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Curso Introductorio de Biologia Molecular: Construccion de genotecas en el
Bacteriofago lambda
Book · January 2003
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Pedro A. Moreno
Universidad del Valle (Colombia)
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Curso Introductorio 
de Biología Molecular
Construcción de Bibliotecas de ADN-Recombinante 
en el Bacteriófago lambda 
para el aislamiento de clonos de genes
Patricia E. Vélez, Esperanza Rodríguez 
& 
Pedro A. Moreno
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Curso Introductorio 
de Biología Molecular
Construcción de Bibliotecas de ADN-Recombinante 
en el Bacteriófago lambda
para el aislamiento de clonos de genes
Patricia E. Vélez, Esperanza Rodríguez
 & 
Pedro A. Moreno
 
2
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Curso Introductorio de Biología Molecular 
Construcción de Bibliotecas de ADN-Recombinante en el Bacteriófago lambda. 
Primera edición
Carátula: Bacterias de E. coli y bacteriófago lambda
Biblioteca del Congreso de la República de Colombia 
Incluye referencias bibliográficas e índice.
ISBN 958-33-5178-0
Todos los derechos reservados. 
Patricia E. Vélez es Licenciada en Biología de la Universidad del Cauca y Maestría en Genética Humana 
de la Universidad Nacional de Colombia. Profesora del Departamento de Biología de la Universidad del 
Cauca, Popayán, Colombia. pvelez@atenea.ucauca.edu.co
Pedro A. Moreno es Biólogo de la Universidad Nacional de Colombia y Doctorante en Biología Celular 
y Molecular del Departamento de Biología y Bioquímica de la Universidad de Houston, Houston, TX. 
EE.UU. pmoreno2@bayou.uh.edu 
Ninguna parte de este libro puede ser reproducida por ningún proceso, mecánico, fotográfico o 
electrónico o en la forma de registro fonográfico ni puede ser almacenado en un sistema de 
recuperación, transmitido o de otra parte copiado para uso público o privado, sin el permiso del 
editor.
Editorial Universidad del Cauca
Distribuido por los Autores
3
mailto:pvelez@atenea.ucauca.edu.co
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
A nuestras hijas Ángela Patricia y Daniela Valentina, 
Por su apoyo paciente en estos tiempos difíciles de manejar.
P.E.V.V. & P.A.M.T.
A mi adorada Familia
E. R.
4
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Prólogo
En los últimos 50 años la biología molecular ha revolucionado la investigación y 
la enseñanza de la biología. Muy pocos biólogos podrían estar exentos del 
entendimiento de la biología molecular como herramienta para estudiar y entender la 
célula viva y los organismos. Esto ha sido posible gracias a la tecnología del ADN-
Recombinante. En efecto, este pequeño libro se ha escrito con el propósito de divulgar 
aspectos teóricos básicos y experimentales referentes a la manipulación de genes in 
vitro. 
La construcción de bibliotecas de ADN-Recombinante o genotecas es un método 
práctico y general desarrollado por Paul Berg y Herbert Boyer en 1975, con el objeto de 
clonar fragmentos de ADN-Recombinante. Desde la reglamentación de este tipo de 
experimentos y el desarrollo de los primeros hospederos y vectores “seguros” esta 
estrategia ha permitido incrementar de manera exponencial el número de las secuencias 
de ADN en las bases de datos. De ahí que a partir de 1977 al presente, se han 
almacenado más de cuatro mil millones de pares de bases de diferentes especies 
biológicas para consulta de “toda” la comunidad científica.
Como resultado, la construcción de genotecas de las especies más “representativas” 
de los Filum que pueblan la Biosfera ha permitido dentro del marco de proyectos 
oficiales (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y privados (http://www.tigr.inc), 
(http://www.celeragenomics.inc) de secuenciación de genomas el secuenciamiento de 
más de 130 genomas bacterianos (0.5 - 7.0 Mpb) con más de 200 bacterias en progreso. 
Del mismo modo, se ha realizado el secuenciamiento de los primeros genomas 
eucarióticos, tales como el primer organismo unicelular Saccharomyces cereviciae (17 
Mpb), el primer organismo multicelular, el nematodo Caenorhabditis elegans (99 Mpb), 
el primer insecto, la Drosophila melanogaster (137 Mpb) y para sorpresa de la 
comunidad científica, antes de lo previsto, la secuencia completa del genoma humano (≈
3000 Mpb) y a la cual se han añadido recientemente, la de la rata, el ratón, el perro y 
próximamente la de la vaca, el pollo y el chimpancé.
Estos hallazgos demuestran que las técnicas de ADN-Recombinante acopladas a 
secuenciación y computación han producido una explosión de conocimiento de los 
procesos fundamentales de la vida orgánica sin precedentes, generado empresas 
biotecnológicas y toda una revolución científica y tecnológica en la biología y la 
sociedad. Adicionalmente, el descubrimiento de secuencias de ADN esta influyendo la 
manera de practicar la medicina, las ciencias forenses, la antropología, el medio 
ambiente, la agronomía, la industria alimentaria y el análisis computacional, entre otros 
campos.
A nivel doméstico, Colombia se ha caracterizado por ser unos de los países con 
mayor biodiversidad del planeta. La cantidad del recurso genético y de 
microorganismosenvueltos en esta red ecológica es astronómica, con un potencial 
inmenso por explorar. Desafortunadamente, los países en vías de desarrollo han 
permanecido ajenos a este tipo de tecnologías por causa de costos, especialidad y 
desinterés político y científico, subestimando así el empleo y desarrollo que estas 
tecnologías moleculares podrían generar. Por otra parte, este tipo de información se 
encuentra reducida a textos especializados, tesis de grado, postgrado y manuales de 
poca difusión y consulta.
5
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Con todas estas razones, los autores hemos considerado hacer un modesto aporte 
para motivar a profesionales y estudiantes universitarios interesados, difundiendo a 
nivel introductorio un texto básico de clonaje molecular. Los protocolos detallados aquí 
han sido probados satisfactoriamente en trabajos rutinarios de investigación, trabajos de 
grado y postgrado y en cursos prácticos de biología molecular. Adicionalmente, el 
presente texto puede ser empleado como referencia o complemento para la docencia y/o 
la investigación de quienes deseen abordar la construcción de genotecas de 
microorganismos en vectores de clonaje tipo lambda. 
El texto ha sido el producto de los resultados y experiencias de los autores a lo largo 
del ejercicio profesional y como recopilación del material de una obra más extensa 
(Moreno, Vélez y Burgos, 2003). En especial, y al parecer, como resultado de la 
“primera tesis de grado que se hizo en biología molecular en la Universidad Nacional de 
Colombia y creemos que en el país (Rodríguez y Moreno, 1987), por lo cual, a pesar del 
tiempo, se constituye en un documento histórico de la ciencia en Colombiana que no ha 
perdido su vigencia, pues muchos de estos principios y protocolos se siguen usando 
actualmente. Finalmente, tenemos la esperanza que este esfuerzo de difusión contribuya 
de manera importante en el beneficio de los futuros estudiosos, constructores y 
administradores de los recursos biológicos.
Agradecimientos
Queremos expresar nuestros agradecimientos a la lingüista Franci Hellen Vélez y al 
Ingeniero Germán Llanos por las generosas correcciones y recomendaciones 
sugeridas. A Carlos Andrés Prado y Diana Milena Muñoz y Adriana Arteaga por su 
colaboración en la ekaboraciòn de algunos graficos en este texto . Finalmente, queremos 
brindar un homenaje póstumo al Dr. Oscar Orozco (del Instituto de Cancerología, 
sección de Inmunología, Bogotá, D. C.) quien nos sugirió hace algún tiempo la 
publicación de este documento como manual y testimonio.
Igualmente agradecemos a las personas representadas en jefes, profesores, colegas, 
alumnos y/o pacientes quienes en su momento tuvieron que ver con el ejercicio de la 
docencia e investigación de los autores. Por esto damos también crédito al Instituto del 
Seguro Social de Bogotá, D. C.; al Departamento de Biología y a la Unidad de Genética 
Humana de la Universidad Nacional; al Instituto de Inmunología del Hospital San Juan 
de Dios; al Departamento de Biología de la Universidad Javeriana; al CIDEIM, Cali; a 
CORPOGEN; al Departamento de Biología y Bioquímica de la Universidad de 
Houston, Texas, USA y a COLCIENCIAS. Sin ellos y estas instituciones, nuestra 
experiencia no hubiera sido posible.
Finalmente, la presente obra ha sido preparada como complemento de un curso 
intensivo de biología molecular celebrado en la Universidad del Cauca, por lo que 
también agradecemos a las directivas, profesores y estudiantes de ésta institución por su 
generoso apoyo y entusiasmo mostrado durante el curso. Igualmente, al departamento 
de edición e impresión que hizo posible esta obra.
