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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERIA AMBIENTAL TESIS EVALUACIÓN DE LA PLUMA DE CONTAMINACIÓN EN SUELO AGRÍCOLA POR PRESENCIA DE GLIFOSATO TRABAJO EXPERIMENTAL SERVICIOS AMBIENTALES AUTOR VASQUEZ CORTEZ ARIANA ESTEFANIA GUAYAQUIL – ECUADOR 2020 PORTADA 2 UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERÍA AMBIENTAL EVALUACIÓN DE LA PLUMA DE CONTAMINACIÓN EN SUELO AGRÍCOLA POR PRESENCIA DE GLIFOSATO EXPERIMENTAL Trabajo de titulación presentado como requisito para la obtención del título de INGENIERA AMBIENTAL AUTOR VASQUEZ CORTEZ ARIANA ESTEFANIA TUTOR ING. ARCOS JÁCOME DIEGO, MSc. GUAYAQUIL – ECUADOR 2020 3 UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERIA AMBIENTAL APROBACIÓN DEL TUTOR Yo, ARCOS JÁCOME DIEGO ARMANDO, docente de la Universidad Agraria del Ecuador, en mi calidad de Tutor, certifico que el presente trabajo de titulación: EVALUACIÓN DE LA PLUMA DE CONTAMINACIÓN EN SUELO AGRÍCOLA POR PRESENCIA DE GLIFOSATO, realizado por la estudiante VASQUEZ CORTEZ ARIANA ESTEFANIA; con cédula de identidad N°172221871-4 de la carrera INGENIERÍA AMBIENTAL, Unidad Académica Guayaquil, ha sido orientado y revisado durante su ejecución; y cumple con los requisitos técnicos exigidos por la Universidad Agraria del Ecuador; por lo tanto se aprueba la presentación del mismo. Atentamente, Ing. Arcos Jácome Diego Armando Tutor Guayaquil, 08 de julio del 2020 4 UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERIA AMBIENTAL APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN Los abajo firmantes, docentes designados por el H. Consejo Directivo como miembros del Tribunal de Sustentación, aprobamos la defensa del trabajo de titulación: “EVALUACIÓN DE LA PLUMA DE CONTAMINACIÓN EN SUELO AGRÍCOLA POR PRESENCIA DE GLIFOSATO”, realizado por la estudiante VASQUEZ CORTEZ ARIANA ESTEFANIA, el mismo que cumple con los requisitos exigidos por la Universidad Agraria del Ecuador. Atentamente, ING. MUÑOZ NARANJO DIEGO, M.Sc. PRESIDENTE ING. MOROCHO ROSERO LUIS, M.Sc ING. CRESPO LEÓN KARLA, M.Sc. EXAMINADOR PRINCIPAL EXAMINADOR PRINCIPAL ING. ARCOS JÁCOME DIEGO, M.Sc. EXAMINADOR SUPLENTE Guayaquil, 06 de julio del 2020 5 Dedicatoria A Dios que siempre me sostuvo de su mano para no darme por vencida. A mi madre por el apoyo que me brindo para culminar con mi carrera, te amo y eres mi gran inspiración. A mi madrina Fernanda Plata por su cariño y apoyo. A los jefes de mi madre, el Arq. José Salvador Salazar y su esposa Dominique de Salvador por la consideración, apoyo incondicional y motivación. 6 Agradecimiento Gracias a mi tutor Ing. Diego Arcos Jácome por ser un gran apoyo para culminar con mi trabajo de tesis, por su tiempo y generosidad. Sin duda alguna un gran profesional. Gracias al Ing. Carlos Banchón Bajaña por siempre motivarme, aportando con sus conocimientos para mi trabajo de titulación y siempre querer lo mejor para sus estudiantes. Un excelente profesional y persona. A cada maestro que impartieron sus conocimientos durante los 5 años de estudio. A la Universidad Agraria del Ecuador por permitirme ser parte de su institución y haberme formado como profesional. 7 Autorización de Autoría Intelectual Yo VASQUEZ CORTEZ ARIANA ESTEFANIA en calidad de autora del proyecto realizado, sobre “EVALUACIÓN DE LA PLUMA DE CONTAMINACIÓN EN SUELO AGRÍCOLA POR PRESENCIA DE GLIFOSATO para optar el título de INGENIERA AMBIENTAL, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación. Los derechos que como autora me correspondan, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento. Guayaquil, 09 de julio del 2020 VASQUEZ CORTEZ ARIANA ESTEFANIA C.I. 172221871-4 8 Índice General PORTADA .............................................................................................................. 1 APROBACIÓN DEL TUTOR ................................................................................. 3 APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN ........................................ 4 Dedicatoria ............................................................................................................ 5 Agradecimiento .................................................................................................... 6 Autorización de Autoría Intelectual .................................................................... 7 Índice General ....................................................................................................... 8 Índice de tablas .................................................................................................. 13 Índice de figuras ................................................................................................. 15 Resumen ............................................................................................................. 17 Abstract ............................................................................................................... 18 1. Introducción .................................................................................................... 19 1.1 Antecedentes del problema ......................................................................... 19 1.2 Planteamiento y formulación del problema ............................................... 21 1.2.1 Planteamiento del problema ................................................................ 21 1.2.2 Formulación del problema ................................................................... 23 1.3 Justificación de la investigación ................................................................ 23 1.4 Delimitación de la investigación ................................................................. 23 1.5 Objetivo general ........................................................................................... 23 1.6 Objetivos específicos................................................................................... 23 2. Marco teórico .................................................................................................. 25 2.1 Estado del arte .............................................................................................. 25 2.2 Bases teóricas .............................................................................................. 28 9 2.2.1 Suelo contaminado ............................................................................... 28 2.2.2 Fugacidad .............................................................................................. 28 2.2.3 Índice de Shannon-Wiener ................................................................... 28 2.2.4 Índice de Simpson ................................................................................ 28 2.2.5 Índice de Margalef ................................................................................. 28 2.2.6 Biocidas .................................................................................................28 2.2.7 Pesticida ................................................................................................ 29 2.2.7.1 Tipos de Pesticidas ........................................................................ 29 2.2.8 Glifosato ................................................................................................. 29 2.2.9 Degradación de suelos ......................................................................... 29 2.2.10 Erosión ................................................................................................. 29 2.2.11 Compactación ..................................................................................... 29 2.2.12 Perdida de fertilidad ............................................................................ 30 2.2.13 Contaminación .................................................................................... 30 2.2.14 Distribución de contaminantes .......................................................... 30 2.2.15 Remediación ........................................................................................ 30 2.2.16 Biorremediación .................................................................................. 30 2.2.17 Fitorremediación ................................................................................. 30 2.2.18 Macroinvertebrados ............................................................................ 31 2.2.19 Materia Orgánica ................................................................................. 31 2.2.20 Microorganismos ................................................................................ 31 2.3 Marco legal ............................................................................................ 31 2.3.1 Constitución de la República del Ecuador ...................................... 31 2.3.2 Ley de prevención y control de la contaminación ambiental ........ 32 2.3.3 Ley de Gestión Ambiental ................................................................. 32 10 2.3.4 Ley Forestal y de Conservación de Áreas Naturales y Vida Silvestre 32 2.3.5 Código Orgánico del Ambiente ........................................................ 32 2.3.6 Acuerdo Ministerial 097-A Texto Unificado de Legislación Ambiental Secundaria, Libro VI, Anexo 2, 2017 ............................................................. 33 2.3.7 Acuerdo Ministerial/ 061, Reforma al TULSMA, mayo, 2015 .......... 33 2.3.8 Resolución No 113 Norma Andina & para el Registro y Control de Plaguicidas Químicos de Uso Agrícola), 2009 ............................................. 