Biotecnologia_de_plantas_superiores_y_al

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Biotecnología Dorado, Jorrín, Tena, Fernández (eds) 
 
 
Aplicaciones biotecnológicas de ureidos y tocoferoles - Pineda et al, 2009 –Pág. 27 de 101– 
Capítulo 7 
 
Biotecnología de plantas superiores y algas verdes 
 
Pineda Priego M
1
, Piedras Montilla P, Aguilar Urbano M, Muñoz Alamillo J, Quiles Luque FA, Sánchez Morán 
MV, Díaz Leal JL, Muñoz Gutiérrez A, Gálvez Valdivieso G, Fernández Conde E, Vera Postigo JM, Fernández 
Alvarez J, Raso Reyes MJ, Cardeñosa Parrado R 
 
1
Dep. Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal, Fisiología Molecular y Biotecnología de Plantas, Campus de Rabanales, 
Edif. Severo Ochoa (C-6), Universidad de Córdoba, 14071 Córdoba; Tel: 957218693; Fax: 957218358; 
1
CE: 
<bb1piprm@uco.es> 
 
RESUMEN 
Los ureidos, alantoína y alantoato, son los principales compuestos sintetizados a partir del nitrógeno fijado en 
los nódulos de las leguminosas que se exportan a las partes aéreas en leguminosas tropicales como la judía. 
Los ureidos se producen por la oxidación de las purinas sintetizadas de novo en los nódulos radicales y 
también como parte de un proceso de recuperación de los compuestos nitrogenados en tejidos senescentes. 
Los ureidos se acumulan en varios tejidos vegetales en respuesta al estrés hídrico, y se ha sugerido que la 
acumulación de estos compuestos nitrogenados es la responsable de la inhibición de la fijación de nitrógeno 
que tiene lugar en condiciones ambientales adversas. A pesar de la importancia crucial de los ureidos como 
compuestos de reserva y transporte de nitrógeno, hasta el momento no se llevado a cabo la caracterización 
de las rutas de síntesis y degradación de ureidos en plantas. En particular, parece que existen dos posibles 
rutas de degradación de alantoato, y que el que determinadas leguminosas usen una u otra ruta puede afectar 
a la sensibilidad o tolerancia de esas plantas a la sequía. Por tanto la determinación de la ruta que opera en 
leguminosas de gran interés agronómico como la judía y el garbanzo, puede a la larga tener utilidad 
biotecnológica con la obtención de plantas que sean capaces de mantener la fijación de nitrógeno en 
condiciones ambientales adversas, como la sequía. Además de en la caracterización, con fines 
biotecnológicos del metabolismo de ureidos en leguminosas, se está trabajando obtención de algas 
superproductoras de γ-tocoferol (vitamina E) mediante ingeniería metabólica, así como en el análisis del 
contenido en antioxidantes del aceite de oliva. 
 
Palabras clave: tolerancia el estrés abiótico, caracterización molecular, patrones de expresión, bioproducción de 
vitaminas, polifenoles. 
 
Introducción 
 
El Grupo CVI-115 desarrolla su actividad investigadora en 
dos temas diferentes, ambos con potencial aplicación 
biotecnológica. Por una parte, se pretende encontrar los 
factores moleculares que determinan la diferenciación 
metabólica de las leguminosas en ureídicas y amídicas. 
Por otra, se ha iniciado recientemente una línea 
relacionada con la utilización de tocoferoles como 
antioxidantes naturales en la que se persigue la obtención 
de algas y plantas superproductoras de vitamina E. 
 
Análisis de la síntesis y movilización de ureidos y 
amidas en leguminosas 
 
Gran parte de la fijación biológica del nitrógeno 
atmosférico se produce en los nódulos de las raíces de las 
leguminosas que se forman en la simbiosis con bacterias 
de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium. Una vez 
incorporado a esqueletos carbonados, el nitrógeno fijado 
en estos nódulos se puede transportar hasta las partes 
aéreas de la planta en forma de amidas (glutamina y 
asparragina) o ureidos (alantoína y alantoato), lo que 
permite distinguir entre plantas amídicas (guisante, 
garbanzo, etc) y ureídicas (soja, judía, etc). La forma de 
transporte depende no sólo del tipo de leguminosa sino 
también del estado de desarrollo de la planta. 
 