A todos, nuestros agradecimientos,
Patricia E. Vélez
Esperanza Rodriguez
Pedro A. Moreno 
Mayo, 2002
6
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Acerca de la Obra y Normas de Bioseguridad
La obra esta dividida en 6 capítulos. En el primero se da una introducción acerca de 
que es la biología molecular y algunos conceptos básicos de ADN-Recombinante, tales 
como la construcción de genotecas, los vectores lambda de amplio uso y los métodos de 
rastreos de clonos recombinantes dentro de las genotecas, con el objeto de familiarizar 
al lego con el ABC de esta disciplina. Los capítulos subsiguientes son cortos y de 
utilidad práctica. En el capítulo dos, dos genotecas de ADN genómico (gADN), una 
bacteriana y otra de eucariote inferior son introducidas a fin de ilustrar las diversas 
metodologías empleadas en la construcción de genotecas y en la identificación de 
secuencias de interés mediante el uso de vectores lambda en Escherichia coli. El tercer 
capítulo trata sobre la síntesis de oligonucleótidos. Si bien estos ya son comercializados 
por diversas compañías nacionales y extranjeras es importante conocer los fundamentos 
de su síntesis para su diseño y usos. El capítulo cuatro tiene que ver con la 
determinación de la calidad de la genoteca. El capítulo cinco ilustra la búsqueda de 
clonos de genes o rastreo (screening) mediante hibridización con sondas de ADN o 
mediante inmunoreactividad con sondas de anticuerpos. El capítulo seis muestra la 
expresión y purificación de las proteínas recombinantes clonadas, usando las ventajas 
de los plásmidos de expresión pBS y pMal. Finalmente, el anexo trae información 
relevante para el manejo apropiado de conceptos y protocolos. Dado que la biología 
molecular usa terminología anglosajona, nosotros vemos la necesidad de usar 
indistintamente la palabra en español o en inglés y las cuales ofrecemos también en el 
glosario y en el índice. Las Figuras y Diagramas son originales producto de los 
resultados obtenidos por los autores. La bibliografía es clásica (y al mismo tiempo 
actualizada en algunos puntos) la cual esperamos sirva de referencia para los lectores.
Por otra parte, debido a que muchos agentes que se manejan en un laboratorio de 
biología molecular son tóxicos, venenosos, carcinógenos e infecciosos, algunas 
recomendaciones especiales de bioseguridad deben ser hechas, tales como: 1) uso de los 
elementos de protección básica, como son la bata, los guantes, chalecos de plomo, 
pantallas de protección, campanas de extracción, cámaras de aire de flujo laminar, uso 
de gafas de protección y tapa bocas según los casos. 2) Aminorar el tiempo de 
exposición y manipulación de agentes químicos y físicos peligrosos (luz U.V., reactivos 
volátiles, cáusticos, radioisótopos, etc). 3) Abstenerse de consumir alimentos o bebidas 
en las áreas de laboratorios. 4) Disminuir los riesgos de contaminación cuando se 
manipulen agentes infecciosos. 5) Ubicar las fuentes de agua limpia, duchas, fregaderos, 
extinguidores de fuego, etc. 6) Leer las etiquetas y el manejo de reactivos nocivos y 
conocer el manejo de equipos. 7) Utilizar los contenedores de sustancias radiactivas, 
corrosivas, flamables y abstenerse de fumar. 8) Acatar las órdenes del personal con 
experiencia del laboratorio. Si no se sabe, preguntar es la solución! 9) Una exposición 
previa del proyecto o experimentos frente a un Comité o Consejo de Bioética debe ser 
efectuado para discutir los alcances y consecuencias de la manipulación de genes y 
genomas propuestos. Y 10) seguir las normas de bioseguridad internacional para 
laboratorios y manipulación genética (Asilomar Conference, guidelines for recombinant 
ADN research).
7
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P.A. Moreno 
Contenido
Prólogo 5
Contenido del libro y normas de bioseguridad 7
Capítulo 1. Qué es la biología molecular? 11
Hitos en la historia de la biología molecular 13
Introducción al ADN-Recombinante 16
1.1. Construcción de una biblioteca de ADN-Recombinante 16
1.1.1. ADN blanco de interés para clonar 17
1.1.2. Vector de clonaje 17
1.1.3. Endonucleasa de restricción 18
1.1.4. ADN ligasa 19
1.1.5. Hospedero 20
1.2. Sistemas de rastreo e identificación de clonos de ADN-Recombinante 
dentro de una genoteca 20
1.2.1. Síntesis química de oligonucleótidos o sondas 21
1.2.1.1. Soporte sólido 22
1.2.1.2. Nucleótidos protegidos 23
1.2.1.3. Hibridización de dos hebras de ácido nucleicos complementarias 24
1.2.1.4. Factores que afectan la hibridización en los filtros de nitrocelulosa 24
1.2.2. Rastreo de genes con oligonucleótidos sintéticos 26
1.2.3. Principios inmunológicos 26
1.2.4. Rastreo de genes con antisueros policlonales 27
1.3. Vectores 27
1.3.1. El bacteriófago lambda 28
1.3.2. Cascada lítica del fago lambda interconectada con el circuito para 
Lisogenia 29
1.3.3. Sistema genético de λgt-10.......................................................................... 30
1.3.4. Sistema genético de λgt-11.......................................................................... 31
1.3.5 Caracteristicas generales del sistema........................................................... 31
1.3.6. Sistema genetico de λZAP II....................................................................... 33
1.3.7 Búsqueda de genes con anticuerpos............................................................. 33
1.3.8. Factores que afectan la estabilidad de las proteínas recombinantes............. 34
1.3.9. Sistema genético lactosa............................................................................... 34
1.3.10. Identificación de clonos recombinantes....................................................... 37
1.3.11. Sistema genético del plásmido Bluescript (pBS).......................................... 39
1.3.12. Sistema genético del plásmido pMal............................................................ 39
1.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).................................................. 39
Capítulo 2. Construcción de bibliotecas de ADN-Recombinante.................. 42
2.1. Preparación del ADN genómico................................................................. 43
2.2. Restricción, ligazón y empaquetamiento............................................... 46
2.3. Cultivo e infección del hospedero y plateo de la genoteca................... 47
2.4. Amplificación y titulación y almacenamiento de la biblioteca genómica... 49
Capítulo 3. Síntesis de sondas de oligonucleótidos................................................ 51
3.1. Evaluación de la eficiencia de acople......................................................... 53
3.2. Tratamiento post-síntesis.............................................................................. 54
3.3. Desanclaje y desprotección........................................................................... 54
3.4. Aislamiento de la sonda mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.. 55
3.5. Purificación por cromatografía de fase reserva............................................. 57
3.6. Radiomarcaje enzimático, mediación de la radiactividad y determinación de la
 actividad específica....................................................................................... 58
Capítulo 4. Calidad de la biblioteca e identificación del fragmento de 
8
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
ADN-Recombinante................................................................................................. 60
4.1. Extracción del ADN clonado del fago............................................................ 60
4.2. Restricción y electroforesis............................................................................. 61
4.3. Transferencia del ADN digerido al papel de nitrocelulosa 
(Southern blotting)............................................................................................ 61
4.4. Hibridización “Southern” y “dot blotting”...................................................... 63
4.5. Autorradiografía............................................................................................. 64
Capítulo 5. Rastreo de clonos de proteínas recombinante mediante el uso de 
sueros policlonales...................................................................................................... 65
5.1. Antisuero policlonal y adsorción con extracto de E. coli............................ 65
5.2. Inducción de antígenos.................................................................................... 68
5.3. Exposición de los antígenos del microorganismo a los antisueros.................. 69
5.4. Revelado.......................................................................................................... 69
Capítulo 6. Expresión y purificación de las proteínas recombinantes clonadas.... 71
6.1. Subclonaje en plásmidos pBlueScript............................................................... 71
6.2. Escisión in vivo usando el sistema ExAssist/SOLR.......................................... 71
6.3. Expresión y purificación de proteínas recombinantes en el vector pMal......... 72
Anexo: Información útil para el manejo de los protocolos..................................... 73
- Algunas propiedades de los ácidos nucleicos............................................................. 73
- Reactivos y preparación de soluciones........................................................................ 74
- Fórmulas.................................................................................................................... 75