33 2.3.9 Norma técnica ecuatoriana ............................................................... 33 3. Materiales y métodos ............................................................................ 34 3.1 Enfoque de la investigación ........................................................................ 34 3.1.1 Tipo de investigación ........................................................................ 34 3.1.1.1 Investigación bibliográfica ............................................................ 34 3.1.1.2 Investigación campo ...................................................................... 34 3.1.1.3 Investigación descriptiva ............................................................... 34 3.1.2 Diseño de investigación .................................................................... 35 3.2.1 Variables ............................................................................................. 35 3.2.1.1 Variable independiente .................................................................. 35 3.2.1.2 Variable dependiente ...................................................................... 35 3.2.2 Tratamientos ...................................................................................... 35 3.2.3 Diseño experimental .......................................................................... 36 3.2.4 Recolección de datos ........................................................................ 36 3.2.4.1 Recursos ......................................................................................... 36 3.2.4.1.1 Recursos humanos ..................................................................... 36 3.2.4.1.2 Recursos de Software ................................................................. 36 11 3.2.4.1.3 Recursos de Materiales .............................................................. 36 3.2.4.2 Métodos y técnicas ......................................................................... 37 3.2.5 Análisis estadístico ........................................................................... 39 4. Resultados ............................................................................................. 41 4.1 Modelación de la distribución del glifosato mediante el cálculo de la capacidad de fugacidad para el ambiente en un posible escenario de contaminación ex situ. ....................................................................................... 41 4.2 Caracterización en el efecto del glifosato a los macro invertebrados mediante los índices de Shannon-Wiener, Simpson y Margalef. ................... 43 4.2.1 Resultados de los Índices de Shannon-Wiener, Simpson y Margalef en la repetición 1 ............................................................................................ 43 4.2.2 Resultados de los índices Shannon-Wiener, Simpson y Margalef en la repetición 2 ................................................................................................. 44 4.2.3 Resultados del tratamiento con glifosato ........................................ 45 4.2.3.1 Resultados de la repetición 1 en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum ............................................................................................. 45 4.2.3.2 Resultados de la repetición 2 en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum ............................................................................................. 47 4.3 Propuesta de un sistema de remediación para suelo contaminado por glifosato mediante revisión de resultados obtenidos y bibliografía ....... 51 4.3.1 Prospección de especies vegetales para la fitorremediación ....... 52 4.3.2 Selección de especies vegetales que toleren glifosato .................. 52 5. Discusión ............................................................................................... 54 6. Conclusiones ......................................................................................... 56 7. Recomendaciones................................................................................. 57 12 8. Bibliografía ............................................................................................ 58 9. Anexos ................................................................................................... 67 13 Índice de tablas Tabla 1. Diferentes dosis de glifosato en el mismo volumen de agua .............. 36 Tabla 2. Distribución del glifosato en un posible escenario de contaminación . 41 Tabla 3.Caracterización inicial de la repetición 1 Lumbricus rubellus y Cornu aspersum.............................................................................................................. 45 Tabla 4. Aplicación del test: Kruskal Wallis en la repetición 1 .......................... 47 Tabla 5. Correlación de Pearson en la repetición 1 ......................................... 47 Tabla 6. Caracterización inicial de la repetición 2 Lumbricus rubellus y Cornu aspersum.............................................................................................................. 48 Tabla 7. Aplicación del test: Kruskal Wallis en la repetición 2 .......................... 50 Tabla8. Correlación de Pearson en la repetición 2 ......................................... 50 Tabla 9. Resumen de las repeticiones en los cuatro tratamientos ................... 51 Tabla 10. Resultados del índice de Shannon del T1 ........................................ 67 Tabla 11. Resultados del índice de Shannon del T2 ........................................ 67 Tabla 12. Resultados del índice de Shannon del T3 ........................................ 67 Tabla 13. Resultados del índice de Shannon del T4 ........................................ 67 Tabla 14. Resultados del índice de Simpson del T1 ........................................ 68 Tabla 15. Resultados del índice de Simpson del T2 ........................................ 68 Tabla 16. Resultados del índice de Simpson del T3 ........................................ 68 Tabla 17. Resultados del índice de Simpson del T4 ........................................ 68 Tabla 18. Resultados del índice de Margalef del T1 ........................................ 69 Tabla 19. Resultados del índice de Margalef del T2 ........................................ 69 Tabla 20. Resultados del índice de Margalef del T3 ........................................ 69 Tabla 21. Resultados del índice de Margalef del T4 ........................................ 69 Tabla 22. Resultados del índice de Shannon del T1, repetición 2 ................... 70 14 Tabla 23. Resultados del índice de Shannon del T2, repetición 2 ................... 70 Tabla 24. Resultados del índice de Shannon del T3, repetición 2 ................... 70 Tabla 25. Resultados del índice de Shannon del T4, repetición 2 ................... 70 Tabla 26. Resultados del índice de Simpson del T1, repetición 2 .................... 71 Tabla 27. Resultados del índice de Simpson del T2, repetición 2 .................... 71 Tabla 28. Resultados del índice de Simpson del T3, repetición 2 .................... 71 Tabla 29. Resultados del índice de Simpson del T4, repetición 2 .................... 71 Tabla 30. Resultados del índice de Margalef del T1, repetición 2 .................... 72 Tabla 31. Resultados del índice de Margalef del T2, repetición 2 .................... 72 Tabla 32. Resultados del índice de Margalef del T3, repetición 2 .................... 72 Tabla 33. Resultados del índice de Margalef del T4, repetición 2 .................... 72 Tabla 34. Aplicación del test: Kruskal Wallis en Lumbricus rubellus ................ 73 Tabla 35. Aplicación del test: Kruskal Wallis en Cornu aspersum .................... 73 15 Índice de figuras Figura 1. Distribución del glifosato en un posible escenario de contaminación 42 Figura 2. Resultados de Shannon, Simpson y Margalef en la repetición 1 ...... 43 Figura 3. Resultados de Shannon, Simpson y Margalef en la repetición 2 ...... 44 Figura 4. Caracterización inicial de la repetición 1, en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum................................................................................... 45 Figura 5. Resultados de la repetición 1 glifosato, en diferentes dosis a los 15 días en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum ............................................. 46 Figura 6. Resultados de la repetición 1 glifosato, en diferentes dosis a los 30 días en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum ............................................. 46 Figura 7. Caracterización inicial de la repetición 2 en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum antes del glifosato ..................................................... 48 Figura 8. Resultados de la repetición 2 glifosato, en diferentes dosis a los 15 días en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum ............................................. 49 Figura 9. Resultados de la repetición 2 glifosato, en diferentes dosis a los 30 días en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum ............................................. 49 Figura 10. Ubicación geográfica del ensayo experimental ............................... 74 Figura 11. Obtención de muestras para el trabajo ex-situ ................................ 74 Figura 12. Materiales para la experimentación ................................................ 75 Figura 13. Conteo de especies macroinvertebrados ........................................ 