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Av. Hidalgo 935, Colonia Centro, C.P. 44100, Guadalajara, Jalisco, México bibliotecadigital@redudg.udg.mx - Tel. 31 34 22 77 ext. 11959 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA COORDINACIÓN GENERAL ACADÉMICA Coordinación de Bibliotecas Biblioteca Digital La presente tesis es publicada a texto completo en virtud de que el autor ha dado su autorización por escrito para la incorporación del documento a la Biblioteca Digital y al Repositorio Institucional de la Universidad de Guadalajara, esto sin sufrir menoscabo sobre sus derechos como autor de la obra y los usos que posteriormente quiera darle a la misma. UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA Centro Universitario en Ciencias de la Salud Doctorado en Ciencias en Biología Molecular en Medicina TESIS DE GRADO “Efecto de una dieta suplementada con omega-3 sobre la expresión de IL-6, citocinas y perfil de ácidos grasos en sujetos con obesidad” PRESENTA LN Karina González Becerra Guadalajara, Jalisco. Febrero 2020 2 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA Centro Universitario en Ciencias de la Salud Doctorado en Ciencias en Biología Molecular en Medicina TESIS DE GRADO “Efecto de una dieta suplementada con omega-3 sobre la expresión de IL-6, citocinas y perfil de ácidos grasos en sujetos con obesidad” PRESENTA LN Karina González Becerra Director de tesis Dra. en C. Erika Martínez López Co-director de tesis Dra. en C. Carmen Magdalena Gurrola Díaz Guadalajara, Jalisco Febrero 2020. iii Sede de la investigación Servicio de Biología Molecular en Medicina del Hospital Civil de Guadalajara, “Fray Antonio Alcalde”. Departamento de Biología Molecular y Genómica, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara. Instituciones participantes: Servicio de Biología Molecular en Medicina del Hospital Civil de Guadalajara, “Fray Antonio Alcalde”. Departamento de Biología Molecular y Genómica, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara. Instituto de Investigación en Enfermedades Crónico-Degenerativas, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara. Fuente de financiamiento Financiamientos propios a través del Fondo ProSNI de la Dra. en C. Erika Martínez López y el Fondo PROINPEP otorgado al Doctorado en Ciencias en Biología Molecular en Medicina (DCBMM). Fortalecimiento No. REC/198/2017 obtenido por la Dra. Carmen Magdalena Gurrola Díaz. iv Agradecimientos A Dios Primero agradezco a Dios por la vida y por guiar mi camino y ayudarme a tomar las mejores decesiones en cuanto a mi crecimiento personal y profesional. A mis padres Por ser mi principal motor, por siempre estar a mi lado apoyando cada una de mis sueños y locuras, y demostrarme con su amor incondicional que cualquier cosa que me proponga si lo hago con el corazón y un gran esfuerzo es posible lograrlo. A mis hermanos y sobrina A Liliana por siempre creer en mí y brindarme su apoyo y amor incondicional a Miriam por contagiarme su chispa y sacarme una sonrisa en mis momentos de crisis, Adrian por ayudarme a resolver mis conflictos más simples y siempre decirme “está muy fácil”. A mi novio Por todo el apoyo en esta etapa, por siempre creer en mí, por escucharme y siempre tener una palabra de aliento ante mis momentos de estrés, por no permitirme rendirme y por todo su amor y paciencia. A mi directora de tesis La Dra. Erika Martínez a quien estimo y admiro, por esa pasión ante la investigación, por su gran compromiso y entrega, por su paciencia y por creer en mí. Gracias por aportar en gran medida a mi crecimiento personal y profesional por demostrarme que el éxito se alcanza con esfuerzo, constancia y responsabilidad; le agradezco v por haberme dado la oportunidad de ser parte de su equipo de trabajo y hacerme parte de este proyecto que implica una gran satisfacción personal. A mi co-directora y sinodales Por sus valiosas aportaciones para mi crecimiento profesional y personal, por su gran compromiso y responsabilidad ante la formación de recursos humanos de gran calidad profesional. A mis amigos y compañeros A mis compañeros del laboratorio que forman parte de este equipo de trabajo y me apoyaron en este proceso formativo. A mis amigos y seres queridos que han estado conmigo durante este proceso de crecimiento continuo siempre mostrándome su apoyo y empatía. A la Universidad de Guadalajara Mi alma mater a quien debo mi formación académica de pregrado y posgrado. Participantes del proyecto Finalmente agradezco a todos los sujetos que participaron en este proyecto e hicieron posible la realización de este estudio. vi Índice Índice de tablas ....................................................................................................... x Índice de figuras .................................................................................................... xii Lista de abreviaturas ............................................................................................ xiii Resumen .............................................................................................................. xv Abstract ............................................................................................................... xvii 1. Introducción .................................................................................................... 1 2. Marco teórico .................................................................................................. 3 Obesidad ............................................................................................................ 3 Obesidad e inflamación ...................................................................................... 5 Papel de IL-6 y TNF-α en la inmunidad............................................................... 6 Marcadores inflamatorios ................................................................................... 7 Interleucina-6 ...................................................................................................... 7 Proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1) ................................................. 8 Adiponectina ....................................................................................................... 8 Dieta y Omegas .................................................................................................. 8 Omegas e inflamación ...................................................................................... 11 3. Antecedentes ................................................................................................ 13 IL-6 y procesos inflamatorios ............................................................................ 13 Los AGPI n-6 y n-3 en procesos inflamatorios .................................................. 15 4. Justificación .................................................................................................. 16 5. Planteamiento del problema.......................................................................... 17 6. Pregunta de investigación ............................................................................. 18 7. Hipótesis ....................................................................................................... 18 8. Objetivos ....................................................................................................... 18 9. Diseño metodológico..................................................................................... 19 Tipo de estudio ................................................................................................. 19 Universo de estudio ..........................................................................................19 Tamaño de muestra ......................................................................................... 19 Sede del Estudio .............................................................................................. 20 Criterios de selección ....................................................................................... 20 Variables de estudio ......................................................................................... 21 Análisis estadístico ........................................................................................... 23 Consideraciones éticas y de bioseguridad ........................................................ 23 vii Recolección de datos ....................................................................................... 25 Intervención nutricional ..................................................................................... 26 Asesoría psicológica ......................................................................................... 27 Análisis de datos nutricionales.......................................................................... 28 Mediciones antropométricas ............................................................................. 28 Mediciones bioquímicas ................................................................................... 28 Extracción del RNA .......................................................................................... 28 Cuantificación de los ácidos nucleicos.............................................................. 30 Síntesis del DNA complementario (cDNA) ........................................................ 30 Ensayos de expresión del RNA ........................................................................ 31 Determinación de citocinas pro y antiinflamatorias ........................................... 32 Determinación de omegas en membranas de eritrocitos .................................. 