- Características de los vectores y cepas....................................................................... 77
- Fig.s....................................................................................................................... 10a
- Glosario...................................................................................................................... 92
Corolario........................................................................................................................ 91
Bibliografía.................................................................................................................... 96
Índice.............................................................................................................................. 97
 
Índice de Diagramas de flujo
 
Diagrama 1. Ruptura de los bacilos: tratamiento enzimático......................................... 44
Diagrama 2. Extracción y purificación del ADN del bacilo........................................... 45
Diagrama 3. Restricción, ligazón y Empaquetamiento del ADN del bacilo................... 46
Diagrama 4. Cultivo de las bacterias hospederas E. coli Y1090, Y1088....................... 47
Diagrama 5. Infección del hospedero E. coli Y1090, Y1088......................................... 48
Diagrama 6. Amplificación y titulación de la genoteca genómica.................................. 49
Diagrama 7. Síntesis automática de las sondas............................................................... 53
Diagrama 8. Tratamiento post-síntesis de las sondas..................................................... 54
Diagrama 9. Tratamiento post-síntesis de purificación de las sondas............................. 57
Diagrama 10. Radiomarcaje y medición de la radiactividad de las sondas..................... 58
Diagrama 11. Aislamiento de fagos a partir de la genoteca y extracción de 
 ADN recombinado....................... ............................................................ 60
Diagrama 12. Restricción de ADN recombinado y transferenciatipo Southern............. 63
Diagrama 13. Rastreo del clon dentro de la genoteca con anticuerpos 
 policlonales................................................................................................ 66
Diagrama 14. Adsorción de sueros anti-bacilo................................................................ 69
Diagrama 15. Rastreo del clon dentro de la genoteca. 71
Índice de Tablas
Tabla 1. Algunas enzimas de restricción 79
Tabla 2. Principales marcadores geneticos del bacteriofago Lambda 80 
Tabla 3. Principales marcadores del bacteriofago Lambda GT11 81
Tabla 4. Principales marcadores geneticos comunes a los hospederos E. coli
9
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Y1088 y Y1090 81
Tabla 5. Principales marcadores geneticos del hospedero E. coli Y1088 82
Tabla 6. Principales marcadores geneticos del hospedero E. coli Y1090 82
Índice de Figuras
Fig. 1. Tipos de genotecas 16
Fig. 2. Reacciones de la síntesis química de sondas de oligonucleotidos 22
Fig. 3. Protección de nucleotidos mediante un enlace tipo eter 23 
Fig.4. Bases AGC son protegidas por acilación 23 
Fig.5. Grupos prtectores de grupos fosfatos 24
Fig.6. Renaturacion de dos hebras de ácidos nucleicos 25
Fig.7. Hibridización en fase solida de acidos nucleicos 25
Fig.8. Mapa genético del fago lamda silvestre 28
Fig.9. Estilos de vida del fago lambda 29
Fig.10. Cascada lítica interconectada con el circuito para la lisogenia 31
Fig.11. Mapas de restricción con Hindi de Lambda gt11 32
Fig.12. Mapa genómico de E. coli 32
Fig. 13. El operón Lac 35
Fig.14. Región controladora del operón Lac 35
Fig.15. Regulación de la síntesis proteica del operon Lac 36
Fig.16. Identificación de recombinantes en Lambda ct11 38
Fig.17. Sistema genético del plasmido Bluescript 39
Fig.18. Sistema genético del plasmido pMal 39 
Fig.19. Variaciones de las temperaturas a lo largo de una PCR estándar 40
Fig.20. Forma esquematizada de una colección de fago Lambda 43
Fig.21. Ciclo de acople de un nucleotido a una síntesis automatica de una sonda 52
Fig.22. Tratamiento de post-sintesis de la sonda 56
Fig.23. Evaluación de la calidad de la libreria 62
Fig.24. Busqueda de genes con antisueros policlonales 66
Fig.25. Mtuberculosis teñido con Zielh-Neelsen visto a microscopio optico 83
Fig.26. Tejido pulmonar afectado por tuberculosis 83
Fig.27. Electroforesis en gel de agarosa 1% 84
Fig.28. Electroforesis del Mtuberculosis con ARN digerido con enzimas de 
restricción 84
Fig.29. Librería cultivada en presencia de IPTG y X-GAL 85
Fig.30. Titulo de 4.0x1010 ufp/mL de la librería amplificada 86
Fig.31. Aislamiento de las ondas sintetizadas por electroforesis en 
poliacrilamida-urea 87
Fig.32. Autorradiografia de geles de poliacrilamida-urea que muestra 
los oligonucleotidos marcados 88
Fig.33.Gradiente en CsCl 89
Fig.34. Análisis comparativo entre ADN genomico y ADNr cortados con enzimas de 
restricción 89
Fig.35. Autorradiografias de ADN de vectores 90
Fig.36. Análisis de electroforesis en agarosa al 1% 91
Fig.37. Muestra del clon 40K puro de M. tuberculosis 91
10
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Capítulo 1
__________________________
¿Qué es la Biología Molecular?
La Biología Molecular (BM) es la reducción a nivel molecular de las estructuras y 
procesos que caracterizan la vida orgánica. Esta ciencia surge de la aplicación de una 
serie de métodos interdisciplinarios encaminados a definir lo viviente. Para propósitos 
pedagógicos podemos agrupar dichos métodos en métodos estructurales, métodos 
informacionales y métodos computacionales. Los primeros se valen de la cristalografía, 
la resonancia nuclear magnética (RNM), la microscopía electrónica (MICE) y tunnel 
(MICTU), entre otros. Los segundos usan métodos derivados de la genética y la 
bioquímica y cuyos resultados se desprenden de geles y reacciones. Estos métodos dan 
fundamento a las tecnologías del ADN-recombinante. Los métodos computacionales 
son una consecuencia de los dos primeros. Estos métodos implican por una parte 
analizar bases de datos, diseñar algoritmos y programas con el propósito de descifrar las 
propiedades subyacentes que las secuencias de ADN almacenan y por otra, el diseño de 
biointegrados con múltiples propósitos.
Biología Molecular
Métodos estructurales Métodos informacionales Métodos computacionales
Cristalografía (Ingeniería genética, ADN- Bases de datos
RNM Recombinante y PCR) Programas
MICE, MICTU Algoritmos
Biointegrados
Estrategias
Familia Gen Proteína
 (Genoma) (Proteoma)
El clonaje ocupa un lugar central
Gen Proteína Gen
 (Célula) (Célula)
11
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Adicional a esto, tres estrategias metodológicas pueden ser planeadas a fin de atacar 
los problemas biológicos a nivel molecular: 1) de la proteína al gen; 2) del gen a la 
proteína y 3) de la familia al gen. En cualquier caso, el clonaje de ácidos nucleicos 
ocupa un lugar central para proveer material puro y específico para múltiples propósitos.
La experimentación combinada de estos métodos esta redundando en el estudio de 
estructuras y funciones de genes, proteínas, genomas y proteomas. Definiendo con estos 
los procesos fundamentales que caracterizan la célula viva, como son el conjunto de 
reacciones del metabolismo celular, el ciclo celular, el crecimiento y la diferenciación 
celular, el movimiento y la comunicación celular, el envejecimiento y la muerte celular, 
entre otros. 
Todos estos procesos se encuentran enraizados en el núcleo central del flujo de la 
información genética intracelular o dogma central de la BM, dados por la replicación del 
ADN, la reparación, la recombinación, la transcripción, la traducción, la regulación 
génica, el transporte intracelular, entre otras propiedades de los ácidos nucleicos. 
Igualmente, los métodos de la BM han generado poderosas biotecnologías o 
herramientas moleculares las cuales están contribuyendo a la investigación de diferentes 
disciplinas cuyos objetos de estudio tienen que ver con lo biológico. 
En un sentido estricto, la BM es una subdisciplina de la biología. Por ello, nosotros 
no podemos esperar entender la estructura y la función de los genes si nosotros no 
estamos preparados para entender la biología y la ecología de los organismos en los 
cuales esos genes y organismos se expresan. En el corazón de la BM se encuentra la 
Ingeniería Genética, la cual permite la manipulación de genes de procesos complejos de 
la célula viva. Así, el entendimiento de la estructura, función y regulación de los genes y 
sus productos es esencial para una apreciación de los sistemas biológicos, lo que implica 
el conocimiento de la organización de los ácidos nucleicos de los organismos. 
Para analizar la estructura genética y los eventos en ésta situación compleja, se 
necesita de la capacidad para aislar y estudiar un grupo de genes o un simple gen en una 
forma pura. La Ingeniería Genética permite hacer esto, a través de una manipulación 
deliberada de genes dentro o entre especies, ya sea con propósitos de análisis genético, 
mejoramiento de cepas, reparación de genes defectuosos, entre otras. Las herramientas 
que utiliza la ingeniería genética son la tecnología del ADN-Recombinante y la 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (o PCR por sussiglas en Inglés). Con estas es 
posible efectuar el reordenamiento in vitro de material genético y la amplificación 
específica de fragmentos de ADN por manipulación enzimática. 