75 Figura 14. Glifosato 2.5ml ................................................................................ 76 Figura 15. Glifosato 5.0ml ................................................................................ 76 Figura 16. Glifosato 7.5ml ................................................................................ 77 Figura 17. Glifosato 10ml ................................................................................. 77 Figura 18. Aplicación del glifosato en la repetición 1 ....................................... 78 16 Figura 19. Aplicación del glifosato en la repetición 2 ....................................... 78 Figura 20. Análisis en el laboratorio de Suelos y Agua de la Universidad Agraria del Ecuador con mi docente guía ......................................................................... 79 Figura 21. Resultados de la absorbancia y longitud de onda del Glifosato y lixiviado ................................................................................................................ 79 17 Resumen Los biocidas si no se los emplea de manera adecuada pueden ser perjudiciales para el ambiente, animales y la salud del ser humano. En Ecuador, entre los años 2008-2013, se presentaron intoxicaciones en agricultores debido al manejo inadecuado de biocidas; por otro lado, se han encontrado restos de biocidas en suelos agrícolas a nivel mundial. Por esta razón, este trabajo de titulación tuvo como objetivo evaluar la distribución del glifosato mediante el cálculo de fugacidad para el ambiente. Donde se determinó que, el glifosato se distribuye en mayor proporción en el suelo y agua, debido a su coeficiente de partición, además de no ser volátil. Por otra parte, se caracterizó el efecto del glifosato en macroinvertebrados mediante los índices de Shannon-Wiener, Simpson y Margalef, donde se agregaron cuatro diferentes dosis de glifosato 2.5 ml, 5.0 ml, 7.5 ml y 10 ml en 1000 ml de agua cada una. Luego de 30 días, se evidenció que las dosis con mayor afectación a los macroinvertebrados Cornu aspersum y Lumbricus rubellus fueron 7.5ml y 10 ml. Se concluye que con una dosis de 10 ml de glifosato diluidos en 1000ml de agua y a 30 cm de profundidad del suelo es capaz de afectar a las especies Cornu aspersum y Lumbricus rubellus, reduciéndolas a cero unidades. Palabras clave: distribución, fitorremediación, fugacidad, glifosato, macroinvertebrados. 18 Abstract Biocides if not used properly can be harmful to the environment, animals and human health. In Ecuador, between 2008 and 2013, farmers were poisoned by improper handling of biocides, on the other hand, traces of biocides have been found in agricultural soils worldwide. For this reason, this titration work aimed to evaluate the distribution of glyphosate by calculating fugacity for the environment. Where it was determined that, glyphosate is more widely distributed in soil and water, due to its partition coefficient, in addition to not being volatile. On the other hand, characterize the effect of glyphosate on macroinvertebrates using the Shannon- Wiener, Simpson and Margalef indices, where four different doses of glyphosate were added 2.5ml, 5.0ml, 7.5ml and 10ml were established in 1000 ml of water each, when passing 30 days it was shown that the doses with the greatest affectation to the macroinvertebrates Cornu aspersum and Lumbricus rubellus are 7.5 and 10ml. It is concluded that witha dose of 10 ml of glyphosate diluted in 1000 ml of water and at 30 cm depth from the soil, it is capable of affecting Cornu aspersum and Lumbricus rubellus species, reducing them to zero units. Key words: distribution, phytoremediation, fugacity, glyphosate, macroinvertebrates. 19 1. Introducción 1.1 Antecedentes del problema Estudios del Centro Común de Investigación de la Comisión Europea muestran que el 45% de suelos de cultivo contienen residuos de glifosato (Vera Silva et al., 2018). Por lo tanto, los biocidas orgánicos naturales como (el aceite de neem, el aceite de lavanda y el aceite de semilla de algodón son los más efectivos con un alto tiempo de degradación) estos a su vez ayudan a reemplazar a los biocidas sintéticos que perjudican el ambiente y la salud humana (Mfarrej & Rara, 2018). En 2015 La Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer (IARC) reclasifico como probablemente cancerígeno el glifosato para los seres humanos en el grupo 2A, luego de 1 año de trabajo junto con 17 expertos de 11 países, donde hallaron pruebas convincentes realizadas en laboratorios con animales. (Organización Mundial de la Salud, 2015). Por lo tanto, en países como El Salvador, Sri Lanka y las islas Bermudas han prohibido el uso del glifosato, por otra parte, en Holanda no se permite su uso a nivel municipal (calles públicas o ayuntamientos) con excepciones de las pistas de aterrizaje y ferrocarril (El Comercio, 2017). En Europa 83 % de suelos agrícolas contienen restos de biocidas, donde la Unión Europea analizó 76 biocidas, en 317 muestras diferentes de suelos agrícolas (Vera Silva et al., 2018). Por otra parte, Estados Unidos aceleró el uso de herbicidas en el año 1970, por el contrario, disminuyeron 28% entre 1982 y 2004 debido a protocolos integrados de gestión de enfermedades (Lichtenberg, 2013). De acuerdo a las estadísticas Estados Unidos para el año 2004 utilizó 69% menos insecticidas (Lichtenberg, 2013). A diferencia de Centro América (Costa Rica, Belice, El Salvador, Honduras, Guatemala, Panamá y Nicaragua) el uso de 20 ingredientes activos alcanza 45 millones de kilos donde el consumo de biocidas per cápita fue 1,3 kg persona/por año (Del Puerto Rodríguez et al., 2014). El Programa de las Naciones Unidas para el Ambiente en 1995 reconoció 12 contaminantes orgánicos persistentes (COP) entre ellos 8 insecticidas (endrina, heptacloro, mirex, toxafeno, aldrina, clordano, dieldrina, DDT), 1 fungicida (hexaclorobenceno) y el resto dioxinas, los cuales causan efectos en el ambiente, son tóxicos y se biomagnifican en la cadena alimenticia. Debido a los sucesos se efectuó la firma del Convenio de Estocolmo el cual entró en vigencia en mayo de 2004 (Morillo & Villaverde, 2017). La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura reportó 1.29 millones toneladas de biocidas, debido al incremento de la producción agrícola (Jaqueline García & José Belisario, 2018). Desde 1995 a 2013 la exposición de los niños a los carbamatos (insecticidas que afectan al sistema nervioso) disminuyó 70%. Motivo por el cual la Agencia de Protección del Medio Ambiente restringió la venta los carbamatos durante ese tiempo (US EPA, 2013). Datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) demuestran que 200.000 personas mueren anualmente por intoxicación de biocidas (Radargreen, 2017). Adicional enfermedades como el Parkinson tiene probabilidades de desarrollarse 70% más en personas que utilizan pesticidas organofosforados (Foerster A, 2016). En Ecuador 7 de cada 10 productores según la encuesta (ESPAC) en 2015, 50% no leen las etiquetas antes de usar el producto (Naranjo, 2017). A partir de entonces Ecuador recibió 17,34% de precauciones sobre el manejo de biocidas en el año 2016 (INEC, 2016). Por esta razón, los biocidas son un riesgo para la salud provocando enfermedades y muertes anualmente, debido a su mal manejo y elevada toxicidad en algunos casos. 21 La European Crop Protection Agency proporcionó datos anuales de 4000 toneladas de biocidas al año mostrando a España como uno de los mayores consumidores(Álvarez, 2016). En cambio Brasil supera a Estados Unidos con 1.000 millones de toneladas de biocidas anualmente, donde 70% de los alimentos consumidos están contaminados (Saccone, 2018). Por otra parte, Cuba ha reducido 50 % de biocidas químicos mediante la utilización de soluciones biológicas (Del Puerto Rodríguez et al., 2014). En cambio, en ciudades como Bogotá, Cartagena, entre otras, se registraron 160.732 kg de DDT hasta el año 2006, donde se estima 5.000 m3 de suelo contaminado (Betancur-Corredor & Pino, 2013). Además, solo 35% de los países en desarrollo cuenta con normas legales que regulan el uso de biocidas (Ginebra, 2017). La Unión Europea prohibió pesticidas neonicotinoides en 2013, por consecuencias en la salud y la destrucción del hábitat de las abejas (Ansede, 2018). El pentaclorofeno (PCP) es un biocida que contamina suelo y aguas subterráneas, utilizado en la industria para la protección de la madera (Shankar et al., 2018). Por lo tanto, está comprobado que los biocidas son perjudiciales para la salud y los ecosistemas, contaminando los suelos y aguas subterráneas. 