47 
Componente Microbiológico ........................................................................................................ 48 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 7 
 
Componente Biológico ................................................................................................................. 48 
Método Electroquímico Técnicas ................................................................................................. 48 
Síntesis de Nanoparticulas de oro (AuNps) .................................................................................. 49 
Inmovilización del Péptido ........................................................................................................... 49 
Detección Electroquímica de Escherichia coli en Agua Natural .................................................. 50 
Filtración por Membrana .............................................................................................................. 52 
Capítulo 7 ...................................................................................................................................... 54 
Resultados y Discusión ................................................................................................................. 54 
Detección de Escherichia coli O157:H7 con Biosensores PEPTIR a Diferentes Concentraciones
....................................................................................................................................................... 54 
Repetibilidad ................................................................................................................................. 62 
Pruebas de Selectividad ................................................................................................................ 63 
Coeficiente de Correlación entre Biosensores y Técnica de Filtración por Membrana ............... 68 
Conclusiones ................................................................................................................................. 71 
Recomendaciones ......................................................................................................................... 73 
Referencias Bibliograficas ............................................................................................................ 74 
 
 
 
 
 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 8 
 
Lista de Figuras 
Figura 1 Identificación y Cuantificación Mediante la Amplificación de Genes de Virulencia 
Asociados a las Categorías Diarreogénicas de E. coli Mediante la Técnica de Reacción en 
Cadena de la Polimerasa PCR 24 
Figura 2 Análisis a Través de Electroforesis en gel de Agarosa 2% de los Productos 
Amplificados por PCR Para el gen eae de Escherichia coli (ECEP) 25 
Figura 3 Identificación (UFC) de E. coli a Través de la Técnica Filtración por Membrana 26 
Figura 4 Identificación (UFC) de E. coli a Través de la Técnica Filtración por Membrana 
(Mayo – agosto) 2013). 27 
Figura 5 Sistema de Detección. Estrategia Basada en Aptámeros con Alta Afinidad de 
Lipopolisacáridos de Escherichia coli O111 28 
Figura 6 Clasificación de Escherichia coli Según el Mecanismo de Infección 33 
Figura 7 Presentación Esquematizada de los Ciclos de una PCR 36 
Figura 8 Esquema de los Componentes de un Biosensor 37 
Figura 9 Variables que Afectan la Reacción de un Electrodo 40 
Figura 10 Gráficos de la Voltametría de Onda Cuadrada 42 
Figura 11 Voltamograma de una Voltametría Cíclica 43 
Figura 12 Características Microbiológicas 45 
Figura 13 Esquema de Circuito Equivalente (EC) 49 
Figura 14 Esquema Metodológico del Ajuste de Microorganismo Escherichia coli. 50 
Figura 15 Caracterización Electroquímica de los Biosensores Para la Detección de 
Escherichia coli. 52 
Figura 16 Diagrama de Nyquist Para la Detección de Escherichia coli 54 
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BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 9 
 
Figura 17 Voltamogramas de la Técnica Voltametría de Onda Cuadrada 56 
Figura 18 Curva de Calibración 58 
Figura 19 Rango Lineal del Biosensor 61 
Figura 20 Repetibilidad del Biosensor 62 
Figura 21 Diagrama de Nyquist Para Evaluación de la Selectividad. Espectroscopia de 
impedancia Electroquímica (EIS) 64 
Figura 22 Evaluación de la Selectividad 66 
Figura 23 Interacción Intimina - TIR 67 
Figura 24 Coeficiente de Correlación 68 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 10 
 
Lista de Apéndices 
Apéndice A. Filtración por Membrana de Escherichia coli 81 
Apéndice B. Promedios del Conteo de Filtración por Membrana 82 
Apéndice C. Siembra en Placa de Escherichia coli 83 
Apéndice D. Promedios del Conteo en Placa 84 
 
 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 11 
 
Resumen 
Título 
 Verificación de las Características Analíticas de Biosensores PEPTIR Para la Detección y 
Cuantificación de Escherichia coli O157:H7 en Aguas Naturales 
Autor 
 Lozano Cadena Jhon Jairo 
Palabras Clave 
 Biosensor, Contaminación, Escherichia coli, Péptidos, Verificación. 
Descripción 
Escherichia coli es un microorganismo patógeno de importancia a nivel de salud púbica. 
Actividades humanas como manejo indiscriminado de desechos, entre otros, ha conllevado a 
generar contaminación
de afluentes hídricos. El consumo del agua sin tratamiento previo ha 
llevado a que se generen enfermedades al ser humano. Por esta razón es importante el uso de 
técnicas que permitan la detección de Escherichia coli O157:H7 como la técnica de filtración por 
membrana y técnicas moleculares muy sensibles. Sin embargo, estas técnicas presentan 
desventajas. Por esta razón surge la necesidad de optar por sistemas más rápidos, fácil manejo y 
bajo costo. 
Para el presente trabajo se utilizó un biosensor electroquímico basado en péptidos 
PEPTIR 2.0 diseñado por el grupo CIBAS de la universidad de Santander, con capacidad de 
reconocer a Escherichia coli O157:H7 y se realizó la verificación con evidencia significativa 
para comprobar que este sistema si cumple con el objetivo por el cual fue diseñado por medio de 
técnicas electroquímicas. 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 12 
 
Para esta verificación se evaluaron características analíticas como Limites de detección y 
cuantificación, repetibilidad y selectividad, además esta respuesta electroquímica del biosensor 
fue comparada con una técnica validada como filtración por membrana. Se determinó que límites 
de detección y cuantificación fueron 20 y 66 UFC/mL, respectivamente, mostrando rango lineal 
entre las concentraciones 10, 30 y 50 UFC/mL. Además, se obtuvo buena repetibilidad. El 
comportamiento de este biosensor en términos de selectividad presento una inclinación marcada 
hacía Escherichia coli O157:H7 en presencia de microorganismos interferentes. La respuesta del 
biosensores fue comparada con la técnica de filtración por membrana, mostrando una buena 
correlación entre las dos, lo que resulta ser un método muy prometedor y permite concluir que es 
mucho más rápido, más fácil de manejar y su potencial uso lo convierten en una gran alternativa 
para ser integrados en la industria. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 13 
 
Abstract 
Title 
 Verification of the analytical characteristics of PEPTIR biosensors for the detection and 
quantification of Escherichia coli O157:H7 in natural waters. 
Author 
 Lozano Cadena Jhon Jairo 
Key Words 
 Biosensor, Contamination, Escherichia coli O157:H7, Peptides, Verification 
Description 
Escherichia coli is a pathogenic microorganism of public health importance. Human activities 
such as indiscriminate waste management, among others, have led to contamination of water 
tributaries. The consumption of water without prior treatment has led to the generation of 
diseases in humans. For this reason, it is important to use techniques that allow the detection of 
Escherichia coli O157:H7, such as the membrane filtration technique and highly sensitive 
molecular techniques. However, these techniques have drawbacks. For this reason, the need 
arises to opt for faster systems, easy handling and low cost. 
For the present work, an electrochemical biosensor based on PEPTIR 2.0 peptides was 
produced, designed by the CIBAS group of the University of Santander, with the capacity to 
recognize Escherichia coli O157:H7, and the verification was carried out with significant 
evidence to verify that this system complies with with the objective for which it was designed by 
means of electrochemical techniques.For this verification, analytical characteristics such as 
detection and quantification limits, repeatability and selectivity were evaluated, in addition this 
electrochemical response of the biosensor was compared with a validated technique such as 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 14 
 
membrane filtration. Limits of detection and quantification were 20 and 66 CFU/mL, 
respectively, showing a linear range between concentrations 10, 30 and 50 CFU/mL. In addition, 
good repeatability was obtained. The behavior of this biosensor in terms of selectivity shows a 
marked bias towards Escherichia coli O157:H7 in the presence of interfering microorganisms. 
The response of the biosensors was compared with the membrane filtration technique, showing a 
good connection between the two, which turns out to be a very promising method and allows us 
to conclude that it is much faster, easier to handle and its potential use is personalized in a great 
alternative to be integrated into the industry. 
 