Con estas herramientas la cacería de genes científica y económicamente importantes 
se ha convertido en el principal objetivo de las ciencias biológicas. Así, la biología ha 
sido transformada por la capacidad de replicar y expresar genes in vitro. La biología del 
desarrollo busca primero un gen para especificar una forma en el embrión. La biología 
celular busca un gen que especifique un elemento estructural. La medicina busca genes 
para producir proteínas del cuerpo o trazar las causas de las enfermedades. Las 
cuestiones evolutivas, desde el origen de la vida hasta el origen de las especies son 
-controversialmente- todas trazadas por patrones de moléculas de ADN. La ecología 
caracteriza las poblaciones naturales por amplificación de ADN: los hábitats sociales de 
los animales y los patrones de migraciones de las poblaciones humanas se conducen 
sobre patrones de ADN. Las cuestiones legales de vida o muerte pueden abordarse sobre 
patrones de restricción de ADN o “fingerprinting” (Gilbert, W. 1991). Y ahora, el 
proyecto genoma ha comenzado a descifrar las secuencias de ADN completas y listar 
cada uno de los genes que caracterizan todas las especies modelo que pueblan la tierra, 
incluida la nuestra.
12
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Como consecuencia de todo esto, alrededor de los genes se mueve una poderosa 
biotecnología cuyos beneficios se están aplicando a todos los campos de la salud, 
industrial, agrícola, energético, ecológico, analítico y social. Sin lugar a dudas, en 
Colombia existen muchas necesidades las cuales esta moderna biotecnología permitiría 
buscar soluciones a problemas domésticos y universales. 
Según Walter Gilbert la BM ha contribuido a resolver tres grandes interrogantes: 1) 
resolvió como la información hereditaria es transmite de generación en generación; 2) 
como dicha información es traducida a estructuras proteicas (obreros del metabolismo) 
y por consiguiente, a la definición básica y especializada de las células; y 3) que todos 
los organismos compartimos el mismo tipo de información y que todos provenimos por 
“evolución” (las comillas son nuestras) de las secuencias de ADN (Ver Nota). 
Otro reciente hecho de trascendencia universal ha sido el dado por el consorcio 
Celera Genomics liderado por Craig Venter. Ellos lograron secuenciar por completo el 
genoma humano. Según James Watson se requerirán por lo menos 1000 años más para 
entender todos los 3000 millones de pares de bases que constituyen el patrimonio 
genético humano. Algunos científicos opinan que durante éste milenio se espera que los 
biólogos moleculares descifren por que somos como somos, derrotemos las 
enfermedades y las taras genéticas que nos afligen y lleguemos a ser menos seniles.
______
Nota: Los evolucionistas suelen afirmar que quien no entiende la teoría de la evolución es por que no 
tiene la fundamentación matemática y poblacional (Mainard-Smith, 1989) para digerirla. Habiendo 
considerado este hecho los autores también han observado que algunos evolucionistas son conscientes de 
las limitaciones e inconsistencias internas en la aplicación del análisis matemático a los procesos de 
selección natural y mutación de las especies. Igualmente, a nivel molecular existe una gran controversia 
con la teoría del reloj molecular, dada la dificultad en reconciliar los cambios en los nucleótidos con el 
tiempo y las evidencias contradictorias con los registros paleontológicos. Finalmente, a nivel del origen 
de la vida hay más especulación que respuestas finales. Parafraseando a Delbrück podríamos decir: "ya 
no leeré ningún artículo sobre la evolución prebiótica hasta que alguien se presente con una receta que 
diga: haga esto y aquello, y en tres meses verá cosas arrastrándose allí" (Luria, 1986). Ver epílogo.
Hitos en la historia de la biología molecular 
La era de la BM nació con la visión del físico Erwin Schrödinger (Lewin, 2000) 
quien en su famoso librito “what is life?”, predijo las propiedades esperadas para el gen 
(Shrödinger, 1944). Su obra influyó sobre algunos físicos de la época, como Wilkins, 
Crick, Staudinger, Luria a incursionar en la biología, y sobre otros, como el bioquímico 
Chargafs y el biólogo Watson ha focalizar sus estudios sobre la estructura del 
cromosoma y la herencia. Ellos rememoraron el impacto que dicha obra causó en sus 
vidas (Gribbin, 1986). De ahí que la BM surge de la colaboración entre biólogos y 
físicos (Haynes & Hanawalt, 1968; Watson, 1968; Luria, 1986; Moreno & Vélez, 2000).
Ya que los grandes logros de la ciencia nacen en ambientes académicos, científicos y 
personales altamente competitivos, una apreciación humana vale tener en cuenta. Al 
igual que cualquier otra actividad humana, la BM esta atada a los avatares del poder, la 
psíquis y los sueños personales de quienes trabajan en ciencias. Al recorrer la historia de 
esta fascinante disciplina es fácil encontrar todo tipo de personalidades, desde aquellos 
que encarnan la modestia y sabiduría de los hombres de ciencia, cada vez más escasa, 
hasta aquellos quienes rinden tributo al glamour, la arrogancia y la ambición personal 
como únicos medios para materializar sus sueños de fama. Ambos estilos producen 
resultados y la historia se encarga de juzgar el impacto universal de sus 
descubrimientos.
La siguiente cronología histórica pretende motivar a los estudiosos a investigar que 
hay detrás de cada uno de estos personajes y a medir el real impacto de sus hallazgos 
sobre el conocimiento y la sociedad. Son ellos quienes con sus contribuciones han 
13
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
fundamentado gran parte de la biología moderna y han permitido descifrar los principios 
y aplicaciones que sustentan la vida orgánica.
• 1865. Gregorio Mendel descubre la naturaleza estadística de la transmisión de los 
caracteres de la herencia o genes. Nace la genética y Mendel es considerado el padre 
de ésta.
• 1865. Mischer descubre la nucleína y posteriormente esta es caracterizada por 
Altman como ácido nucleico.
• 1920. Thomas Morgan establece los primeros mapas de ligamiento cromosómico 
mediante uso de formas alternas o alelos producidos en el laboratorio por rayos X.
• 1940. Delbrück, Luria y Hershey crean el grupo del fago para estudiar las 
propiedades de “la molécula de la herencia”. 
• 1944. Erwin Shrödinger publica “what is life?”. Obra que influyó sobre muchos 
físicos atómicos a efectuar alianzas con biólogos y químicos contemporáneos para 
estudiar la naturaleza del gen. Nace la era de la biología molecular.
• 1944. Avery, McCleod y M. Carthy descubren el “principio transformante” del 
pneumococo.
• 1950. Erwin Chargaff determina las proporciones de las bases nitrogenadas en el 
ADN.
• 1950. Linus Pauling deduce la estructura del enlace peptídico y la hélice α de las 
proteínas.
• 1950. George Beadle, Edward Tatum y Joshua Lederberg descubrieron que los genes 
actúan regulando eventos químicos definidos y que la célula bacteriana experimenta 
reordenamientos y transferencia de la información genética a otras células.
• 1953. Watson, Crick, Wilkins y Rosalind descubren la estructura molecular del ADN. 
• 1956. Francis Crick propone el dogma central de la biología molecular.
• 1958. Perutz y Kendrew descifran la estructura tridimensional de la lisozima y la 
mioglobina.
• 1958. Arthur Kornberg aísla la ADN polimerasa I, la primera enzima que hace ADN 
en el tubo de ensayo.• 1960. Descubrimiento del RNA mensajero y demostración que éste lleva la 
información que ordena los aminoácidos en la proteína.
• 1965. Jacques Monod, André Lwoff y François Jacob fueron galardonados con el 
premio Nobel por sus descubrimientos acerca del control genético de la síntesis de 
virus y enzimas.
• 1966. Niremberg y Khorana determinan el código genético completo.
• 1966. Holley descifra la estructura tridimensional del tRNA.
• 1970. Aldber, Natans y Smith descubren las primeras enzimas de restricción, enzimas 
que cortan ADN en sitios específicos.
• 1972. Las primeras moléculas de ADN-recombinantes son generadas mediante la 
enzima ADN ligasa.
• 1973. Paul Berg y Herbert Boyer toman fragmentos de ADN extraño los cuales son 
insertados en un plásmido de ADN para crear los primeros plásmidos quiméricos. Se 
encontró que estos pueden ser funcionalmente reinsertados en la bacteria E. coli. El 
potencial ahora existe para clonar en las bacterias cualquier gen. Nace la ingeniería 
genética.
• 1975. Renato Dulbecco, Howard Temin y David Baltimore ponen en reversa el 
dogma central de la biología molecular mediante la transcriptasa reversa.
• 1977. Sanger, Maxam y Gilbert desarrollan los métodos de secuenciación del ADN.
14
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
• 1977. Creación de las primeras moléculas de ADN recombinante conteniendo ADN 
de mamífero y descubrimiento de los genes interrumpidos por Phillips and Richards.
• 1978. La somatostatina llega a ser la primera hormona humana clonada producida 
mediante el ADN-Recombinante.
