Estudio a nivel de moléculas individuales de la ctividad de replicaxion del ADN de la polimerasa del bactriofago

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-Tesis Doctoral-
Estudio a nivel de moléculas individuales de la
actividad de replicación del ADN de la
polimerasa del bacteriófago Phi29
José Alberto Morin Lantero
Julio de 2013
Universidad Autónoma de Madrid
Facultad de Ciencias
Departamento de Física de la Materia Condensada
Memoria presentada para obtar al grado de Doctor en Biofísica
José Alberto Morin Lantero
Junio, 2013
Universidad Autónoma de Madrid
Facultad de Ciencias
Departamento de Física de la Materia Condensada
Directores de tesis:
Dr. Borja Ibarra
IMDEA Nanociencia
Dr. José L. Carrascosa
CNB - CSIC
3
Abstract
The accurate replication of DNA is essential to keep genetic integrity. Replicative DNA polymerases
are the enzymes responsible for DNA synthesis; they work as molecular motors that translocates
along DNA through a series of conformational changes fuelled by dNTP binding and hydrolysis. This
process requires overcoming the energetic barrier associated with the base pair melting of its double
helix and a �ne tuned coordination between the processes of DNA unwinding and replication. One
intriguing question that remains poorly understood is the exact mechanism of the coupling of these
two reactions. Moreover, little is known about the mechanochemistry of translocation: How thermal
and chemical energies are converted to movement? Or more speci�cally, which step of the dNTP
binding and incorporation cycle lead to translocation? In the bacteriophage Phi29 the processes of
replication and unwinding are tightly coupled within the same protein: the Phi29 DNA polymerase.
This polymerase also presents the basic architecture of the polymerase domain, common to all known
polymerases, and the basic features of Family B DNA polymerases.
In this thesis we use optical tweezers to characterize, at a single molecule level, the basis for the
tight coupling between replication and unwinding and the mechanochemistry of translocation in
the Phi29 DNA polymerase. We found, after including the pause kinetic in a model to quantify
the unwinding mechanism, that the wild type and an unwinding de�cient polymerase variant both
destabilize the fork with the same active mechanism: the polymerase destabilize at least two base
pairs in the junction with an energy per base pair of 4Gd = 2 kBT .
We also found that this polymerase presents a robust mechanism, capable of processing DNA at
high opposing forces. For all conditions tested (opposing and aiding forces (−50 to 20 pN)) the
velocity without pauses follows a Michaelis-Menten relation (for dNTP concentrations of 5, 10, 50,
100, 200, 500 µM). The force dependence of the Michaelis-Menten parameters (Vmax and Km)
indicates that the force dependent step in the polymerization cycle is related to the binding step,
suggesting a Brownian ratchet type of mechanism.
5
Índice general
Abstract 5
1. Introducción 5
1.1. La Replicación del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1.1. El ciclo de Polimerización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2. Mecanoquímica de la translocación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3. Estudios a nivel de moléculas indviduales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.3.1. Técnicas experimentales de molécula individual . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.3.2. Aplicaciones al estudio de la replicación del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.4. La polimerasa de ADN de Phi29 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2. Objetivos 29
3. Materiales y Métodos 31
3.1. El instrumento de pinzas ópticas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.1.1. Diseño de la celda de �uidos y sistema de �uidos. . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.2. Diseño de las moléculas de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.2.1. Estudio del acoplamiento de las actividades de extensión del primer y despla-
zamiento de banda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.2.2. Estudio del mecanismo de translocación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.2.3. Preparación de las asas con digoxigeninas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.3. Protocolo experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.3.1. Protocolo para unir las moléculas de ADN entre las microesferas. . . . . . . . 38
3.3.2. Tampones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.3.3. Obtención de las microesferas recubiertas con antidigoxigenina. . . . . . . . . 39
3.4. Polimerasa de ADN de Phi29 salvaje, mutante D12AD66A y biotinilada. . . . . . . . 39
i
3.5. Dependencia del tiempo de residencia con la secuencia de la horquilla. . . . . . . . . 40
4. Resultados 41
4.1. Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . 41
4.1.1. Diseño experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.1.2. Caracterización de la horquilla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.1.3. Detección de Actividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.1.4. Efecto de la estabilidad de la horquilla en la velocidad de replicación . . . . . 47
4.1.5. Cinética de Pausas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.1.6. Cuanti�cación del mecanismo de apertura de la doble hebra. . . . . . . . . . . 58
4.2. Mecanoquímica de la translocación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.2.1. Diseño experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.2.2. Detección de Actividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.2.3. Efecto de la fuerza y la concentración de nucleótidos en la actividad de repli-
cación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
5. Discusión 77
5.1. Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . 77
5.2. Mecanoquímica de la translocación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
6. Conclusiones 85
Agradecimientos 87
7. Anexos 89
7.1. Ensayo bioquímico de actividad de polimerización, exonucleólisis y desplazamiento de
banda de la polimerasa de Phi29 etiquetada con biotina en el extremo amino-termial. 90
7.1.1. Ensayo acoplado de polimerización/exonucleólisis (pol/exo). . . . . . . . . . . 90
7.1.2. Ensayo de desplazamiento de banda acoplado a la replicación del ADN M13. . 91
7.2. Determinación de las energías de enlace entre pares de bases AT y GC. . . . . . . . . 91
7.3. Modelo de Betterton y Julicher . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
7.4. Artículos publicados durante el periodo de tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
Bibliografía 99
Nomenclatura 109
ii
Índice de �guras
1.1. Proteínas que componen la horquilla de replicación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2. El ciclo de polimerización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3. Transición de la con�guración abierta a cerrada en el dominio dedos de la polimerasa Klentaq1. . . 10
1.4. Diagrama de energía libre de una reacción afectada por una fuerza inhibitoria. . . . . . . . . . . 12
1.5. Elasticidad del ADN de cadena doble y sencilla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.6. Ejemplo de aplicaciones de las técnicas de manipulación de moléculas individuales al estudio de
polimerasas de ADN, ARN y helicasas a nivel de moléculas individuales. . . . . . . . . . . . . . 21
1.7. Estructura del complejo binario de la polimerasa de Phi29 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.1. Construcción de la celda de �uidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.2. Representación esquemática (no a escala) de la horquilla construida para el estudio de la replicación
acoplada al desplazamientode banda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.3. Representación esquemática del diseño y componentes de las moléculas de ADN utilizadas para
formar el complejo ADNp-ADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4.1. Diseño experimental. Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda . . . . . . . . 42
4.2. Detección de las actividades de desplazamiento de banda y extensión del primer. . . . . . . . . . 43
4.3. Determinación de la curva de fuerza-extensión del ssDNA para el estudio de la replicación acoplada
al desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.4. Dependencia con la tensión de las velocidades medias para la polimerasa salvaje y el mutante ddb. . 48
4.5. Dependencia del tiempo de residencia con la secuencia para la polimerasa salvaje y el mutante ddb. 49
4.6. Procedimiento de detección de pausas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.7. Procesividad de las polimerasas salvaje y mutante ddb. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.8. Dependencia de la duración de pausas con la concentración de polimerasa para las polimerasas salvaje
y mutante ddb. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
1
4.9. Comportamiento de la frecuencia de pausas para la polimerasa salvaje. Estudio del acoplamiento
entre las actividades de desplazamiento de banda y replicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
4.10. Comportamiento de la frecuencia de pausas para el mutante ddb. Estudio del acoplamiento entre las
actividades de desplazamiento de banda y replicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
4.11. Duración de pausas para las polimerasas salvaje y mutante ddb. . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4.12. Representación esquemática y notación del modelo utilizado para describir el avance de la polimerasa
en las condiciones de desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.13. Predicción de la velocidad media de desplazamiento de banda con valores alternativos de ∆Gd y M . 64
4.14. Diseño experimental. Estudio del mecanismo de translocación. Con�guración fuerza a favor. . . . . 68
4.15. Diseño experimental. Estudio del mecanismo de translocación. Con�guración fuerza en contra. . . . 69
4.16. Actividad de replicación de la polimerasa inmovilizada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.17. Determinación de la curva de fuerza-extensión del ssDNA. Mecanismo de translocación. . . . . . . 70
4.18. Procedimiento de detección de pausas. Mecanismo de translocación . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.19. Frecuencia y duración de pausas. Mecanismo de translocación . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.20. Dependencia de la velocidad de replicación con la fuerza a diferentes concentraciones de dNTP en
los modods de extensión del primer y desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.21. Dependencia de la velocidad sin pausas con la concentración de nucleótidos . . . . . . . . . . . . 75
4.22. Dependencia de de Km, Vmax y Kb con la fuerza. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
5.1. Mecanismo de apertura del ADN propuesto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
5.2. Efecto de la fuerza en la estabilidad del complejo binario/terciario . . . . . . . . . . . . . . . . 82
7.1. Ensayo acoplado de polimerización/exonucleólisis (pol/exo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
7.2. esplazamiento de banda acoplado a la replicación del ADN M13 . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
7.3. Determinación de las energías de enlace entre pares de bases AT y GC . . . . . . . . . . . . . . 93
7.4. Alineamiento de las curvas experimentales de apertura mecánica de la doble hebra. . . . . . . . . 95
2
Índice de tablas
4.1. Rates y cambios conformacionales durante las reacciones de extensión del primer (e. p.) y despla-
zamiento de banda (d. b.) determinados a partir de ajustes independientes a la dependencia de la
frecuencia y duración de pausas con la tensión. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.2. Rates de entrada y salida durante las reacciones de polimerización y desplazamiento de banda (poldb)
y solo polimerización (pol) determinados a partir de la distribución de frecuencia de duración de pausas. 61
4.3. Rates de entrada a pausa por unidad de tiempo sin pausa, (a f = 0), y cambios conformacionales
durante las reacciones de polimerización y desplazamiento de banda (poldb) y solo polimrización (pol)
determinados a partir de la dependencia de tensión de la longitud y la frecuencia de pausas. . . . . 63
3
1 Introducción
1.1. La Replicación del ADN
La molécula de ADN contiene toda la información genética necesaria para la vida. Antes de cada
evento de división celular, se deben hacer nuevas copias de cada una de las muchas moléculas que
forman la célula, incluyendo la duplicación de todas las moléculas de ADN. La replicación es el
proceso de duplicación de la información genética (los genes), que permite que esta información pase
de cada célula a las dos células hijas producto de la división celular y por tanto de un organismo a
su descendencia (Alberts (2003)).