Además, las plantas ureídicas sólo transportan ureidos 
cuando los compuestos nitrogenados proceden 
exclusivamente de la fijación biológica de N2 que se lleva a 
cabo en los nódulos, de manera que se comportan como 
amídicas cuando se fertilizan con nitrato, y entonces la 
forma de transporte del nitrógeno orgánico es en forma de 
aminoácidos (glutamina y asparragina). 
 
En general se ha prestado mucha atención a procesos 
como la fijación o la asimilación del nitrógeno, procesos 
esenciales para el desarrollo vegetal. Finalmente, el 
nitrógeno contenido en los ureidos o en los aminoácidos 
debe ser liberado para su reutilización en la síntesis de 
todos los compuestos con nitrógeno esenciales para la 
planta (ácidos nucleicos, otros aminoácidos, etc). 
 
A pesar de su importancia, no se han estudiado todavía en 
profundidad a las rutas de degradación de los compuestos 
nitrogenados en plantas, y menos en leguminosas. En 
nuestro grupo analizamos las rutas de degradación de 
ureidos en judía, que es una planta ureídica, y en 
garbanzo, planta amídica, ambas leguminosas de gran 
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–Pág. 28 de 101– Aplicaciones biotecnológicas de ureidos y tocoferoles - Pineda et al, 2009 
interés agronómico. 
 
 
Figura 1. Síntesis y transporte de ureidos y aminoácidos en plantas 
ureídicas y amídicas. La mayoría del nitrógeno fijado en plantas 
ureídicas se exporta en forma de ureidos (alantoína y alantoato), 
mientras que en plantas amídicas lo hace en forma de amidas 
(asparragina y glutamina). 
 
Búsqueda de los factores responsables de la 
diferenciación metabólica de las leguminosas en 
ureídicas y amídicas 
 
En nuestro grupo hemos clonado genes que codifican 
tanto enzimas de la síntesis de amidas (asparragina 
sintetasa) como de ureidos (urato oxidasa), y estamos 
analizando la expresión de estos genes tanto en plantas 
amídicas como ureídicas, en distintas condiciones 
fisiológicas y de desarrollo. 
 
Recientemente hemos abordado la caracterización de las 
enzimas responsables de la degradación de ureidos con 
objeto de estudiar la implicación de las mismas y de los 
ureidos en los procesos de desarrollo, tanto en plantas de 
judía como de garbanzo. En primer lugar se ha estudiado 
la enzima que cataliza la degradación de alantoína 
(alantoinasa) de judía (Phaseolus vulgaris). La actividad, 
detectada en diversos tejidos, se purificó a partir de frutos 
en desarrollo, donde presentaba los niveles más elevados. 
 
A través de cromatografía de intercambio iónico se 
obtuvieron dos picos con actividad alantoinasa, que 
representa dos posibles isoformas con una diferencia en la 
movilidad electroforética de unos 5 kDa. También se ha 
clonado el ADNc que codifica la alantoinasa de judía y, 
sorprendentemente, el análisis de Southern-blot de ADN 
genómico reveló que el gen clonado se encuentra como 
copia única en judía. En la actualidad se está llevando a 
cabo la caracterización de la misma enzima en garbanzo, 
y se van a comparar los resultados en esta planta amídica 
con los obtenidos en judía. 
 
Análisis molecular con fines biotecnológicos de la 
tolerancia a la sequía en judía. 
 
En condiciones de estrés hídrico se produce rápidamente 
la inhibición de la fijación del N, y se cree que esta 
inhibición puede estar mediada por la acumulación de 
ureidos en las hojas (“ureide-feedback hypothesis”). No 
obstante, como aún no se han podido determinar la 
mayoría de las actividades enzimáticas del catabolismo de 
ureidos en plantas, esta hipótesis está aún por confirmar. 
 