• 1984. César Milstein es galardonado con el premio Nobel por desarrollar un método 
para la producción de grandes cantidades de anticuerpos monoclonales. 
• 1986. Kary Mullis desarrolla la reacción en cadena de la polimerasa o PCR.
• Década de los 80. Primeras plantas y animales transgénicos diseñados y patentados e 
inicios de la terapia génica.
• 1990. Arranca oficialmente el proyecto genoma.
• 1995. Primer genoma bacteriano secuenciado.
• 1999. Secuenciamiento del primer organismo multicelular eucariótico (el C. elegans).
• 2000. Craig Venter y su compañía privada Celera Genomics secuencian por completo 
el genoma humano, adelantándose así por tres años al proyecto genoma oficial.
• Nuevas avenidas parecen dirigir los análisis de genes y genomas hacia la geometría 
fractal (Moreno et al. 2000), las matemáticas, la física óptica y cuántica, la química 
combinatoria y el manejo computacional que encriptan las secuencias o mensajes 
unidimensionales de genes y genomas. La gran complejidad de los diferentes niveles 
de resolución en los cuales se autocontiene lo viviente seguramente requerirá de un 
enfoque más holístico que de cuenta de las estructuras tridimensionales complejas 
que forman los organismos vivos, tales como proteínas, células y organismos 
multicelulares. De alcanzar esta meta, se cumpliría otra de las máximas predichas 
por Schrödinger quien señaló: “...las estructuras cromosómicas son al mismo tiempo 
los instrumentos que realizan el desarrollo que ellos mismos pronostican. Es decir, 
....llevan una clave elaborada (o encriptada) que contiene todo el desarrollo futuro 
del organismo” (Schrödinger, 1944).
Para un transfondo más completo de los pioneros, principios y tecnologías de la biología 
molecular sugerimos otra obra de los autores llamada: Biología Molecular, Genómica y 
Post-Genómica, 2002 (Moreno et al., 2002).
15
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
_______________________________
 Introducción al ADN-Recombinante
1.1. Construcción de una biblioteca de ADN-Recombinante
En el proceso de clonaje las moléculas de ADN blanco, objeto de estudio, se ligan a 
ADN autónomos como plásmidos o virus y posteriormente se introducen dentro de 
células hospederas. Después de su replicación, las moléculas híbridas son seleccionadas 
y amplificadas para producir suficiente cantidad de un segmento determinado (53). 
Estos fragmentos de ADN específicos pueden ser caracterizados por técnicas tales como 
mapeo de restricción, inducción de expresión y secuencia de nucleótidos entre otros. 
Un experimento típico de clonaje requiere de dos procedimientos combinados: la 
construcción de una genoteca de ADN recombinante y un sistema de detección de 
clonos que lleven secuencias de un gen especifico o fragmentos de este (42, 43, 46, 53).
Una genoteca es el conjunto de fragmentos de ADN de un organismo distribuidos en 
el vector, cuya unión representa el genoma total del organismo. En la práctica, una 
genoteca contiene algunos o todos los genes de una especie dada. Esta genoteca esta 
constituidas de una población de clonos bacteriales o de fagos, cada uno teniendo 
pequeños segmentos de información genética a partir de la especie en cuestión (Ver 
Tabla pagina siguiente) Una vez la genoteca ha sido construida el próximo paso -y 
usualmente el reto más grande- es rastrearla (screening) a fin de seleccionar el clon o los 
clonos los cuales contienen el gen de interés (ver capítulo 5).
Existen dos principales tipos de genotecas, a partir de las cuales los genes pueden 
ser aislados: 1) las genómicas, las cuales se construyen a partir del ADN genómico del 
organismo y 2) las de ADN complementario o ADNc, construidas a partir de ARNm, 
Fig. 1.
 Tejido Vectores (2)
 (elección de un vector)
ARNm (1) ADN
ADNc ADN completa o 
parcialmente digerido
ADNdb Separación por
metilado tamaño
 ADN clonable 
 Restricción (3)
ADN ligado al vector
 (4)
Introducción del ADN blanco o 
vector ligado en E. coli (empaquetamiento
in vitro o transformación)
(5)
Título y caracterización 
de la genoteca
Rastreo para el Amplificación 
 clon deseado para almacenaje
por largo término
16
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Fig. 1. Pasos implicados en la construcción de una genoteca de gADN o ADNc. La 
construcción de una genoteca implica la conjugación de cinco aspectos importantes: 1) 
un ADN blanco o clonar; 2) un vector de clonaje; 3) endonucleasas de restricción; 4) 
una enzima ADN-ligasa y 5) un hospedero procariote o eucariote, donde se propague el 
vector (53).
Para las especies eucariotas es usual comenzar con una genoteca de ADNc. Esta es 
hecha a partir del aislamiento del ARNm a partir de células que expresan el (los) gen(es) 
de interés, convirtiendo el ARNm a ADNc y clonando el ADNc. Una ventaja importante 
de este enfoque es que esta reduce el número de clonos los cuales se necesitan ser 
rastreados ya que la genoteca sólo contiene ADNcs correspondientes a los genes que 
están siendo expresados y lo cual puede constituir el 1% o menos del total de 
información genética presente en la célula.
1.1.1. ADN blanco de interés para clonar
Puede ser el de cualquier organismo, por ejemplo el de M. tuberculosis. Este ADN 
es aislado del resto de componentes de la célula por diferentes métodos, dependiendo de 
las características intrínsecas del organismo. Estos métodos básicamente se agrupan en: 
métodos de ruptura mecánica, métodos enzimáticos o combinados.
1. Rompimiento mecánico de la célula. Puede hacerse utilizando una cámara de presión 
celular, en la cual se colocan las células en suspensión y se congelan, luego se aplica 
presión para estallar las células. 
2. Sonicado, mediante el cual las células se someten a ultrasonido, provocando la 
ruptura celular. 
3. Con perlas de vidrio. Las células en suspensión se homogenizan ocasionando su 
rompimiento total mediante cambios bruscos de congelamientoy descongelamiento. No 
obstante, estos métodos son inadecuados para el aislamiento de ácidos nucleicos, pues 
causan fracturas indeseables en el ADN. 
4. Método enzimático, el cual efectúa la lisis celular mediante enzimas que atacan la 
pared celular.
 Organismo Tamaño Tipo de No. de cromosomas
 pb Mpb ADN (haploide)
 
 FX174 5X103 0.005 ADNmc 1
 Fago l 5X105 0.05 ADNbl 1
 E. coli 4X106 4 ADNbc 1
 Levadura 2X107 20 ADNbl 17
 Mosca 3X107 30 " 4
 Ratón 2X108 200 " 21
 Planta 1X1077-10 100-10000 " 20-1000
 Humano 3X109 3000 " 23
 cro.1 2.6X108 263 " 1
 cro.Y 5X107 59 " 1
 Saurio 1X1010 10000 " ?
Tabla 1. Tamaño del genoma de diferentes organismos. Como referencia se dan las dimensiones del cromosoma 1 
humano, el más grande y el cromosoma Y, el más pequeño. m: monocatenario, b:bicatenario, l: lineal, c: circular.
1.1.2. Vector de clonaje
Como su nombre lo indica, es el vehículo que transporta el ADN blanco de interés 
para clonar. El vector es un ADN que se replica autónomamente. La elección del vector 
adecuado depende de los objetivos trazados; varias consideraciones influyen en esta 
elección: las enzimas de restricción que han de emplearse, el tamaño de los fragmentos 
de ADN blanco a ser insertados (40), y el método de selección de genes a usar. 
Comercialmente se dispone de una colección de vectores bien caracterizados (9), los 
17
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
cuales, en su gran mayoría, tienen un marcador seleccionable que permite distinguir las 
células transformadas, es decir, permite diferenciar los fagos recombinantes; finalmente, 
el hospedero debe estar bien caracterizado y ser compatible con el vector (18, 53).
Existen vectores para células procariotas y vectores para células eucariotas. Entre 
los primeros tenemos vectores para E. coli, los más numerosos, vectores para bacterias 
grampositivas y bacterias gramnegativas, vectores para streptomyces y levaduras y para 
mycobacterias (31), entre otros. Finalmente, hay vectores para células vegetales y para 
células animales. Dentro de cada uno de estos grupos hay vectores de clonaje para 
propósitos generales y para propósitos especializados. Los vectores mas utilizados 
pertenecen al grupo de los plásmidos, los bacteriófagos M-13 y lambda (9).
Dentro de los bacteriófagos lambda existen vectores de inserción y de substitución. 
Los vectores de inserción son aquellos que tienen un sitio único de restricción en el cual 
el ADN blanco es insertado, por ejemplo, el bacteriófago lambda gt-11. Aquellos 
vectores en los que se reemplaza parte de material genético del vector no fundamental 
por parte del ADN blanco se conocen como vectores de substitución, por ejemplo, el 
bacteriófago EMBL-3. De otra parte, los vectores de expresión llevan elementos de 
control que favorecen la expresión del ácido nucleico heterólogo insertado, por ejemplo, 
el fago lambda gt-11 (16, 40) (ver numeral 1.3.).