 
 
 
 
 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 15 
 
Capítulo 1 
Introducción 
A medida que aumenta la población mundial, se agudiza la problemática de 
contaminación de los recursos hídricos a causa de algunas fuentes como son aguas residuales 
industriales y domésticas, también se evidencia contaminación por plantas de tratamiento, 
actividades agrícolas y ganadería no controladas y tanques de pozos sépticos, esto aumenta el 
número de componentes orgánicos que favorecen el crecimiento de microorganismos indeseables 
y contaminantes que hacen que el agua no sea potable y se transforme en peligroso vector de 
microorganismos causante de enfermedades (Gil, Soto, Usma, & Gutierrez, 2012). Un gran 
problema que se presenta al utilizar aguas residuales, es la presencia de coliformes fecales 
(Corrales Ramirez, Sanchez Leal, & Escucha Rodriguez, 2014), los coliformes fecales son un 
sub grupo de los coliformes totales, son fermentadores de lactosa a 37°C, aproximadamente el 
95% del grupo de los coliformes presentes en heces fecales, están formados por Escherichia coli 
(Red Iberoamericana de Potabilización y Depuración del Agua). 
Teniendo en cuenta esta problemática, se hace necesario el control de este tipo de aguas 
por medio de técnicas autorizadas como lo es la filtración por membrana, según el Instituto de 
Hidrología, Meteorología y Estudios Ambientales (IDEAM), esta técnica se basa en un 
mecanismo el cual atrapa microorganismos cuyo tamaño es mayor a 0,45µm, sin embargo, 
presenta ciertas desventajas en su realización como el tiempo de respuesta que en promedios es 
de 24 horas (Chiluisa Utreras, Coba, & Echeverria, 2014), los altos niveles de turbiedad pueden 
intervenir en los resultados y microorganismos acompañantes intervienen en el conteo (Iriarte, 
2014). Otro tipo de técnica más especializada es qPCR, ya que genera resultados cuantitativos en 
menor tiempo, y seguridad para el operario al evitar el uso de reactivos cancerígenos como el 
bromuro de etidio (Huerta Caro, Urbano Caceres, & Torres Caycedo, 2019). Actualmente en una 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 16 
 
de las técnicas más sensibles para detectar y cuantificar ácidos nucleicos (Tamay De Dios, 
Ibarra, & Velasquillo, 2013), pero la utilización de equipos sofisticados la hacen una técnica más 
costosa y difícil de optimizar (Chirinos Arias, 2015). 
Por esta razón, surge la necesidad de desarrollar sistemas mucho más rápidos, 
económicos y confiables, como son los biosensores electroquímicos para la detección rápida de 
E. coli. Por lo anterior, el uso de biosensores electroquímicos ha despertado el interés para ser 
usados en la detección de microorganismos. Son instrumentos que se destacan por su capacidad 
para absorber moléculas como ADN y péptidos (aptámeros), gracias a su superficie de 
nanopartículas de oro las cuales tienen propiedades superficiales y catalíticas únicas de este 
material, además la presencia de partículas a nivel manométricas hace posible la transferencia de 
carga directa entre el grupo redox y la superficie del electrodo (Agüï Chicharro, Yañez Sedeño, 
Gonzalez Cortes, & Mena, 2005). se basan en detectar el producto de una reacción química (o 
bioquímica) sobre la superficie de un material conductor.
En este caso, la señal detectada se 
traduce en una señal eléctrica para su 
investigación, por ser electroquímico, esta medida puede llevarse a cabo con volúmenes 
muy pequeños de muestra, los límites de detección que se pueden obtener son suficientes y 
adecuados para la detección del analíto de interés, su simplicidad de uso y bajo costo permiten 
una fácil disponibilidad de este instrumento (Reviejo & Pingarron, 2000). Al igual estos sistemas 
de biosensores tienen ciertas limitaciones en cuanto al uso a largo plazo de los polímeros, por 
otro lado, tiene limitaciones en la detección de analítos múltiples debido a la superposición de la 
emisión de señal. Investigadores del grupo CIBAS de la universidad de Santander, han 
desarrollado un biosensor electroquímico basado en aptámeros peptídicos con capacidad de 
detectar E. coli en matrices acuosas. Los aptámeros peptídicos están basados en secuencias de 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 17 
 
péptidos análogas a la proteína TIR, la cual es específica a la proteína de membrana de E. coli 
llamada Intimida. Límites de detección y cuantificación (2 y 6 UFC/ mL respectivamente) fueron 
determinadas de una forma preliminar y se realizaron por duplicado y triplicado, pero surge la 
necesidad de aportar evidencia significativa del cumplimiento para el uso y aplicación por el cual 
fue construido mediante la Verificación del método en muestras de aguas naturales (Ropero, 
Redondo, Galvis, Rondon, & Florez, 2021). Sin embargo, existen algunas características 
analíticas que se desean conocer tales como linealidad, especificidad, límite de detección, límite 
de cuantificación y sensibilidad de este biosensor y se hace necesario la debida verificación de 
este método para comprobar que su funcionamiento es el ideal para el objetivo por el cual fue 
construido. Por esta razón se debe comparar este biosensor en cuanto a su sensibilidad y 
especificidad de detección de E. coli frente a una de las técnicas convencionales como lo es 
filtración por membrana, con el fin de evaluar el potencial uso de los biosensores en aplicaciones 
biotecnológicas. 
El comportamiento de un biosensor normalmente es una gran alternativa de detección y 
se caracteriza experimentalmente evaluando su LOD, sensibilidad, selectividad, rango lineal y 
dinámico, reproducibilidad, tiempo de respuesta, estabilidad, portabilidad y facilidad de uso, su 
funcionamiento se basa en el reconocimiento de un agente biológico que es enviado al 
transductor, estos elementos están conectados en forma directa de manera que al unirse la 
molécula especifica o analíto, se producirá una señal química o física que luego será procesada 
para dar información cuantitativa. En los últimos años, los biosensores han venido teniendo gran 
acogida, ya que ofrecen ventajas en cuanto a miniaturización, automatización, reducción de los 
costos de análisis y facilidad para integrarlos dentro de sistemas de aguas y en procesos de 
manipulación de alimentos, todo esto hace que los biosensores presenten un carácter más 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 18 
 
sostenible que los métodos convencionales (Borraz Martinez, 2016). Según estudios realizados 
por (Wang, Zhao, & Bie, 2019), los biosensores electroquímicos demuestran una buena 
reproducibilidad y un amplio rango de respuesta lineal para detectar E. Coli. Estos biosensores 
permiten obtener resultados fiables en mucho menos tiempos que los métodos convencionales 
(Iglesias de la Arada, 2012). Este método de detección realmente muy novedoso por su 
desarrollo biotecnológico, características como el acoplamiento de la micro-nano-tecnología y su 
estrategia de inmovilización, resulta cada vez más potentes para resolver problemas analíticos 
(Campuzano, 2011). 
Por esta razón surge la necesidad de realizar la respectiva verificación de un biosensor, 
comparándolo en cuanto a la sensibilidad y especificidad con otras técnicas definidas 
previamente como estándares de validación (“Gold stándard”),según la Unión internacional de 
química pura aplicada (IUPAC, 2002), La verificación del método es, por tanto, un componente 
esencial de las medidas que un laboratorio debe implementar para permitirle producir datos 
analíticos fiables, el método está fundamentado básicamente en establecer y documentar ciertas 
características de acuerdo al rendimiento del método, y así demostrar si es adecuado para un 
proceso analítico en particular. Este proceso de verificación del método en este caso los 
biosensores, requieren de ciertos estudios para establecer su funcionalidad y de esta manera 
observar su desempeño y así saber si es adecuada o no, para integrarla en la industria. Dentro de 
la verificación hay algunas actividades a evaluar como las características analíticas de 
desempeño más habituales como límite de detección, repetibilidad y selectividad, que se hacen 
muy importantes por razones sustentables como por ejemplo el control de la calidad del agua. 
Los laboratorios que adopten los métodos deben o bien revalidarlos o bien verificarlos como 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 19 
 
proceda para garantizar su funcionamiento adecuado en su entorno habitual (Morillas & et al, 
2016). 
 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 20 
 