La estructura del ADN, una doble hélice formada por cadenas complementarias antiparalelas (Wat-
son (1953)), tiene consecuencias notables en el proceso de replicación. El hecho de que cada nucleótido
en una de las cadenas esté apareado con un nucleótido complementario de la cadena opuesta, signi�ca
que cualquier parte de la secuencia podría actuar como una plantilla para la parte correspondiente
de la cadena complementaria. Esta estructura ofrece además, la estabilidad física necesaria, en las
condiciones del interior celular, a una molécula cuya función principal es la de contener la informa-
ción genética. Al mismo tiempo, cualquier mecanismo de lectura, ya sea durante la replicación o la
transcripción de genes, requiere el acceso dinámico a la secuencia de bases escondidas en el interior
de la doble hélice. Por esta razón, el proceso de apertura de las dos cadenas no puede ser espontá-
neo, sino que requiere de proteínas especializadas capaces de vencer el conjunto de interacciones que
mantienen unidas las dos cadenas.
La replicación en el interior celular es llevada a cabo por un complejo de proteínas llamado �repliso-
ma�, que se ensambla para formar una estructura en forma de �Y� llamada horquilla de replicación
(Cairns (1963)) y de la cual la polimerasa replicativa de ADN, la enzima responsable de copiar el
ADN, es su componente fundamental, Figura 1.1.
Esta proteína utiliza la energía proveniente de la unión e hidrólisis de los nucleótidos trifosfato (dATP,
dTTP, dGTP, dCTP) para desplazarse, en la dirección 3' a 5' de la cadena molde, incorporando
5
Capítulo 1 Introducción
AbrazaderaMdeslizante
Helicasa
PolimerasaMenM
laMcadenaMlíder
Primasa
Primosoma
Topoisomerasa
ParentalMDNAMhelix
ProteínaMdeMunión
MaMcadenaMsencilla
FragmentoMdeMOkazakiM
MoldeMlíder
CargadorMdeMabrazadera
CebadorMdeMARN
MoldeMretrasado
Figura 1.1: Reproducido de Alberts (2003). Proteínas que componen la horquilla de replicación. La maquinaria
de replicación en organismos tan variados como virus, bacterias y eucariotas posee un conjunto de proteínas que
realizan funciones similares. Cada sistema consiste en una molécula de polimerasa de ADN en la hebra líder y
una en la retrasada, una primasa, proteínas de unión a cadena sencilla que revisten al ADN molde y lo mantienen
abierto y con las bases expuestas, una helicasa que junto a la topoisomerasa promueven la apertura la doble hélice y
proteínas accesorias adicionales que mantienen las polimerasas unidas entre si y al molde de ADN . Adicionalmente,
se necesitan un conjunto de proteínas (no se muestran) que promueven la formación de la horquilla en el origen de
replicación, una enzima ARNasaH para eliminar los primers de ARN de los fragmentosde Okazaki y una ligasa de
ADN para sellar los fragmentos de Okazaki adyacentes entre sí para formar una cadena de ADN continua.
secuencialmente el nucleótido seleccionado, de acuerdo a su emparejamiento con el complementario
(T, A, C o G, respectivamente), al extremo 3' de la cadena naciente. La direccionalidad química
de la cadena sencilla de ADN y el hecho de que las dos cadenas que forman la doble hebra sean
antiparalelas implica que sólo una de las cadenas hija pueda ser sintetizada de manera continua, por
una polimerasa que se mueve a lo largo de la cadena líder, mientras otra copia de la polimerasa es
necesaria para la síntesis de la cadena retrasada, a través de la síntesis una serie de fragmentos cortos
de ADN llamados fragmentos de Okazaki (Okazaki et al. (1968)). Además del molde, las polimerasas
de ADN necesitan un extremo de una cadena de ADN o ARN preexistente (un cebador, en inglés
primer) al cual unir el nucleótido incorporado. Por esta razón la polimerasa de la cadena retrasada
necesita la acción de una enzima llamada primasa que produce una molécula corta de ARN que
actúa como primer de cada fragmento de Okazaki.
La �delidad del proceso de replicación es crucial para mantener la estabilidad genética. En general,
este proceso se lleva a cabo cometiendo un error por cada 109 - 1010 bases replicadas. Esta alta
6
1.1 La Replicación del ADN
precisión se logra mediante la combinación de diferentes mecanismos que funcionan al unísono: i) La
selectividad del nucleótido correcto durante la síntesis procesiva, ii) la capacidad de corrección de
errores que tienen muchas polimerasas y iii) mecanismos de eliminación de errores una vez el error
ha sido incorporado.
Ante el evento de incorporación de un nucleótido incorrecto, muchas polimerasas poseen una activi-
dad de corrección exonucleasa asociada que hidroliza los nucleótidos de la cadena primer apareados
de forma incorrecta, mejorando la �delidad en más de 100 veces (Kunkel (2004)). En el caso en que
un error se sella y queda incorporado en el genoma, existen mecanismos de reparación que eliminan
la/s base/s erróneas. La mayor contribución a la �delidad en el proceso de replicación la aporta la
actividad de la polimerasa de ADN.
La helicasa replicativa de ADN es la enzima encargada de abrir la doble hebra. Esta proteína se
mueve a lo largo de una de las cadenas forzando a la doble hélice a abrirse por delante de la horquilla
de replicación de manera que la juntura (frontera entre la región de cadena doble y de cadena sencilla)
de la horquilla se desplaza en la dirección de replicación de la cadena líder al tiempo que las bases
del ADN queden expuestas para ser copiadas por la polimerasa. Estas proteínas poseen actividad
ATP-asa, lo que les permite convertir la energía química proveniente de la hidrólisis dATP en trabajo
mecánico capaz de generar movimiento unidireccional y aportar energía al proceso de separación de
las cadenas de la doble hebra(Lohman and Bjornson (1996)).
La maquinaria replicativa se alinea de manera especí�ca de modo que cada paso sucesivo está
�namente regulado por el anterior dando lugar a un proceso extremadamente complejo, pero a su
vez rápido e increíblemente preciso. La caracterización de un sistema biológico como la replicación del
ADN, requiere responder preguntas fundamentales sobre la mecánica, dinámica y mecanoquímica
del proceso: ¾Cómo modulan las propiedades físicas del ADN la organización y actividad de la
maquinaria replicativa?, ¾Cómo están acopladas las reacciones de apertura y replicación del ADN?
¾Cuál es el mecanismo físico que utilizan las polimerasas y helicasas replicativas para replicar y
desestabilizar la juntura al mismo tiempo?
Por otra parte, poco se sabe acerca de la dinámica y mecanoquímica de translocación de las polime-
rasas replicativas: ¾Cómo convierten estas proteínas las energías térmica y química en movimiento
a lo largo del ADN? ¾Qué paso del proceso de unión e incorporación de dNTP conlleva a la translo-
cación? O de manera más general, ¾Presenta la polimerasa un mecanismo de `Brownian ratchet' en
el cual la unión de dNTP solo es capaz de capturar y estabilizar el estado translocado o presenta un
mecanismo de `power stroke' en el cual la hidrólisis de dNTP, o la liberación del producto, induce
7
Capítulo 1 Introducción
un cambio conformacional en la proteína que �empuja� la enzima hacia delante (Steitz (2006))?
1.1.1. El ciclo de Polimerización
Todas las polimerasas de ADN de una sola unidad, de las cuales se conoce su estructura, a pesar de
provenir de organismos que cubren toda la gama de seres vivos (Archaea, Bacteria, Eukaria y virus)
y de presentar una gran disparidad en su secuencia, presentan un dominio de polimerización con
una arquitectura básica y una relación espacial similar, que asemeja la forma de una mano derecha
formada por subdominios identi�cados como palma, pulgar y dedos (Rothwell and Waksman (2005)).
Los subdominios pulgar y dedos forman una hendidura en forma de �U� debajo de la cual se encuentra
el subdominio catalítico palma. El subdominio pulgar estabiliza el dúplex primer-molde, producto de
la síntesis, mientras que el subdominio dedos contiene residuos básicos que unen la región trifosfáto
del nucleótido entrante y el pirofosfato, producto de la reacción de transferencia fosforil.
Un mecanismo cinético estándar, basado principalmente en estudios de pre-steady state kinetics of
nucleotide turnover, (Johnson (1993)), también se ha propuesto para todas las polimerasas conocidas
y se inicia una vez la enzima se ha unido al extremo terminal del primer (p/t) para formar el
complejo enzima-p/t (E:p/t) (paso 1), Figura 1.2. La unión de la proteína al sitio p/t redunda en
cambios conformacionales en la proteína fundamentalmente localizados en el dominio pulgar y cuyo
resultado global es el de formar un cilindro que rodea completamente al ADN. Las interacciones
que se establecen entre la proteína y la porción corriente arriba del ADN, además de mantener el
extremo 3' del primer alineado con el sitio activo de polimerización, permiten que la proteína se
mantenga unida al ADN durante el proceso de polimerización procesiva.