35 10. Resultados .................................................................................................... 38 Inclusión de pacientes ...................................................................................... 38 Datos sociodemográficos de la población de estudio ....................................... 38 Hábitos y comportamientos relacionados con la alimentación y nutrición. ........ 39 Datos dietéticos de la población de estudio ...................................................... 40 Datos antropométricos de la población de estudio ........................................... 43 Datos bioquímicos de la población de estudio .................................................. 43 Datos sociodemográficos basales por grupo de estudio ................................... 45 Datos nutricionales basales por grupo de estudio ............................................ 45 Datos antropométricos basales por grupo de estudio ....................................... 47 Datos antropométricos basales por genero ...................................................... 47 Datos bioquímicos basales por grupo de estudio ............................................. 48 Cambios en los datos dietéticos posterior a la intervención nutricional ............. 50 Camios antropométricos posterior a la intervención por genero .................... 53 Datos antropométricos durante la intervención en el grupo placebo y grupo n-3 ......................................................................................................................... 54 Datos bioquímicos durante la intervención en el grupo placebo y grupo n-3 .... 56 Efecto de la asesoría psicológica sobre el apego a la intervención .................. 59 Comparación de datos nutricionales Inter-grupo .............................................. 60 Comparación de datos antropométricos Inter-grupo ......................................... 61 Comparación de datos bioquímicos Inter-grupo ............................................... 62 Estandarización de técnica PCR tiempo real para la expresión de genes. ....... 64 Expresión relativa del gen IL-6 normalizado con el gen ACTB ......................... 68 viii Diferencias en la expresión de IL-6 a lo largo del tiempo en cada grupo. ...... 68 Diferencias de expresión de IL-6 entre los grupos ........................................ 68 Correlaciones entre la expresión del gen IL-6 y los niveles de la proteína circulante .......................................................................................................... 69 Concentraciones de moléculas pro y antiinflamatorias posterior a la intervención. ......................................................................................................................... 70 Concentraciones de moléculas pro y antiinflamatorias posterior al tratamiento nutricional en los grupos de estudio. ................................................................ 71 Perfil de ácidos grasos ..................................................................................... 72 Ácidos grasos de la dieta y perfil de ácidos grasos en membrana de eritrocitos ..................................................................................................................... 72 Cambios en el perfil de ácidos grasos posterior a la intervención ................. 73 Diferencias en el perfil de ácidos grasos entre los grupos de estudio ........... 75 Contenido de ácidos grasos en membranas de los eritrocitos relacionado con el perfil inflamatorio ....................................................................................... 75 11. Discusión ...................................................................................................... 77 12. Conclusiones ................................................................................................ 92 13. Perspectivas y limitaciones ........................................................................... 93 14. Referencias ................................................................................................... 94 15. Anexos ........................................................................................................ 109 1. Dictamen de aceptación del comité de ética ............................................. 109 2. Carta de consentimiento informado .......................................................... 110 3. Historia clínica .......................................................................................... 113 4. Herramientas utilizadas en la intervención nutricional .............................. 116 4.1 Seguimiento a través de un grupo de WhatsApp .................................. 116 4.2 uso de réplicas de alimentos ................................................................. 117 4.3 Recomendaciones generales para cambios de hábitos relacionados con la alimentación y nutrición ............................................................................... 118 4.4 Ejemplo de formato de menú ............................................................. 119 4.5 Tríptico de equivalentes ........................................................................ 120 4.6 Formato de equivalentes generales ...................................................... 122 5. Resultados del análisis de las cápsulas de omega 3 ................................ 123 6. Aplicación de instrumento BITA para favorecer la adherencia a las recomendaciones nutricionales ...................................................................... 124 7. Diario dietético ......................................................................................... 132 8. Cromatogramas........................................................................................ 136 ix 9. Productos durante el doctorado ................................................................ 137 9.1 Estancia de investigaciónen una Universidad de Navarra, Pamplona España........................................................................................................ 137 9.2 Curso de capacitación en Secuenciación Masiva (NGS). ...................... 138 9.3 Presentación oral .................................................................................. 139 9.4 Presentación cartel en el congreso Internacional NUGOweek 2019. .... 140 9.5 Curso de capacitación para la determinación de ácidos grasos por cromatografía de gases .............................................................................. 141 9.6 Artículo como primer autor publicado en Journal of International Medical Research. Factor de impacto 1.351 ............................................................ 142 9.7 Artículo como co-autor publicado en Nutrients Factor de impacto: 4.171 ................................................................................................................... 143 9.8 Artículo como co-autor publicado en Obesity Facts. Factor de impacto 2.653 ........................................................................................................... 144 9.9 Artículo como co-autor publicado en Lyfestyle Genomics FI 1.943 ....... 145 9.10 Artículo como primer autor publicado en Lipids in Health and Disease. Factor de impacto 2.651 ............................................................................. 146 9.11 Artículo enviado a publicación a la revista Journal of Nutrition Education and Behavior ............................................................................................... 147 9.12 Formación de recursos humanos ........................................................ 148 x Índice de tablas Tabla 1. Puntos de corte de diagnóstico de obesidad abdominal ........................... 4 Tabla 2. Clasificación de obesidad por categorías de IMC en adultos OMS. .......... 4 Tabla 3. Variables dependientes .......................................................................... 22 Tabla 4. Variables independientes ....................................................................... 22 Tabla 5. Mezcla de reacción para medir la expresión relativa .............................. 32 Tabla 6. Números de catálogos y ensayos para medir la expresión génica ......... 32 Tabla 7. Datos socio demográficos de la población de estudio ............................ 39 Tabla 8. Hábitos y comportamientos asociados con la alimentación .................... 40 Tabla 9. Datos nutricionales al inicio de la intervención ....................................... 41 Tabla 10. Datos de ingestión de vitaminas y minerales al inicio de la intervención ............................................................................................................................. 42 Tabla 11. Datos antropométricos basales ............................................................ 43 Tabla 12. Datos bioquímicos basales ................................................................... 44 Tabla 13. Datos generales por grupo de estudio .................................................. 45 Tabla 14. Datos nutricionales basales por grupo de estudio ................................ 46 Tabla 15. Datos antropométricos basales por grupo de estudio ........................... 47 Tabla 16. Datos antropométricos basales por género .......................................... 48 Tabla 17. Datos de variables bioquímicas por grupo de estudio .......................... 49 Tabla 18. Cambios en datos nutricionales posterior a la intervención dietética en el grupo placebo ...................................................................................................... 