Capítulo 2 
Objetivos 
Objetivo General 
• Establecer las características analíticas de un biosensor electroquímico basado en 
péptidos PEPTIR para la detección de E. coli O157:H7 en agua natural. 
Objetivos Específicos 
• Realizar la calibración de biosensores PEPTIR utilizando muestras de agua natural para 
determinar límite de detección, límite de cuantificación y repetibilidad. 
• Evaluar la selectividad de biosensores PEPTIR hacia la detección de E. coli O157:H7 
en presencia de microorganismos interferentes. 
• Identificar el coeficiente de correlación de las técnicas filtración por membrana y de 
biosensores PEPTIR para la detección de Escherichia coli O157:H7 en aguas naturales. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 21 
 
Capítulo 3 
Marco de Antecedentes 
En los últimos años, se ha evidenciado en gran manera las diferentes aplicaciones que 
generan los sistemas de biosensores portátiles, ya que presentan facilidad a la hora de su uso. 
Además de esto, sus buenos resultados permiten la integración de biosensores en diferentes 
campos diagnósticos como son áreas de bioprocesos, ambiental, clínico, entre otros. Una de las 
funciones principales en el área de bioprocesos es la detección y cuantificación de 
microorganismos patógenos, como por ejemplo el grupo de los coliformes fecales que están 
relacionados con enfermedades transmitidas por alimentos y por consumo de aguas. 
En este capítulo se recopilará información sobre sistemas de detección de Escherichia 
coli, diseñados con aptámeros peptídicos siendo este el principal elemento de reconocimiento. 
Por esta razón se recopilaron trabajos de investigación científica, dando énfasis en el 
elelemento principal de reconocimiento es un aptamero peptídico donde el objetivo principal es 
la detección de Escherichia coli. Por esta razón cada uno de los trabajos que se referenciaron se 
buscó mejorar algunas características analísticas como una buena sensibilidad, bajos límites de 
detección, y reducir tiempo de respuesta dando resultados confiables. 
Contaminación Microbiana 
En el año 2015, Ashbol destaca que pueden existir alrededor o más de 500 
microorganismos que son patógenos que generan preocupación ya que son transmitidos por agua 
potable, que fueron identificados
por la agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos 
(EPA), existe un grupo de bacterias que representan un riesgo para la salud humana como las 
bacterias entéricas, el cual son indicativos de presencia de materia fecal (Ashbolt, 2015). 
Actualmente la Organización Mundial de la Salud (OMS), ha generado parámetros en los 
cuales recomienda que cuando hay presencia de microorganismos tales como Escherichia coli en 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 22 
 
aguas potables, este es un gran indicativo de presencia de materia fecal, cuando se hay presencia 
de dicho microorganismo y es consumido puede causar diferentes enfermedades asociadas con 
diarrea (Gruber, Ercumen, & Colford, 2014) 
Escherichia coli. 
Escherichia coli es un microorganismo de morfología Gram-negativo y pertenecen a los 
coliformes fecales que normalmente se encuentran en el intestino de seres humanos y también de 
animales. Estos microorganismos son tan pequeños que requieren del microscopio para poder ser 
observado, sin embargo, la forma en que crecen puede observarse como colonias en diferentes 
medios de cultivo (Agar). 
En la actualidad la mayoría de las bacterias E. coli no presentan riesgo para la salud 
humana, pero si dicho microorganismo ingresa a algún sitio equivocado puede causar diferentes 
enfermedades tales como diarrea, fiebre, náuseas y vomito (Rock & Rivera, 2014). 
Para este grupo de microorganismo existen diferentes tipos que reciben el nombre de 
cepas de Escherichia coli, que pueden causar múltiples enfermedades. Algunas cepas causales de 
enfermedades se pueden clasificar de la siguiente manera: Enterotoxigénico (ETEC), 
Enteropatógenos (EPEC), Enterohemorrágico (EHEC) y Enteroinvasivo (EIEC). 
Una de las cepas más importantes a nivel de salud pública es Escherichia coli O157:H7 
es una de las cepas más conocidas ya que es la causante de generar diarreas acompañadas de 
sangre y en algunos casos está implicada en daños asociados a riñones y el síndrome urémico 
hemolítico potencialmente fatal (Rock & Rivera, 2014). 
Métodos de Detección 
Métodos Convencionales. 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 23 
 
Medios de Cultivo. Actualmente existen diferentes técnicas que nos permiten la 
identificación de microorganismos como por ejemplo Escherichia coli. Unos de los métodos 
convencionales son los medios de cultivo los cuales constan de nutrientes que permiten el 
crecimiento, identificación y cuantificación de E. coli (Carrillo Zapata & Lozano Caicedo, 2008). 
Este método de identificación fenotípico (características de forma macroscópicas y 
microscópicas), se destaca principalmente por comparar este comportamiento de bacterias en 
diferentes medios de cultivo, esta identificación será confirmada de acuerdo a la cantidad de 
características similares del microorganismo a identificar (Fernadez Olmos, Garcia de la Fuente, 
Saez Nieto, & Valdezate Ramos, 2011). 
Pruebas Moleculares. Otro de los métodos convencionales que se destacan actualmente 
es la identificación molecular, dicho método ha surgido como una técnica más específica, lo cual 
se convierte en una alternativa de identificación más exacta. A medida que avanzan los años se 
da un gran avance de la tecnología y la biotecnología en cuanto a la utilización de técnicas de 
secuenciación genómica y la implementación de genes cuyo procedimiento de secuencia 
permiten la identificación más exacta de géneros y especies de bacterias (Fernadez Olmos, 
Garcia de la Fuente, Saez Nieto, & Valdezate Ramos, 2011). 
En la actualidad existe una técnica ampliamente descrita y una de las más utilizadas como 
lo es la Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR. Estudios realizados con esta técnica han 
arrojado resultados relevantes en la identificación y cuantificación de Escherichia coli asociada a 
infecciones enteropatogénicas. Martínez y colaboradores en el 2015, realizaron estudios 
utilizando PCR para la identificación de Escherichia coli presente en aguas, dando como 
resultado un aislamiento de dicho microorganismo dando un indicativo de que las aguas 
analizadas están siendo contaminadas con materia fecal. 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 24 
 
 
Nota. Patotipos diarrogénicos de E. coli, aislados e identificados en las muestras de aguas 
marinas de las playas peñón, culí, güirintal, quetepe y tocuchare, estado sucre, Venezuela. 
Tomado de Martínez, 2015. 
El patotipo que tuvo más frecuencia en la amplificación fue E. coli ECEP 
Enteropatógena), donde el proceso de electroforesis permitió evidenciar bandas aproximadas de 
482 pares de bases dando a entender que esta cepa contenían el gen eae. (Figura 2) (Martinez, 
Villalobos, & Castillo, 2015). 
 