El siguiente paso del ciclo de incorporación es la unión del nucleótido (dNTP) al complejo E:p/t (paso
2). Estudios estructurales sugieren que las polimerasas de la familia A (polimerasas de reparación
en bacterias, la mayoría de las polimerasas replicativas en bacteriófagos, y la polimerasa de ARN de
T7) unen el nucleótido entrante a un sitio de pre-inserción localizado cerca del dominio dedos antes
de acompañarlo al sitio de inserción, estando la base de cada nucleótido apuntando hacia la zona de
unión a ADN. Por otra parte, debido a que las polimerasas de la familia B (replicación del genoma
en virus y eucariota) presentan una discriminación mucho mayor entre el nucleótido correcto y el
incorrecto, se ha propuesto que estas polimerasas unen el nucleótido directamente en el sitio activo.
En todo momento el subdominio dedos �uctúa entre una conformación abierta y cerrada, estando la
conformación abierta favorecida en ausencia del nucleótido entrante o del producto pirofosfato (Dahl
8
1.1 La Replicación del ADN
3'
5'
-10
+1
5'
sitio)de)inserción
Molde
Primer
5'
3'
-10
+1
5'
dNTP)entrante
5'
3'
-10
+1
5'
Pol)+)p/t)DNA
))))(binario)))
3'
5'
-10+1
5'
3'
5'
Translocación)?
Pol+p/t+dNTP
pre-inserción)
-10
+1
5'
Pol+p/t+dNTP
post-inserción
(ternario)
Liberación)de
pirofosfáto
Pol+p+1/t)pre-traslocación
)))))))))))))
Molde
corriente)abajo
Pol+p+1/t
post-traslocación)
(binario)
Figura 1.2: El ciclo de polimerización. Reproducido de Berman et al. (2007). La polimerasa (círculo gris) se
une a un molde con un extremo 3' (azul y rojo) para formar el complejo binario E:p/t , seguido de lo cual el
nucleótido entrante (verde) se une al sitio de inserción (naranja) para formar el complejo ternario (E:p/t:dNTP).
La incorporación del dNTP alla hebra primer, catalizada por la polimerasa, resulta en la extensión del primer un
nucleótido más una molécula de pirofosfato unida cerca del sitio activo. La liberación de pirofosfato es necesaria
para que el nucleótido recién incorporado se mueva desde el sitio de inserción al sitio de priming.
et al. (2012); Rothwell et al. (2005)). Adicionalmente, en la con�guración abierta de los dedos, un
impedimento estérico se inserta en el sitio activo de polimerización y se posiciona encima del primer
par de bases del dúplex, Figura 1.3a, bloqueando el acceso directo del nucleótido entrante a la base
molde. En la conformación cerrada los dedos se mueven hacia adentro y se posicionan mucho más
cerca del sitio activo de polimerización, lo que facilita que los grupos fosfato del nucleótido entrante
actúen como un intermediario electrostático1 entre residuos básicos en la punta de los dedos y los
iones metálicos catalíticos quelados por los residuos conservados del subdominio palma, estabilizando
de esta forma la conformación cerrada (Rothwell and Waksman (2005)), Figura 1.3b. Durante esta
transición, el impedimento estérico es liberado del sitio activo, lo que permite a la primera base de la
cadena sencilla (la base molde) posicionarse en frente del nucleótido entrante en una con�guración
espacial similar a la que tendría si formara parte de la doble hebra. Una de las características más
llamativas de esta conformación es que contiene, universalmente, una interfase plana con la cual
veri�car la disposición de planos paralelos inherente al apareamiento de Watson y Crick (Steitz
1Corsslink
9
Capítulo 1 Introducción
(2006)).
(a)
Tyr 671
Base Molde
MoldeMolde
(b)
Figura 1.3: Transición de la con�guración abierta a cerrada en el dominio dedos de la polimerasa Klentaq1. En la
con�guración abierta de los dedos 1.3a, la Tirosina 671 se inserta en el sitio activo de polimerización bloqueando
el acceso directo del nucleótido entrante a la base molde (violeta). En la conformación cerrada 1.3b los dedos se
mueven hacia adentro y se posicionan mucho más cerca del sitio activo de polimerización, lo que facilita que los
grupos fosfato del nucleótido entrante (gris) actúen como un intermediario electrostático entre residuos básicos en
la punta de los dedos y los iones metálicos catalíticos quelados por los residuos conservados del subdominio palma
(naranja). Durante esta transición, el impedimento estérico es liberado del sitio activo.
Como se ha mencionado, la �delidad en la replicación de la información genética es un requerimiento
esencial del ciclo de polimerización. La idea inicial, propuesta por Watson y Crick y basada en
la estructura del ADN, fue que la selección estaba determinada por el apareamiento basado en
los enlaces de hidrógeno de las bases A-T y G-C. Sin embargo, la diferencia de energía, debida
exclusivamente a los enlaces de hidrógeno, entre la formación de un par de bases A-T y uno G-C
podría explicar a lo sumo una frecuencia de error de 10−2, (Loeb and Kunkel (1982)), en clara
contradicción con la frecuencia observada (∼ 10−3 - 10−6). La estructura del sitio de unión en la
conformación cerrada de los dedos provee una lectura estérica mucho más estricta y se piensa que
juega el papel fundamental en la discriminación entre el nucleótido correcto y el incorrecto.
Una vez en la con�guración cerrada de los dedos, ocurre una transición estructural, presumiblemente
el paso limitante de la reacción, en la cual todos los componentes del sitio activo son ensamblados y
organizados en una con�guración topológica y geométrica que le permite a la enzima llevar a cabo el
paso de la reacción química: una reacción de transferencia fosforil que implica el ataque nucleofílico
del grupo 3'-OH del extremo terminal del primer al fosfato alpha del dNTP entrante (paso 4).
10
1.2 Mecanoquímica de la translocación.
El sitio activo de polimerización se de�ne por un conjunto de grupos carboxilato y otros residuos
polares conservados en la hendidura de la base de la polimerasa. En particular, los grupos carboxilato
sirven para anclar dos iones metálicos divalentes (generalmente Magnesio) uno de los cuales promueve
la deprotonación del grupo 3' OH del extremo del primer, mientras que el otro estabiliza la carga
negativa que surge debido a la salida del oxigeno y se une a los fosfatos β y γ, facilitando la salida
del grupo PPi, promovida por un segundo cambio conformacional en el dominio dedos (paso 5). La
necesidad de tener un grupo 3'- OH para catalizar la inserción de un nuevo nucleótido explica el por
qué las polimerasas de ADN necesitan un primer, o lo que es lo mismo, no pueden iniciar la síntesis
de novo. Una vez que ocurre la reacción, el nucleótido recién incorporado se mueve desde el sitio
de inserción al sitio priming, liberando el sitio de inserción para que un nuevo nucleótido pueda ser
incorporado (síntesis procesiva).
Como resultado global del ciclo, la polimerasa ha incorporado un nuevo nucleótido y se ha desplaza-
do (translocado) sobre la cadena molde una base corriente abajo. En otras palabras, las polimerasas
de ADN transforman la energía química, proveniente de la unión y/o hidrólisis del nucleótido incor-
porado o la liberación del producto PPi en el trabajo mecánico asociado al desplazamiento sobre la
cadena sencilla molde. En cierto sentido la fuerza desarrollada por la polimerasa puede ser consi-
derada como un producto de la reacción química de polimerización. Por tanto, una fuerza externa
que se opone al movimiento puede actuar como un inhibidor de la reacción y una que asista puede
promover la reacción y actuar como un activador. Como resultado, la velocidad del motor frecuen-
temente depende de la fuerza externa y de la concentración de substrato de una manera dictada
por el mecanismo de operación. Por esta razón, la fuerza desarrollada por, o aplicada sobre el motor
resulta una variable natural para la descripción de estas proteínas en cuanto a su carácter mecánico,
así como las concentraciones de substrato y producto lo son en cuanto a sus propiedades catalíticas.
1.2. Mecanoquímica de la translocación.
Papel de la fuerza en la termodinámica y cinética de la reacción. De manera general la aplicación
de una fuerza externa sobre un sistema molecular tiene dos efectos inmediatos: i) Primeramente
introduce una dirección privilegiada que se convierte en la coordenada de reacción natural a lo largo
de la cual la reacción va a proceder, por lo que el diagrama de energía de la reacción puede ser descrito
como función de la posición a lo largo de esta coordenada, Figura 1.4. y ii) si el trabajo asociado se
realiza de manera reversible, a temperatura y presión constante, todo el trabajo entregado al sistema
11
Capítulo 1 Introducción
va a ser empleado en alterar la energía libre de la reacción, ∆G0 (Tinoco and Bustamante (2002);
Bustamante et al. (2004)).
G
x
A
B
∆G‡
∆x‡A
∆xAB
f ∆x AB
f ∆x‡A
∆G0
Figura 1.4: Diagrama de energía libre hipotético de una
reacción afectada por una fuerza inhibitoria. La �gura
muestra un diagrama de energía hipotético (línea sólida
roja) que conecta los estados A (inicial) y B (�nal) con
la coordenada mecánica, x , correspondiente al desplaza-
miento a lo largo de la dirección de translocación. En
este ejemplo, una fuerza inhibitoria f , inclina el per�l de
energía una cantidad igual al trabajo realizado en con-
tra de la fuerza aplicada, produciendo un cambio (línea
discontinua azul) en el per�l original. El estado de tran-
sición de la reacción se incrementa la cantidad f ·∆x‡A,
donde ∆x‡A es la distancia al estado de transición locali-
zado entre A y B. La fuerza también afecta la termodiná-
mica del equilibrio entre los estados, elevando la energía
relativa del estado B la cantidad f ·∆xAB , donde ∆xAB
es la distancia de equilibrio entre A y B .