1.2 Planteamiento y formulación del problema 1.2.1 Planteamiento del problema La problemática que tiene el glifosato sobre las afectaciones en seres humanos, ecosistemas y animales, es que debido a estudios realizados puede ser un producto cancerígeno (El Comercio, 2017). Por este motivo, fue preciso realizar la presente experimentación para observar de qué manera afecta a los macroinvertebrados y por ende su distribución en suelo, aire y agua en un posible 22 escenario de contaminación ex-situ para luego proponer un sistema de remediación. En Ecuador 70% de los agricultores deciden usar biocidas sin seguir la dosis estimada en el envasado (Naranjo, 2017). Por esta razón, en Carchi - Ecuador durante los años 1991-1992 se generaron intoxicaciones agudas de 33 trabajadores agrícolas por presencia de pesticidas (organofosforados y carbamatos), puesto que, el equipo de protección personal relativamente impermeable era inadecuado (Cole et al., 2000). Sobre todo, el manejo inadecuado de biocidas producen envenenamiento y contaminación ambiental, por esta razón generalmente la mayoría de los agricultores son responsables (Rother, 2018). Por esta razón, es importante dar capacitaciones a los agricultores sobre el uso y dosificación de biocidas, para tener mejor control sobre los agroquímicos con alta toxicidad. Según Naranjo Ecuador importó 214 764 toneladas de biocidas desde 2008 hasta 2015. A partir de entonces, un estudio del 2017 de la Organización Acción Ecológica registra que no existe producción de biocidas en Ecuador, pero provienen de 48 países (Plan V, 2018). Por consiguiente, Ecuador muestra niveles de intoxicación en diferentes provincias por biocidas desde 2008 hasta 2013 (Carchi, Cotopaxi, Chimborazo, El Oro, Guayas, Loja, Los Ríos, Manabí, Pichincha, Sucumbíos, Orellana y Sto. Domingo (Naranjo, 2017). Decisivamente La Agencia de Protección Ambiental (EPA) comienza la reevaluación sistemática de los pesticidas antiguos a partir de 2007. Por lo que, en 2012 se canceló el uso de acefato en las judías verdes, el imidacloprid en almendras y el oxamilo en soja (US EPA, 2013). 23 1.2.2 Formulación del problema ¿Cuál es el efecto del glifosato en macroinvertebrados del suelo? 1.3 Justificación de la investigación El presente estudio se realizó debido a las afectaciones que tienen los biocidas en los suelos, especies y seres humanos. Por lo que, fue de gran importancia analizar la distribución de la pluma de contaminación del glifosato en un posible escenario de contaminación ydeterminar cómo afecta la aplicación del glifosato en los macroinvertebrados presentes en los suelos, con la dosis establecida por la norma o la dosis que usualmente aplican los agricultores Los beneficios de este trabajo son proponer un sistema de remediación para suelos contaminados y reemplazar biocidas orgánicos por los tradicionales. 1.4 Delimitación de la investigación • Espacio: Las muestras se recolectaron en la parroquia Súa del cantón Atacames situado en la provincia de Esmeraldas (0º50’03” N – 79º53’17” W) (Ver Figura 10) • Tiempo: 6 meses. 1.5 Objetivo general Evaluar la pluma de contaminación en suelo agrícola por presencia de glifosato para propuesta de un sistema de remediación. 1.6 Objetivos específicos • Modelar la distribución del glifosato mediante el cálculo de la capacidad de fugacidad para el ambiente en un posible escenario de contaminación ex situ. • Caracterizar el efecto del glifosato al macro invertebrado mediante los índices de Shannon-Wiener, Simpson y Margalef. 24 • Proponer un sistema de remediación para suelo contaminado por glifosato mediante revisión de resultados obtenidos y bibliografía. 1.7 Hipótesis Existe una relación inversa entre la concentración de glifosato y la concentración de macro invertebrados. 25 2. Marco teórico 2.1 Estado del arte El presente estudio realizado en Lima- Perú comprendido en el año 2004-2005 durante los meses junio, octubre y abril, en la metodología para el cálculo de diversidad ecológica se emplearon varios índices entre ellos: Shannon-Wiener, Simpson y Margalef dando como resultados para Shannon-Wiener (F=0,86; P=0,43) para Simpson (F=0,42; P=0,66) y para Margalef (F=0,71; P=0,51). Por lo tanto, el índice de Simpson mostró valores bajos debido a que no presentaron dominancia mayor al 50% de ninguna tasa (Iannacone & Alvariño, 2007). En la investigación de Delgado se utilizó la metodología del modelo de fugacidad como análisis preliminar con fines de gestión de la contaminación, representando afinidad por los diferentes compartimentos ambientales entre ellos suelo y agua, en efecto los valores logarítmicos del porcentaje del contaminante en el compartimiento suelo y KOC, debido a esto los valores de Log (KOC) < 2.4 representan que el porcentaje en el compartimiento suelo es lineal creciente (Delgado, 2016). En Chimichagua, Chiruguaná y Jagua de Ibirico se realizó evaluaciones sobre macroinvertebrados, para determinar la diversidad aplicaron el índice de Shannon Wiener donde expresa que el ecosistema Playón tiene mayor diversidad respecto a los otros ecosistemas con un valor de 2,94 seguido con el ecosistema de Olivella con 2,54 mientras el ecosistema de Arroyo obtuvo la menor diversidad con 0,13 (Rojas-Martínez et al., 2016). De acuerdo al trabajo realizado por Paravani, Sasal, Sione, Gabioud, Oszust entre otros autores determinaron la concentración del glifosato en muestras de 26 agua y el 100 % fueron positivas en la técnica de ELISA también resultaron afirmativas para la UHPLC-MS/MS. Concluyendo que, en el análisis de agua de sistemas agrícolas se encuentra glifosato pero en bajas concentraciones, inferiores a 250 µg/L en el 75 % de las muestras realizadas (Paravani et al., 2016). En la investigación de Vera, Zomer y Marc se determinó que, en 11 países de la Unión Europea, más del 80% del suelo contenían residuos de biocidas, 25% de las muestras tomadas tenían 1 residuo, 58% de las muestras tenían 2 o más residuos. Se obtuvieron 166 combinaciones de diferentes biocidas entre ellos: Glifosato, DDT, Tebuconazol se encontraron en mayor frecuencia y altas concentraciones. Estos compuestos excedieron sus concentraciones ambientales pronosticadas. La metodología usada fue por cada muestra vegetal se utilizaba una mezcla de cinco submuestras (0-15/20 cm), las submuestras fueron recolectadas en una franja inter-fila. Como resultado las muestras tomadas en el Sur con el 26% tenían menos residuos que las muestras tomadas en el Norte (Vera Silva et al., 2018). De acuerdo a la investigación realizada en la ciudad de Mendoza-Argentina, el impacto ambiental de biocidas fue aplicado por los productores, se realizó un cálculo de Coeficiente de Impacto Ambiental (EIQ), al realizar un EIQ de campo para distintas formulaciones de un mismo ingrediente activo y diferentes patrones, la fórmula que aplicaron, fue multiplicar el valor de EIQ para un 55 químico especifico por el respectivo porcentaje del ingrediente activo (IA) la dosis usada por hectárea y su frecuencia de aplicación anual (A) (Mansilla, 2017). En Salamanca se realizó la evaluación de contaminación de suelos y aguas por biocidas en zonas de viñedos, donde se presentó un protocolo de análisis para separar y determinar los compuestos seleccionados en las muestras de suelo y agua, posteriormente aplicaron el análisis en muestras reales, con concentraciones 27 de biocidas a 500 o 1000 µg/ml. Con otra disolución diluyendo alícuotas en metanol las cuales fueron almacenadas a 4oC en la oscuridad (Álvarez, 2016). Hylan, Bradman, Gerona, Klein y otros ejecutaron un estudio en Estados Unidos donde mencionan que la intervención de dieta orgánica reduce los niveles de pesticidas en niños y adultos. Debido al estudio recolectaron muestras de orina de 4 familias diversas de los EE.UU antes y después de la intervención, aplicando la siguiente formula (n=16 participantes y un total de 158 muestras de orina) (Hyland et al., 2019). Conforme a la evaluación de campo sobre nano partículas de algitano de sodio cargadas de biocidas se empleó un diseño experimental de un diseño sistemático de experimentos mediante el Software Desing Expert (Versión 7.1.6, Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN) La eficiencia de atrapamiento y la carga de biocidas se estimaron en 98.66% y 2.46% respectivamente (Kumar et al., 2014). En la provincia de Talca-Chile se describió la concentración en distintas matrices Ambientales, en periodos de tiempo alta y baja de producción agrícola por lo que se hizo un estudio de diseño transversal en 190 estudiantes y se midieron los residuos de los biocidas en agua y vegetales, dando como resultado la matriz vegetal con mayor concentración en ambos periodos, los residuos de biocidas con mayor presencia en vegetales fueron clorpirifos, difenilamina, pirimetanil y tiabendazol (Muñoz-Quezada et al., 2014). En un estudio de Satapute, Kamble, Adhikari y Jogaiah se determinó la influencia de biocidas como triazol en las poblaciones microbianas del suelo, realizaron evaluaciones en campos con diferentes concentraciones, el análisis lo hicieron por cromatografía liquida-ionización y por electropulverización espectrometría los cuales dieron como resultados altos niveles de propiconazol en suelos negros 28 profundos y en franco arenoso rojo, por lo tanto el crecimiento bacteriano aumento a bajas concentraciones de propiconazol (Satapute et al., 2019). 2.2 Bases teóricas 2.2.1 Suelo contaminado Las características del suelo son alteradas negativamente por la presencia de químicos de carácter peligroso, el cual es inaceptable para el ambiente y la salud humana (Álvarez, 2016). 2.2.2 Fugacidad La fugacidad mide la tendencia a escapar de una molécula y se puede evaluar de forma similar a un gas (Valsaraj K & Melvin E, 2009). 2.2.3 Índice de Shannon-Wiener El índice de Shannon-Wiener usado para medir la diversidad de especies, indica que tan uniformes están representadas las especies (Gelambi, 2018). 2.2.4 Índice de Simpson El índice de Simpson muestra la probabilidad de que 2 individuos sacados al azar pertenezcan a la misma especie (Cando, 2014). 2.2.5 Índice de Margalef Es un índice de diversidad de especies simple que destacala riqueza de especies e intenta corregir el número creciente de especies recolectadas con un mayor número de organismos muestreados, dividiendo el recuento de especies por el registro natural del número de organismos muestreados (Death, 2008). 