1.1.3. Endonucleasa de restricción
Estas son enzimas aisladas principalmente de procariotes, que reconocen secuencias 
específicas dentro del ADN de doble hélice para cortar y/o modificar la molécula. Estas 
pueden clasificarse dentro de tres grupos: las enzimas tipo I, tipo II y tipo III (Tabla 2).
Las enzimas tipo I y tipo III producen una modificación (metilación) y al tiempo 
tienen actividad de restricción (clivaje) dependiente del ATP. Ambos tipos de enzimas 
reconocen secuencias especificas no metiladas en el ADN sustrato; sin embargo, las 
enzimas tipo I clivan aleatoriamente, mientras que las enzimas tipo III cortan el ADN en 
sitios específicos.
El sistema de modificación restricción tipo II esta constituido por endonucleasas de 
restricción y metilasas de modificación separadas. Se han aislado más de 200 
endonucleasas de restricción, muchas de las cuales son valiosas en el clonaje molecular. 
Estas enzimas cortan el ADN dentro o cerca de sus secuencias particulares de 
reconocimiento, las cuales típicamente son de 4 a 6 nucleótidos de longitud; estas 
secuencias son palindrómicas y poseen un eje doble de simetría (20, 81). Ver Tabla 
página siguiente.
Algunas de estas enzimas, como Eco RI, no clivan exactamente en el eje de simetría, 
sino en posiciones separadas de 4 nucleótidos en las dos bandas de ADN, generando 
fragmentos de ADN con extremos 5' salientes y cohesivos.
5’ .G AATT C.3’ Eco RI 5´ G 3’ 5’ AATTC.3’
 ||| || || || || ||| ---------> ||||| || || || + || || |||| |||
3’ .C TTAA G.5’ 3’ CTTAA 5’ 3’ G.5’
18
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Cualquiera de estos extremos cohesivos puede formar apareamiento de bases con 
cualquier otro fragmento de ADN que tenga extremos cohesivos complementarios, 
originándose así una molécula de ADN-recombinante. También hay enzimas que 
generan fragmentos cohesivos 3' salientes, y enzimas que cortan ambas cadenas de ADN 
en el mismo sitio generando extremos romos (43). 
Tabla 2. Características de las endonucleasas de restricción 
------------------------------------------------------------------- 
 Tipo I Tipo II Tipo III
-------------------------------------------------------------------
Actividad de Enzima Metilasa y enzimas separa-
restricción y multifuncional endonucleasa das con una ac-
modificación simple separada tividad en común
Estructura 3 subunidades Simple 2 subunidades 
proteica de diferentes diferentes
la ER.
Requerimientos ATP, Mg2+, Mg+2 ATP, Mg+2,
para la S-adenosilMet S-adenosilmetio-
restricción nina
Secuencia de Eco B: TGAN8TGCT Usualmente sime- Eco P1: AGACC 
los sitios Eco K: AACN6GTGC tría rotacional Eco P15: CAGCAG
específicos 
del hospedero 
Sitios de Posiblemente En o cerca al 24-26 pb hacia
clivaje aleatorios, al sitio específico el extremo 3'
 menos 1000 pb del sitio espe-
 desde el sitio cífico
 específico
Activación de No Si Si
la enzima
Translocación Si No No 
del ADN
Sitio de Sitio Sitio Sitio 
metilación específico específico específico
 
-------------------------------------------------------------------
N = Cualquier nucleótido.
1.1.4. ADN ligasa
Una vez apareados los sitios cohesivos (o extremos romos) presentes en el vector 
con los extremos del ADN blanco, la estabilidad de estas moléculas recombinantes 
depende de la capacidad de sellar covalentemente las rupturas en cada banda o muescas 
(nicks) en el ADN. Este proceso es llevado a cabo tanto in vivo como in vitro por las 
enzimas de ADN polinucleótido ligasa. Esta enzima es un simple polipéptido de 68 kDa 
de peso molecular, que cataliza la formación de enlaces fosfodiester entre el grupo 
hidroxilo 3 y el fosfato 5 de los dos nucleótidos adyacentes de la muesca, 
reestableciéndose así la continuidad estructural de las bandas de ADN (40, 53).
Para llevar a cabo lareacción de ligazón se consideran dos parámetros: la relación 
entre los brazos del bacteriófago y los insertos, y la concentración de las dos clases de 
19
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
ADN a ligar. Cada brazo del fago lleva dos clases de extremos cohesivos como se 
observa en el esquema: uno es el extremo Cos, que es compatible solamente con la 
secuencia complementaria Cos del otro brazo; y el otro es el extremo Ct generado por el 
corte de una endonucleasa de restricción y es compatible tanto con los extremos del 
inserto como con el otro extremo Ct del vector.
Cos ---------- Ct Ct ---------- Ct Ct ---------- Cos
El sustrato optimo de ADN para ser empaquetado en el fago es la molécula 
concatamérica [(brazo derecho-inserto-brazo izquierdo)n]. Para obtener el mayor 
número de estas moléculas, la reacción de ligazón debe contener concentraciones 
equimoleculares de extremos Ct en cada una de las tres clases de ADN (brazos 
izquierdos, insertos y brazos derechos). Puesto que cada brazo contiene solamente un 
extremo Ct, mientras que cada inserto contiene dos, entonces la relación de moléculas 
en la reacción debe ser 2:1:2 (brazo izquierdo-inserto-brazo derecho). La concentración 
de ADN a clonar debe ser suficientemente alta para asegurar la ligazón intermolecular, 
que conduce a la formación de concatámeros y no a la formación de círculos 
monoméricos, los cuales no se empacan dentro de las cápsides virales (40).
1.1.5. Hospedero
Una vez ligadas las moléculas de ADN-recombinante, son introducidas dentro de la 
célula hospedera por transformación si son plásmidos. Si son fagos, los ADN-
recombinantes junto con las proteínas de la cápside y la cola son autoensambladas in 
vitro como partículas virales infecciosas, para que inyecten las moléculas de ADN 
dentro de la célula hospedera. Los hospederos pueden ser procariotes o eucariotes; debe 
existir una compatibilidad genética entre el ADN vector y el ADN del hospedero. Por 
esto, el genotipo y el fenotipo de ambos deben estar bien definidos.
Además de los sistemas de regulación del gen, dos sistemas principales deben 
conocerse bien: el sistema de modificación-restricción y el sistema de recombinación 
(20, 30). Todos los hospederos de E. coli son derivados de la cepa salvaje E. coli K-12, 
la cual normalmente produce enzimas de restricción que clivan el ADN. Naturalmente, 
la E. coli produce metilasas de modificación que protegen su propio ADN del clivaje. 
Por lo tanto, los fagos no modificados que infecten E. coli son destruidos. Esto puede 
evitarse propagando los fagos recombinantes en un hospedero deficiente de restricción 
(r-). Las cepas hsdR- son deficientes en restricción pero no en modificación (r-, m+), 
mientras que las cepas hsdS- son deficientes en ambas funciones (r-, m-).
Por otro lado, E. coli K-12 tiene la capacidad de experimentar más o menos 
recombinación homóloga eficiente mediante un número de vías diferentes. Por lo tanto, 
deben elegirse hospederos Rec-, adecuados para amplificar o buscar genes en una 
genoteca (16). Una vez construida la genoteca debe determinarse el porcentaje de 
recombinantes, amplificar y conocer el título, y en lo posible, evaluar la calidad de la 
genoteca para efectuar con mayor seguridad la búsqueda de clonos recombinantes 
específicos.
1.2. Sistemas de rastreo e identificación de clonos de ADN-Recombinante dentro de 
una genoteca
Existen dos estrategias para la búsqueda in situ de clonos portadores de genes 
específicos dentro de una genoteca: Con sondas de ácidos nucleicos sintéticas o 
naturales marcadas con isótopos o enzimas, ya sea por hibridización o mediante la PCR. 
Y con anticuerpos policlonales y/o anticuerpos monoclonales, utilizados como sondas, 
marcados con isótopos radiactivos o con enzimas (70), entre otros métodos.
20
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Diagrama de flujo general para el rastreo de genotecas
Genotecas en 
plásmidos, fagos, cósmidos
YACs
Sembrado de la genoteca
(considerar genoteca base y tamaño de inserto)
Rastreo de la genoteca mediante:
1) hibridización a sondas largas de ADN u oligonucleótidos,
2) inmunoreactividad 
3) selección de híbridos de ARNm y traducción o
4) PCRs con iniciadores específicos
5) Purificación de placas o colonias.