La Figura 1.4 muestra un diagrama de energía
libre, a lo largo de la coordenada establecida por
la aplicación de una fuerzaexterna, de una reac-
ción en la cual la especie A se convierte en la
especie B. Los estados A y B son observables
del sistema con mínimos en las posiciones xA y
xB, que en el caso de los motores moleculares
que translocan sobre el ADN de cadena sencilla
se corresponden a posiciones de bases contiguas.
En este ejemplo, la aplicación de una fuerza (f)
inhibidora cambia el per�l de energía libre ori-
ginal de la reacción (línea sólida roja) de modo
que la constante de equilibrio se ve afectada de
la forma:
K (f) = K (0) · exp
[
−f ·∆xAB
kBT
]
(1.1)
donde K (0) es la constante de equilibrio de la
reacción en ausencia de fuerza externa y está to-
talmente de�nida por el cociente entre las pro-
babilidades de ocupación de los estados B y A,
que a su vez viene determinado por la diferencia de energía estándar entre estos estados (∆G0).
∆xAB = xB − xA es el cambio conformacional asociado a la transición A → B; kB es la constante
de Boltzmann y T es la temperatura absoluta.
Además de afectar la diferencia de energía estándar ∆G0 entre los estados A y B, si una fuerza
externa se opone a la reacción en un determinado sentido, por ejemplo en el sentido A → B,
entonces la energía libre del estado de transición ∆G‡ relativa a ese estado aumenta la cantidad
f · ∆x‡A, siendo ∆x
‡
A = x
‡ − xA la distancia al estado de transición desde el estado A. Por el
contrario, la diferencia de energía entre el estado B y el estado de transición disminuye una cantidad
f ·∆x‡B con ∆x
‡
B = xB − x‡. En consecuencia, los rates de transición a través de la barrera también
12
1.2 Mecanoquímica de la translocación.
se ven afectados por la fuerza, según (para la transición A→ B):
kA→B (f) = kA→B (0) · exp
[
−
f ·∆x‡A
kBT
]
(1.2)
donde kA→B (0) es el rate de transición del estado A al B en ausencia de fuerza. Una expresión
similar se aplica a la transición B → A.
Por lo tanto, la aplicación de una fuerza externa hace posible modular el equilibrio de una reacción
en la cual ocurre un cambio conformacional, así como afectar los rates independientes en uno u
otro sentido de la reacción. Adicionalmente, permite conocer las distancias características entre los
estados así como la distancia al estado de transición.
Efecto combinado de la fuerza y la concentración de substrato. Como se ha mencionado, la
característica fundamental que de�ne a una proteína como un motor molecular es que utiliza alguna
fuente de energía química para realizar trabajo mecánico. La manera en que se insertan los cambios
conformacionales en el ciclo catalítico de la enzima, o más directamente, la identidad de los pasos
de este ciclo asociados a la generación de fuerza, de�nen la mecanoquímica del motor. Para la
descripción apropiada del ciclo mecanoquímico característico de estos sistemas se deben tener en
cuenta pasos catalíticos que conecten los distintos estados químicos y pasos mecánicos que conecten
los diferentes estados conformacionales. Un camino de reacción debe incluir al menos un paso de
unión del sustrato, un paso de reacción química (hidrólisis), un paso de liberación de productos y
un paso mecánico, asociado a un cambio conformacional (que puede coincidir o no con alguno de los
pasos químicos) (Keller and Bustamante (2000); Bustamante et al. (2004)).
Asumiendo un ciclo mecanoquímico irreversible (como es el caso en el límite cuando la concentración
de productos de la reacción tiende a cero), la velocidad a la que la enzima completa un ciclo, kt, (en
inglés turnover rate) viene dada por la ecuación de Michaelis-Menten:
kt =
kcat · [S]
KM + [S]
(1.3)
donde [S] es la concentración de sustrato, kcat es la velocidad catalítica máxima en unidades de
moles · sec−1 y KM la constante de Michaelis-Menten. En los experimentos en los que se aplica una
fuerza externa, ya sea opuesta o a favor de la dirección de movimiento del motor, la determinación
de la velocidad del motor, dada por v = δ ·kt2, donde δ es el tamaño del paso, en función de la fuerza
2En esta de�nición se ha asumido, por simplicidad, que cada evento de catálisis produce un evento de movimiento
13
Capítulo 1 Introducción
informa sobre el paso del ciclo mecanoquímico implicado en la generación de fuerza (sólo el paso
que conlleva a un cambio conformacional genera una señal observable). Sin embargo, dado que sólo
se puede ver el efecto una vez completado el ciclo, esta curva no nos informa sobre la localización
de este paso (acoplamiento entre la reacción química y el paso mecánico), por lo que es necesario
conocer el comportamiento de esta magnitud a diferentes concentraciones de substrato y producto.
A concentraciones saturantes de substrato ([S] � KM ), la velocidad máxima, v ∼ Vmax = δ · kcat,
es independiente de substrato por lo que va a depender, en general, de todos los rates de transición
excepto aquellos asociados al paso de unión a substrato. A bajas concentraciones ([S] < KM ), la
velocidad está limitada por la unión de substrato, v ∼ δ · kcatKM ·[S], donde kcat/KM es una constante de
unión (binding) efectiva, por lo que va a depender de todos los rates que conectan reversiblemente los
estados de la enzima conectados con el estado de unión a substrato y del rate de entrada al primer
estado irreversible posterior a la unión. En consecuencia, la localización del paso dependiente en
fuerza dentro del ciclo mecanoquímico, o lo que es lo mismo, la identidad de los rates de transición
que dependen de fuerza, dicta como va a ser la dependencia en fuerza de las magnitudes Vmax y kcatKM .
La presencia de un paso ireversible introduce una separación muy clara entre los estados anteriores,
relacionados con la unión a substrato y los posteriores, completamente separados de estos. Tres
casos se pueden dar, en dependencia de donde se localiza el paso dependiente de fuerza (paso de
movimiento) con respecto al paso irreversible del ciclo.
El paso dependiente de fuerza coincide con el paso de unión a substrato. En este caso, una
fuerza que se opone al movimiento del motor actúa como un inhibidor competitivo para el substrato,
desplazando el equilibrio hacia el estado de la enzima libre y reduciendo por tanto la constante
de unión efectiva (kcat/KM ). Sin embargo, la adición de mas substrato contrarresta este efecto,
desplazando el equilibrio de vuelta al estado enzima-substrato. Como resultado, la velocidad a una
concentración in�nita de substrato (Vmax) no se ve afectada por la fuerza mientras que KM aumenta
con la fuerza, ya que cada vez hace falta más substrato para compensar el efecto de la fuerza.
El paso dependiente de fuerza está después del primer paso irreversible y precede al próximo
evento de unión. En este caso, una fuerza opuesta al movimiento del motor afecta el equilibrio
entre estados que no están conectados a la unión de substrato, como un inhibidor no competitivo.
Como resultado, cuando la unión de sustrato es limitante ([S] < KM ), la velocidad (v ∼ δ · kcatKM · [S])
(acoplamiento uno a uno)
14
1.3 Estudios a nivel de moléculas indviduales.
no depende de la fuerza3. En el otro extremo ([S] � KM ), la velocidad (v = Vmax) disminuye con
la fuerza, dado que el paso dependiente de fuerza (translocación) no está asociado a la unión de
substrato, por lo que el efecto de la fuerza permanece aun en condiciones de saturación. En este
caso, KM y Vmax deben tener la misma dependencia en fuerza, para garantizar la independencia de
fuerza de kcat/KM .
El paso dependiente de fuerza coincide con el primer paso irreversible. Este es un caso in-
termedio entre los dos anteriores, en el que una fuerza opuesta actúa como un inhibidor mixto (no
competitivo). Debido a que el paso irreversible está conectado de manera indirecta tanto a los pasos
relacionados con la unión a substrato, como a los posteriores a ésta (corriente abajo del paso irrever-
sible), tanto la constante de unión efectiva kcat/KM como la velocidad a concentraciones saturantes,
Vmax, van a estar afectadas por la fuerza. En estecasoKM puede aumentar o disminuir como función
de la fuerza dependiendo de cómo la fuerza afecte relativamente a Vmax y a kcat/KM .
A pesar de la gran cantidad de estudios estructurales y cinéticos disponibles sobre polimerasas
replicativas, existe debate acerca de cuál de los pasos del ciclo de polimerización conduce a la
translocación []. Dos modelos, el power stroke y el browninan ratchet, han sido propuestos para
explicar el acoplamiento de la energía química y térmica a la translocación. En el contexto del ciclo
de polimerización, un mecanismo de power stroke implicaría que la energía para la translocación
se obtiene de la disociación del producto pirofosfato y es empleada para generar el movimiento
de translocación o lo que es lo mismo, que el paso dependiente de fuerza se corresponde con un
paso posterior a la hidrólisis del nucleótido (paso irreversible). Por otra parte en un mecanismo de
brownian ratchet la unión del nucleótido entrante serviría para �jar la posición translocada en un
sistema que está oscilando, potenciado por las �uctuaciones térmicas, entre las posiciones post- y
pre-translocadas (Guajardo and Sousa (1997); Dahl et al. (2012)), por lo que el paso dependiente
de fuerza sería anterior a la hidrólisis.