2.2.6 Biocidas Son sustancias químicas cuyo objetivo es contrarrestar, destruir, neutralizar e impedir la acción de cualquier organismo considerado nocivo para el ser humano (Ministerio para la transición ecológica, 2016). 29 2.2.7 Pesticida Sustancia elaborada de forma natural o sintética para combatir o controlar plagas (Álvarez, 2016). 2.2.7.1 Tipos de Pesticidas • Insecticidas. - son utilizados para controlar insectos • Fungicidas. - son utilizados para controlar hongos como el moho, verdín y óxido. • Herbicidas. - matan o inhiben el crecimiento de plantas no deseadas, también conocidas como malas hierbas (Álvarez, 2016). 2.2.8 Glifosato Es el principal ingrediente activo del herbicida clasificado por la OMS, como probablemente cancerígeno para los seres humanos (Greenpeace, 2019). 2.2.9 Degradación de suelos Alteración del suelo debido a la imposibilidad para ofrecer servicios ecosistemáticos a seres humanos y animales. Se debe a las malas actividades como uso de biocidas, sobrepastoreo o deforestación, provocando impactos irreversibles (Romero, 2017). 2.2.10 Erosión Es la degradación y transporte de suelo en superficie terrestre debido al agua, viento y cambios térmicos siendo causas naturales que no afectan este recurso (Romero, 2017). 2.2.11 Compactación En áreas agrícolas la mecanización excesiva y el pastoreo intensivo aumentan el grado de compactación, provocando cambios físicos que afecta el crecimiento de las plantas ampliando la erosión (Romero, 2017). 30 2.2.12 Perdida de fertilidad La pérdida de fertilidad reduce la capacidad de absorción en nutrientes como la eficacia de fertilizantes y biocidas, por el manejo inadecuado debido a las actividades antrópicas (Romero, 2017). 2.2.13 Contaminación Los contaminantes son orgánicos e inorgánicos debido a la concentración de dicho contaminante, proveniente de residuos industriales o domésticos, provocando efectos negativos al ecosistema (Romero, 2017). 2.2.14 Distribución de contaminantes Los contaminantes se distribuyen en el suelo por medio de la aplicación de biocidas orgánicos e inorgánicos y mediante deposiciones atmosféricas (Düring et al., 2002). 2.2.15 Remediación La remediación es el tratamiento ejecutado para recuperar la calidad de subsuelo contaminado (Litoclean, 2019). 2.2.16 Biorremediación La biorremediación puede utilizar organismos autóctonos o exógenos, puede ejecutarse de manera ex situ o in situ y en condiciones aerobias o anaerobias. Además tiene ventajas de alta eficiencia, es de bajo costo e inocuo para el ecosistema (Martínez et al., 2011; Zhang et al., 2020). 2.2.17 Fitorremediación Es un conjunto de tecnologías que se encarga de reducir la concentración de diversos compuestos de manera ex situ o in situ, a partir de procesos bioquímicos realizados por las plantas y los microorganismos, además sirve para remover, degradar y reducir los contaminantes (Delgadillo et al., 2011). 31 2.2.18 Macroinvertebrados Los macroinvertebrados se los designa como los ingenieros del ecosistema, los cuales tienen efecto directo sobre las propiedades del suelo, mineralización y procesos de humificación de la materia orgánica (Pareja et al., 2011). 2.2.19 Materia Orgánica La materia orgánica representa aproximadamente el 99% del peso seco de los seres vivos, en el suelo contiene 5% de Nitrógeno total, fósforo, magnesio, azufre, calcio y micronutrientes, también facilita los mecanismos de absorción de sustancias peligrosas como los biocidas (Julca et al., 2006). 2.2.20 Microorganismos Los microorganismos colonizan aire, agua y suelo participando de forma importante en los ecosistemas, donde interactúan con animales, plantas y humanos. Además son clave para el funcionamiento de los sistemas biológicos y el sustento de la vida del planeta (Montaño et al., 2010). 2.3 Marco legal 2.3.1 Constitución de la República del Ecuador …Art. 276.- El régimen de desarrollo tendrá los siguientes objetivos: Recuperar y conservar la naturaleza y mantener un ambiente sano y sustentable que garantice a las personas y colectividades el acceso equitativo, permanente y de calidad al agua, aire y suelo, y a los beneficios de los recursos del subsuelo y del patrimonio natural… …Art. 409.- Es de interés público y prioridad nacional la conservación del suelo, en especial su capa fértil. Se establecerá un marco normativo para su protección y uso sustentable que prevenga su degradación, en particular la provocada por la contaminación, la desertificación y la erosión... …Art. 410.- El Estado brindará a los agricultores y a las comunidades rurales apoyo para la conservación y restauración de los suelos, así como para el desarrollo de prácticas agrícolas que los protejan y promuevan la soberanía alimentaria… 32 2.3.2 Ley de prevención y control de la contaminación ambiental …Art. 10.- Queda prohibido descargar, sin sujetarse a las correspondientes normas técnicas y regulaciones, cualquier tipo de contaminantes que puedan alterar la calidad del suelo y afectar a la salud humana, la flora, la fauna, los recursos naturales y otros bienes… …Art. 12.- Los Ministerios de Agricultura y Ganadería y del Ambiente, cada uno en el área de su competencia, limitarán, regularán o prohibirán el empleo de substancias, tales como plaguicidas, herbicidas, fertilizantes, desfoliadores, detergentes, materiales radioactivos y otros, cuyo uso pueda causar contaminación… 2.3.3 Ley de Gestión Ambiental …Art. 13.- Los consejos provinciales y los municipios, dictarán políticas ambientales seccionales con sujeción a la Constitución Política de la República y a la presente Ley. Respetarán las regulaciones nacionales sobre el Patrimonio de Áreas Naturales Protegidas para determinar los usos del suelo y consultarán a los representantes de los pueblos indígenas, afroecuatorianos y poblaciones locales para la delimitación, manejo y administración de áreas de conservación y reserva ecológica… …Art. 23.- La evaluación del impacto ambiental comprenderá: a) La estimación de los efectos causados a la población humana, la biodiversidad, el suelo, el aire, el agua, el paisaje y la estructura y función de los ecosistemas presentes en el área previsiblemente afectada… 2.3.4 Ley Forestal y de Conservación de Áreas Naturales y Vida Silvestre …Art. 73.- La flora y fauna silvestres son de dominio del Estado y corresponde al Ministerio del Ambiente su conservación, protección y administración, para lo cual ejercerá las siguientes funciones: b) Prevenir y controlar la contaminación del suelo y de las aguas, así como la degradación del medio ambiente… 2.3.5 Código Orgánico del Ambiente …Art. 5.- Derecho de la población a vivir en un ambiente sano. El derecho a vivir en un ambiente sano y ecológicamente equilibrado comprende: La conservación y uso sostenible del suelo que prevenga la erosión, la degradación, la desertificación y permita su restauración… …Art. 26.- Facultades de los Gobiernos Autónomos Descentralizados Provinciales en materia ambiental. Controlar el cumplimiento de los parámetros ambientales y la aplicación de normas técnicas de los componentes agua, suelo, aire y ruido… …Art. 109.- Disposiciones generales para el manejo forestal sostenible. Las disposiciones generales deberán orientarse a: Prevenir, evitar y detener la erosión o degradación del suelo… 33 2.3.6 Acuerdo Ministerial 097-A Texto Unificado de Legislación Ambiental Secundaria, Libro VI, Anexo 2, 2017 …5.2.3.1 Se prohíbe la descarga de residuos líquidos sin tratar hacia el sistemade alcantarillado, provenientes del lavado y/o mantenimiento de vehículos aéreos y terrestres, así como el de aplicadores manuales y aéreos, recipientes, empaques y envases que contengan o hayan contenido agroquímicos u otras sustancias tóxicas… 2.3.7 Acuerdo Ministerial/ 061, Reforma al TULSMA, mayo, 2015 …Art. 213 Tratamiento de Suelos Contaminados. - Se lo ejecuta por medio de procedimientos validados por la Autoridad Ambiental Competente y acorde a la norma técnica de suelos, de desechos peligrosos y demás normativa aplicable. Los sitios de disposición temporal de suelos contaminados deberán tener medidas preventivas eficientes para evitar la dispersión de los contaminantes al ambiente… … “Art. 214 Restricción. - Se restringe toda actividad que afecte la estabilidad del suelo y pueda provocar su erosión” … 2.3.8 Resolución No 113 Norma Andina & para el Registro y Control de Plaguicidas Químicos de Uso Agrícola), 2009 … “Que la Resolución 630 de la Comunidad Andina señala que, de conformidad con el artículo 70 de la Decisión 436, se debe adoptar el Manual Técnico Andino para el Registro y Control de Plaguicidas Químicos de Uso Agrícola para su aplicación en los Países Miembros” … …Que el art. 5 (cap. III) de la Decisión 436 señala que la Autoridad Nacional Competente establecerá con las autoridades de los sectores salud y ambiente y otras que correspondan del respectivo país, los mecanismos de interacción que sean necesarios para el cumplimiento de los requisitos y procedimientos de registro y control establecidos en la presente Decisión, sin perjuicio de las competencias que corresponden a cada entidad en el control de todas las actividades vinculadas con plaguicidas químicos de uso agrícola, en el ámbito nacional… 2.3.9 Norma técnica ecuatoriana …2.1.6 Deberán tener un sitio autorizado para la recolección o eliminación de los residuos de plaguicidas y productos afines 34 3. Materiales y métodos 3.1 Enfoque de la investigación 3.1.1 Tipo de investigación 3.1.1.1 Investigación bibliográfica López (2002) afirma que “la investigación documental es una técnica que consiste en la selección y compilación de información a través de la lectura y crítica de documentos, materiales bibliográficos, bibliotecas, periódicos, centros de documentación e información”. Para la presente investigación se realizó una recopilación de información mediante varias fuentes como artículos científicos, revistas que permitieron tener mayor información sobre el proyecto a realizar. 