 
 
 
Figura 1 
Identificación y Cuantificación Mediante la Amplificación de Genes de Virulencia Asociados a 
las Categorías Diarreogénicas de E. coli Mediante la Técnica de Reacción en Cadena de la 
Polimerasa PCR 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 25 
 
. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nota. Pozos de electroforesis: (1) marcador de peso molecular; (2) control positivo (E. coli cdc 
edl 933); (3) control negativo (E. coli ATCC 25922); (4-16) cepas positivas. Tomado de 
Martínez 2015 
La presencia de estos patógenos confirmados mediante la ampliación de genes asociados 
a la bacteria Escherichia coli mediante la técnica PCR dejan en evidencia que estos patógenos 
están siendo parte de la contaminación de aguas marinas lo cual genera un riesgo para los 
bañistas y turistas que por su contacto directo con el agua incluso cuando se ingiere por error 
representan un gran peligro de adquirir enfermedades entéricas (Martinez, Villalobos, & 
Castillo, 2015). 
Técnica de Filtración por Membrana. Uno de los métodos más utilizados para la 
identificación de Escherichia coli en aguas es la técnica de filtración por membrana, es una 
técnica altamente reproducible y genera resultados alrededor de las 24 hora. Por esta razón surge 
la necesidad de realizar un control sobre la calidad del agua para consumo humano y su 
potabilización reconociendo que por ciertas actividades industriales se está generando una 
contaminación gracias a coliformes fecales dentro de los cuales se encuentra Escherichia coli. 
Figura 2 
Análisis a Través de Electroforesis en gel de Agarosa 2% de los Productos Amplificados 
por PCR Para el gen eae de Escherichia coli (ECEP) 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 26 
 
Un estudio realizado en el 2016, destaco que en dos zonas como la Bahía de sechura las delicias 
y parachique encontraron presencia de Escherichia coli en aguas de dichas zonas. El estudio se 
basó en la toma de muestra (total de muestras 32) de dos puntos diferentes en cuanto a su 
profundidad en la zona de la toma, el cual ellos denominaron una toma superficie y la segunda 
toma la llamaron profundidad y la detección y cuantificación de dicho microorganismo se realizó 
a través de la técnica de filtración por membrana (Quijada Rojas, 2016). 
Se analizaron las 32 muestras del estudio y arrojaron que si hubo presencia de 
Escherichia coli, además de esto se evidencio que hubo una presencia alta de contaminación en 
las muestras tomadas en la profundidad como se observa en las figuras 3 y 4 (Quijada Rojas, 
2016). 
Nota. *UFC = cada colonia visualizada por cada 100ml de muestra procesada. Valores absolutos 
según normas del ISO 8199:2005 de Water quality. Tomado de Quijano 2016. 
Figura 3 
Identificación (UFC) de E. coli a Través de la Técnica Filtración por Membrana 
 
BIOSENSORES
PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 27 
 
 Nota.*UFC = colonia visualizada por cada 100ml de muestra procesada. Valores absolutos 
según ISO número 8199:2005 de Water quality. Tomado de Quijano 2016. 
 
Estos resultados permitieron destacar que estas aguas tienen presencia del 
 microorganismo Escherichia coli lo cual es un indicativo de contaminación fecal, además de 
esto la técnica de filtración por membrana permite realizar el monitoreo y control de calidad del 
agua con resultados fiables. 
Biosensores Electroquímicos. Un nuevo método en la actualidad son los biosensores, 
estos han desarrollado un gran interés debido a las diferentes problemáticas con respecto a las 
técnicas convencionales ya que estas tienen tiempos de respuesta prolongados y su utilización es 
más costosa. Un biosensor electroquímico se compone estrictamente de dos partes: el receptor o 
sistema de reconocimiento y un transductor. La primera parte es el receptor y está encargado de 
interaccionar con el analíto para generar un posterior cambio, el transductor reconoce ese cambio 
y genera una señal, esta señal es enviada a un transductor electroquímico, Esta señal se 
convertirá en una señal eléctrica para su posterior análisis de los datos en tiempo real (Royano 
Martinez, 2020). 
 
Figura 4 
Identificación (UFC) de E. coli a Través de la Técnica Filtración por Membrana (Mayo – agosto) 
2013). 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 28 
 
En la actualidad los biosensores electroquímicos han mostrado un buen comportamiento 
y funcionamiento rápido frente a la detección de patógenos que pueden afectar al ser humano por 
la ingesta de alimento y consumo de agua contaminada. Estos sistemas se han centrado en 
mejorar las diferentes técnicas enfocándose en el sistema biológico de reconocimiento, de igual 
forma mejorando las nanopartículas y el electrodo para generar un mejor paso de electrones 
siendo estos sistemas más eficaces (Xu, Wang, & Li, 2017). 
Según Luo y colaboradores en el 2012 trabajaron en el desarrollo de un biosensor 
electroquímico, con una buena especificidad y sensibilidad que se basan en la inmovilización de 
un aptamero que reconoce a la célula diana, para la detección de Escherichia coli O111. El 
aptamero o elemento biológico de reconocimiento se inmovilizo en una superficie de oro anclada 
al electrodo por medio de la unión de oro y el grupo tiol. la cual puede ser detectada 
electroquímicamente como se puede observar en la Figura 5. Esta investigación puedo 
determinar que el límite de detección fue de 111 UFC/mL, en solución salina y de 305 UFC/mL, 
en leche en un rango de horas entre 3 y 5 (Luo, 2012). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nota. En la figura se observa la detección de Escherichia coli O111 mediada por aptámeros con alta afinidad de 
lipopolisacáridos. Tomado de Luo. 2012. 
 
Figura 5 
Sistema de Detección. Estrategia Basada en Aptámeros con Alta Afinidad de Lipopolisacáridos 
de Escherichia coli O111 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 29 
 
En la actualidad son varios los experimentos que utilizan estos sistemas como alternativas 
por su facilidad de uso, buena miniaturización, bajo costo, y son sistemas muy sensibles. De 
acuerdo a esto existen múltiples investigaciones, pero en la actualidad no hay ninguna que se 
base en elementos de reconocimientos muy específicos a proteínas de membrana como lo 
destacan Ropero y colaboradores 2021. Este trabajo es uno de los pioneros en realizar reportes 
basados en diseños bioinformáticas los cuales se han inspirado en una proteína extra celular 
llamada Tir que a su vez es un receptor de proteínas de membrana de Escherichia coli llamada 
Intimina. Este biosensor se basó en la modificación del electrodo con nanoparticulas de oro. 
Los resultados encontrados en este estudio arrojan que límites de detección y 
cuantificación son de 2 y 6 UFC/mL respectivamente, además este biosensor presenta gran 
selectividad hacia Escherichia coli en presencia de otros microorganismos como Staphylococcus 
aureus y Pseudomonas aeruginosa. Esto lo convierte en un nuevo método sensible, de gran 
selectividad y de un tiempo de detección rápida de aproximadamente 30 minutos (Ropero, 
Redondo, Galvis, Rondon, & Florez, 2021). 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 30 
 
Capítulo 4 
Marco Teórico 
Contaminación de Fuentes Hídricas 
El agua es el líquido vital para los procesos biológicos de la naturaleza, por sus 
innumerables propiedades que la componen, el agua natural se puede encontrar en cualquier 
parte del planeta teniendo en cuenta que toda agua natural es aquella que el ser humano no le ha 
realizado ningún tipo de tratamiento o ha sido modificada, además de esto, el agua es utilizada 
para hacer parte de procesos en la agricultura entre un 70 % y 80%, la actividad industrial que se 
compone de un 20% y la actividad doméstica en un 6 %. Esto la convierte en el recurso más 
importante de todo el mundo, De allí viene la importancia de cuidar y preservar estas fuentes 
hídricas, para asegurar la calidad del agua y de esta manera generar aprovechamiento durante 
muchos años (Arcos pulido & et al, 2005). 
Gracias a las malas prácticas generadas por el hombre mediante actividades que están 
acelerando y contribuyendo a la contaminación del agua por proceso tales como la eutrofización, 
que genera alteración de la calidad del agua se han venido evidenciando que estos afluentes 
hídricos están siendo contaminados y además estructuras biológicas también se están viendo 
afectados por el aumento de componentes orgánicos e inorgánicos. Este proceso de eutrofización 
afecta las características normales del agua y conduce a la muerte de diferentes especies de 
animales. Esto ayuda al aumento y proliferación de microorganismos indeseables tales como 
bacterias que en ultimas representan un riesgo para la salud humana (Arcos pulido & et al, 2005). 
Una de las mayores preocupaciones que se está presentando en la actualidad es la 
contaminación fecal de aguas superficiales ya que estas sirven como una gran fuente de 
abastecimiento en países que están en procesos de desarrollo. Esta contaminación en gran parte 
se da por el mal manejo de vertimientos de desagües que no tienen un tratamiento previo de 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 31 
 