51 Tabla 19. Cambios en datos nutricionales posterior a la intervención dietética en el grupo omega ........................................................................................................ 52 Tabla 20. Datos antropométricos durante la intervención en el grupo placebo ..... 55 Tabla 21. Datos antropométricos durante la intervención en el grupo omega ...... 56 Tabla 22. Datos antropométricos durante la intervención en los hombres............ 53 Tabla 23. Datos antropométricos durante la intervención en las mujeres ............. 54 Tabla 24. Datos bioquímicos durante el seguimiento en el grupo placebo ........... 57 Tabla 25. Datos bioquímicos durante el seguimiento en el grupo omega ............. 58 Tabla 26. Datos del seguimiento al apego nutricional .......................................... 59 Tabla 27. Datos del apego a la intervención por grupos de estudio ..................... 59 Tabla 28. Datos de asociación entre la asesoría psicológica y el apego al tratamiento nutricional .......................................................................................... 60 Tabla 29. Diferencias en variables dietéticas entre grupos al final de la intervención ............................................................................................................................. 61 Tabla 30. Diferencias en variables antropométricas entre grupos al final de la intervención ......................................................................................................... 62 Tabla 31. Diferencias en variables bioquímicas entre grupos al final de la intervención ......................................................................................................... 63 Tabla 32. Cambios en las moléculas pro y antiinflamatorias posterior a la intervención ......................................................................................................... 70 Tabla 33. Cambios en las moléculas pro y antiinflamatorias posterior a la intervención ......................................................................................................... 71 Tabla 34. Perfil de ácidos grasos en las capsulas de placebo y omega 3 ............ 72 xi Tabla 35. Cambios en el perfil de ácidos grasos en el grupo placebo posterior a la intervención ......................................................................................................... 74 Tabla 36. Cambios en el perfil de ácidos grasos en el grupo omega posterior a la intervención ......................................................................................................... 74 Tabla 37. Diferencias en el perfil de ácidos grasos entre grupos posterior a la intervención ......................................................................................................... 75 xii Índice de figuras Figura 1. Efectos de TNF-α e IL-6 sobre la inmunidad .......................................... 6 Figura 2. Estructura tridimensional de la IL-6 ........................................................ 7 Figura 3. Ruta metabólica de los ácidos grasos omegas 6 y 3 ............................ 10 Figura 4. Vías de señalización de GPR120. ........................................................ 12 Figura 5. Disfunción del tejido adiposo en sujetos con obesidad ......................... 14 Figura 6. Diagrama de flujo de la intervención .................................................... 26 Figura 7.Diagrama de inclusión de pacientes ...................................................... 38 Figura 9. Diluciones seriadas y eficiencias de amplificación de IL-6 y POLR2F .. 64 Figura 10. Expresión del gen IL-6 y gen POLR2F del grupo placebo y grupo omega al inicio de la intervención. ....................................................................... 65 Figura 11. Comparación de la expresión del gen IL-6 y gen POLR2F del grupo omega al final de la intervención. ......................................................................... 65 Figura 12. Diluciones seriadas y eficiencias de amplificación del gen IL-6 y 18S5 .............................................................................................................................66 Figura 13. Diluciones seriadas y eficiencias de amplificación del gen IL-6 y ACTB ............................................................................................................................. 67 Figura 14. Comparación de la expresión del gen IL-6 y ACTB del grupo omega al final de la intervención. ........................................................................................ 67 Figura 15. Cambios en la expresión de IL-6 posterior a la intervención .............. 68 Figura 16. Cambios en la expresión de IL-6 por grupos de estudio ..................... 69 Figura 17. Correlación entre el consumo de EPA y el contenido de este en membranas de eritrocitos ..................................................................................... 73 Figura 18. Correlación entre porcentaje de DHA en membranas de eritrocitos y niveles de IL-8 circulante ..................................................................................... 76 xiii Lista de abreviaturas AA: Ácido araquidónico AGMI: Ácidos grasos monoiinsaturados AGPI: Ácidos grasos poliinsaturados ALA: Ácido alfa-linolénico AMPc: AMP cíclico AMPK: Proteína quinasa activada por AMP BHT: Butilhidroxitolueno CONACyT: Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CPMN: Células polimorfonucleares CRETIB: residuos peligrosos corrosivos reactivos, explosivos, inflamables, tóxicos y biológico-infecciosos CRP: Proteína C reactiva DCBMM: Doctorado en Ciencias en Biología Molecular en Medicina DEXA: Absorción dual de rayos X DHA: Ácido graso docosahexaenoico DM2: Diabetes mellitus tipo 2 DNA: Ácido desoxirribunucleíco ECNT: Enfermedades crónicas no transmisibles EPA: Ácido graso eicosapentaenoico HATs: Enzimas acetilasas de histonas HDACs: Enzimas desacetilasas de histonas HMTs: Enzimas metiltransferasas IDR: Ingesta diaria recomendada IL-18: Interleucina 18 IL-6: Interleucina 6 IMC: Índice de masa corporal LA: Ácido graso alfa-linolenico M1: Macrófagos tipo 1 M2: Macrófagos tipo 2 xiv MT: Modelo transteórico MBD por sus siglas en inglés methyl binding domain MCP-1: Proteína quimiotáctica de monocitos tipo 1 MDI: Intensidad Mediana de Fluorescencia en blanco miRNAs: Micro RNAs n-3: Omega 3 n-6: Omega 6 NAFLD: Enfermedad de hígado graso no alcohólica NASH: Esteatohepatitis no alcohólica NFκB: factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas. NOM: Norma Oficial Mexicana OMS: Organización mundial de la Salud PROINPEP: Programa de Incorporación y Permanencia de Posgrado en el Programa Nacional de Posgrado de Calidad. ProSNI: Programa para la Mejora de las Condiciones de Producción de los Miembros del Sistema Nacional de Investigadores RNA: Ácido ribonucleico RPBI:Residuos peligrosos biológico-infecciosos TGFβ: Factor de crecimiento transformante beta tipo 1 TNFα: Factor de necrosis tumoral alfa URE: Unidades relativas de expresión xv Resumen Introducción: La obesidad es una enfermedad multifactorial que se define como la acumulación excesiva de grasa en el organismo, y se caracteriza por un estado de inflamación generalizada en el que predomina una elevación de la concentración de citocinas pro-inflamatorias y disminución en las antiinflamatorias. En México existe una alta prevalencia de esta enfermedad y su desarrollo es de carácter multifactorial (interacciones complejas entre factores genéticos como la expresión de citonas pro y antiinflamatorias), y del estilo de vida como la alimentación. Particularmente los ácidos grasos poliinsaturados se han resaltado por propiedades pro y antiinflamatorias, los n-3 se les atribuyen antiinflamtorias y a los n-6 proinflamtorias. Objetivo: Analizar el efecto de una dieta suplementada con omega- 3 sobre la expresión del gen IL-6, concentraciones de citocinas y perfil de ácidos grasos en sujetos con obesidad. Metodología: Se realizó un ensayo clínico aleatorizado controlado, ciego simple con placebo. La intervención nutricional fue por un periodo de seguimiento de 4 meses. A los dos grupos se les dio una intervención nutricional la cual consistió en una reducción del 20% del gasto energético total con una distribución de HC 50%, lípidos 30% y proteínas 20% más la suplementación con omega 3, (1.5g, 1000mg EPA y 500mg de DHA). Además, se les ofreció a los pacientes asesoría psicológica con la finalidad de lograr un mayor apego a la intervención nutricional. Durante los 4 meses de intervención se realizaron sesiones mensuales en las que realizaron mediciones, bioquimicas, nutricionales y antropométricas. Los parámetros bioquímicos fueron determinados mediante química seca (Vitros 250). La composición corporal fue analizada mediante un equipo de bioimpedencia eléctrica tetrapolar (In Body 370). La información del consumo de alimentos, se obtuvo a través de la aplicación de un registro directo de consumo de alimentos de tres días el cual fue analizado en el software Nutritionist Pro. Las mediciones basales y finales además de las antes mencionadas incluyeron el análisis de expresión de IL- 6 mediante la técnica de PCR tiempo real (expresión relativa 2-ΔΔCT LightCycler 96, Roche), cuantificación de citocinas pro y anti-inflamarias (MagPix) y el perfil de ácidos grasos fue realizado mediante cromatografía de gases. El análisis estadístico xvi fue realizado con el software SPSS. Se utilizó la prueba de Shapiro Wilk para evaluar la normalidad de las variables. Se utilizó la prueba T de Student para variables cuantitativas y Jí cuadrada para variables cualitativas; t de student pareada para evaluar los cambios al inicio y final de la intervención y correlaciones para comparar 