3.1.1.2 Investigación campo Guerrero (2004) afirma que la observación del terreno y formas de la exploración, se caracteriza por el contacto directo con el objetivo de estudio y se realiza en el medio donde se desenvuelve el fenómeno. Se utilizó la investigación de campo debido al contacto directo con el ambiente natural en donde se realizó el estudio en cuestión, resultando como objetivo encontrar una explicación al comportamiento del fenómeno a estudiar. 3.1.1.3 Investigación descriptiva Van & William (2006) mencionan que a través de la descripción exacta de las actividades, procesos y personas se conoce las situaciones, actitudes y costumbres predominantes, por lo tanto, la investigación descriptiva no se limita a la recolección de datos, sino a la identificación y predicción que existe entre dos o más variables. 35 Resultó de gran importancia la investigación descriptiva en el presente trabajo porque aportó con la identificación de las variables. 3.1.2 Diseño de investigación Se empleó la investigación de tipo experimental debido a que se utilizaron varias concentraciones de glifosato, determinando la reacción y afectación en los macroinvertebrados. 3.2 Metodología 3.2.1 Variables 3.2.1.1 Variable independiente Glifosato (ml por cantidad de agua) Profundidad (cm) Tiempo (días) 3.2.1.2 Variable dependiente Cantidad de macro invertebrados muertos/vivos 3.2.2 Tratamientos Se aplicaron diferentes dosis de glifosato en volumen de agua constante para cada muestra. Según el Acuerdo Ministerial 097-A Texto Unificado de Legislación Ambiental Secundaria, Libro VI, Anexo 1 el límite máximo permisible a utilizar de glifosato es 1000ml en 200 L de agua por cada hectárea, se recolectaron muestras para realizar un prototipo de 1 m2. La cantidad proporcional de glifosato estimada fue 2.5 ml y 1000 ml de agua. Se recolectaron las muestras del suelo para luego determinar el índice de Shannon-Wiener, Simpson y Margalef dónde los datos se obtendrán entre el día 1 al 30. 36 Tabla 1. Diferentes dosis de glifosato en el mismo volumen de agua Variables T1 T2 T3 T4 (Testigo) Dosis agua (ml) 1000 1000 1000 1000 - Dosis glifosato (ml) 2.5 5.0 7.5 10 - Tiempo (días) 30 30 30 30 - Vásquez, 2019 3.2.3 Diseño experimental Se empleó un diseño completamente al azar (DCA) donde se definieron los tratamientos a aplicar, la prueba experimental fue de 1000 ml de agua constante para la dilución con el glifosato en cuatro dosis diferentes de 2.5ml; 5.0 ml; 7.5 ml y 10 ml para cada uno de los tratamientos, excepto en el testigo. 3.2.4 Recolección de datos La toma de muestras se realizó mediante los lineamientos establecidos en el Acuerdo Ministerial 097-A Texto Unificado de Legislación Ambiental Secundaria, Libro VI, Anexo 2 de la Norma de Calidad Ambiental del recurso suelo y criterios de remediación para suelos contaminados. 3.2.4.1 Recursos 3.2.4.1.1 Recursos humanos La investigación se llevó a cabo por la tesista con instrucción del tutor, además de autofinanciamiento por parte del autor de este trabajo de titulación. 3.2.4.1.2 Recursos de Software • Microsoft Excel 3.2.4.1.3 Recursos de Materiales • Bomba de fumigación 37 • Guantes • Mascarilla • Computadora • Pala • Glifosato • Agua 3.2.4.2 Métodos y técnicas El método que se utilizó en el primer objetivo específico sobre la modelación de distribución del glifosato fue mediante el cálculo de la capacidad de fugacidad para el ambiente insertando datos del glifosato en el programa Excel como volumen, constante, densidad y temperatura. El primer paso es calcular la capacidad de fugacidad Z (mol/m3/Pa) Fórmulas: Aire: 1/RT Agua: 1/Kaw Suelo: Ksw.ρs/Kaw Sedimento: Ksw. ρs/Kaw Biota: Kbw. ρb/Kaw R: 8.314 Pa m³ /mol Dónde: R: es la constante de gas Kaw: es la constante de Henry para especies (Pa m³ /mol) Ksw: es la constante de partición para especies entre suelo o sedimento y el agua (dm3 / kg) Kbw: es la bioconcentración factor (dm3 / kg) 38 ρs y ρb: son las densidades (kg/ dm3) de suelo, sedimento y biota, respectivamente. 1 dm3= 1L El segundo paso es calcular la fugacidad ƒ= 𝒎𝒐𝒍𝒆𝒔 𝜮 𝒁 Dónde: ƒ= Fugacidad (Pa) z= Sumatoria total de la multiplicación de las constantes por volúmenes El último paso es calcular las concentraciones en cada fase C= ƒ. Z Dónde: ƒ= Fugacidad (Pa) Z= Capacidad de fugacidad En el segundo objetivo específico se caracterizó el efecto del glifosato en macro invertebrados, donde se recolectaron muestras al azar del suelo siguiendo las indicaciones de la Norma de Calidad Ambiental con un prototipo de 1 m2 a cada una, donde se aplicaron el índice de Shannon-Wiener, Simpson y Margalef para determinar la cantidad de macro invertebrados, y se procedió a la aplicación del glifosato con el volumen de agua en las respectivas muestras. En la propuesta para el sistema de remediación de suelo contaminado por glifosato se lo realizó por fitorremediación mediante revisión de bibliografía. 39 3.2.5 Análisis estadístico En este proyecto, se realizó un análisis estadístico descriptivo mediante el índice de Shannon-Wiener, Simpson y Margalef. El índice de Shannon-Wiener mide el contenido de información por individuoen muestras obtenidas al azar. La fórmula es la siguiente: 𝐻′ = − ∑ Ϸ𝑖 In 𝑆 𝑖=1 Ϸ𝑖 Dónde: S = Número de especies (la riqueza de especies) pi = Proporción de individuos de la especie i respecto al total de individuos (es decir la abundancia relativa de la especie i) ni = Número de individuos de la especie i N = Número de todos los individuos de todas las especies Gelambi (2018) afirma que “Los valores menores a 2 son ecosistemas con una diversidad de especies relativamente baja, mientras que los mayores a 3 son altos”. Sonco (2013) menciona que “El Índice de Simpson.- es otro método comunmente utilizado para determinar la diversidad de una comunidad” 𝐷 = 𝛴 ( 𝑛 𝑁 )2 Dónde: n= Número total de organismos de una especie en particular N= Número total de organismos de todas las especies El valor de D oscila entre 0 y 1 Si el valor de D da 0, significa diversidad infinita Si el valor de D da 1, significa que no hay diversidad. 40 (Death 2008) menciona que “El índice de Margalef es uno de los primeros intentos en compensar los efectos del tamaño de la muestra diviendo el número de especies en una muestra por el logaritmo natural del número de organismos recogidos”. 𝐷 = 𝑆 − 1 𝐼𝑛(𝑁) Dónde: S= Número de especies en una muestra N= Cantidad de organismos en la muestra Valores inferiores a 2 hacen referencia a una baja biodiversidad y valores superiores a 5 son indicativos biodiversidad alta. Adicional, se empleó el test de Kruskal- Wallis.- siendo una prueba no paramétrica que permite evaluar si dos o más muestras se extraen de la misma distribución. Las conclusiones con esta prueba se basan en la comparación de un valor H calculado versus un valor H crítico, de acuerdo si los grupos son uno grande (n >5) y el otro pequeño (K = 3, 4 o 5 y n < 5). H0 = Todas las muestras provienen de la misma población HA= Al menos una muestra proviene de una población con una distribución diferente Se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson que estudia la relación entre dos variables, comprende valores entre -1 y +1. Si el coeficiente es igual a 1 o -1 se considera que la correlación existente entre las variables es perfecta, si el coeficiente es mayor que 0 la correlación es positiva, si es menor que 0 es negativa, es decir se relacionan inversamente y por último si el coeficiente es igual a 0 se puede afirmar que no existe relacion lineal entre las variables. 41 4. Resultados 4.1 Modelación de la distribución del glifosato mediante el cálculo de la capacidad de fugacidad para el ambiente en un posible escenario de contaminación ex situ. En base a la metodología de los autores Mackay & Wania, (1995) se determinó la distribución del glifosato en un posible escenario de contaminación del aire, agua, suelo y sedimento mediante la fórmula de la capacidad de fugacidad para el ambiente. Manteniendo constante el volumen del aire 92291 m3, suelo 1000 m3, sedimento 0.5 m3 y variando el volumen del agua en las 9 simulaciones respectivas. Tabla 2. Distribución del glifosato en un posible escenario de contaminación Distribución del Glifosato Aire Agua Suelo Sedimentos 1 0,00% 28,32% 71,65% 0,04% 2 0,00% 44,14% 55,83% 0,03% 3 0,00% 54,24% 45,74% 0,02% 4 0,00% 61,24% 38,74% 0,02% 5 0,00% 66,39% 33,59% 0,02% 6 0,00% 70,33% 29,66% 0,01% 7 0,00% 73,44% 26,54% 0,01% 8 0,00% 75,96% 24,02% 0,01% 9 0,00% 78,05% 21,94% 0,01% Vasquez, 2020 En la tabla 2, se observa las nueve simulaciones de la distribución del glifosato en un posible escenario de contaminación, en la primera la simulación con 1000ml de agua, el porcentaje del agua es 28.32% y 71.65% suelo, por lo tanto, a medida que aumenta el volumen del agua 9000ml crece el porcentaje de la contaminación en agua 78.05% y disminuye 21.94% en el suelo. 