1.3. Estudios a nivel de moléculas indviduales.
El estudio de los motores moleculares vinculados al metabolismo de los ácidos nucléicos se ha abor-
dado desde diversas perspectivas experimentales. Por un lado, existe un gran número de estudios
estructurales que proporcionan información detallada sobre las distintas conformaciones del motor
3y por tanto kcat/KM
15
Capítulo 1 Introducción
en cada paso del ciclo mecanoquímico (Steitz (2006); Keller and Brozik (2005)). Sin embargo, aun-
que imprescindibles, estas imágenes son estáticas y no informan sobre los cambios dinámicos que
ocurren entre estados conformacionales del motor. Más aún, en estos estudios sólo es posible observar
uno de los múltiples estados accesibles al sistema, aquel que es más estable en la vencindad de las
condiciones de cristalización, por lo que se escapa la posibilidad de observar intermediarios de vida
corta difíciles de cristalizar.
Por ejemplo, hasta muy recientemente se pensó que los cambios conformacionales observados en el
dominio dedos de las polimerasas de ADN eran responsables de generar el movimiento necesario
para la translocación y que el paso limitante observado en experimentos cinéticos se debía a esta
transición. Posteriormente se ha observado que las conformaciones abierta y cerradas del dominio
dedos se encuentran en un equilibrio rápido (en comparación con el paso limitante) en todo momento,
por lo que este paso no debe ser el limitante.
Por otra parte, ensayos bioquímicos de motilidad y cinética proporcionan una imagen más dinámica
de estos sistemas []. Sin embargo, esta aproximación implica el promediado de señales provenientes
de todas las moléculas presentes en la muestra. Esta aproximación tiene limitaciones debido a tres
aspectos fundamentales: i) Dado que la reacción ocurre de manera estocástica (activada térmica-
mente) una vez comenzada, el alcance de la reacción en el momento de realizar la medición va a
ser diferente, en general, para cada molécula, por lo que la medición va a ser un promediado tem-
poral del estado de avance de la reacción; ii) una vez alcanzado el equilibrio químico, el proceso
de conversión de productos a reaccionantes y viceversa no cesa, sólo se mantiene constante en el
tiempo la proporción de moléculas que están en uno u otro estado. Visualizando el sistema como
un conjunto de reacciones químicas que ocurren en paralelo, en un momento determinado, cierta
proporción de estas reacciones habrán ocurrido en sentido directo (de reaccionantes a productos) y
cierta en sentido inverso. El equilibrio químico es el estado en el cual la proporción de reacciones
que se encuentran en un estado y en otro no cambia y iii) la presencia de molécuals inactivas o
�defectuosas� o de estados inactivos intrínsecos (como por ejemplo las pausas transcripcionales [])
puede llevar a una subdeterminación de las velocidades de catálisis. El resultado de lo anterior es
que al realizar una medición coexisten en la muestra moléculas en diversos estados (en el caso mas
simple, reaccionantes y productos), por lo que la señal pudiera corresponder a estados intermedios
que no se corresponden con ninguno de los estados accesibles al sistema. El efecto inmediato de este
tipo de medición es la observación de trayectorias de reacción suaves, en las cuales no se aprecia el
carácter estocástico intrínseco de las reacciones moleculares.
16
1.3 Estudios a nivel de moléculas indviduales.
Adicionalmente, como ha sido explicado, la fuerza es una variable muy relevante en el estudio de las
propiedades de sistemas macromoleculares, ya sea porque es un producto de la reacción, como en el
caso de los motores moleculares, o porque la aplicación de una fuerza externa permite la exploración
de estados conformacionales no accesibles de otra manera, como es el caso del estudio del plegamiento
de proteínas o las propiedades mecánicas de ácidos nucléicos. Las técnicas estructurales y bioquímicas
no permiten el acceso a esta variable. Sólo investigando una molécula a la vez es posible ejercer fuerza
y/o medir las fuerzas desarrolladas por estos sistemas. Más aún, el acceso a la dinámica de una sola
molécula permite, en principio, la observación directa de las �uctuaciones inherentes a las reacciones
moleculares, así como a todos los intermediarios cinéticos presentes en la reacción a lo largo de la
coordenada mecánica establecida (sólo limitado por la resolución experimental). Como consecuencia
de lo anterior, también es posible observar estados no representativos de la media, pero que ocurren
de manera sistemática así como seleccionar del conjunto sólo las moléculas activas.
Finalmente, debido al carácter estocástico de las reacciones moleculares, las propiedades del siste-
ma determinadas a nivel de molécula única presentarán grandes �uctuaciones. Por esta razón, es
necesario realizar un gran número de mediciones (sobre diferentes moléculas) para obtener una idea
acerca del comprtamiento medio de la magnitud en cuestión. La diferencia entre el promedio que se
realiza en este caso, y el promedio temporal y poblacional que se realiza en los estudios de muchas
moléculas (bulk) radica en que en el primero se promedia sobre propiedades reales del sistema.
1.3.1. Técnicas experimentales de molécula individual
Existe una gran variedad de técnicas experimentales que permiten el estudio de moléculas a nivel
individual (Greenleaf et al. (2007)). De manera general, todas estas técnicas requieren un método
de seguimiento o identi�cación de la molécula en cuestión. Los métodos en los que solamente se
sigue la posición de la molécula, o en general, se monitorea alguna propiedad del sistema sin in�uir
activamente sobre este, se conocen como métodos de seguimiento pasivo. Por otra parte, las técnicas
que permiten la manipulación de moléculas individuales requieren, además de un modo de localizar
espacialmente las moléculas, una sonda, normalmente de tamaño microscópico, capaz de generar o
detectar fuerzas y desplazamientos en la escala molecular(Neuman and Nagy (2008)).
Las pinzas ópticas Las pinzas ópticas es una de las técnicas de manipulación de moléculas in-
dividuales más versátiles. Esta técnica se puede utilizar como una herramienta cuantitativa capaz
17
Capítulo 1 Introducción
de ejercer fuerzas calibradas sobre sistemas moleculares de interés, así como para medir con gran
precisión y sensibilidad las fuerzas y desplazamientos generados por estos sistemas.
Debido a que la luz porta momento lineal y angular, es capaz de ejercer fuerzas y torques en su
interacción con la materia. Las pinzas ópticas explotan esta propiedad fundamental para atrapar
objetos en un pozo de potencial tridimensional (Ashkin (1970); Ashkin et al.(1986)). Las trampas
ópticas involucran el balance de dos fuerzas: las fuerzas de dispersión, las cuales empujan los objetos
a lo largo de la dirección de propagación de la luz y las fuerzas de gradiente, las cuales atraen a
los objetos dieléctricos a lo largo de un gradiente espacial de intensidad de la luz [Ricardo]. En
las implementaciones prácticas de trampas ópticas, un haz láser de longitud de onda en el infrarojo
cercano es fuertemente enfocado por un objetivo de microscopio de alta apertura numérica para crear
el gradiente espacial de intensidad necesario para formar una trampa estable (Neuman and Block
(2004)). En la vecindad de este foco, la trampa óptica se comporta como un resorte lineal, generando
fuerzas sobre el objeto atrapado, en el rango de 0,1 a 100 pN4, proporcionales al desplazamiento de
este con respecto al centro de la trampa. Esta escala de fuerzas, en comparación con otras técnicas de
manipulación basadas en fuerza, (Neuman and Nagy (2008)), es de especial relevancia en el estudio
de los motores asociados al metabolismo del ADN (Mo�tt et al. (2008)).
La magnitud de las fuerzas ópticas es generalmente insu�ciente para atrapar establemente macro-
moléculas biológicas directamente, pero son más que su�ciente para atrapar objetos dieléctricos
microscópicos, tales como microesferas de polyestireno, las cuales pueden ser unidas bioquímica-
mente a las macromoléculas de interés. En la mayoría de los experimentos de molécula individual
utilizando pinzas ópticas, estas microesferas sirven como agarraderas del sistema biológico, permi-
tiendo su manipulación en el interior de una celda de reacción. Ejercer fuerzas calibradas sobre la
molécula de interés, generalmente requiere que esta se una a otro punto de manipulación por el
otro extremo. Típicamente, este segundo punto consiste en la super�cie de la celda de reacción, una
segunda microesfera mantenida mediante succión en la punta de una micropipeta o una miroesfera
mantenida en una segunda trampa óptica ( Bustamante et al. (2000a, 2003); Greenleaf et al. (2007)).
De esta manera, es posible estirar el sistema mediante el movimiento relativo de la trampa óptica
con respecto al segundo punto de unión. Una vez establecida una coordenada mecánica de reacción,
y gracias a los muy sensibles métodos de detección de la posición y la fuerza, es posible seguir en
�tiempo real� la evolución del sistema molecular en determinadas condiciones de reacción.
41 pN = 10−12 Newtons
18
1.3 Estudios a nivel de moléculas indviduales.
1.3.2. Aplicaciones al estudio de la replicación del ADN
A nivel de moléculas individuales, la actividad de los motores implicados en la replicación se puede
investigar a través de los cambios conformacionales que estos imponen sobre el ADN durante su
actividad, por lo que el conocimiento de las propiedades físicas, y en particular elásticas de este
biopolímero resulta esencial. Las propiedades físicas de la doble hélice de ADN son diferentes a
los de cualquier otro polímero natural o sintético. El apilamiento de las bases y la arquitectura
trenzada le con�eren una rigidez inusual. Más aún, el esqueleto de fosfatos lo convierten en uno de
los polímeros conocidos con mayor densidad de carga lineal.