descontaminación, y generalmente esto ocurre con frecuencia en las grandes ciudades de todo el 
planeta (Arcos pulido & et al, 2005). 
Un gran indicador de contaminación fecal en aguas es la presencia de Escherichia coli, 
este microorganismo normalmente se encuentra en el tracto digestivo tanto de animales como del 
ser humano. Por esta razón este microorganismo es catalogado como un indicador universal de 
presencia fecal en aguas, la sola presencia de E. coli en agua es motivo de preocupación ya que si 
estas fuentes hídricas son consumidas pueden generar en el ser humano gastroenteritis incluso 
llegar a causar la muerte como es el caso de E. coli O157:H7 (IDEAM, 2007). 
Escherichia coli O157:H7 
Historia y Origen. Escherichia coli O157:H7 recibe ese nombre ya que posee 157 
antígenos somáticos (O), y el 7 es un antígeno flagelar (H). Este microorganismo en el año de 
1982 fue conocido como una bacteria patógena en humanos por estar relacionada en diferentes 
casos clínicos tales como colitis hemorrágica y síndrome hemolítico urémico posdiarreico. Esta 
bacteria representa gran importancia a nivel de salud pública y se hace necesario su control ya 
que es una de las primeras cepas reconocidas como enterohemorrágica y que en la actualidad ha 
estado involucrada
en aproximadamente el 90% de casos asociados a diarreas (Mead & Griffin, 
1998). 
Generalidades y Taxonomía. Escherichia coli de acuerdo con su morfología es un 
bacilo GRAM negativo, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, genero Escherichia, este 
microorganismo mide aproximadamente 2 µm de largo y 0,5 µm de diámetro reconociendo 
además que es un microorganismo anaerobio facultativo. Este presenta características de 
motilidad por sus flagelos perítricos. En su gran mayoría estas cepas pueden fermentar la lactosa 
catalasa positivo y oxidasa negativa. 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 32 
 
Patogenicidad. Los patógenos que provocan diarrea, tales como los enteropatógenos, 
emplean una serie de estrategias avanzadas que le permiten adentrarse en el ser humano para 
adherirse en el epitelio intestinal del huésped y así causar múltiples enfermedades que afectan su 
salud. Cuando el microorganismo llega a las células del colon altera el cito esqueleto de las 
mismas que se regula por la proteína de membrana intimina implicada en procesos de 
adherencia, situada allí empieza una producción de verotoxina lo cual empiezan a generan 
grandes daños inhibiendo la síntesis proteica y finalmente generando una necrosis hemorrágica 
en las vellosidades del intestino. 
 Las toxinas generadas por este microorganismo se transportan hacia el torrente 
sanguíneo provocando coagulaciones intravasculares afectando el sistema nervioso central. 
Diferentes cepas de E. coli, poseen diferentes mecanismos de infección y se pueden clasificar 
diferente como se observa en la figura 6. 
Cada ser humano adopta naturalmente mecanismos de acción frente a este tipo de 
microorganismo con el fin de mitigar la acción de Escherichia coli en el organismo. Como se 
conoce actualmente, una de las barreras contra estos patógenos es la acides estomacal, este 
proceso biológico juega un papel importante que hace más difícil el trabajo de infección de dicho 
microorganismo. Otra barrera muy importante es la aportada por el sistema inmune el cual se 
encarga de producir anticuerpos gracias al estímulo de antígenos específicos (Hidalgo & 
Ulcuango, 2019). 
Métodos de Detección. 
De manera diaria en los laboratorios se aplican técnicas y métodos convencionales para la 
identificación de Escherichia coli en aguas. Estos métodos ya se encuentran establecidos en los 
laboratorios, en especial en los de microbiología, tales métodos como fenotípicos que se basan en 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 33 
 
la observación y forma de crecimiento en medios de cultivo. Otros como la filtración por 
membrana que se basa en filtran cierto volumen de agua con equipos compuesto de una bomba 
de vacío y técnica molecular como la PCR y qPCR que se enfocan en la amplificación de genes 
específicos para cada microorganismo (Radeland, Krüger, & Luchessi, 2017). Sin embargo, estos 
métodos convencionales presentan ciertas limitaciones como altos costos y tiempos de respuesta 
prolongados. Por esta razón, surge la necesidad de optar por sistemas mucho más rápidos, 
sencillos de utilizar y su costo sea más bajo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nota. En la figura se presenta cada microorganismo con su abreviatura, mecanismo de acción y síntoma que causa al 
ser humano. Tomado de Ulcuango, 2019. 
 
Figura 6 
Clasificación de Escherichia coli Según el Mecanismo de Infección 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 34 
 
Filtración por Membrana. Esta técnica de filtración por membrana, consta de un 
mecanismo por el cual se atrapan en la parte superficial de una membrana bacterias como 
Escherichia coli, para su posterior análisis. El poro de este filtro de membrana consta de un 
diámetro de 0.45 µm. Consta de una bomba de vacío que genera una fuerza de presión ejercida 
sobre la muestra haciendo que se filtre. Ciertos microorganismos como virus que presentan un 
tamaño menor que el del poro pasaran sin ningún problema, pero microorganismos como 
Escherichia coli quedaran atrapadas en la superficie de esta membrana que serán llevadas a 
diferentes medios de características selectivas y diferenciales en el cual se dará su posterior 
crecimiento en Unidades Formadoras de Colonias (Carrillo Zapata & Lozano Caicedo, 2008). 
Este equipo contiene un soporte que contiene el filtro, este soporte está compuesto por un 
embudo que a su vez este contiene una pieza que funciona a presión para mantener el sistema 
estable. Este equipo de filtración por membrana debe asegurar que cuando pase el agua a través 
del filtro se mantenga rígido y así evitar cualquier daño mecánico (Carrillo Zapata & Lozano 
Caicedo, 2008). 
Para la identificación de coliformes totales y coliformes fecales dentro de los cuales se 
encuentra Escherichia coli, se utiliza medio de cultivo llamado Chromocult, que se compone de 
Salmon GAL – 6 cloro – 3 indol y βD galactopiranosido, es un componente cromogénico, y 
finalmente cuando hay la presencia de coliformes totales se tornara de color rojo salmón por la 
reacción del microorganismo con dichos componentes. Para la identificación de Escherichia coli 
y diferenciación de los coliformes totales se da por medio de X-Glucorósido, que también hace 
parte del medio cromogénico, este presentara una reacción con una enzima llamada 
glucoronidasa que a su vez reaccionaran con el sustrato llamado salmón-GAL que también hace 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 35 
 