42 Figura 1. Distribución del glifosato en un posible escenario de contaminación Vasquez,2020 En la figura 1, se visualiza la distribución del glifosato en un posible escenario de contaminación con 1000 ml de agua donde el mayor porcentaje fue en el suelo 71.65%, 28.32% agua, aire 0% y sedimento 0.04%. En la segunda simulación con 2000ml de agua se obtiene 55.83% de suelo, 44.14% agua, al contrario, en aire 0% y sedimento 0.03%. En la tercera distribución con 3000ml de agua la contaminación es del 54.24% en agua, 45.74% suelo, 0% aire y 0.02% sedimento. Con 4000ml de agua los resultados fueron 61.24% agua, 38.74% suelo, 0% aire y 0,.2% sedimento. En 5000ml de agua las distribuciones correspondieron 66.39% agua, 33.59% suelo, 0% aire y sedimento 0.02%. Por consiguiente, en 6000ml de agua se esparció 70.33% agua, 29.66% suelo, 0% aire y 0.02% sedimento. En la séptima simulación con 7000ml de agua se propagó 73.44% agua, 26.54% suelo, 0% aire y 0.01% sedimento. Por consiguiente, en la octava simulación con 8000ml de agua el 75,96% agua, 24.02% suelo, 0% aire y 0.01% sedimento. Para finalizar con 9000ml de agua los resultados conformes fueron 78.05% agua, 21.94% suelo, 0% aire y 0.01% sedimento. 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00% 70,00% 80,00% 90,00% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Distribución del Glifosato Aire Agua Suelo Sedimentos 43 4.2 Caracterización en el efecto del glifosato a los macro invertebrados mediante los índices de Shannon-Wiener, Simpson y Margalef. Se estableció 4 tratamientos, los mismos constaban de dosis diferentes de glifosato (2.5 ml, 5.0ml, 7.5ml y 10ml) en 1000ml de agua con réplicas por cada tratamiento. Se consideró el tiempo (días), para determinar la afectación de los macroinvertebrados (Cornu aspersum) y (Lumbricus rubellus) a la presencia de las diferentes dosis del glifosato. Mediante la fórmula del índice de Shannon se efectuó la contabilización de las respectivas especies. 4.2.1 Resultados de los Índices de Shannon-Wiener, Simpson y Margalef en la repetición 1 Figura 2. Resultados de Shannon, Simpson y Margalef en la repetición 1 Vasquez,2020 En la figura 2 se puede observar los cuatro tratamientos con los distintos resultados en la repetición 1. El índice de Shannon-Wiener muestra valores de 0.6, 0.5, 0.6, 0.7 < 2, es decir, presenta una diversidad de especies relativamente baja. 0.6 0.4 0.4 0.5 0.3 0.6 0.6 0.4 0.4 0.7 0.5 0.4 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Shannon-Wiener Simpson Margalef Resultados de los índices en la repetición 1 T1 T2 T3 T4 44 A continuación, Simpson con valores de 0.4, 0.3, 0.4, 0.5 < 1, por ello, se tiene una diversidad infinita y finalmente el índice de Margalef dio valores de 0.4, 0.6, 0.4, 0.4 < 2 , en donde hace referencia a una biodiversidad baja. Por lo tanto, no hay diferencias significativas debido a la baja diversidad de especies Cornu aspersum y Lumbricus rubellus en los respectivos tratamientos. 4.2.2 Resultados de los índices Shannon-Wiener, Simpson y Margalef en la repetición 2 Figura 3. Resultados de Shannon, Simpson y Margalef en la repetición 2 Vasquez,2020 En la figura 3 se puede visualizar los cuatro tratamientos con los distintos resultados, en la repetición 2. Por consiguiente, el índice de Shannon-Wiener presenta valores de 0.5, 0.6, 0.6, 0.7 < 2, por ende, expresa una diversidad de especies relativamente baja, por otro lado el índice de Simpson demuestra valores de 0.3, 0.4, 0.4, 0.5 < 1, por ello, se tiene una diversidad infinita y para concluir el índice de Margalef con valores de 0.4, 0.5, 0.4, 0.4 < 2 haciendo referencia a una biodiversidad baja. Por consiguiente, no hay diferencias significativas debido a la baja diversidad de especies Cornu aspersum y Lumbricus rubellus en los respectivos tratamientos. 0.5 0.3 0.4 0.6 0.4 0.5 0.6 0.4 0.4 0.7 0.5 0.4 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Shannon-Wiener Simpson Margalef Resultados de los índices en la repetición2 T1 T2 T3 T4 45 4.2.3 Resultados del tratamiento con glifosato Se establecieron previamente cuatro diferentes dosis de glifosato cada uno (2.5ml, 5.0ml, 7.5ml y 10ml), los cuales fueron diluidos en 1000ml de agua cada dosis, para ser aplicados en cada tratamiento, en las siguientes especies de macroinvertebrados: Cornu aspersum y Lumbricus rubellus. 4.2.3.1 Resultados de la repetición 1 en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum Tabla 3.Caracterización inicial de la repetición 1 Lumbricus rubellus y Cornu aspersum Tratamientos Lumbricus rubellus Cornu aspersum T1 9 3 T2 5 1 T3 7 3 T4 7 4 Testigo 8 6 Vasquez,2020 Figura 4. Caracterización inicial de la repetición 1, en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum Vasquez,2020 En la figura 4 se muestran los datos obtenidos de las especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum antes de aplicar las respectivas dosis de glifosato. 9 3 5 1 7 3 7 4 8 6 0 2 4 6 8 10 Lumbricus rubellus Cornu aspersum ESPECIES T1 T2 T3 T4 Testigo 46 Figura 5. Resultados de la repetición 1 glifosato, en diferentes dosis a los 15 días en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum Vasquez, 2020 En la figura 5 se muestran los resultados a los 15 días, luego de aplicar las diferentes dosis de glifosato, al aplicar 2.5ml en el Tratamiento 1 no hubo decrecimiento, siguiendo con la dosis de 5.0 ml en el T2 disminuyó a 4 lombrices y se mantuvo la especie Cornu aspersum, en la dosis 7.5ml en el T3 se reduce a 5 lombrices y 2 caracoles, por último, suministrando la dosis de 10ml en el T4 decreció a 3 lombrices y 2 caracoles. Figura 6. Resultados de la repetición 1 glifosato, en diferentes dosis a los 30 días en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum Vasquez,2020 9 3 4 1 5 2 3 2 0 2 4 6 8 10 Lumbricus rubellus Cornu aspersum RESULTADOS INTERMEDIOS 15 DÍAS T1 T2 T3 T4 9 33 1 3 0 1 0 0 2 4 6 8 10 Lumbricus rubellus Cornu aspersum RESULTADOS FINALES 30 DÍAS T1 T2 T3 T4 47 En la figura 6 se visualizan los resultados después de 30 días, analizando el gráfico, se apreció que el tratamiento 4 tuvo mayor incidencia en ambas especies, reduciendo de 7 lombrices a 1 y 4 caracoles a 0. Tabla 4. Aplicación del test: Kruskal Wallis en la repetición 1 Variable Especies N Medias D.E. Medianas gl H p Macroinvertebrados Cornu aspersum 4 2,75 1,26 3 1 5,33 0,0286 Macroinvertebrados Lumbricus rubellus 4 7 1,63 7 Vasquez,2020 En la tabla 4 se visualiza la aplicación del test Kruskal Wallis, donde se concluye que existen diferencias entre las medianas, visto que el valor de p es menor al nivel de significancia p=0,0286 < 0,05 por lo tanto, se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alternativa. Tabla 5. Correlación de Pearson en la repetición 1 Correlación de Pearson Macroinvertebrados y Glifosato -0,694 Valor P 0,056 Vasquez,2020 En la tabla 5 se presenta la correlación de Pearson entre las diferentes dosis de glifosato y los macroinvertebrados Lumbricus rubellus y Cornu aspersum en la repetición 1, el resultado es menor a cero, por consiguiente, las variables se relacionan inversamente. Mientras la dosis es alta, el número de especies decrecen. 4.2.3.2 Resultados de la repetición 2 en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum 48 Tabla 6. Caracterización inicial de la repetición 2 Lumbricus rubellus y Cornu aspersum Tratamientos Lumbricus rubellus Cornu aspersum T1 8 2 T2 6 3 T3 9 4 T4 7 4 Vasquez,2020 Figura 7. Caracterización inicial de la repetición 2 en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum antes del glifosato Vasquez,2020 En la figura 7 se muestran los datos obtenidos de Lumbricus rubellus y Cornu aspersum antes de aplicar las respectivas dosis de glifosato 8 2 6 3 9 4 7 4 0 2 4 6 8 10 Lumbricus rubellus Cornu aspersum ESPECIES T1 T2 T3 T4 49 Figura 8. Resultados de la repetición 2 glifosato, en diferentes dosis a los 15 días en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum Vasquez, 2020 En la figura 8 se visualizan los resultados de la repetición 2 en 15 días, al aplicar la dosis 2.5ml en el Tratamiento 1 no hubo decrecimiento, siguiendo con la dosis de 5.0 ml en el T2 disminuyó a 6 lombrices, pero se conservó la especie Cornu aspersum, en la dosis 7.5ml del T3 se reduce a 7 lombrices y 3 caracoles, por último, la dosis de 10ml en el T4 decreció a 3 lombrices y 2 caracoles. Figura 9. Resultados de la repetición 2 glifosato, en diferentes dosis a los 30 días en especies Lumbricus rubellus y Cornu aspersum Vasquez, 2020 8 2 5 3 7 33 2 0 2 4 6 8 10 Lumbricus rubellus Cornu aspersum RESULTADOS INTERMEDIOS 15 DÍAS T1 T2 T3 T4 8 2 4 3 5 1 0 0 0 2 4 6 8 10 Lumbricus rubellus Cornu aspersum RESULTADOS FINALES 30 DÍAS T1 T2 T3 T4 50 En la figura 9 se visualizan los resultados después de 30 días, el tratamiento 4 volvió a tener mayor incidencia en ambas especies, reduciendo de 7 lombrices a 0 y 4 caracoles a 0. Tabla 7. Aplicación del test: Kruskal Wallis en la repetición 2 Variable Especies N Medias D.E. Medianas gl H p Macroinvertebrados Cornu aspersum 4 3,25 0,96 3,5 1 5,33 0,0286 Macroinvertebrados Lumbricus rubellus 4 7,5 1,29 7,5 Vasquez,2020 En la tabla 7 se muestra el test de Kruskal Wallis, concluyendo que existen diferencias entre las medianas, acotando que el valor de p es menor al nivel de significancia p=0,0286 < 0,05 por consiguiente, se acepta la hipótesis alternativa y se rechaza la hipótesis nula. Tabla 8. Correlación de Pearson en la repetición 2 Correlación de Pearson de Macroinvertebrados y Glifosato -0,674 Valor P 0,067 Vasquez,2020 En la tabla 8 se muestra la correlación de Pearson entre las diferentes dosis de glifosato y los macroinvertebrados Lumbricus rubellus y Cornu aspersum en la repetición 2, el resultado fue menor a cero, por lo tanto, significa que las variables 51 se relacionan inversamente. Mientras la dosis es alta, el número de especies disminuye. Tabla 9. Resumen de las repeticiones en los cuatro tratamientos Tratamientos Lumbricus rubellus Cornu aspersum T1 9 3 T1 8 2 T2 3 1 T2 4 3 T3 3 0 T3 5 1 T4 1 0 T4 0 0 Vasquez, 2020 En la tabla 9 se puede visualizar el resumen de los cuatro tratamientos; observamos la presencia de Lumbricus rubellus para el tratamiento 1 con un promedio de 8 unidades, para el tratamiento 2 de 3 unidades, para el tratamiento 3 de 4 unidades y para el tratamiento 4 de 1 unidad, mientras que para la especie Cornu aspersum para el tratamiento 1 con un promedio de 2 unidades, para el tratamiento 2 de 2 unidades, para el tratamiento 3 de 1 unidad y finalmente para el tratamiento 4 de 0 unidades. 