Nuestro objetivo es caracterizar tanto a nivel molecular 
como bioquímico las posibles vías de degradación de 
ureidos en leguminosas, y estudiar los niveles de 
expresión y de actividad en condiciones normales y de 
estrés hídrico en plantas de judía. Para ello se han 
comenzado a clorar secuencias codificantes de cada uno 
de los posibles genes implicados en el metabolismo de 
ureidos, y en particular de los genes que codifican las 
enzimasencargadas de la degradación de alantoato, ya 
que se han descrito varias enzimas alternativas, que 
podrían degradar el alantoato hasta ureidoglicolato y este 
hasta amonio. 
 
En concreto, se ha sugerido que la ruta de degradación de 
ureidos se bifurca en dos ramas a partir del alantoato, una 
que produciría urea, y una segunda que liberaría 
directamente amonio, y parece que las plantas que usan 
preferentemente cada una de estas ramas de la ruta 
difieren en su sensibilidad a la sequía. En estos momentos 
se ha purificado y caracterizado la última enzima de la 
ruta, que degrada el ureidoglicolato a glioxilato en frutos 
de garbanzo y de judía, y ha resultado ser enzimas de 
rama que libera urea. Pero en contra, hemos clonado el 
gen de una ureidoglicolato amidohidrolasa, que 
correspondería a la ruta que libera directamente amonio. 
 
También hemos clonado el gen que codifica la alantoato 
amidohidrolasa, enzima que también libera amonio. Por 
tanto tenemos evidencias de que la ruta, al menos en judía 
opera tanto por la ruta amidohidrolasa, productora de 
amonio, como urea-liasa, que libera urea. También 
tenemos datos que corroboran la acumulación de ureidos 
en todos los tejidos analizados, en condiciones de sequía. 
La comparación en la expresión de los genes y la actividad 
de todas estas enzimas en condiciones de riego normal o 
de déficit hídrico nos permitirán aclarar si efectivamente 
las rutas de degradación de ureidos influyen en la 
tolerancia a la sequía, y si la acumulación de ureidos es o 
no la responsable de la inhibición de la fijación de 
nitrógeno en condiciones de déficit hídrico. 
 
Obtención de algas y plantas superproductoras de γ-
tocoferol (vitamina E) mediante ingeniería metabólica. 
 
La capacidad antioxidante del α-tocoferol es unas 200 
veces superior a la del butilhidroxitolueno (BHT), 
antioxidante alimentario usado habitualmente. La 
capacidad antioxidante de los isómeros β, γ, y δ es 1.5, 3 y 
5 veces superior a la del isómero α. Nuestro objetivo es 
conseguir una fuente biológica con alto contenido en 
tocoferoles (fundamentalmente de γ-tocoferol) de forma 
que su extracción resulte económicamente rentable. 
Todas las plantas superiores tienen α-tocoferol en sus 
hojas y otras partes verdes, mientras que el γ-tocoferol 
(también el β- y el δ-tocoferol) está presente en 
concentraciones muy inferiores. 
 
Desde un punto de vista metabólico, tanto el γ- como el α-
tocoferol se producen a partir del ácido homogentísico y 
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del fitil-pirofosfato. La p-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa 
(EC 1.13.11.27) cataliza la síntesis del ácido 
homogentísico y la γ-tocoferol metiltransferasa (EC 
2.1.1.95) cataliza la metilación del γ-tocoferol a partir de la 
S-adenosilmetionina para dar α-tocoferol. El α-tocoferol se 
produce sintéticamente a escala industrial mientras que el 
γ-tocoferol sólo se obtiene en pequeñas cantidades a partir 
de los aceites naturales mediante procedimientos de 
extracción y separación, por lo que su precio resulta 
prohibitivo para la industria. 
 