Propiedades mecánicas del ADN. Aunque las propiedades mecánicas varían con la secuencia local
y la estructura de la hélice, las propiedades físicas más relevantes en el contexto biológico se pueden
describir utilizando un modelo de grano-grueso conocido como worm-like chain (WLC ) Kratky and
Porod (1949), el cual caracteriza al polímero como una línea continua que se dobla suavemente
bajo la in�uencia de las �uctuaciones térmicas aleatorias. En su variante más simple, este modelo
caracteriza la elasticidad del ADN a través de un único parámetro, la longitud de persistencia P , que
de�ne la distancia promedio a la que se pierde la linealidad local del polímero. De acuerdo con este
modelo, es energéticamente más favorable doblar la molécula suavemente, distribuyendo el estrés a
lo largo de distancias grandes que doblarlo localmente en regiones más pequeñas que la longitud de
persistencia (P ∼ 50 nm para el dsDNA y P ∼ 1,5 nm para el ssDNA, en condiciones �siológicas)
(Schellman (1974)). El modelo WLC conecta explícitamente la elasticidad local con la conformación
global de la molécula: un polímero con menor oposición a la �exión (menor longitud de persistencia)
tiende a adoptar una estructura de ovillo más compacta.
Un polímero �exible se enrolla aleatoriamente en solución, dando como resultado una distancia entre
extremos mucho más corta que su longitud de contorno. Estirar la molécula hacia un estado más
extendido es entrópicamente desfavorable, ya que el número de conformaciones disponibles disminuye
a extensiones más largas, siendo el límite una sola conformación posible (una línea recta perfecta)
para la extensión máxima (Bustamante et al. (1994)). La distancia entre extremos de la molécula,
y la fuerza necesaria para estirarla, son las variables con las que comúnmente se describe, a nivel de
moléculas individuales la elasticidad del ADN (Smith et al. (1992, 1996); Wang et al. (1997b)).
Para el ADN de doble cadena, la curva de fuerza extensión muestra un comportamiento no lineal:
por debajo de 6 pN, la fuerza se emplea para vencer el enrollamiento entrópico causado por las
19
Capítulo 1 Introducción
F
ue
rz
a
 (
pN
) 60
40
20
0
80
0 0.5 1 1.5 2
Extensión Normlizada
dsDNA
ssDNA
WLC
inextensible
Sobreestiramiento
pol
dsDNA = ssDNA
Figura 1.5: Adaptado de Bustamante et al. (2003). Curva de fuerza extensión experimental, por par de bases, del
ADN de cadena doble (línea discontínua azul) y sencilla (línea discontínua verde) con los respectivos ajustes del
modelo WLC (línea sólida roja). La �echa horizontal muestra el cambio en distancia observado, por par de bases,
al mantener la tensión en el ADN constante durante la reacción de polimerización (pol).
�uctuaciones térmicas. Por encima de 6 pN, la molécula se extiende como un resorte lineal hasta
llegar a aprox 65pN, fuerza a la que ocurre una transición de sobre estiramiento. Por el contrario,
el ADN de cadena sencilla es un polímero mucho más �exible, por lo que adopta una con�guración
más compacta a bajas fuerzas, como resultado de lo cual se establecen numerosas interacciones
intramoleculares débiles que conducen a una extensión de extremo a extremo más corta. En el límite
opuesto, donde la fuerza de estiramiento es su�ciente para romper las interacciones intramoleculares,
el ssDNA se extiende considerablemente más que su homólogo de doble cadena, debido a que no
está restringido a adoptar una estructura helicoidal Smith et al. (1996), Figura 1.5.
Efecto de la tensión en el molde sobre la actividad de polimerización Como se ha mencionado
las polimerasa de ADN son motores moleculares que translocan sobre el ADN de cadena sencilla al
tiempo que incorporan el nucleótido complementario al extremo 3' de la cadena naciente. Dicho de
otra manera, estas proteínas convierten secuencialmente una molécula de ADN de cadena sencilla en
ADN de cadena doble, Figura 1.5. Esta propiedad ha sido explotada para observar la actividad de
replicación de polimerasas de ADN individuales, Figura 1.6 (a). En estos experimentos, una molécula
de ADN de cadena sencilla es estirada entre dos super�cies al tiempo que una polimerasa replica
la molécula, mantenida a una tensión constante. La actividad de replicación se puede monitorear
en tiempo real mediante el seguimiento de la extensión (por debajo de 6 pN) o contracción (por
encima de 6 pN) de la molécula anclada entre los dos puntos. Estos estudios mostraron que el
20
1.3 Estudios a nivel de moléculas indviduales.
paso limitante de la velocidad de replicación, es sensible a la tensión en el ADN y es capaz de
generar fuerzas tan altas como 35 pN . Un resultado sorprendente fue la inducción de actividad de
exonucleólisis procesiva a tensiones por encimade 40 pN Wuite et al. (2000); Maier et al. (2000).
En un estudio relacionado, utilizando la polimerasa de ADN de Phi29 salvaje y dos mutantes,
fue posible proponer dos intermediarios de la reacción de transferencia intramolecular del primer,
uno correspondiente a una conformación funcional sensible a la tensión y uno inactivo que pudiera
funcionar como punto de control para la reacción de corrección de errores Ibarra et al. (2009).
Figura 1.6: Ejemplo de aplicaciones de las técnicas de manipulación de moléculas individuales al estudio de
polimerasas de ADN , ARN y helicasas a nivel de moléculas individuales. (a) Adaptado de Wuite et al. (2000) y
Ibarra et al. (2009). Una molécula de ssDNA con un inicio de replicación es mantenida a tensión constante entre una
microesfera en la trampa óptica y una microesfera en la punta de una micropipeta. La actividad de polimerización
se observa como un cambio en distancia, a tensión constante, en la molécula de ADN . (b) Adaptado de Manosas
et al. (2012b). Mediante la utilización de imanes, es posible ejercer fuerzas sobre una molécula de ADN anclada
entre una super�cie funcionalizada y una micoresfera magnética para observar en tiempo real el acoplamiento entre
las actavidades de desplazamiento de banda (en este estudio con la helicasa de T4) y la actividad de replicación
de la polimerasa de ADN (en este estudio de T4 , T7 y Phi29 ). (c) Adaptado de Thomen et al. (2008). Al unir la
polimerasa de ARN de T7 directamente a una supre�cie funcionalizada y el extremo corriente abajo de la molécula
de ADN a una micoresfera atrapada ópticamente los autores pudieron ejercer tensión mecánica directamente sobre
la enzima a diferentes concentraciones de substrato e iones Magnesio.
Efecto de la tensión en la juntura de la horquilla en la actividad helicasa. Además de estirar
la molécula linealmente, es posible aplicar tensión en cada una de las cadenas que forman una
21
Capítulo 1 Introducción
horquilla de ADN, promoviendo la apertura mecánica de la doble hebra Essevaz-Roulet et al. (1997);
Bockelmann et al. (2002). El patrón de apertura mecánica del ADN tiene una forma de diente de
sierra cuyos picos guardan una relación muy estrecha con la secuencia de la horquilla. Este tipo de
experimentos ofrecen información de primera mano sobre el papel que juegan las interacciones entre
pares de bases y entre pares de bases vecinos (apilamiento de las bases) en la estabilidad global de
la molécula Huguet et al. (2010).
La desnaturalización mecánica del ADN tiene especial relevancia en el estudio de la actividad he-
licasa. Las helicasas son motores moleculares que se mueven a lo largo de una de las cadenas del
ADN, promoviendo la separación de la cadena complementaria. En este proceso, la interacción entre
la helicasa y la horquilla tiene carácter local: ocurre en la interface entre la porción de cadena doble
(corriente abajo) y sencilla. A diferencia de los procesos de desnaturalización térmica o por pH,
en los cuales toda la molécula está expuesta al agente desnaturalizante, la aplicación de tensión en
cada una de las cadenas, en la dirección de apertura, interroga especí�camente la estabilidad de la
juntura, por lo que simula de manera simpli�cada la forma en que las helicasas abren el ADN.
Este hecho ha sido explotado para interrogar si las helicasas interactúan con la horquilla de mane-
ra activa: los cambios conformacionales provocados por la hidrólisis del ATP son su�cientes para
translocar y a la vez desestabilizar la horquilla completamente; o pasiva: sólo tienen la capacidad
de translocación y necesitan que los primeros pares de bases de la horquilla se abran espontánea-
mente para avanzar y de esta manera evitar que se cierren Betterton and Julicher (2005). En la
con�guración experimental típica, la horquilla se mantiene a una tensión inferior a la necesaria para
abrirla (aprox 14 pN). Dado que la tensión en esta con�guración asiste la reacción de apertura de
la doble hebra, un mecanismo pasivo se vería favorecido por la aplicación de tensiones crecientes,
mientras uno activo no (cualquiera sea la tensión, una enzima activa sería capaz de abrir la doble
hebra e�cientemente). Los resultados más relevantes muestran que las helicasas utilizan mecanismos
de apertura que van desde prácticamente activo, como es el caso de la helicasa NS3 del virus de la
hepatitis C Cheng et al. (2007), parcialmente activo, como en el caso de la helicasa gp4 del fago T7
Johnson et al. (2007) hasta un mecanismo prácticamente pasivo, como es el caso de la helicasa gp41
del fago T4 Lionnet et al. (2007).