1.2.1. Síntesis química de oligonucleótidos o sondas
Los dos métodos más ampliamente usados para sintetizar químicamente 
oligonucleótidos son: el método fosfito-triester y el fosfodiester. El método fosfito-
triester usa fósforo trivalente más reactivo, tiene una alta eficiencia de síntesis, del 98%, 
cortos periodos de tiempo por ciclo de acople y dos pasos de reacción para efectuar el 
puente fosfodiester (acople y oxidación) (26, 47). El método fosfotriester utiliza un solo 
paso para efectuar el puente fosfodiester (acople), fósforo pentavalente menos reactivo, 
tiene eficiencias de acople del 95% y periodos de tiempos largos (19, 26). Cada acople 
de un nucleótido durante la síntesis de la sonda, según el método fosfito-triester, implica 
la ejecución de un ciclo de cuatro pasos de reacción (ver Fig. 1.4).
Desbloqueo: consiste en remover el grupo protector DMTr del último nucleótido 
acoplado, con Ac. dicloroacético en diclorometano, para dejar libre el grupo 5’OH.
Acople: es la adición de un nuevo nucleótido protegido a la cadena creciente mediante 
una reacción de esterificación entre el grupo 3’ fosfato del nucleótido entrante y el grupo 
5’OH del nucleótido desbloqueado. Esta reacción es catalizada por el tetrazol en 
acetonitrilo o piridina.
Bloqueo de nucleótidos no elongados: el soporte es tratado con una mezcla de 
anhídrido acético (AC20), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y 2,4,6-colidina (Coll.), en 
acetonitrilo. Esta reacción acetila los grupos 5’OH del azúcar que no han reaccionado 
durante el acople. La reacción asegura que solamente las cadenas con secuencias 
correctas puedan crecer en los pasos siguientes.
Oxidación: el grupo fosfito-triester es luego oxidado a un fosfato-triester más estable. 
La oxidación se ejecuta por tratamiento del fosfito con una mezcla de yodo, colidina y 
agua en acetonitrilo.
21
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Para efectuar la síntesis química de ONS en fase sólida son importantes el soporte 
sólido sobre el cual va anclada las cadenas de nucleótidos que se están sintetizando, y 
los nucleótidos debidamente protegidos para evitar reacciones laterales e inespecíficas.
Fig. 2. Reacciones de la síntesis química de sondas de oligonucleótidos por el método fosfito triester (7, 
26).
1.2.1.1. Soporte sólido
Es la matriz donde va unido el primer nucleótido por el extremo 3’OH y a partir del 
cual se elonga la síntesis de la cadena del oligonucleótido. Se han elaborado diferentes 
tipos de soportes; sobre éste viene unido cualquiera de los cuatro nucleótidos 
protegidos. El soporte sólido puede ser de sílica, perlas de vidrio, plástico o papel de 
celulosa, y se caracteriza por: ser insoluble e inerte en todos los solventes y reactivos 
usados durante la síntesis. Ser bastante rígido para resistir la presión del solvente 
aplicado. Poseer gran área de superficie y poros para dar acceso rápido a reactivos y 
solventes. Para mayor accesibilidad de los solventes y los reactivos y evitar 
impedimentos estéricos durante la reacción, sobre el soporte derivado con una 
alquilamina, se une el primer nucleótido por el extremo 3’ mediante un gruposuccinato.
 S NH / \ / \ / \ / \ / \ / \ NH2 S: perlas de plástico de 10 µm con
 \ / macroporos de 4x10³ Da (800Å)
 |
 O B
 N
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 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
 | O ___ODMTr
 O |/ \
 S NH / \ / \ / \ / \ / \ / \ NH | \ __ /
 \ / \ / \ / \ / \ /
 | | | 
 O O O
1.2.1.2. Nucleótidos protegidos
El paso clave en la síntesis de ADN es la formación específica y secuencial del 
enlace fosfato internucleótido. Para lograr esto, grupos funcionales como los OH 3’ y 
5’, y grupos amino exocíclicos, deben ser protegidos. Así, durante la síntesis se tienen 
dos clases de grupos protegidos:
Los temporales, se colocan para obtener especificidad de una reacción simple y son 
removidos después de ésta. Los permanentes, que se quedan unidos al oligonucleótido 
durante toda la síntesis y son removidos al final durante el desanclaje de la sonda del 
soporte. Dentro del primer grupo tenemos: el grupo hidroxilo en la posición 5’ del 
nucleótido, se protege mediante un enlace tipo éter con el catión dimetoxitritil (DMTr), 
para evitar que los hidroxilos del nucleótido entrante compita con los hidroxilos de la 
cadena en crecimiento.
Fig.3 B
 N OH
 P
Los grupos amino primarios exocíclicos de las bases nitrogenadas A,G,C son 
generalmente protegidos por acilación. Estos grupos protectivos son estables en todos 
los pasos de la reacción y los comúnmente utilizados son el benzoil para A y C y el 
isobutirilo para G.
Fig.4
 NH C
GUANINA 
 N N NH2
 
 NH2
ADENINA
 
 N N
El grupo fosfato: la naturaleza del grupo protector depende del método de acople 
elegido. Los grupos protectores del grupo fosfato son el clorofenil desarrollado con la 
química del fosfotriester y con el β−cianoetil en la química del fosfitotriester. Este 
grupo puede ser fácilmente removido por tratamiento con amonio concentrado (19). 
(Fig.5)
23
c OCH3O
O
O
N
N
N
N
O
NH C
BENZOYLAMIDA
N O
NH2
N
CITOCINA
ISOBUTIRIL
AMIDA
O
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Fig.5
1.2.1.3. Hibridización de dos hebras de ácido nucleicos complementarias
El ADN es una molécula de dos cadenas antiparalelas cuya hélice es mantenida 
principalmente mediante enlaces de H entre los pares A-T y G-C (81). Cuando la doble 
cadena de ADN es sometida a condiciones extremas de temperatura o pH, los puentes de 
H en la doble hebra se rompen y el ADN se separa en dos cadenas sencillas, o sea, se 
desnaturaliza.
Si se usa el calor como desnaturalizante, la temperatura a la cual se separa el 50% de 
las cadenas de ADN es conocida como Tm o temperatura de fusión. Si las dos hebras 
son retornadas desde estas condiciones extremas a su estado original (normal), ellas 
pueden reasociarse para formar la doble hebra. Esta reasociación específica se denomina 
renaturalización molecular, la cual puede tener lugar entre bandas complementarias de 
ADN o RNA o entre hebras de RNA y ADN (13).
La proporción de renaturalización de dos hebras de ácido nucleico depende de la 
frecuencia de colisiones y posterior nucleación (inicio de la formación de la doble 
hélice) de las regiones complementarias; así, el grado de renaturalización va a estar 
determinado por la naturaleza de la muestra, tamaño de los fragmentos del ADN, y 
condiciones de renaturalización tales como: temperatura, fuerza iónica, concentración 
del ADN y temperatura permitida para la reasociación (45). (Fig. 6)
Existen varios métodos para detectar complementariedad de ácidos nucleicos; uno 
de estos es la inmovilización de un ácido nucleico en una fase sólida, como el papel de 
nitrocelulosa. Luego el ADN se desnaturaliza y se pone en contacto con la sonda 
marcada, posteriormente se detectan las secuencias complementarias y el sitio al cual se 
ha unido la sonda (13, 70). Este principio es sumamente útil para la biología molecular 
y con base en éste se han desarrollado técnicas como southern blot, northern blot e 
hibridización in situ, etc. (Fig. 7)
1.2.1.4. Factores que afectan la hibridización en los filtros de nitrocelulosa
Muchos son los factores que afectan la rata de hibridización y la estabilidad de los 
híbridos. La temperatura de fusión de un híbrido (Tm) es afectada por la fuerza iónica, 
pH, la longitud de la sonda y su composición de bases, así como por la concentración de 
agentes desestabilizantes de la hélice, como formamida.
24
 OOH
B
N
O
 P
X
P
 O
CN
B-CIANOETIL
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Fig: 6. Renaturación de dos hebras de ácido nucleico
Fig: 7. Hibridización en fase sólida de ácidos nucleicos inmovilizados con ONS 
radiomarcados
1.2.1.5. Sondas menores de 50 nucleótidos
Los efectos de composición de bases sobre el Tm son mayores cuando las sondas 
son menores de 50 bases de longitud. Para las sondas de oligonucleótidos de 20 
nucleótidos de longitud puede calcularse un valor aproximado para el Tm, usando la 
siguiente fórmula, cuando la hibridización se lleva a cabo bajo condiciones estándar 
(aproximadamente 0.9 M NaCl):
25
A
T
G
T
C
C
T
A
A
C
G
G
T
T
TA
A
A
C
C
C
G
G
G
A
B C
A. colisiones aleatorias de pares de bases aleatorias
B. nucleación
C. reasociación de bandas
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Tm (ºC) = 4 (G+C) + 2 (A+T)
Donde G, C, A, T son los números de bases respectivas en el oligonucleótido. En la 
hibridización en filtros, usando sondas de ONS, debe emplearse una temperatura de 5ºC 
bajo el Tm, para una secuencia perfectamente complementaria. Por cada par de bases 
erradas, debe reducirse la temperatura de hibridización en 5ºC (2). Para más detalles del 
cálculo de las temperaturas de hibridización para diferentes tipos de sondas consultar el 
anexo.