parte del medio cromogénico, para generar en las colonias de Escherichia coli un color azul-
violeta y así poder ser diferenciado de coliformes totales (rojo salmón) (IDEAM, 2007). 
Métodos Moleculares. Estas técnicas moleculares se han desarrollado puntualmente para 
el estudio de todo tipo de ácido nucleico. La aplicación de estas técnicas se centra en identificar 
ADN de microorganismos que estén relacionado con la contaminación de productos alimenticios 
y de aguas, entre otros, por medio de técnicas ampliamente descritas como la PCR (Reacción en 
Cadena de la polimerasa) y qPCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real). Dichas 
técnicas son altamente sensibles y ayudan en la identificación de patógenos como por ejemplo 
Escherichia coli O157:H7 (Radeland, Krüger, & Luchessi, 2017). 
Métodos moleculares (PCR). La técnica de PCR (Reacción en Cadena de la 
Polimerasa), se fundamenta en la generación de múltiples segmentos de ADN. Para dar un inicio 
favorable de esta técnica es de vital importancia realizar una mezcla de componentes para que se 
lleven a cabo ciertas reacciones, esta mezcla lleva el nombre de master mix los cuales se 
componen de dos Primers (oligonucleótidos), que se comportan en la reacción como iniciadores, 
también debe ir presente el ADN polimerasa termoestable o Taq, nucleótidos (dNTPs), Mg+2, 
buffer de PCR y agua tridestilada. Posteriormente cuando se da esta mezcla se procede a realizar 
los ciclos de termociclados como se observa en la Figura 4, cada ciclo que ocurre dentro de la 
reacción sucede en tres pasos. El primer paso inicia cuando se da la desnaturalización de la hebra 
de ADN y esto genera que las dos cadenas se separen, a una temperatura de 90 °C. El segundo 
paso inicia la fase de hibridación o annealing, y está a diferencia del primer paso utiliza una 
temperatura entre los 40 °C y los 60 °C. Esto permite que el par de Primers encuentre una región 
especifica dentro de una de las cadenas de ADN. El tercer y último paso ocurre lo que llamamos 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7
36 
 
la extensión, donde el ADN polimerasa añade nucleótidos que se complementan entre si 
iniciando por el extremo 3’ de la hebra molde anteriormente desnaturalizada. 
Nota. En la imagen se puede observar como de una hebra se generan el doble a medida que los ciclos de la técnica 
aumentan. Tomado de Radeland 2017. 
 
Este último paso se lleva a cabo a temperaturas de 72 °C ya que la ADN polimerasa 
presenta gran actividad enzimática, repitiéndose cada ciclo en forma exponencial (Radeland, 
Krüger, & Luchessi, 2017). 
Métodos Moleculares (qPCR). para la técnica de PCR en tiempo real tanto la 
amplificación como la detección se llevan a cabo en un proceso simultaneo, lo cual evita la 
implementación de geles y esto permite que a medida que se dé la amplificación de los genes 
pueda ser cuantificado. Para el desarrollo de esta técnica se necesitan termocicladores que tengan 
incorporado lectores fluorescentes. Finalmente, dependiendo de la fluorescencia emitida este será 
proporcional a la cantidad de ADN formado. 
Figura 7 
Presentación Esquematizada de los Ciclos de una PCR 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 37 
 
 Biosensores 
Estos dispositivos llamados biosensores se encuentran integrados por diferentes 
elementos biológicos como agentes de reconocimiento (enzimas, péptido, aptámeros, etc). Estos 
biosensores se basan en analizar reacciones que van a generar señales cuantificables para análisis 
posteriores. Estos sistemas de biosensores se componen de dos elementos básicos, un sistema de 
reconocimiento molecular llamado receptor y un transductor. Este acoplamiento biológico 
traduce una información que es convertida a una señal y esta será directamente proporcional a la 
concentración de muestra que se analiza. Este sistema como se observa en la Figura 5, 
esquematiza cada parte desde la muestra hasta el procesador (Gutierrez, Venegas, & Bollo, 
2021). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nota En la figura se muestra el esquema representativo del funcionamiento de un biosensor. La muestra analizar está 
representada por figuras geométricas de color violeta simulando el microorganismo Escherichia coli en una matriz 
acuosa, seguidamente del elemento de reconocimiento tales como aptámeros peptídicos, los cuales estarán en 
contacto directo e interactuaran con el analíto, el transductor, será el encargado de transmitir la señal y pasar esta 
información a la parte electrónica donde se analizarán los resultados tomado de Gutiérrez 2021. 
 
Figura 8 
Esquema de los Componentes de un Biosensor 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 38 
 
Biosensores Electroquímicos. Estos tipos de biosensores, inicialmente consta de un 
transductor electroquímico. Estos biosensores en principio están integrados por un transductor y 
un receptor, y este es capaz de generar una información cuantitativa mediante el elemento 
biológico de reconocimiento. Los biosensores pueden clasificarse de acuerdo con el mecanismo 
de transducción de las señales, como por ejemplo potenciométricos, efecto de campo o de 
conductividad (Thevenot, Toth, Durst, & Wilson, 2001). Para la presente investigación nos 
enfocaremos sobre los biosensores electroquímicos de carácter potensiométricos ya que son el 
objeto de estudio. 
Potensiométricos. Se fundamentan en las diferencias de potenciales, entre un indicador y 
un electrodo de transferencia, en este caso el transductor que lo compone puede ser un electrodo 
selectivo de iones basados en películas delgadas. Para el funcionamiento de estos biosensores se 
debe tener en cuenta aspectos fundamentales como por ejemplo cuando se coloca una capa 
biocatalizadora junto al detector. 
• Transporte de sustrato en la superficie del electrodo 
• Difusión del analíto 
• Reacción del analíto en presencia del biocatalizador 
• Difusión de producto de reacción hacia el detector 
(Thevenot, Toth, Durst, & Wilson, 2001). 
Estos biosensores electroquímicos básicamente constan de dos partes: El transductor y el 
elemento de reconocimiento. 
Elemento de Reconocimiento. El elemento de reconocimiento biológico es el encargado 
de reconocer el analíto y de esta manera traducir la información biológica a información 
cuantificable, lo que se conoce como una señal electroquímica. Realmente este elemento de 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 39 
 
reconocimiento se encarga de proveer al biosensor un alto grado de afinidad hacia lo que 
queremos detectar. De acuerdo con esto debemos entender que los biosensores son selectivos 
para analíto en particular, como por ejemplo los que utilizan, biosensores para compuestos 
fenólicos, para células completas, entre otros. 
Transductor. El transductor en este tipo de biosensores tiene como objetivo proporcionar 
la señal que viene desde el sistema de reconocimiento hacia el dominio electico. Este transductor 
genera una señal bidireccional hacia el transductor (Detector), y de esta manera poder cuantificar 
esta información y generar señales a través de ciertas técnicas electroquímicas (Thevenot, Toth, 
Durst, & Wilson, Electrochemical Biosensors: Recommended Definitions and Classification, 
1999). 
Técnicas Electroquímicas. La técnica electroquímica facilita el estudio de la 
termodinámica cuando se trata de reacciones. Se enfoca en estudiar las diferentes propiedades de 
la espectroscopia que tienen que ver con diferentes intermediarios como radicales iónicos, estos 
métodos a su vez se emplean como herramientas analíticas. La implementación de las diferentes 
técnicas electroquímicas obliga a entender más sobre los principios involucrados entre la 
reacción en el electrodo y las propiedades eléctricas del electrodo y la solución. Existen algunas 
variables que pueden afectar las reacciones en un electrodo como se observa en la figura 6. Para 
describir térmicamente la reacción en el electrodo, se hace a través de la ecuación de Nernst: 
 
 
Siendo CO especie oxidada y CR la especie reducida. El potencial de reducción que 
contiene la cupla respecto a un electrodo de hidrogeno se denotará como EO (Bonetto, 2013). 
 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 40 
 
Nota. En el esquema se presenta cada una de las variables que pueden afectar las 
reacciones en el electrodo. Tales variables son: variables del electrodo, variables de transferencia 
de masa, variables de la solución, variables externas y variables eléctricas. Tomado de Bonetto 
2013. 
Figura 9 
Variables que Afectan la Reacción de un Electrodo 
 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 41 
 