En consecuencia, lo que se plantea es aumentar la 
concentración de tocoferoles en plantas y en algas 
sobreexpresando el gen de la p-hidroxifenilpiruvato 
dioxigenasa e incrementar la concentración de γ-tocoferol 
anulando la expresión del gen de la γ-tocoferol 
metiltransferasa. Ambos genes se han clonado en nuestro 
grupo recientemente, lo que abre la posibilidad de obtener 
plantas modificadas genéticamente, que presenten un 
contenido elevado en vitamina E. 
 
HPPDasa: p-hidroxifenil piruvato dioxigenasa
!-TMT: !-tocoferol metiltransferasa
SAM
3
HO
O
H
H
!-TMT
SAM
HO2C
OH
HO
! cido homogent"sico
Metilaci#n
Ciclaci#n 3
HO
H
O
H
H+
..
Metilaci#n
2-metil-6-fitil-1,4-benzoquinol
2,3-dimetil-5-fitil-1,4-benzoquinol
! cido 4-hidroxifenil pir$vico
3O
HO
H
3O
HO
H
"-tocoferol !-tocoferol
HPPDasa
CO2HO
O2HO HO
CO2HO
O
CO2
Plastoquinonas
CO2
Fitil difosfato
PPO H
3
 
Figura 2. Síntesis de tocoferol en plantas. Se muestran las reacciones 
de la ruta metabólica de producción de tocoferol. 
 
Caracterización de aceites de oliva virgen y detección 
de mezclas fraudulentas 
 
La capacidad antioxidante asociada a la fracción 
insaponificable del aceite tiene una enorme trascendencia 
en diversos aspectos que repercuten directamente en el 
valor nutritivo y comercial del aceite. Además, las 
concentraciones absolutas y la abundancia relativa de los 
diferentes tocoferoles y polifenoles pueden usarse como 
indicadores de la autenticidad y de la calidad de un aceite 
así como de su estabilidad frente a la oxidación. 
 
Por tanto, los análisis de tocoferoles se están aplicando a 
los aceites de oliva vírgenes extraídos de las principales 
variedades de aceitunas de la provincia de Córdoba, a 
saber: arbequina, hojiblanca, picual y picuda. El objetivo 
de este trabajo es completar la caracterización de dichos 
aceites y usar el contenido en antioxidantes (polifenoles y 
tocoferoles) como parámetro de autenticación en la lucha 
contra el fraude. 
 
Agradecimientos 
 
Financiado por los Proyectos BIO2006-09366 (MEC) y 
AGR01283 (Junta de Andalucía) y Grupo PAI CVI-115 
(Junta de Andalucía). 
 
Referencias 
 
Muñoz A, Raso MJ, Pineda M, Piedras P (2006): 
Degradation of ureidoglycolate in French bean 
(Phaseolus vulgaris) is catalysed by a ubiquitous 
uredoglycolate urea-lyase. Planta 224: 175-184. 
Todd CD, Tipton PA, Blevins DG, Piedras P, Pineda M, 
Polacco JC (2006): Update on ureide degradation in 
legumes. J Exp Bot 57: 5-12. 
Mohamed R, Pineda M, Aguilar M (2007): Antioxidant 
capacity of extracts from wild and crop plants of the 
mediterranean region. J Food Sci 72: 59-63. 
Mohamed R, Fernández J, Pineda M, Aguilar M (2007): 
Roselle (Hibiscus sabdariffa) seed oil is a rich source 
of g-tocopherol. J Food Sci 72: 207-211. 
Raso MJ, Pineda M, Piedras P (2007): Tissue abundance 
and characterization of two purified proteins with 
allantoinase activity from French bean (Phaseolus 
vulgaris). Physiol Plant 131: 355-366. 
Raso MJ, Muñoz A, Pineda M, Piedras P (2007): 
Biochemical characterisation of an allantoate-
degrading enzyme from French bean (Phaseolus 
vulgaris): the requirement of phenylhydrazine. Planta 
226:1333-1342.