2 variables cuantitativas. Un valor de p<0.05 se consideró estadísticamente significativo. Resultados: Se incluyeron un total de 41 sujetos (19 grupo n-3 y 22 en el grupo placebo). Los cambios nutricionales posterior a la intervención fueron principalmente disminución del consumo de energía, azúcar y AGtrans y aumentar el consumo de AGPI (EPA y DHA). Los cambios antropométricos principales fueron en peso, IMC y circunferencia de cintura, sin embargo, tuvieron mejor resultados de composición corporal los sujetos del grupo placebo. Por otro lado, con respecto al apego a la intervención nutricional se encontró que el apego se perdió al 3ro y 4to mes de intervención en ambos grupos, sin embargo, los sujetos del grupo placebo tuvieron mayor porcentaje de apego vs los sujetos del grupo omega, y la herramienta psicológica utilizada (BITA) demostró tener un efecto para lograr una mayor adherencia. Las diferencias entre grupos en variables bioquímicas mostraron que el grupo omega disminuyo significativamente más c-LDL que el grupo placebo. Con respecto a los datos de expresión de RNAm del gen de IL-6 se logró disminuir posterior a la intervención en el grupo omega vs el grupo placebo. Además, se disminuyeron las citocinas de IL-8, MCP-1 y MIP-1 posterior a la intervención en ambos grupos. Y finalmente se logró incrementar el contenido de Ácido linolénico, DHA y total de n-3 en membranas de los eritrocitos en el grupo omega y en el grupo placebo este incremento solo se observó significativo en DHA. Además, se encontró una correlación negativa entre el DHA y los niveles de IL-8. Conclusiones: Se demostró que tanto intervenciones enfocadas a garantizar la pérdida de peso de los sujetos como una suplementación con omega 3 tienen un efecto sobre disminuir el ambiente inflamatorio característico de los sujetos con obesidad lo cual está asociado con mejorar el perfil metabólico y evitar otras complicaciones asociadas; además de comprobar que las intervenciones nutricionales deben ser multidisciplinarias para tener una mayor impacto en el manejo y tratamientode los sujetos con obesidad. xvii Abstract Introduction: Obesity is a multifactorial disease that is defined as the excessive accumulation of body fat and is characterized by a state of generalized inflammation in which an increase in the concentration of pro-inflammatory cytokines and a decrease in anti-inflammatories. In Mexico there is a high prevalence of this disease and its development is multifactorial (complex interactions between genetic factors such as the expression of pro and anti-inflammatory cytokines), and lifestyle as diet. Particularly polyunsaturated fatty acids have been highlighted by pro and anti- inflammatory properties, n-3 are attributed anti-inflammatory and n-6 proinflammatory. Objective: To analyze the effect of a diet supplemented with omega-3 on the expression of the IL-6 gene, cytokine concentrations and fatty acid profile in obese subjects. Methodology: A randomized controlled, single-blind, placebo-controlled clinical trial was performed. The nutritional intervention was for a follow-up period of 4 months. The two groups were given a nutritional intervention which consisted of a 20% reduction in total energy expenditure with a distribution of 50% HC, 30% lipids and 20% protein plus omega 3 supplementation (1.5g, 1000mg EPA and 500mg of DHA). In addition, patients were offered psychological counseling in order to achieve greater adherence to nutritional intervention. During the 4 months of intervention, monthly sessions were held in which was performed biochemical, nutritional and anthropometric measurements. The biochemical parameters were determined by dry chemistry (Vitros 250). Body composition was analyzed using a tetrapolar electrical bioimpedence (In Body 370). The information on food consumption was obtained through the application of a direct record of three-day food consumption which was analyzed in the Nutritionist Pro software. Baseline and final measurements in addition to those mentioned above included expression analysis. of IL-6 using the real-time PCR technique (relative expression 2-ΔΔCT LightCycler 96, Roche), quantification of pro and anti-inflammatory cytokines (MagPix) and the fatty acid profile was performed by gas chromatography. Statistical analysis was performed with the SPSS software. The Shapiro Wilk test was used to test the normality of the variables. Student's T test was used for quantitative variables and xviii Chi square for qualitative variables; Paired student t to assess changes at the beginning and end of the intervention and correlations to compare 2 quantitative variables. A value of p <0.05 was considered statistically significant. Results: A total of 41 subjects were included (19 in n-3 group and 22 in the placebo group). The nutritional changes after the intervention were mainly a decrease in the consumption of energy, sugar and trans fatty acids and increase the consumption of PUFA (EPA and DHA). The main anthropometric changes were in weight, BMI and waist circumference, however, subjects in the placebo group had better body composition results. On the other hand, regarding the adherence to the nutritional intervention it was found that the adherence was lost at the 3rd and 4th month of intervention in both groups, however, the subjects of the placebo group had a higher percentage of attachment vs the subjects of the omega group, and the psychological tool used (BITA) proved to have an effect to achieve greater adherence. Differences between groups in biochemical variables showed that the omega group decreased significantly more c-LDL than the placebo group. Regarding the mRNA expression data of the IL-6 gene, it was possible to decrease after the intervention in the omega group vs the placebo group. In addition, the cytokines of IL-8, MCP-1 and MIP-1 were reduced after the intervention in both groups. And finally, it was possible to increase the content of linolenic acid, DHA and total n-3 in erythrocyte membranes in the omega group and in the placebo group was only observed significant increase in DHA. In addition, a negative correlation was found between DHA and IL-8 levels. Conclusions: It was demonstrated that interventions focused on guaranteeing the weight loss of the subjects and a supplementation with omega 3 have an effect on reducing the inflammatory environment characteristic of obese subjects which is associated with improving the metabolic profile and avoiding other complications. In addition, nutritional interventions must be multidisciplinary to have a greater impact on the management and treatment of obese subjects. 1 1. Introducción La obesidad es una enfermedad multifactorial que afecta a gran parte de la población. En México la prevalencia de Sobrepeso y Obesidad es de alrededor de 70%, lo que representa un gran problema de salud pública. El exceso de grasa corporal, principalmente a nivel abdominal tiene efectos negativos en la salud. Los adipocitos actúan como depósito para el almacenamiento de grasa, y además de su función como células endocrinas, liberan moléculas como citocinas inflamatorias, relacionadas con una serie de alteraciones metabólicas, como RI, disfunción en el metabolismo de glucosa, lípidos entre otras. La obesidad y sus complicaciones representa un importante costo para el país; se estima que el Sector Salud en México invirtió 806 millones USD (dólares) en el 2008, se calcula que para el año 2030 el costo ascenderá a 1254 millones USD y para el 2050 será de 1706 millones de USD. Sin embargo, si se logra una disminución de aproximadamente el 5% de sobrepeso/obesidad en la población, los costos podrían disminuir de 1254 billones USD a 1137 USD para el año 2030 y de 1706 billones de dólares a 1514 billones de USD (Rtveladze K, 2013). Por lo que es importante proponer diferentes estrategias multidisciplinarias que se enfoquen en lograr una disminución de la prevalencia de obesidad. En este sentido se han propuesto diversos enfoques, el presente trabajo se abordaron aspectos nutricionales, genéticos y psicológicos. Con respecto a los factores nutricionales se ha descrito que los ácidos grasos juegan un papel muy importante en el desarrollo de obesidad y su relación con procesos inflamatorios, particularmente los ácidos poliinsaturados n-6 y n-3 tienen efectos antagónicos, proinflamatorios y antiinflamatorios respectivamente. Se ha descrito en población mexicana una ingestión excesiva de omega 6 e insuficiente de omega 3, expresado en una relación de consumo dietético de 12:1 (Campos-Pérez, 2016), cuando las recomendaciones de diversos autores establecen como adecuado una relación de consumo de 3:1 o 5:1 para tener efectos 2 positivos en la salud (Simopolous AP, 2002; Simopolous AP, 2008), lo que indica que la población, a través de la dieta favorece un ambiente inflamatorio en el organismo. En relación con los factores psicológicos y sociales, se ha propuesto por diversos autores que el éxito de intervenciones nutricionales que involucran cambios del estilo de vida se requieren utilizar diversas herramientas conductuales que a través de estrategias motivacionales favorezcan el apego a los tratamientos nutricionales y así tener mejores resultados con respecto a la pérdida de peso (Lemstra, 2016) y por consiguiente disminución de marcadores inflamatorios. Respecto a los ácidos grasos se ha reportado que componentes de la alimentación como los n-3 pueden ser ligando de algunos factores transcripcionales y así modular la expresión de genes involucrados en procesos inflamatorios como IL-6. Evaluar además la incorporación de estos ácidos graos omega 3 en relación con los omega 6 posterior a una intervención dietética y suplementada con omega 3 permitirá la disminución de moléculas inflamatorias, mejorando el perfil metabólico de los sujetoscon obesidad. Por lo anterior el objetivo del presente trabajo fue analizar el efecto de una dieta suplementada con omega-3 sobre la expresión del gen IL-6, concentraciones de citocinas y perfil de ácidos grasos en sujetos con obesidad. 