Para estudiar este tipo de procesos de óxido reducción que normalmente se dan en el electrodo 
debemos hablar y abordar ciertas técnicas electroquímicas como los son la Espectroscopia de 
Impedancia Electroquímica (EIS), Voltametría de Onda Cuadrada (SWV), y Voltametría Cíclica 
(CV). 
Espectroscopia de Impedancia Electroquímica (EIS). Esta técnica se caracteriza por 
analizar diferentes campos como la electrocatálisis y la energía, esta técnica se caracteriza por 
dos aspectos fundamentales, el primero es que se pueden presentar propiedades físicas como por 
ejemplo velocidad de las reacciones químicas, coeficiente de difusión, características 
microestructurales del sistema electroquímico. Como segundo aspecto 
 fundamental es que esta técnica en cuanto a su implementación es muy fácil, y es la 
única técnica que puede medir la corriente y la diferencia de potencial que se aplica en función 
de la frecuencia. Esta técnica en especial mide la transferencia que hay entre la corriente y el
potencial, este sistema se sometido a un voltaje sinusoidal para un grupo de frecuencias dando 
como respuesta corriente o voltaje resultante (Ciucci, 2019). 
Voltametría de Onda Cuadrada. La técnica Voltametría de Onda Cuadrada (SWV) se 
fundamenta en medir una corriente mediante rangos de tiempo cortos. Se denota como una onda 
de carácter positivo que se dirige hacia adelante en tiempo ti1 y otra onda de carácter negativo 
que se dirige hacia atrás al tiempo ti2 como se observa en la figura 10. 
Finalmente se encontrará una variación o diferencia entre la intensidad de corriente que 
es i1-i2 la cual se denota en función del potencial, de esta manera se obtiene un voltamograma 
que generara un pico simétrico. Esta técnica da como resultado mejor sensibilidad comparada 
con otras técnicas electroquímicas como por ejemplo voltametría de pulso diferencia (DPV) 
puesto que la intensidad de corriente global, el resultado es la suma de corrientes, una anódica la 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 42 
 
cual comprende la fase positiva y se da un proceso de oxidación, y una corriente catódica que 
comprende la fase negativa y se da un proceso de reducción, llegando a una sensibilidad de al 
menos de 3 veces mayor a la de la DPV que se encuentra en rangos de 10-7 hasta 10-8 mol L-1 
(Huertas, 2018). 
Nota. En la presente figura se esquematiza las diferentes intensidades de corriente parte izquierda, y en la parte 
derecha se observa un voltamograma con un pico simétrico tomado de Huertas, 2018. 
 
Voltametría Cíclica (CV). La técnica de voltametría cíclica se encarga de mostrar 
reacciones de óxido reducción y que además de esto son reversibles, dándose la transferencia de 
electrones, presentando al final 2 picos, un pico que corresponde a la oxidación del compuesto 
que se reduce (pico anódico), y el otro pico que muestra la reducción del compuesto oxidado (el 
pico catódico) así como se observa en la figura 8. En este punto se puede conocer el potencial 
que corresponde a cada uno de los picos, denotándose como (Epa) el pico de oxidación anódico, 
y denotándose como (Epc) el pico de reducción catódico Esta técnica facilita la obtención de 
información de procesos termodinámicos de la cupla redox que se esté utilizando (Bonetto, 
2013). 
Figura 10 
Gráficos de la Voltametría de Onda Cuadrada 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 43 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nota. En el esquema se muestra el voltamograma de un proceso redox reversible donde se da la transferencia de 
electrones, un pico Epc catódico de reducción y un pico Epa anódico de oxidación tomado de Bonetto, 2013. 
 
 
Figura 11 
Voltamograma de una Voltametría Cíclica 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 44 
 
Capítulo 5 
Marco Legal 
En Colombia se han establecido decretos como el 1575 de 2007 establecido por el 
ministerio de la protección social, el cual tiene como objetivo generar un control en cuanto a la 
calidad del agua, realizando un monitoreo de prevención para el control de riesgos acerca de la 
salud humana que causan el consumo del agua. Este decreto dicta los parámetros 
microbiológicos que debe tener el agua ya sea cruda o tratada. 
Otra norma encargada para el control del agua es la resolución 2115 de 2007 la cual da a 
conocer características como el control y calidad del agua para consumo humano. Para llevar a 
cabo este proceso de calidad del agua, este decreto menciona los procedimientos y técnicas que 
se deben realizar para determinar la calidad del agua teniendo en cuenta los parámetros 
microbiológicos. 
Para el análisis de Escherichia coli, y coliformes totales las técnicas a utilizar son: 
Filtración por membrana, sustrato definido, enzima sustrato y presencia o ausencia. En el decreto 
2115 de 2007 en el artículo 11 expone las características microbiológicas que debe tener el agua 
para el consumo humano, el cual estos análisis deben estar dentro de los valores máximos 
partiendo del criterio microbiológico, donde se establecen límite de confianza de un 95% y las 
técnicas utilizadas deben tener la habilidad de detectar desde una Unidad formadora de colonia 
(UFC) o un microorganismo en 100 cm3 de muestra. 
Así como se observa en la figura 12, se dan las características microbiológicas y los 
rangos aceptables que emite esta resolución. 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 45 
 
 Nota. en la figura se muestra cada técnica autorizada para el análisis de Escherichia coli y coliformes totales y sus 
rangos aceptables para la calidad del agua tomado resolución 2115 de 2007 emitido por el ministerio de la 
protección social, de ambiente vivienda y desarrollo territorial. 
 Es necesario destacar que, para este proyecto, la parte experimental se realizó 
únicamente a nivel de laboratorio, con el fin de realizar investigaciones y los diferentes 
materiales y sustancias generadas a raíz de este trabajo se descartaron y fueron destruidas 
siguiendo los lineamientos de bioseguridad establecidos por el laboratorio de biotecnología de la 
universidad de Santander UDES, por esta razón todas las actividades que se realizaron para 
cumplir con las actividades del proyecto no generaron impacto ambiental. Para poder garantizar 
el seguimiento de los resultados se tuvo en cuenta las buenas prácticas del laboratorio teniendo 
en cuenta los lineamientos internos que maneja el laboratorio de biotecnología. Cabe resaltar que 
la presente investigación no se realizó en seres humanos. Para este proyecto se tuvieron en 
cuentas cepas de referencia como Escherichia coli (ATCC 43888), Escherichia coli (ATCC 
25922), Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus De acuerdo con la Resolución Nº 
008430 DE 1993 del Ministerio de Salud de la República de Colombia del 4 de octubre de 1993, 
por la cual se establecen las normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación 
en salud, esta investigación tuvo en cuenta el Título IV de la bioseguridad de las investigaciones, 
Capítulo I de la investigación con microorganismos patógenos o material biológico que pueda 
contenerlos. Principalmente, en sus artículos 63-66, 68 y 71 en donde se dispone la normatividad 
Figura 12 
Características Microbiológicas 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 46 
 
para el manejo de estos microorganismos. Las bacterias que se usaron en este estudio hacen parte 
del grupo de riesgo II (riesgo moderado individual y riesgo comunitario limitado). En cuanto a la 
manipulación de estas bacterias, el artículo 68 dispone que deben procesarse en laboratorios 
básicos de microbiología empleando gabinetes de seguridad cuando se considere necesario. 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 47 
 
Capítulo 6 
Metodología 
Materiales y Equipos Utilizados 
Instrumentos 
Para realizar un control de las diferentes medidas electroquímicas, y así poder llevar a 
cabo los posteriores análisis de electroquímica se empleó un potenciostato/galvanostato con 
módulo de impedancia EmStat Pico Development Kit (PalmSens). 
 De igual forma se utilizó un equipo de filtración por membrana perteneciente al 
laboratorio de biotecnología, con el fin de confirmar las diferentes concentraciones de 
Escherichia coli empleadas en este estudio. 
Electrodos. Para dar cumplimiento al proyecto se utilizaron electrodos serigrafiados de 
marca ItalSens (IS). Estos electrodos serigrafiados tienen la característica de que están 
compuestos de un
sistema que abarca tres partes fundamentales (electrodo de trabajo, electrodo 
de referencia y contra electrodo). Este sistema de biosensores se compone de un área de trabajo 
de 7,07 mm2. Los potenciales registrados en este trabajo se trabajaron de acuerdo al electrodo de 
referencia de plata/cloruro de plata (Ag/AgCl). 
Reactivos del Sistema. En el trabajo realizado se utilizaron los siguientes reactivos para 
llevar a cabo los procesos electroquímicos. Una solución Ácido tetracloroáurico (HAuCl4.3H2O) 
al 1,0 mM en 0,5 M de ácido sulfúrico (H2SO4). De igual forma se utilizó una solución de 
Hexacianoferrato (II) y (III) y 0,1 M de KCl a dos concentraciones, la primera concentración fue 
de 10,0 mM y la segunda concentración de 5,0 mM. También se utilizó una solución de cloruro 
de potasio (KCl) al 0,1 M y una solución de Ácido sulfúrico (H2SO4) al 0,5 M. 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 48 
 