1.2.2. Rastreo de genes con oligonucleótidos sintéticos
Los oligonucleótidos sintéticos (ONS) son fragmentos de ADN o RNA de cadena 
sencilla o doble que pueden construirse químicamente, manual o automáticamente en el 
laboratorio. La secuencia del ONS puede derivarse bien sea a partir de una parte de la 
secuencia de un ADN o de un RNAm ya conocido o puede ser deducida a partir de la 
secuencia de aminoácidos de la proteína de interés. En la primera aproximación se 
genera un ONS de secuencia única, mientras que en la segunda aproximación, debido a 
la degeneración del código genético, se genera una sonda redundante o mezcla de 
sondas, que integra todas las combinaciones posibles de tripletes para cada aminoácido. 
Esta sonda es poco práctica cuando su redundancia es elevada (45). Para obviar esta 
dificultad, se puede deducir a partir de la secuencia de aminoácidos, una sonda única 
larga a través del análisisdel codón preferencia, o sea los codones más frecuentemente 
utilizados en cada organismo para buscar y seleccionar genes dentro de una genoteca.
1.2.3. Principios inmunológicos
El sistema inmune es uno de una serie de mecanismos protectivos que los 
vertebrados han desarrollado para defenderse contra otros organismos, especialmente 
microscópicos. El término inmune significa que un animal frente a un agente infeccioso 
permanece libre de infección por ese agente (13). La base del sistema inmune de un 
organismo es el reconocimiento, el poder discernir entre lo propio y lo extraño (14). 
Cuando un agente extraño entra en el organismo, contra éste se desencadena una 
respuesta mediada por una red de interacciones cooperativas entre poblaciones o 
repertorios de células especializadas que conlleva a la destrucción o neutralización del 
agente extraño. Esta interacción sucede entre tres tipos fundamentales diferentes de 
células: las células T (timo-dependientes), las células B (Bursa-dependientes) y los 
macrófagos. Las primeras son responsables de la inmunidad celular, la cual se basa en 
la reacción de reconocimiento del agente extraño por parte de moléculas unidas 
covalentemente a la superficie de la célula. Las células B son las responsables de la 
inmunidad humoral, causada por moléculas llamadas anticuerpos producidas por las 
células B, ya no unidas a estas sino en solución.
Los anticuerpos son proteínas colectivamente denominadas inmunoglobulinas, de 
forma similar a una V. Constituyen el 20% de las proteínas en la sangre. Una simple 
molécula de estas se denomina anticuerpo. Este tipo de moléculas va a reaccionar con 
partes específicas del agente extraño (11).
El antígeno es el agente extraño estimulador de la producción de anticuerpos o 
células inmunes, cuando es inyectado dentro de un animal, y reacciona específicamente 
con los anticuerpos o las células inmunes. Estudios con antígenos hidrolizados 
demostraron que solamente ciertas porciones restringidas de las macromoléculas están 
implicadas en la reacción antígeno-anticuerpo y/o antígeno-célula inmune. En otras 
palabras, un antígeno lleva parte o regiones específicas que determinan la especificidad 
de la reacción inmunoquímica, denominadas determinantes antigénicos o epítopes. 
Cada antígeno puede tener muchos epítopes diferentes y producir una respuesta inmune 
especifica, por ejemplo: un clon de células B produce anticuerpos de solamente una 
26
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
especificidad, es decir, un clon de células B dirigido contra un mismo epítope. Un 
animal inmunizado produce generalmente un número aleatorio de clonos, y su antisuero 
es policlonal. Aproximadamente uno de cada mil clonos reconocen un determinado 
epítope. En contraste, los anticuerpos monoclonales son producidos por un simple clon 
de células B, y consecuentemente tienen la misma afinidad y especificidad (32). Un 
antisuero es policlonal poliespecífico si es producido contra el organismo total, por 
ejemplo el M. tuberculosis; o puede ser policlonal monoespecífico si es producido 
contra un antígeno determinado, por ejemplo la proteína MTP-40K de M. tuberculosis.
1.2.4. Rastreo de genes con antisueros policlonales
La búsqueda de genes dentro de una genoteca con antisueros (o anticuerpos) sólo es 
posible si el gen buscado es transcrito y traducido en proteína. La proteína expresada es 
así reconocida por una reacción antígeno-anticuerpo. Este primer anticuerpo puede 
estar radiomarcado o ser reconocido por un segundo anticuerpo generalmente 
conjugado a una enzima. Tras la autorradiografía o el revelado de color por medio de 
un sustrato cromogénico se identifican los clonos (16).
1.3. Vectores
Como observó en el Numeral 1.1.2. existen varios tipos de vectores de acuerdo a los 
propósitos de clonaje. No obstante, solo unas pocas categorías son usadas en proyectos 
de secuenciación a gran escala, como los observados en la Tabla siguiente
Vector Hospedero Tamaño del inserto
____________________________________(kb)_________
Plásmido E. coli 0- 10
Fago λ E. coli 0- 25
Cósmido E. coli 20- 45
Fago P1 E. coli 70- 100
PACs E. coli 100- 300
BACs E. coli ≤ 300
HAECc Células de mamíferos ≤ 300
YACs S. Cerevisiae 200 - 2000
_________________________________________________
Tabla 3. PACSs: cromosomas artificiales derivados de P1. BACs: cromosoma artificial bacteria HAECs: 
cromosoma episómico artificial huma YACs: cromosoma artificial de levadura.
En este texto, sólo los vectores tipo lambda son utilizados en la construcción de 
genotecas y los plásmidos en el subclonaje de insertos y la expresión de proteínas. Por 
lo cual, a continuación se considerará algunos aspectos relevantes de la biología del 
bacteriófago lambda.
1.3.1. El bacteriófago lambda
El genoma del bacteriófago está formado por un ADN lineal de doble cadena de 50 
kpb de longitud, el cual está empaquetado en una cápside icosaédrica de naturaleza 
proteica. Este ADN está en forma de una molécula duplex lineal, cuyos extremos 
cohesivos (Cos) están formados por 12 nucleótidos de cadena sencilla.
Las partículas de fagos se adsorben por el extremo de la cola a receptores en la 
membrana más externa de la célula. Esta adsorción es más eficiente si está presente la 
maltosa en el medio de cultivo, ya que ésta induce la expresión del operón de la 
maltosa, el cual contiene el gen Lamb que codifica para el receptor de lambda.
27
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Después de entrar en la célula, el genoma de lambda se circulariza a través de sus 
extremos Cos y la molécula se une covalentemente. De esta manera el ADN sustrato 
queda listo para la replicación y la transcripción del ADN de lambda.
Siendo un fago temperado, puede seguir ya sea por vía productiva (lítica) o por vía 
temperada (lisogénica). En cualquier caso, la transcripción es iniciada a partir de dos 
promotores “tempranos”, PL y PR. Fig. 8. En una infección productiva (lítica) se logra 
la transición de la transcripción temprana; se sintetizan las proteínas del virus, los 
genomas virales se empaquetan y la lisis de la célula libera aproximadamente 100 
partículas infectivas.
En la respuesta temperada, la mayoría de funciones del fago lambda son represadas, 
ya sea directa o indirectamente, mediante moléculas represoras del fago unidas a las 
regiones operadas asociadas con PL y PR. Si la represión ocurre antes de que se activen 
los genes tardíos, la lisis se evita y la lisogenia queda asegurada.
Para que la lisogenia sea estable y no abortiva requiere la integración del genoma de 
lambda dentro del cromosoma hospedero mediante recombinación sitio específico; de 
esta manera el genoma del fago (el profago) será replicado como parte del cromosoma 
de E. coli. Si el lisogeno (la bacteria) es sensibilizado con calor o luz UV, el profago 
entra en vía lítica (16, 33). Fig. 9.
Fig. 1.7. Mapa genético de lambda mostrando el agrupamiento de las funciones reguladoras.
Fig. 8. Mapa genético del fago lambda silvestre mostrando el agrupamiento de las funciones reguladoras.
28
Regulador Antiterminador Represor Antirepresor Regulador 
positivo negativo
 CIII N nut CI Cro CII 
O
L
 P
L
P
R
 O
R
P
E
P
M
 P. E. Vélez, E. Rodriguez & P. A. Moreno 
Fig. 9. Estilos de vida del fago lambda.
1.3.2. Cascada lítica