3 2. Marco teórico Obesidad La obesidad es una enfermedad multifactorial que se define como la acumulación excesiva de grasa en el organismo, principalmente a nivel abdominal y se caracteriza por un estado de inflamación generalizada (OMS, 2016). El mantenimiento de la homeostasis energética es un proceso altamente regulado (Singla P, 2010), por lo tanto, cuando no existe un equilibrio entre la energía consumida y la energía gastada, el exceso de energía se acumula en el organismo en forma de grasa (Brown R, 2016). Este desequilibrio está influenciado por diversos factores tanto externos como internos, entre los que destacan: genéticos, epigenéticos, ambientales, estrés, patrones de alimentación inadecuados (desbalance en la ingestión de ácidos grasos omegas 6 y 3), y sedentarismo (OMS, 2016; Barquera S, 2013). En los últimos años a nivel mundial y principalmente en México se ha registrado un aumento en la ingestión de alimentos con alto contenido energético, ricos en grasa, principalmente saturada, y alto en hidratos de carbono simple (Campos-Perez, 2016); así como una disminución en el nivel de actividad física, propiciado por las exigencias y formas de trabajo, el uso excesivo de los medios de transporte y la creciente urbanización. Los cambios en los hábitos alimentarios y de actividad física son consecuencia de cambios ambientales y sociales asociados al desarrollo y a la falta de políticas de apoyo en sectores como salud, agricultura, transporte, planificación urbana, medio ambiente, seguridad, distribución y comercialización de alimentos, así como la educación (OMS, 2016). Por lo que el sistema en general favorece un ambiente obesogénico tanto por estilos de vida como por exigencias laborales o bien culturales y sociales. Actualmente y debido a la importancia clínica y de salud pública que representa la obesidad hay diversos métodos para diagnosticar obesidad, entre ellos el índice de masa corporal (IMC), plicometría, bioimpedancia eléctrica y absorción dual de rayos X (DEXA). Así también se puede hacer el diagnóstico de obesidad abdominal a 4 través de la medición de la circunferencia de cintura, parámetro antropométrico que se ha convertido en un indicador importante de riesgo cardiovascular. Los puntos de corte propuestos por varios organismos internacionales son mostrados en la Tabla 1. Tabla 1. Puntos de corte de diagnóstico de obesidad abdominal Hombres Mujeres Referencia Obesidad Abdominal > 90 cm >80 cm Secretaría de Salud Pública de México >102 cm >88 cm ATP III >90 cm >80 cm IDF ATP III: Guías para el tratamiento de las dislipidemias en el adulto, OMS: Organización Mundial de la Salud, IDF: Federación Internacional de Diabetes Actualmente el método más utilizado para la clasificación de sobrepeso y obesidad es el IMC. A pesar de que el IMC no es una medida directa de adiposidad, tiene utilidad clínica y es aceptado por la Organización Mundial de la Salud, (OMS) (Molly, 2008). El criterio de la OMS para la clasificación de sobrepeso y obesidad de la población adulta de acuerdo a las categorías del IMC se muestra en la Tabla 2. Tabla 2. Clasificación de obesidad por categorías de IMC en adultos OMS. Tomado de (OMS, 1998). Para fines de este estudio se considerará la clasificación de IMC de la OMS tomando en cuenta la obesidad tipo I y tipo II y los criterios de obesidad abdominal de la IDF (Federación Internacional de Diabetes) y de la Secretaría de Salud Púbica de México. Clasificación IMC (kg/m²) Peso Normal ≥ 18.5 a < 25 Sobrepeso ≥ 25 a < 30 Obesidad grado I ≥ 30 a < 35 Obesidad grado II ≥ 35 a <40 Obesidad grado III ≥ 40 5 Obesidad e inflamación La obesidad además de incrementar el riesgo de desarrollar enfermedades crónico no transmisibles (ECNT), también favorece el desarrollo de algunos desórdenes mediados por el sistema inmunológico debido a que, como se ha identificado en los últimos años, existe una vía de enlace importante entre el metabolismo y el sistema inmunológico (Tilg, 2006). En el proceso de transición de normopeso-sobrepeso-obesidad se desencadenan una serie de alteraciones metabólicas, principalmente relacionadas con procesos inflamatorios lo que conduce a hipoxia y muerte de los adipocitos; con un cambio de macrófagos de tipo M2 (fenotipo antinflamatorio) a M1 (fenotipo altamente inflamatorio) (Braune, 2017); favoreciendo disfunción endotelial, resistencia a la insulina, aumento de lipólisis y elevación de la concentración de citocinas pro- inflamatorias y disminución en las antiinflamatorias. El papel de la proteína quimiotáctica de monocitos (MCP-1), TNFα e insulina en procesos inflamatorios y obesidad se describe como “cambio fenotípico” (phenotypic switch), caracterizado por una transformación en el estado de polarización de los macrófagos, es decir, la transformación de un estado anti- inflamatorio M2 (forma predominante durante el balance de energía negativo), a la forma M1 que es de tipo proinflamatoria (Lumeng CN, 2008). Diversos estudios demuestran que el tejido adiposo presente en la obesidad presenta una infiltración masiva de macrófagos M1 secundaria al incremento en la secreción de la MCP-1, la cual juega un papel crucial en la respuesta inflamatoria, siendo el factor nuclear kappa B (NF-kB) uno de los mayores inductores de la expresión de MCP-1 (Zeyda M, 2007; Prieur, 2011). Como consecuencia, la proporción de macrófagos del tejido adiposo aumenta del 10% al 40% del total de las células presentes. A su vez TNF- α tiene un impacto importante en la resistencia a la insulina, ya que inhibe la acción de la insulina en los adipocitos a través de inhibidores en la vía de señalización de esta hormona y también está relacionado con la resistencia a la insulina periférica. Por tanto, la población de macrófagos M1 que predomina en el tejido adiposo de los sujetos con obesidad están expresando una serie de factores proinflamatorios y 6 demuestra una correlación positiva con la resistencia a la insulina (Weisberg SP, 2003). Papel de IL-6 y TNF-α en la inmunidad La IL-6 y el TNF-α actúan sobre cascadas inflamatorias y sobre la inmunidad innata. La IL-6 también actúa además sobre la inmunidad adaptativa, donde resulta esencial para la diferenciación de los linfocitos Th17. El bloqueo de la IL-6 conduce tanto a la inhibición de cascadas inflamatorias, como de mecanismos de la respuesta innata, de la diferenciación celular Th17, y de células claves en procesos inflamatorios (Figura 1). Figura 1. Efectos de TNF-α e IL-6 sobre la inmunidad La IL-6 a su vez tiene efectos directos sobre la inmunidad adaptativa, estimulando la proliferación y diferenciación de linfocitos T, sobre todo los del fenotipo proinflamatorio Th1 y Th17 y la diferenciación de linfocitos B a células plasmáticas productoras de autoanticuerpos. Además, IL-6 tiene también efecto sobre: hepatocitos, con un aumento en la producción de reactantes de fase aguda (CRP, por sus siglas en ingles C- reactive protein); el eje hipófisis-hipotálamo-adrenales, promoviendo fatiga, inactividad, falta de concentración y alteración del sueño; e incrementa la síntesis de ácidos grasos y colesterol. Figura tomada de: Sanchéz- Ramon S. Universidad Computense de Madrid. 7 Marcadores inflamatorios Interleucina-6 La IL-6 es una citocina de la serie pro-inflamatoria, el gen que codifica dicha citocina se ubica en el cromosoma 7p21, y está compuesto por 6 exones. Participa en múltiples procesos entre los que destacan: la respuestainmune, inflamación, regulación celular, activación de genes, proliferación, supervivencia y diferenciación celular; y es secretada por los macrófagos, células T, células endoteliales y fibroblastos (Heinrich PC, 2003). El RNAm de IL-6 codifica una proteína de 212 aminoácidos incluyendo un péptido señal de 28 aminoácidos de longitud, que da como resultado una proteína madura de 184 aminoácidos, con un peso molecular de 21 kDa, sin embargo, tiene varias isoformas de 21-28 kDa debido a diferentes tipos de N-glicosilaciones (Schiel X, 1990). Todas las citocinas de tipo IL-6 comprenden cuatro hélices α largas denominadas A, B, C y D, que están dispuestas de una manera que conduce a una topología de arriba hacia abajo (Figura 2). Figura 2. Estructura tridimensional de la IL-6 Las cuatro hélices largas A, B, C y D se destacan en diferentes colores. Los sitios de unión a receptor I, II y III de IL-6 están indicados por círculos. 