Componente Microbiológico 
Las cepas utilizadas en el presente trabajo de investigación fueron: Escherichia coli 
O157:H7 ATCC 43888, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa y 
Staphylococcus aureus. Estas cepas se encontraban en el laboratorio de biotecnología de la 
universidad de Santander, conservadas y preservadas a temperatura de -20°C. Para ajustar el 
inóculo y estimar una concentración se llevó a cabo mediante densidad óptica, (0,08 de 
absorbancia que es igual a 1x108 UFC/mL en solución salina). esto se realizó a una longitud de 
onda de 600 nm. 
Componente Biológico 
Se realizó un proceso de inmovilización utilizando un péptido PEPTIR como agente 
biológico de reconocimiento. Este péptido fue diseñado por el grupo CIBAS de la universidad de 
Santander (Redondo, F). 
Método Electroquímico Técnicas 
Siguiendo los parámetros establecidos por Galvis, 2020 las técnicas electroquímicas, se 
basaron en relación entre la aplicación del voltaje en la celda y la intensidad de corriente. Los 
electrodos ItalSens (IS), se caracterizaron mediante las técnicas electroquímicas espectroscopia 
de impedancia electroquímica (EIS), voltametría de onda cuadrada (SWV) y voltametría cíclica 
(CV). Cabe resaltar que este proceso se realizó antes y después de la síntesis de nanoparticulas 
de oro (AuNps). Para la técnica de espectroscopia de impedancia electroquímica se basó en el 
circuito equivalente (EC), este se fundamenta en circuito Randles doble paralelo. 
Así como se observa en la figura 13, el circuito Randles está constituido por la resistencia 
de la solución (RS), también está constituido por la capacitancia de la doble capa (Cdl), 
Resistencia de la trasferencia de electrones (Ret) y por último la impedancia de Warburg (Zw). 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 49 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nota. En la figura se puede observar los componentes de los cuales está compuesto el circuito, Resistencia de la 
solución, capacitancia de la doble capa, resistencia de la transferencia de electrones, impedancia de warburg tomado 
de Galvis, 2020. 
 
Síntesis de Nanoparticulas de oro (AuNps) 
Para realizar la síntesis de nanopartículas de oro (AuNps), se empleó una solución 
precursora (HAuCl4.3H2O 1,0 mM en 0,5 M H2SO4), se depositaron 100 µL sobre el electrodo 
y se aplicó un potencial de reducción de -0,05 V vs Ag/AgCl durante un periodo de 100 
segundos. Todas estas condiciones fueron establecidas por el grupo CIBAS de la universidad de 
Santander. 
Inmovilización del Péptido 
El péptido que se utilizó en este estudio es el PEPTIR 2.0 
(CQKVNIAELGNAIPSGVLKDD) este péptido fue diseñado en el grupo de investigación 
CIBAS, perteneciente a la universidad de Santander (Redondo, F). Este péptido contiene una 
cisteína en el amino terminal, y de esta manera el grupo tiol puede inmovilizarse sobre las 
nanopartículas de oro (AuNps). Continuando con el proceso de inmovilización del péptido se 
añadieron 10 µL del péptido, contenidos en solución acuosa y depositados únicamente en el 
Figura 13 
Esquema de Circuito Equivalente (EC) 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 50 
 
electrodo de trabajo previamente modificado con nanoparticulas de oro. Para el proceso de 
inmovilización se llevó a cabo un proceso de incubación de 16 horas. 
Detección Electroquímica de Escherichia coli en Agua Natural 
Para iniciar con la detección de la bacteria Escherichia coli se realizó un montaje 
utilizando un vaso precipitado estéril de vidrio de un volumen de 10 mL, y se depositó en él 7 
mL de agua natural. Para ajustar las concentraciones de microorganismo se plantearon 2 métodos 
fundamentales validados por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI). Un 
método es la comparación visual guiándose por la escala 0,5 de Macfarland y la otra utilizando 
un espectrofotómetro. La preparación del inóculo inició con el crecimiento de la bacteria en 
caldo Luria Bertani (LB), tomando una asada de un vial criopreservado a -80°C. Este inóculo se 
dejó en crecimiento alrededor de 24 horas. Pasadas las 24 horas se tomó un tubo con 5 mL de 
solución salina y se agregaron pequeñas alícuotas del inoculo en crecimiento. Esto se ajustó a 
una escala turbidimétrica de 0,5 de Mcfarland, utilizando un espectrofotómetro indicando una 
absorbancia del inóculo microbiano entre 0,08 y 0,10 medido a una longitud de onda de 600nm. 
Esto es equivalente a tener una concentración aproximada de 1*108UFC/mL (Ulloa & Paguay, 
2015). El proceso se realizó de la siguiente forma como se observa en la figura 14. 
 
 
 
 
 
 
 
Nota. Todas las diluciones se realizaron en NaCl al 0.9 % 
Figura 14 
Esquema Metodológico del Ajuste de Microorganismo Escherichia coli. 
 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 51 
 
El proceso de detección se realizó a partir del tubo final que se encontraba a una 
concentración aproximada de 5000 UFC/mL, como se especifica en la figura 14. Los cálculos 
para las concentraciones utilizadas en la detección de los microrganismos se detallan a 
continuación: 
 10 UFC/mL se tomaron 14 µL del tubo final (5000 UFC/mL). 
 30 UFC/mL se tomaron 42 µL del tubo final (5000 UFC/mL). 
 50 UFC/mL se tomaron 70 µL del tubo final (5000 UFC/mL). 
 100 UFC/mL se tomaron 140 µL del tubo final (5000 UFC/mL). 
 150 UFC/mL se tomaron 210 µL del tubo final (5000 UFC/mL). 
 200 UFC/mL se tomaron 280 µL del tubo final (5000 UFC/mL). 
Este proceso se realizó a una temperatura de 25°C durante un tiempo de incubación de 30 
minutos, este montaje se hizo en una placa de agitación (150 rpm). Al terminar el tiempo de 
incubación, este biosensor se lavó con agua tipo 1 y posteriormente se realizaron las diferentes 
pruebas electroquímicas (Figura 15). 
Todo el proceso de detección de la bacteria se hizo mediante la aplicación de las técnicas 
electroquímicas antes y después de colocar el biosensor en contacto con el microorganismo. Para 
la investigación se utilizó un blanco que es agua natural, posteriormente se realizó la 
caracterización del biosensor lo cual abarca la síntesis de nanopartículas de oro, inmovilización 
del péptido, y finalmente la detección de Escherichia coli. en la figura 15 se detalla el proceso 
anteriormente mencionado. 
BIOSENSORES PEPTIR PARA Escherichia coli O157:H7 52 
 
 Nota. Las técnicas electroquímicas CV y SWV se hicieron con 10 mM de Fe (CN)6-3/Fe (CN)6-4 en 0,1 M de KCl 
(excepto los lavados que se realizaron con KCl 0,1M o H2SO4 0,5 M según lo estipulado). Para la técnica de EIS se 
utilizó la solución de 5 mM de Fe (CN)6-3/Fe (CN)6-4 en 0,1 M de KCl. Tomado de Galvis 2020. 
Filtración por Membrana