Acoplamiento entre apertura de la doble hebra y replicación. Este diseño experimental (en
este caso con pinzas magnéticas De Vlaminck and Dekker (2012)) ha sido utilizado para elucidar
el acoplamiento entre la actividad de polimerización de las polimerasas de los fagos T4, T7 y del
22
1.3 Estudios a nivel de moléculas indviduales.
bacteriófago Phi29 y la actividad de desplazamiento de banda de la helicasa gp41 de T4 Manosas
et al. (2012a). Experimentos con las polimerasas aisladas mostraron la síntesis rápida y procesiva
de la cadena líder unido a una capacidad de apertura de la doble hebra de�ciente. Adicionalmente,
se observa una actividad exonucleasa procesiva a bajas fuerzas, que se debe, según los autores, a
que la horquilla corriente abajo de la polimerasa genera una presión de regresión (ver) que inhibe
el movimiento de la polimerasa hacia adelante (en sentido de polimerización). Por el contrario, en
presencia de la helicasa de T4 el sistema acoplado (polimerasa más helicasa) es capaz de sintetizar
el ADN a la velocidad máxima5, excepto en el caso de Phi 29 en el que la velocidad de replicación
se observó muy similar en presencia y en ausencia de la horquilla. Finalmente, los autores proponen
un modelo de colaboración en el cual la helicasa libera la presión de regresión de la horquilla sobre
la polimerasa, permitiéndole adoptar una conformación de polimerización procesiva y a su vez, la
polimerasa desestabiliza las primeras bases de la horquilla y por tanto incrementa la e�ciencia de
apertura de la doble hebra mediada por la helicasaManosas et al. (2012b). Este último aspecto ya
había sido observado para el sistema de T7 Stano et al. (2005).
Mecanoquímica de RNAp de T7 El estudio experimental de la mecanoquímica de motores mo-
leculares requiere acceder a la coordenada mecánica de translocación al tiempo que se varía la
concentración de los cofactores químicos. En los experimentos de molécula individual descritos hasta
ahora, la coordenada mecánica con la que se interroga al sistema polimerasa-ADN (o Helicasa-ADN
o Helicasa-Polimerasa-ADN) es la distancia entre extremos de la molécula de ADN, en una con�gura-
ción geométrica u otra. Por esta razón, los cambios conformacionales detectados experimentalmente
sólo informan del efecto que tiene la actividad de estos motores sobre el ADN y no sobre los grados
de libertad internos de los mismos. Por el contrario, la aplicación de una fuerza directamente sobre
el motor, hace posible acceder a la coordenada mecánica de translocación.
Para lograr esto, la estrategia más utilizada consiste en unir la proteína en complejo con el ADN
directamente, o a través de una molécula espaciadora, a la super�cie pasiva y unir el otro extremo
del ADN a la microesfera localizada en la trampa óptica. De esta manera, el movimiento relativo
entre la super�cie pasiva y la trampa óptica, genera una tensión mecánica que es trasmitida a la
proteína a través del ADN.
Estudios de la polimerasa de ARN de T7, estructuralmente similar a las polimerasas de ADN Sousa
et al. (1993), bajo el efecto de una fuerza opuesta al movimiento y variando la concentración de
5Velocidad de extensión del primer en ausencia de la horquilla
23
Capítulo 1 Introducción
nucleótidos y magnesio revelaron que la fuerza actúa como un inhibidor competitivo para la unión
de nucleótidos y que los iones de de magnesioestán involucrados en un paso que no depende de la
fuerza externa Thomen et al. (2005, 2008). Utilizando la información obtenida en los experimentos
de molécula individual, junto a la información bioquímica, de mutagénesis y estructural disponible
para este sistema Yin et al. (2004), los autores proponen un mecanismo de translocación del tipo
Brownian ratchet, en el cual la polimerasa �uctúa entre los estados pre- y post-translocados y la
hidrólisis de los NTP y la posterior liberación del producto, �ja a la polimerasa irreversiblemente
en el estado post-translocado. Un mecanismo de Power stroke, en el cual la translocación está
promovida directamente por la liberación de producto resulta incompatible con las observaciones
experimentales.
1.4. La polimerasa de ADN de Phi29
En esta tesis hemos escogido a la polimerasa de ADN de Phi29 (Phi29DNAp) como sistema modelo
para el estudio, a nivel de moléculas individuales, de la mecanoquímica de las polimerasas de ADN de
la familia B y del acoplamiento entre las actividades de polimerización y desplazamiento de banda.
Esta elección se basa en cuatro aspectos fundamentales: i) Este sistema está muy bien caracterizado
a nivel bioquímico Blanco and Salas (1996) y ii) estructural Kamtekar et al. (2004); Berman et al.
(2007); iii) es una polimerasa replicativa altamente procesiva, lo cual facilita la observación de
trazas de replicación largas (con muchos pasos del ciclo de polimerización) y iv) posee actividad de
desplazamiento de banda acoplada a replicación en la misma proteína, lo cual resulta ideal para el
estudio del acoplamiento entre estas actividades. Adicionalmente, existen estudios previos, a nivel de
moléculas individuales, del efecto que tiene la tensión en el ADN sobre la actividad de esta proteína
Ibarra et al. (2009).
Phi29 es un bacteriófago de B. subtilis con un genoma lineal de 19.2 kb de dsDNA. En este sistema la
replicación se inicia de manera no sincronizada desde cada extremo del genoma, cuando la polimerasa
de Phi29 se une a una proteína primer unida a cada extremo 5' del genoma (TP del inglés Terminal
Portein) Salas et al. (1978). Después de la adición de 10 nucleótidos, la polimerasa se disocia de la
TP y replica procesivamente el resto del genoma del fago Blanco and Salas (1985); Blanco et al.
(1989); Mendez et al. (1997). Según avanza desde cada origen de replicación, la polimerasa va
generando grandes cantidades de ADN de cadena sencilla (la cadena desplazada) que es protegido
de la degradación por la proteína de unión a cadena sencilla de Phi29 (Phi29 SSB, del inglés Single
24
1.4 La polimerasa de ADN de Phi29
stranded binding protein) hasta que la cadena desplazada se convierte en molde y es replicada por
la polimerasa que avanza desde el origen de replicación opuesto, por lo que en este sistema no existe
el equivalente a síntesis de la cadena retrasada.
La polimerasa de ADN de Phi29 consiste en un dominio de exonucleólisis (exo) N-terminal y un
dominio de polimerización (pol) C-terminal. A pesar de que no contiene el dominio regulatorio N-
terminal observado en otras polimerasas de la famila B cuyas estructuras se conocen Wang et al.
(1997a); Zhao et al. (1999); Hopfner et al. (1999); Rodriguez et al. (2000); Hashimoto et al. (2001),
la estructura y orientación relativa de los dominios exo y pol encajan bien en la arquitectura global
de las polimerasas de ADN de esta familia. El dominio de exo está estructuralmente conservado a
lo largo de las familias A, B y C y comparte un mecanismo común de catálisis mediada por dos
iones metálicos que se unen a la enzima a través de cuatro grupos carboxilatos. Estos grupos han
sido indenti�cados en el dominio exo de la Phi29 ADNp Bernad et al. (1990); Soengas et al. (1992);
Esteban et al. (1994).
Molde
Molde
Nucleótido 
entrante
Túnel 
corriente 
abajo
Nucleótido +1(a) (b)
Figura 1.7: Estructura de la polimerasa de Phi29. (a) Representación tipo cinta de la organización de dominios
de la polimerasa de Phi29: dominio de exonucleólisis (rojo), palma (rosa), TPR1 (dorado), dedos (azul), TPR2
(cian) y pulgar (verde). El ADN que se muestra proviene del complejo ternario de RB69 (Franklin et al. (2001)) y
ha sido modelado sobre la estructura de la polimerasa de Phi29 usando como único elemento de alineamiento los
dominios palma de las estructuras de RB69 y Phi29 (Kamtekar et al. (2004)). Las posiciones del primer modelado
(gris claro), el molde (gris oscuro) y el nucleótido entrante (amarillo, representación de esferas sólidas) se indican.
(b): Representación tipo espacio-relleno de la polimerasa cortada a través de un plano que muestra el substrato
primer-molde y el ADN de cadena sencilla 5' en el túnel corriente abajo. El nucleótido +1 se muestra en amarillo,
el nucleótido entrante en magenta, la cadena primer en verde y la cadena molde en azul.
Adicionalmente a los subdominios encontrados en la arquitectura general del dominio de polime-
25
Capítulo 1 Introducción
rización de las polimerasas replicativas Joyce and Steitz (1994), la polimerasa de Phi29 posee dos
inserciones de secuencia asociadas con la interacción con la TP llamadas regiones de proteína ter-
minal 1 y 2 (TPR1 y TPR2, del inglés terminal protein region). Estos dominios, que son especí�cos
de polimerasas que inician la replicación mediada por proteínas, Salas et al. (1978), interactúan con
los dominios intermedio y primer de la TP respectivamente Dufour et al. (2000).
Residuos del subdominio palma, pulgar, TPR1 y TPR2 y del dominio exo encierran una apertura
hacia el sitio activo que envuelve el dsDNA corriente arriba. Un giro beta en la punta del dominio
pulgar, que es pequeño en comparación con el de otras polimerasas de la misma familia, contacta la
punta del dominio TPR2 para formar un arco capaz de envolver el ADN y mejorar la procesividad,
de manera análoga a como lo hacen los sliding clamps (Abrazadera, pinza, mordaza) presentes como
proteínas independientes en otros replisomas Kamtekar et al. (2004).