8 Proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1) La MCP-1, es un miembro de la familia de quimiocinas C-C, y un potente factor quimiotáctico para monocitos. El gen que codifica para esta proteína se localiza en el cromosoma 17q11.2 , MCP-1 humano está compuesto por 76 aminoácidos y tiene un peso molecular de 13 kDa (Van Coillie, 1999). Es producida por una variedad de tipos de células, incluyendo células endoteliales, fibroblastos, células epiteliales de músculo liso, mesangiales, astrocíticos, monocíticos y microgliales o después de la inducción por estrés oxidativo, citocinas o factores de crecimiento (Deshmane SL, 2008). Adiponectina La adiponectina es una adipocitocina secretada por los adipocitos que regula el metabolismo energético del organismo, ya que estimula la oxidación de ácidos grasos, reduce los triglicéridos plasmáticos y mejora el metabolismo de la glucosa mediante un aumento de la sensibilidad a la insulina. Además, la adiponectina inhibe las fases iniciales de la aterosclerosis, ya que reduce la expresión de moléculas de adhesión en células endoteliales, la transformación de macrófagos en células espumosas, la expresión de TNF-α y la proliferación de células de tejido muscular liso. La obesidad y la RI se asocian con una reducción de las concentraciones plasmáticas de adiponectina (Palomer X, 2005). La cuantificación de la concentración de adiponectina plasmática podría permitir la caracterización de pacientes en función del riesgo de desarrollar complicaciones asociadas a la obesidad (García-García M, 2015). Dieta y Omegas A su vez la dieta juega un papel importante en el desarrollo de obesidad, específicamente los ácidos grasos juegan un papel clave en la homeostasis energética; al mantener un balance adecuado entre los tipos de ácidos grasos se puede tener efectos positivos en la salud. Los ácidos grasos polinsaturados (AGPI) omega 6 (n-6) y omega 3 (n-3) son ácidos grasos esenciales, esto significa que no son sintetizados en el organismo y tienen 9 que ser obtenidos a través de la dieta; es necesario obtener cantidades adecuadas a través de peces y productos de aceite de pescado que son los alimentos que contienen los niveles más altos de AGPI omega-3. Los ácidos grasos n-6 y n-3 poseen dos o más dobles enlaces, pero su diferencia radica en el lugar donde ocurre el primer doble enlace. En los ácidos grasos omega-3, el primer doble enlace aparece en el tercer átomo de carbono, mientras que en los omega-6 el primer doble enlace se da en el sexto átomo de carbono contando desde el extremo metilo (denominado omega) (Valenzuela R, 2011). El AGPI n-3 o ácido alfa-linolénico (ALA) es un ácido graso esencial que se encuentran en alta proporción en los tejidos de ciertos pescados (principalmente pescados azules, salmón, sardina), y en algunas fuentes vegetales como las semillas de lino,de chía, y en las nueces. Del ALA se derivan principalmente ácido eicosapentanoico (EPA) y ácido docosahexanoico (DHA), los cuáles son ácidos grasos con propiedades antiinflamatorias (European Food Information Council, 2016). El omega 6 o ácido linoléico (LA) del que se deriva principalmente el ácido araquidónico (AA), se encuentra en alimentos de origen animal (Cerdo, vaca, pollo, huevo), es un ácido graso que participa en proceso pro-inflamatorios (European Food Information Council, 2016). En el organismo, el LA y el ALA compiten por el metabolismo de la enzima desaturasa delta 6 (Δ6-desaturasa). Se sugiere que esto es importante para la salud ya que un consumo elevado de LA puede reducir la cantidad de Δ6-desaturasa disponible para el metabolismo del ALA, lo que puede favorecer que se desencadenen procesos proinflamatorios (Figura 3) (Simopoulos AP, 2016). 10 Figura 3. Ruta metabólica de los ácidos grasos omegas 6 y 3 Metabolismo de los AGPI n-6 y n-3, competencia por las enzimas desaturasas y elongasas así como sus productos finales. Por lo anterior, es importante que haya una relación de consumo dietético de omega 6 y 3 adecuado, esto para mantener un equilibrio en las vías pro y anti-inflamatorias, diversos estudios han mostrado consecuencias positivas con distintas relaciones de consumo dietético de omega 6 y 3. Entre ellos, una relación de 4:1 se asoció con una disminución del 70% en la mortalidad total asociada a eventos cardiovasculares. Una relación de 2-3:1 con disminución de marcadores inflamatorios en pacientes con artritis reumatoide, y una relación de 5:1 con efectos benéficos en pacientes con asma, mientras que una relación ≥10:1 se demostró que tiene consecuencias negativas a la salud. Estos estudios indican que la relación óptima puede variar con la enfermedad en consideración, sin embargo, el consenso de estos estudios demuestra que una relación de consumo dietético adecuado oscila entre 3-5:1 (Simopoulous AP, 2008). 11 Omegas e inflamación Los AGPI omega-3 pueden modular la inflamación, la agregación plaquetaria y la hipertensión. Diferentes mecanismos contribuyen a estos efectos, que incluyen el acondicionamiento de la función y composición de la membrana celular, la producción de eicosanoides y su función para actuar como ligando de factores transcripcionales como PPAR-γ (por sus siglas en inglés Peroxisome proliferator- activated receptor gamma) y favorece la expresión génica de genes blancos (Molfino, 2014). Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son moléculas de señalización importantes para muchos aspectos de la función celular. Son miembros de una gran familia que comparte motivos estructurales comunes, como siete dominios transmembrana y la capacidad de activar proteínas G heterotriméricas, como Gαs, Gαi y Gαq. Los ligandos se unen específicamente a GPCR para estimular e inducir una variedad de respuestas celulares a través de varias vías de segundo mensajero. La activación de GPR120 (de la familia de receptores acoplados a proteínas G con 7 dominios transmembranales) por n-3, EPA y DHA interactúa con TAB1 (Quinasa 1 activada por TGF-beta (MAP3K7) proteína de unión 1) a través de β-arrestin-2 (que actúa como una proteína de andamiaje para reclutar a TAB1, y esta interacción interrumpe la activación de TAK1 (proteína quinasa quinasa quinasa activada por mitógeno 7 (MAP3K7) por TNF-α y por lo tanto se suprime las respuestas inflamatorias a través de NF-kB y JNK (Jun N-terminal cinasa) en macrófagos. Cuando un ligando como los AGS se unen a los receptores tipo Toll 4 y al receptor de TNFα, TAK1 a su vez se une a la proteína TAB1 que inicia una señalización proinflamatoria a través de JNK y NFκB (Li A, 2015; Lesley G, 2013) (Figura 4). Además, se ha demostrado que la activación de GPR120 mejora la captación de glucosa inducida por insulina en el tejido adiposo a través de proteínas Gq/11 y la vía de la PI3K (quinasa de inositol trifosfato) (LiA, 2015) Algunos agonistas de GPR120, como n-3, DHA y EPA, exhiben la capacidad de estimulación de la secreción de insulina a través de las incretinas que son un grupo de hormonas gastrointestinales que estimulan una disminución del nivel de glucosa en la sangre. Estas incretinas como el péptido 1 tipo glucagón (GLP-1) pueden ser 12 reguladas indirectamente por los ácidos grasos libres a través de GPR120. Por lo que el aumento de las incretinas puede dar como resultado un incremento en la secreción de insulina dependiente de glucosa (Kazakos K, 2011). La interacción del ligando con el receptor GPR120 potencian la liberación de insulina, lo cual se realiza a través de la vía de señalización del AMPc (AMP cíclico), el cual se produce después de la activación de la enzima adenilatociclasa por las proteínas acopladas a proteínas G, familia de receptores de la cual forma parte GPR120 produciendo una mayor producción de AMPc, activando las vías de señalización intracelular que culmina en un incremento del Ca2+ intracelular (Moran BM, 2014; Mobraten K, 2013). Estos hallazgos indican que GPR120 tiene un papel importante en la secreción de insulina inducida por ácidos grasos, por lo tanto, la suplementación con omega 3 puede tener un efecto sobre la RI y la inflamación. Figura 4. Vías de señalización de GPR120. GPR120 es un receptor transmembranal. GPR120 se une a β-arrestina 2, después de la estimulación por ligando (omega 3; EPA, DHA), seguido de la endocitosis del receptor y la inhibición de TAK1 proteína quinasa quinasa quinasa activada por mitógeno 7 (MAP3K7), mediada por Tab1; este mecanismo puede inhibir las vías de señalización proinflamatorias de TLR y TNF-α. El receptor GPR120 acoplado a proteínas G regula la secreción de la hormona peptídica gastrointestinal, la adipogénesis y la diferenciación de adipocitos. Y a su vez dependiendo el estímulo favorece vías pro o antiinflamatorias. Tomado de Li A, 2015. 13 3. Antecedentes IL-6 y procesos inflamatorios El gen IL-6 codifica para la proteína del mismo nombre, la cual se produce principalmente en respuesta a estímulos como infecciones, y procesos de inflamación aguda y crónica, lo cual a su vez induce una respuesta inflamatoria (Nile CJ, 2008). La transición de inflamación aguda a inflamación crónica se caracteriza por un cambio de infiltrado celular a partir de neutrófilos polimorfonucleares a células mononucleares, e IL-6 es un regulador clave de este proceso, por lo que desempeña un papel clave en la transición de procesos inflamatorios agudos a crónicos (Yoshizaki K, 1998). IL-6 tiene múltiples funciones biológicas como la activación de células T, diferenciación de monocitos a macrófagos, inducción de moléculas de adhesión y principalmente la estimulación de proteínas inflamatorias como CRP (por sus siglas en inglés C-reactive Protein) (Yoshizaki K, 1998; Gabay C 1990). En sujetos con normopeso, en el tejido adiposo principalmente se encuentran macrófagos tipo 1 (M1), y por la vía de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) se favorece un ambiente antiinflamatorio donde hay una mayor producción de citocinas antiinflamatorias como IL-10 y adiponectina. Por otro lado, en sujetos con obesidad cuando existen adipocitos hipertróficos y por acción principalmente de la MCP-1 se da un cambio de M1 a macrófagos tipo 2 (M2) lo que inactiva la vía de AMPK favoreciendo un ambiente pro-inflamatorio con el incremento de citocinas pro-inflamatorias como IL-6, TNFα, MCP-1, entre otras (Figura 5) (Bijland S, 2013). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yoshizaki%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9836380 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yoshizaki%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9836380 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gabay%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9971870 14 Figura 5. Disfunción del tejido adiposo en sujetos con obesidad Adaptado de Bijland S, Clinial Science 2013. En un tejido adiposo magro se encuentran principalmente macrófagos M2 que activan la vía de AMPK favoreciendo un ambiente antiinflamatorio. En la obesidad el tejido adiposo es disfuncional hay muerte de los adipocitos, polarización de macrófagos M2 a M1, por la MCP-1 principalmente se inhibe la vía de AMPK y se favorece un ambiente proinflamatorio con el incremento de citocinas proinflamatorias y disminución de moléculas antiinflamatorias. IL-10: Interleucina 10, TNFα: Factor de necrosis tumoral alfa, IL-6: Interleucina 6, MCP-1: Proteína quimiótactica de monocitos 1. La IL-6 además de participar en procesos inflamatorios, hay evidencia que cuando su concentración esta elevada también se favorece la alteración de la concentración de lípidos sanguíneos como incremento en los niveles de triglicéridos, estimulación de síntesis de lípidos hepáticos e incremento de lipólisis en el tejido adiposo (Khovidhunkit W, 2004). En población México-Americana, en un estudio en el que dieron 2 tipos de dietas (mexicana y estadounidense) se evaluaron los cambios en los niveles de IL-6 y no se encontraron cambios significativos en IL-6 por los 2 tipos de dieta. Los valores https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khovidhunkit%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15102878 15 reportados para ambas dietas fueron 1.36 pg/mL, al separar a los sujetos por normopeso y sobrepeso/obesidad los valores de IL-6 oscilaron entre 1.0 y 1.85 pg/mL, respectivamente (Santiago-Torres M, 2017). Los AGPI n-6 y n-3 en procesos inflamatorios Los AGPI n-3 tienen una participación importante en procesos antiinflamatorios, algunos de los efectos de este ácido graso son provocados por la cantidad y el tipo de eicosanoides producidos, y otros efectos son provocados por mecanismos como acciones sobre vías de señalización, la actividad como factor de transcripción y por lo tanto, por su efecto en la modulación de la expresión génica. Estudios en modelos animales y estudios clínicos de intervención demuestran que los ácidos grasos omega-3 tienen propiedades anti-inflamatorias y, por lo tanto, podría ser útil en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes, reportes recientes destacan que una relación de consumo de ácidos grasos omega 6:3 es adecuada cuando se mantiene una relación de 3:1 o 5:1 de omega 6 y 3, respectivamente (Simopoulos AP 2002, Simopoulos AP, 2003; Simopoulos AP, 2008; Riediger ND, 2008). Existe evidencia que el n-3 pueden mejorar la inflamación sistémica a través de la reducción de la concentración plasmática de IL-6 ya que en estudio realizado en población de estados unidos se encontró una correlación inversa entre los AGPI n- 3 y DHA con los niveles de IL-6 en plasma, a mayor n-3 y DHA menores niveles plasmáticos de IL-6 (Ma Y, 2016). 16 4. Justificación Reportes en población mexicana indican que hay una ingestión excesiva de omega 6 e insuficiente de omega 3, expresado en una relación de consumo dietético de 12:1 (Campos-Pérez, 2016), cuando las recomendaciones de diversos autores establecen como adecuado una relación de consumo de 3:1 o 5:1 para tener efectos positivos en la salud (Simopolous AP, 2002; Simopolous AP, 2008), lo que indica que la población, a través de la dieta favorece un ambiente inflamatorio en el organismo, además según datos reportados por la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición, del 2000 al 2006 la obesidad aumentó de 23.7% a 30.8% (ENSANUT 2006). En la actualidad, la ENSANUT 2012 y 2016 (ENSANUT 2012; ENSANUT 2016) reportaron que siete de cada diez mexicanos tienen problemas de sobrepeso u obesidad; en el contexto de que durante la obesidad se cursa por un estado de inflamación generalizada es de gran importancia estudiar los diferentes componentes que pueden contribuir al desarrollo de obesidad y comorbilidades asociadaspara establecer estrategias efectivas para el abordaje clínico de los sujetos con obesidad. El exceso de grasa corporal, principalmente a nivel abdominal tiene efectos negativos en la salud. Los adipocitos actúan como depósito para el almacenamiento de grasa, y además de su función como células endocrinas, liberan moléculas de forma regular, entre ellas: citocinas inflamatorias como TNF-α, IL-6, IL-18, CRP, factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), adipocitocinas como leptina; todos estos factores intervienen en la homeostasis de lípidos, sensibilidad a la insulina y control de la inflamación (Flier JS, 2008). Además de un problema de salud, la obesidad y sus complicaciones representa un importante costo para el país; se estima que el Sector Salud en México invirtió 806 millones USD (dólares) en el 2008, se calcula que para el año 2030 el costo ascenderá a 1254 millones USD y para el 2050 será de 1706 millones de USD. Sin embargo, si se logra una disminución de aproximadamente el 5% de sobrepeso/obesidad en la población, los costos podrían disminuir de 1254 billones 17 USD a 1137 USD para el año 2030 y de 1706 billones de dólares a 1514 billones de USD (Rtveladze K, 2013). Los resultados del presente trabajo generarán conocimiento que ayude a esclarecer el efecto de los AGPI n-6 y n-3 en procesos inflamatorios y sobre la expresión del gen IL-6. Lo anterior podría tener un impacto en prevención y tratamiento de ECNT como la obesidad, con la finalidad de apoyar el establecimiento de nuevas estrategias para la intervención médico-nutricional en pacientes con obesidad y así disminuir sus comorbilidades asociadas. El presente trabajo de investigación ha sido establecido y coordinado bajo la dirección de la Dra en C. Erika Martínez López y fue financiado por Fondos propios a través del Programa ProSNI y PROINPEP Otorgado al Doctorado en Ciencias en Biología Molecular en Medicina. 5. Planteamiento del problema Un consumo inadecuado de macro y micronutrimentos específicamente la relación de ácidos grasos omega 6 y 3 en la población, aunado a estilos de vida poco saludables como el consumo de alcohol, tabaco y sedentarismo favorecen el desarrollo de sobrepeso y obesidad el cual se caracteriza por un estado de inflamación generalizada. La inflamación crónica presente en la obesidad aunado a las alteraciones en las concentraciones de lípidos; principalmente triglicéridos, colesterol total y LDL elevados, así como colesterol HDL disminuido propician que la obesidad se asocie a una serie de comorbilidades como hipertensión, DM2, NAFLD, resistencia a la insulina, enfermedades cardiovasculares, entre otras. La fisiopatología de la obesidad y sus comorbilidades es muy compleja, por lo que es importante conocer más biomarcadores que puedan facilitar la prevención, manejo y tratamiento de esta patología. No se conoce la relación que existe entre la expresión de IL-6 así como el papel que juegan con el consumo de ácidos grasos omega 6 y 3 en este proceso inflamatorio en sujetos con obesidad. 18 6. Pregunta de investigación ¿Cuál es el efecto de una dieta suplementada con omega 3 sobre la expresión de IL-6, concentraciones de citocinas y perfil de ácidos grasos en sujetos con obesidad? 7. Hipótesis Hipótesis de investigación Una dieta suplementada con omega 3 disminuye la expresión de IL-6, concentración de citocinas inflamatorias y mejora el perfil de ácidos grasos en sujetos con obesidad. Hipótesis nula Una dieta suplementada con omega 3 no modifica la expresión de IL-6, de citocinas inflamatorias y niomejora el perfil de ácidos grasos en sujetos con obesidad. 8. Objetivos Objetivo General ❑ Analizar el efecto de una dieta suplementada con omega-3 sobre la expresión del gen IL-6, concentraciones de citocinas y perfil de ácidos grasos en sujetos con obesidad Objetivos Específicos 1. Describir las características sociodemográficas, nutricionales, antropométricas y bioquímicas de los sujetos de estudio. 2. Comparar el efecto de la intervención dietética sobre variables nutricionales, antropométricas y bioquímicas en ambos grupos de estudio. 3. Evaluar el efecto de la asesoría psicológica sobre la adherencia al tratamiento nutricional. 4. Comparar la expresión del gen IL-6 al inicio y al término de la intervención entre los grupos de estudio (omega 3 vs placebo). 19 5. Correlacionar la expresión del gen IL-6 con los niveles de la proteína circulante. 6. Comparar el perfil de citocinas pro y antiinflamatorias al inicio y al término de la intervención y entre grupos (omega 3 vs placebo) 7. Correlacionar la ingestión de n-3 y n-6 con el contenido de n-3 (EPA, DHA) y n-6 (AA) en membrana de eritrocitos. 8. Asociar el contenido de n-3 (EPA, DHA) y n-6 (AA) en membrana de eritrocitos con marcadores inflamatorios (IL-1α, IL-10, IL-6, TNF-α, MCP-1 y adiponectina). 9. Diseño metodológico Tipo de estudio Ensayo clínico aleatorizado controlado con placebo, ciego simple. Universo de estudio El universo de estudio del presente trabajo son sujetos con obesidad, de ambos sexos y que acudieron al Servicio de Biología Molecular en Medicina del Hospital Civil “Fray Antonio Alcalde”, Departamento de Biología Molecular y Genómica, CUCS, Universidad de Guadalajara. Tamaño de muestra Para realizar el cálculo del tamaño de la muestra, se utilizó la fórmula para ensayo clínico individual comparando las medias entre grupo tratado y no tratado, se utilizó como valores de referencia el cambio en las concentraciones de IL-6 en una población con EPOC (Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica) que recibió un suplemento que contenía omega 3 (se tomó como referencia este artículo ya que no se encontró uno que mostrara cambios de expresión de IL-6 en sujetos con obesidad que recibieron una suplementación, sin embargo, en este estudio no se considerará EPOC solo fue para tomar la referencia de cambios en IL-6) y vieron cambios en niveles de distintos marcadores inflamatorios (Sugawara, 2010). 