4.3 Propuesta de un sistema de remediación para suelo contaminado por glifosato mediante revisión de resultados obtenidos y bibliografía La propuesta de un sistema de remediación para suelo contaminado por glifosato mediante revisión de bibliografía y los resultados obtenidos de la investigación, se propone como alternativa la recuperación con el método de fitorremediación al ser una técnica limpia, natural y económica, que utiliza distintas 52 especies vegetales, las cuales sobreviven a los ambientes contaminados por metales pesados y sustancias orgánicas debido a esto se encargan de extraer, inmovilizar, acumular y transformar los contaminantes del suelo (Bernad et al., 2007). Se plantea dos ciclos de cultivos cereal-pastos. Debemos seguir los siguientes pasos para realizar una fitorremediación. 4.3.1 Prospección de especies vegetales para la fitorremediación Massot, (2018) Menciona que la Agencia de Protección Ambiental al momento de escoger una especievegetal, se debe tener en cuenta 3 aspectos importantes: • Especies vegetales que anteriormente hayan sido capaces de tolerar el contaminante a remediar • Especies de fácil implantación, con grande elaboración de biomasa • Especies nativas, las cuales representen un valor productivo 4.3.2 Selección de especies vegetales que toleren glifosato Massot, (2018) Afirma que Las especies forrajeras están consideradas como postulantes para llevar acabo la fitorremediación. Trabajaron con 4 especies, Lotus tenuis, Lotus corniculatus, Lolium multiflorum y Medicago sativa. Entre ellas Medicago sativa (alfalfa) posee muchos nutrientes que contribuye a la recuperación de la fertilidad y estabilidad edáfica, debido a su fijación simbiótica del nitrógeno atmosférico. Además, su ciclo de producción es similar al de trigo y maíz. Su raíz penetra el suelo a 4 metros o más (Massot, 2018). Según investigaciones realizadas, se propone que se utilice la especie vegetal remediadora Zea mays ya que posee la cualidad de absorber metales pesados como cadmio y plomo, destacando que el trabajo lo realizaron en suelos agrícolas. Ubicaron 5 semillas de maíz por maceta 4 kg; luego de la germinación y el establecimiento de las plantas, trabajaron solo con 3 plantas por maceta. Luego 53 cosechó manualmente y cuando la planta alcanzó su madurez fisiológica se tuvo en cuenta la aparición de la inflorescencia masculina (panoja) que fue en 4 meses (Munive et al., 2018). Los resultados de la acumulación de plomo en el maíz: 80% raíz, 15% hojas y 5% tallo como promedio de todos los tratamientos. Por otra parte, al extraer el cadmio en el maíz se dieron los siguientes resultados: 91% raíz, 6 % hojas y 3% tallos en promedio de todos los tratamientos (Munive et al., 2018). 54 5. Discusión Delgado, (2016) manifiesta que, los resultados del modelo de fugacidad representan afinidad por los diferentes compartimentos ambientales destacando que la mayoría son por suelo y agua, en efecto los valores logarítmicos del porcentaje del contaminante en el compartimiento suelo y KOC, debido a esto los valores de Log (KOC) < 2.4 representan que el porcentaje en el compartimiento suelo es lineal creciente. Por consiguiente, encontraron glifosato en las aguas superficiales en Reino Unido. Para finalizar estas afirmaciones se confirmaron con el trabajo de titulación realizado, mediante el cálculo de la capacidad de fugacidad para el ambiente que el glifosato se distribuyó principalmente en suelo y agua, por lo cual el valor de Log (KOC) estaba por debajo de 2.4. En la modelación de distribución del glifosato en un posible escenario de contaminación, con 1000ml y 2000ml de agua en 1m3 de suelo, la distribución se esparció con 72% y 56% en suelo, por otro lado, en la simulación mientras más se aumentaba la dosis de agua mayor fue la distribución de glifosato en el agua alcanzando 78%. Del mismo modo Paravani et al., (2016) mediante la determinación de la concentración de glifosato en muestras de agua el 100 % fueron positivas para la técnica de ELISA también resultaron afirmativas para la UHPLC-MS/MS. Concluyendo que, en el análisis de agua de sistemas agrícolas se encuentra presencia de glifosato en bajas concentraciones, inferiores a 250 µg/L en el 75 % de las muestras realizadas. En la caracterización empleada en esta investigación, la afectación del glifosato a los macro invertebrados mediante los índices propuestos, conllevaron resultados de una diversidad relativamente baja de especies Shannon-Wiener y Margalef. Mientras tanto el estudio realizado en Lima-Perú comprendido en el año 2004-2005 55 calcularon la de diversidad ecológica empleando varios índices entre ellos: Shannon-Wiener, Simpson y Margalef dando como resultados una baja diversidad de especies. Tal como relata (Iannacone & Alvariño, 2007). En esta investigación, como resultado en la dosis 10ml de glifosato diluida en 1000ml de agua se pudo demostrar que la lombriz (Lumbricus rubellus) se ve afectada al pasar los días. El tratamiento se inició con 7 lombrices y después de 30 días quedo 1 lombriz. Por otro lado, el estudio de Pochron et al., (2019) menciona que los investigadores han analizado los efectos de las formulaciones a base de glifosato y glifosato en la salud de la lombriz de tierra (Eisenia fetida) después de 29 días de exposición, el 89% (137/154) de los gusanos en el suelo no calentado permaneció en sus tanques, mientras solo el 75% (116/155) de los gusanos permanecieron en el suelo calentado. Finalmente, se planteó una propuesta para desarrollar un sistema de remediación para suelo contaminado por glifosato mediante revisión de resultados obtenidos y bibliografía este proceso fue establecido por (Massot, 2018) y (Munive et al., 2018) en sus investigaciones aseguran que las especies forrajeras son consideradas postulantes para llevar a cabo una fitorremediación. 56 6. Conclusiones Al realizar las respectivas simulaciones de la distribución del glifosato en los compartimentos ambientales mediante el cálculo de la capacidad de fugacidad para el ambiente, se llegó a la conclusión, que se distribuye mayormente en agua y suelo, por otro lado, con menores cantidades en el aire y sedimento, esto es debido al coeficiente de partición, además de no ser volátil. La dosis 7.5ml de glifosato causó mayor afectación en la especie Cornu aspersum reduciéndolos entre 1 y 0 a los 30 días del tratamiento. De modo similar, la dosis 10ml de glifosato ocasiono afectación en mayor cantidad en ambas especies Cornu aspersum y Lumbricus rubellus disminuyéndolas a 0 en los 30 días del tratamiento. Además, los índices de Shannon-Wiener, Margalef proporcionaron una diversidad relativamente baja, mientras el índice de Simpson una diversidad infinita. Finalmente, se realizó una propuesta para remediar el suelo contaminado por glifosato mediante revisión bibliográfica y como alternativa se consideró la fitorremediación, al ser un tratamiento natural y económico que utiliza distintas especies vegetales, las cuales se encargan de sobrevivir a los ambientes contaminados por metales pesados y sustancias orgánicas. 57 7. Recomendaciones Se recomienda utilizar las fórmulas de la capacidad de fugacidad para el ambiente y simular la distribución de los biocidas en un posible escenario de contaminación debemos de identificar su coeficiente de partición y la constante de Henry ya que son parte fundamental para aplicar las fórmulas y así observar cómo se dispersa un contaminante. En cuanto a las dosis de glifosato utilizadas en el presente trabajo, las que más afectaron a las especies antes mencionadas fueron a partir de 7.5ml y 10 ml, a diferencia de 2.5ml y 5.0ml las cuales no presentaron mayor afectación; se sugiere aumentar las dosis de glifosato en una posible investigación a futuro, servirá para evidenciar el daño que causa a las especies de macroinvertebrados. Para remediar un suelo contaminado por glifosato se recomienda una fitorremediación siendo un tratamiento económico y natural, que se encarga de inmovilizar, degradar y reducir el contaminante; además, se debe utilizar especies nativas del suelo a tratar y que sean tolerantes al glifosato u otro contaminante entre ellas recomendaría Medicago sativa conocida como (alfalfa) la cual posee muchos nutrientes, que contribuyen a la recuperación de la fertilidad y estabilidad edáfica o maíz (Zea mays ) que absorbe cadmio y plomo. 58 8. Bibliografía Álvarez, A. (2016). Evaluación de la contaminación de suelos y aguas por pesticidas en zonas de Viñedo: Diagnóstico y desarrollo de Estrategias fisicoquímicas de Prevención y/o control [Salamanca].
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