Un segundo túnel formado por residuos del dominio TPR2, exo, palma y dedos rodea la cadena
molde corriente abajo del sitio activo pol. Las pequeñas dimensiones de este túnel, menos de 10Å de
largo y aproximadamente 10Å de diámetro, obliga a las cadenas molde y complementaria a separarse
para que la cadena molde pueda entrar al sitio activo, proporcionado una base estructural para la
actividad de desplazamiento de banda observada en Phi29 Kamtekar et al. (2004). Por otra parte,
una conformación abierta del túnel sería necesaria para ensartar el molde durante la replicación
ssDNA circular []. Adicionalmente, in vivo la última base de la cadena molde se encuentra unida
covalentemente a la proteína terminal y el túnel, en su con�guración cerrada no permite el paso de
la TP al interior de la polimerasa por lo que la disociación de la polimerasa del ADN requiere una
conformación abierta también.
El dominio TPR2 presenta una con�guración espacial que se enfrenta directamente a la juntura de
la horquilla corriente abajo. Esta conformación está estabilizada por los contactos que se establecen
entre el dominio pulgar y TPR2. Por otra parte el sitio activo exo, de�nido por la presencia de
los aminoácidos que unen iones metálicos (Asp12 y Glu14 del motivo Exo I, Asp66 del Exo II,
Asp169 del Exo III y Lys143 del Kx2hxA), está formado por residuos de los dominios exo y por
residuos pertenecientes a la punta del subdominio pulgar. Mutaciones introducidas en los residuos
catalíticos responsables de la actividad de exonucleólisis, además de inactivar esta actividad, afectan
severamente la actividad de desplazamiento de banda Soengas et al. (1992); de Vega et al. (1997).
Sorprendentemente, estas mutaciones no afectan la capacidad de síntesis procesiva en ausencia de
cadena doble. El hecho de que ninguna de las mutaciones introducidas en los residuos vinculados
con la unión de la proteína a ssDNA en el sitio activo exo afecten la capacidad de desplazamiento26
1.4 La polimerasa de ADN de Phi29
de banda y que los datos cristalográ�cos descarten contactos entre la cadena desplazada y el sitio
activo exo hace suponer que la estabilidad de la interacción exo-pulgar esté fuertemente in�uida por la
unión de iones metálicos en esa región Esteban et al. (1994).Una distorsión sutil en el dominio pulgar
pudiera causar una orientación inapropiada del dominio TPR2 y explicar por tanto la pérdida de la
capacidad de desplazamiento de banda. En esta tesis, hemos escogido el doble mutante D12AD66A
(Soengas et al. (1992)) para estudiar el proceso de acoplamiento entre las actividades de replicación y
desplazamiento de banda en una polimerasa de�ciente en desplazamiento de banda pero que conserva
las propiedades de extensión del primer y compararla con la polimerasa salvaje.
27
2 Objetivos
Los objetivos de esta tesis se centran en dos proyectos diferentes, pero estrechamente relacionados.
1. Estudio del mecanismo de acoplamiento entre las actividades de repli-
cación y apertura del ADN. Utilizando la técnica de pinzas ópticas y la polimerasa
de ADN de Phi29 como modelo, pretendemos estudiar a nivel de moléculas individuales el
mecanismo de acoplamiento entre las actividades de replicación y desplazamiento de banda
de esta proteína y elucidar el mecanismo físico que utiliza esta enzima para desestabilizar la
doble hebra de ADN que encuentra a su paso. Para ello planteamos los siguientes objetivos
especí�cos:
a) Desarrollar un sistema experimental, utilizando pinzas ópticas, que permita detectar, a
nivel de moléculas individuales, las actividades de replicación y desplazamiento de banda
de manera diferenciada.
b) Determinar la dependencia de la velocidad de replicación y sus �uctuaciones (pausas) con
factores que afectan la estabilidad de la juntura de la doble hélice tales como la secuencia
y la fuerza externa aplicada sobre la juntura en la dirección de apertura.
c) Implementar un modelo teórico que explique la dependencia de la velocidad de replica-
ción con los factores que modulan la estabilidad de la juntura y que permita cuanti�car
la capacidad de la polimerasa de desestabilizar la doble hélice durante el proceso de
replicación.
2. Estudio del mecanismo de translocación de las polimerasas replicativas
de ADN. Para abordar el estudio de la dinámica y mecanoquímica del proceso de translo-
cación de la polimerasa de Phi29 sobre la cadena sencilla del ADN planteamos los siguientes
objetivos especí�cos:
a) Desarrollar un sistema experimental que permita inmovilizar la polimerasa de Phi29 en
una super�cie de modo que sea posible aplicar fuerzas externas directamente sobre la
29
Capítulo 2 Objetivos
proteína. Detectar a nivel de moléculas individuales la actividad de polimerización de la
polimerasa de Phi29 unida a la super�cie pasiva del instrumento de pinzas ópticas.
b) Determinar la dependencia de la cinética de replicación con la aplicación de fuerzas ex-
ternas en las direcciones a favor y en contra del movimiento a diferentes concentraciones
de dNTP.
30
3 Materiales y Métodos
3.1. El instrumento de pinzas ópticas.
Los experimentos mostrados en esta tesis se realizaron utilizando un instrumento de pinzas ópticas
de doble haz, diseñado por Smith et al. (2003) y construido en nuestro laboratorio por Hormeño... El
uso de haces contrapropagantes permite generar una trampa óptica estable combinando la utilización
de haces de baja apertura numérica y objetivos de alta apertura numérica a la vez que hace posible
colectar y analizar toda la luz que sale de la trampa en ambas direcciones. Esta última condición
permite aplicar el principio de conservación del momento lineal para determinar la fuerza externa
que actúa sobre una partícula atrapada: la variación del cambio de momento de todos los fotones
que entran y salen de la trampa es igual a la fuerza que actúa sobre la partícula atrapada.
Determinación de la Fuerza Cuando una fuerza externa actúa sobre la partícula, la distribución
angular de intensidad, colectada en detectores fotodiodo sensibles a posición de tipo continuo (DL-10,
United Detector Technology) colocados en los planos principales imagen de los objetivos (nikon..)
varía. A partir de las señales reportadas por los detectores y de constantes conocidas, es posible
calcular las componentes transversales de la fuerza como (Smith et al. (2003)):
Fx =
DxRD
cΨRL
Fy =
DyRD
cΨRL
(3.1)
donde Dx y Dy son las señales del detector en las direcciones x e y, proporcionales a la sensibilidad
Ψ del detector y a la suma de las irradiancias locales multiplicadas por sus distancias relativas al
centro del detector xRD o
y
RD
siendo RD la mitad de la anchura del detector. RL es un radio efectivo
para la lente igual a su distancia focal y c la velocidad de la luz en el vacío.
La calibración de este sistema es independiente de la potencia del láser, del índice de refracción del
tampón, del tamaño, forma o índice de refracción de la partícula atrapada. Más aun, las pérdidas de
31
Capítulo 3 Materiales y Métodos
luz en las lentes de los objetivos y la óptica asociada se pueden incluir, siempre que sean constantes,
en una sensibilidad efectiva de los detectores.
Medición de distancias La distancia entre una microesfera en la trampa óptica y otra localizada
en la punta de una micropipeta móvil se determinó utilizando dos métodos complementarios para
determinar la posición de cada microesfera por separado.
Por un lado, se utilizó la imagen de video microscopía del plano imagen, coincidente con la posición
en la dirección z de la trampa óptica y con la posición de la microesfera localizada en la pipeta
(enfocada con este propósito), captada en una cámara ccd. Sobre las imágenes capturadas se aplica
un algoritmo que localiza el centro de las esferas y devuelve la posición promedio en píxeles en x e
y. Este método requiere la calibración previa de la cámara ccd para conocer la relación pı́xel/µm.
Por otra parte, para determinar la posición de la microesfera ubicada en la pipeta con mayor re-
solución se utilizó un sistema basado en la refracción de luz (en inglés light-lever). Este dispositivo
está compuesto por una �bra óptica unida a un láser de diodo (LPF-3224-635-FC, Thorlabs), un
detector sensible a la posición (DL-10, United Detector Technology) y una lente (C140TM-B, Nikon,
f = 1,45 mm) insertada en el marco de la cámara de �uidos. Esta lente colima la luz desde la �bra y
dirige el haz de salida sobre el fotodetector. Puesto que la distancia focal de la lente es muy pequeña
en comparación con su distancia al detector (640 mm), un desplazamiento pequeño de la lente (y,
por lo tanto, de la micropipeta �jada en la cámara de �uidos) se traduce en un movimiento ∼ 420
veces mayor de la luz sobre el detector. Finalmente se construye una curva de calibración con las
medidas en µm provenientes de la imagen de video-microscopia y las medidas a mayor resolución
provenientes del foto-detector sensible a la posición del dispositivo ligth-lever.
Para determinar con mayor resolución la posición de la microesfera atrapada ópticamente, se cons-
truyó una curva de calibración con las posiciones obtenidas a partir de la imagen de videomicroscopía
y la lectura del detector destinado al cálculo de la fuerza en la dirección y, Dy. Este método permi-
tió además comprobar, en cada experimento, la validez de la asunción de linealidad entre fuerza y
distancia en la trampa óptica Jahnel et al. (2011).
La mayoría de los experimentos se realizaron en un régimen de retroalimentación de fuerza, con-
sistente en corregir la distancia entre las micreosferas con el �n de mantener la tensión en el ADN
constante. La frecuencia de adquisición de datos está determinada por el límite que impone el ré-
gimen de retroalimentación, 60 Hz. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente
(23± 2 ºC)
32
3.1 El instrumento de pinzas ópticas.
3.1.1. Diseño de la celda de �uidos y sistema de �uidos.