20 Despejando la fórmula y considerando un poder del 80% y una significancia a dos colas de 0.05 el resultado fue de 19 sujetos por grupo. K=7.9 µ1 = 5.6 µ2 = 50.6 σ1 = 37.2 σ2 = 58.8 𝒏 = 𝟕. 𝟗 (𝟑𝟕. 𝟐𝟐 + 𝟓𝟖. 𝟖𝟐)/(𝟓. 𝟔 − 𝟓𝟎. 𝟔)𝟐 𝒏 = 𝟏𝟖. 𝟖 Considerando un porcentaje de pérdidas del 20% se incluyeron 23 sujetos por grupo (Velasco VM, 2002). Sede del Estudio El presente estudio se llevó a cabo en las instalaciones del Servicio de Biología Molecular en Medicina del Hospital Civil “Fray Antonio Alcalde”, Departamento de Biología Molecular y Genómica, CUCS, Universidad de Guadalajara. El periodo del estudio fue de agosto de 2016 a diciembre de 2019. Criterios de selección Criterios de inclusión - Sujetos ambos géneros - Adultos de 30 a 50 años de edad - Firmen el consentimiento Informado - Obesidad tipo I y II considerando el IMC (30 - 40kg/ m2) 21 - Obesidad abdominal de acuerdo con lo establecido por la IDF - Circunferencia de cintura (CC) mujeres ≥80cm, hombres ≥90cm Criterios de no inclusión - Mujeres embarazadas o en periodo de lactancia - Consumir suplementos de omegas, medicamentos AINES, o algún tipo de hipolipemiantes. - Enfermedades metabólicas (DM2, NASH, NAFLD), cardiovasculares o algún tipo de cáncer. - Infecciones virales (pueden alterar niveles de IL-6 y marcadores inflamatorios). Criterios de exclusión - Muestra insuficiente - Sujetos que deseen abandonar el estudio Variables de estudio En la tabla 3 se describen las variables dependientes y su operacionalización y en la tabla 4 se describen las variables independientes. 22 Tabla 3. Variables dependientesVariables dependientes Unidad de medición Tipo Expresión de IL-6 UER Cuantitativa continua Concentración proteica de IL-6 pg/ml Cuantitativa continua Perfil de lípidos mg/dL Cuantitativa continua Adiponectina µg/mL Cuantitativa continua IL-6, MCP-1, IL-8 pg/mL Cuantitativa continua Contenido de omega 3 (EPA, DHA) omega 6 (AA) Porcentaje Cuantitativa continua IMC Kg/m2 Cuantitativa continua Circunferencia de cintura Centímetros Cuantitativa discreta Porcentaje de grasa Porcentaje Cualitativa nominal Tabla 4. Variables independientes Variables independientes Unidad de medición Tipo Edad Años Cuantitativa discreta Género M (mujer) H (hombre) Cualitativa nominal Consumo omega 3 y 6 Porcentaje Cuantitativa continua 23 Análisis estadístico Los datos se capturaron en una hoja de cálculo de Excel para posteriormente ser exportados y analizados en el software SPSS V20. Se realizó una prueba de Shapiro-Wilk para evaluar la normalidad de las variables. Las variables cuantitativas paramétricas se analizaron con la prueba T de Student, y las no paramétricas con la prueba U de Mann Withney; las correlaciones paramétricas fueron analizadas con la prueba de Pearson y las no paramétricas con la prueba de Spearman; para el análisis de variables cualitativas se usó la prueba Chi-cuadrada. Para analizar el efecto de la intervención dietética y la suplementación sobre variables antropométricas y bioquímicas en los diferentes tiempos de intervención se utilizó la prueba de ANOVA de medidas repetidas. Para ver las diferencias entre grupos se utilizó la prueba de t de Student para muestras independientes (utilizando los deltas del final vs el basal). La t de student pareada se utilizó para ver las diferencias entre el tiempo basal y final. Se realizó un modelo de regresión lineal múltiple para ver la contribución de variables dietéticas, antropométricas y bioquímicas sobre la expresión de IL-6. Consideraciones éticas y de bioseguridad El proyecto fue sometido y aprobado por el Comité de ética del CUCS, con el número de registro: CI-01219 (Anexo 1). De acuerdo con el Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de investigación para la Salud, publicado en el Diario Oficial de la Federación el 6 de enero de 1987, el estudio se clasifica como Investigación de riesgo mínimo. En el título segundo, sobre los aspectos éticos de la investigación en seres humanos, capítulo 1, artículo 14 se establece que cuando la investigación se realice en seres humanos, ésta deberá contar con el consentimiento informado y por escrito del sujeto de investigación o su representante legal. Además, describe que las intervenciones deberán ser realizadas por profesionales de la salud con experiencia para cuidar la integridad del ser humano, bajo la responsabilidad de la institución de atención a la salud que actúe bajo la supervisión de las autoridades sanitarias competentes y que cuente 24 con los recursos humanos y materiales necesarios, que garanticen el bienestar del sujeto de investigación, aspectos que también son considerados en este estudio. Este estudio se ajusta a la Declaración de Helsinki en su actualización realizada en Fortaleza, Brasil 2013. Para la planeación y desarrollo de esta investigación se han considerado las normas de Buenas Prácticas Clínicas que fueron presentadas en 1994 por la Conferencia Internacional de Armonización, las cuales proporcionan garantía para los sujetos de estudio de que sus derechos, la seguridad y el bienestar están protegidos en todo momento. El manejo de los residuos biológico-infecciosos se realizará conforme a lo establecido en la NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-infeccioso- Clasificación y especificaciones de manejo. Los residuos peligrosos biológico- infecciosos envasados deberán almacenarse en contenedores metálicos o de plástico con tapa y ser rotulados con el símbolo universal de riesgo biológico, con la leyenda "RESIDUOS PELIGROSOS BIOLOGICO-INFECCIOSOS". Las bolsas para el almacenamiento de residuos como sangre que serán los desechos principales del proyecto deberán ser de polietileno de color rojo traslúcido de calibre mínimo 200 y con un contenido de metales pesados de no más de una parte por millón y libres de cloro, además deberán estar marcadas con el símbolo universal de riesgo biológico y la leyenda Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos. Aparte de las precauciones estándar de seguridad como el uso de guantes de nitrilo, se utilizará un contenedor rígido rojo para el material punzocortante y una bolsa roja para material infeccioso empapado en sangre, y en caso de material con poca cantidad de fluidos biológicos, se desechará en la bolsa negra de la basura comunitaria. Del mismo modo, el manejo de los residuos peligrosos corrosivos reactivos, explosivos, inflamables, tóxicos y biológico-infecciosos (CRETIB) se hará de acuerdo a la NOM-052SEMARNAR-2005, los cuales serán colocados en los recipientes correspondientes a las familias químicas y serán etiquetados adecuadamente de acuerdo a lo establecido por la Comisión de Bioseguridad del Hospital Civil y del CUCS, para su almacenamiento y su posterior disposición. La infraestructura del laboratorio del Servicio de Biología Molecular en Medicina cuenta con los elementos primarios necesarios para el manejo y desecho de los 25 RPBI. Así como con la capacitación técnica y seguimiento de las buenas prácticas de laboratorio, considerando al laboratorio como establecimiento del nivel 1. Las sustancias y reactivos que se utilizan, así como su característica química y disposición final será procesado de acuerdo a las fichas técnicas. En este proyecto se usará cloruro de sodio al 10% y al 5M, SDS, tampón de fosfato y acetato a diferentes concentraciones, todas estas sustancias químicas son seguros y pueden ser desechados por drenaje. Los desechos que contengan pequeñas cantidades de cloroformo se dejarán evaporar en una campana de extracción tal como se establece en la hoja de seguridad de la sustancia. Los desechos que contengan restos de Trizol serán desechados en recipientes en una planta de eliminación de residuos autorizada. En este proyecto no se manejarán sustancias explosivas. Todos los colaboradores que participan en este proyecto conocen y practican de forma correcta las disposiciones de residuos generados en el proyecto de investigación de acuerdo a las normas previamente mencionadas. Así mismo, el investigador responsable cuenta con la formación académica y experiencia adecuada para la dirección del trabajo a realizarse, y para supervisar cada uno de los procedimientos. Recolección de datos Se invitó al estudio a los sujetos que acudieron al Servicio de Biología Molecular en Medicina del Hospital Civil “Fray Antonio Alcalde”. Se realizó una valoración clínica y antropométrica, aquellos sujetos que cumplían con los criterios de inclusión y que aceptaron participar en el estudio, se les pidió que firmarán una carta de consentimiento informado (Anexo 2) y posteriormente se les dio una cita para la entrevista y recolección de muestra biológica. Los sujetos fueron entrevistados antes de las mediciones basales con el fin de obtener información de aspectos demográficos, antecedentes familiares y patológicos, así como datos relacionados con el estilo de vida. Esta información se obtuvo utilizando un cuestionario diseñado de acuerdo con la información requerida en el estudio (Anexo 3). 26 Intervención nutricional La intervención nutricional fue por un periodo de seguimiento de 4 meses, los sujetos que cumplieron con los criterios de inclusión se asignaron de manera aleatoria a uno de los grupos: grupo experimental (suplementación
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