XV JCyT NOA - 2022- Rivero Mariano

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XV JORNADAS DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE FACULTADES DE INGENIERÍA DEL NOA 29 Y 30 DE SEPTIEMBRE DE 2022
BIOSURFACTANTES MICROBIANOS: PRODUCCION Y CARACTERIZACION 
Mariano Rivero (1,4), Carla V. Coronel (2), Augusto E. D´Ambrosio-Ornass (3), Viltes Sánchez Agustina S. (1), Pablo Cuesta (3,4), Victoria Wierna (3,4), Dolores Gutiérrez-Cacciabue (1,4), Verónica B. Rajal (1,4), Verónica P Irazusta (2,4)*
(1) Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Salta (UNSa), Av. Bolivia 5150, Salta, Argentina.c
(2) Facultad de Ciencias Naturales, UNSa, Av. Bolivia 5150, Salta, Argentina.
(3) Facultad de Ciencias Exactas, UNSa, Av. Bolivia 5150, Salta, Argentina.
(4) Instituto de Investigaciones para la Industria Química (INIQUI) – CONICET –UNSa, Av. Bolivia 5150, Salta, Argentina.
*Correo Electrónico (Verónica Irazusta): irazustaveronica@gmail.com
Resumen
Los biosurfactantes son moléculas producidas por microorganismos como parte de su metabolismo. Presentan varias ventajas sobre sus pares sintéticos, con el beneficio adicional de ser biodegradables y no tóxicos. Una de las desventajas son sus altos costos de producción a gran escala. Para afrontar este problema podría utilizarse fuentes de carbono y otros nutrientes económicos como lo son los subproductos agroindustriales. Entre las industrias del Noroeste Argentino se destaca Ledesma, dedicada principalmente a la producción de azúcar, papel y alcohol. De los dos últimos procesos mencionados se obtienen como subproductos licor negro y vinaza. Una de las opciones es darles valor agregado utilizándolos como sustratos económicos en la obtención de biosurfactantes. Hace un par de años Ledesma brindó muestras de licor negro y vinaza, de donde se realizó el aislamiento de microorganismos. Se evaluaron dichas cepas por su capacidad de disminuir la tensión superficial del medio de producción, lo que se correlaciona con la síntesis de biosurfactantes. El objetivo de este trabajo fue obtener moléculas biosurfactantes a partir de microorganismos seleccionados, utilizando para ello los subproductos de esta industria con el propósito de reemplazar a los tensioactivos sintéticos que actualmente se utilizan. Se identificaron molecularmente cinco cepas pre-seleccionadas y se eligió una bacteriana para optimizar la producción de biosurfactantes y para su posterior caracterización.
ABSTRACT
Biosurfactants are molecules produced by microorganisms as part of their metabolism. They have several advantages over their synthetic counterparts, with the additional benefit of being biodegradable and non-toxic. One of their disadvantages is the high large-scale production costs. To address this a carbon source and other cheap nutrients such as agro-industrial by-products can be used. In northwestern Argentina, Ledesma is an industry mainly dedicated to the production of sugar, paper and alcohol. Black liquor and vinasse are by-products from the latter two processes. One of the options is to use them as economic substrates to obtain biosurfactants. Previously, Ledesma provided black liquor and vinasse samples, from which microorganisms were isolated. These strains were evaluated for their capacity to produce a surface tension decrease of the production medium, which is correlated to the synthesis of biosurfactants. The aim of this work was to obtain biosurfactant molecules from selected microorganisms, using sugar cane by-products to eventually replace the synthetic surfactants currently used in some of their processes. Five pre-selected strains were molecularly identified, and one bacterial strain was selected to optimize the biosurfactants production and for its characterization.
Palabras clave: biosurfactantes, subproductos azucareros, microorganismos extremófilos, identificación molecular, caracterización química
Introducción
Los surfactantes son moléculas anfipáticas con acción tensioactiva que se utilizan principalmente en la industria farmacéutica, alimentaria, cosmética y de limpieza principalmente. Cuando dichas moléculas son producidas por microorganismos se denominan biosurfactantes. Estos tienen varias ventajas sobre sus contrapartes sintéticas: son biodegradables y no se acumulan en el ambiente, tienen bajo nivel de toxicidad y presentan propiedades físicas y químicas (capacidad emulsificante, tolerancia al pH, fuerza iónica, etc.) superiores [Liu et al., 2020]. Sin embargo, los altos costos de producción limitan su aplicación a gran escala. Una opción podría ser utilizar subproductos agroindustriales como sustratos económicos [Liu et al., 2020]. Hace algunos años, Ledesma brindó vinaza y licor negro, de donde se aislaron y seleccionaron cepas capaces de producir biosurfactantes. La vinaza y el licor negro son subproductos de la destilación del alcohol y el proceso de fabricación de papel, y representan opciones interesantes para ser aprovechadas como sustrato. El objetivo de este trabajo fue identificar microorganismos presentes en estos subproductos y obtener biosurfactantes utilizando vinaza en la composición del sustrato. Se pretende conocer las características y propiedades de los tensioactivos producidos, lo cual va de la mano con las aplicaciones potenciales. Esto permitiría disminuir el impacto que la vinaza genera en el medio ambiente y obtener un producto eco-amigable que traería también beneficios a esta industria, contribuyendo al balance de economía circular proyectado por la empresa.
Materiales y Métodos
Selección de los microorganismos productores de biosurfactantes
Previamente se obtuvieron 39 cepas (utilizando los subproductos para el aislamiento y crecimiento de las cepas): 19 de vinaza (y por sus características se clasificaron como acidófilas) y 20 de licor negro (alcalófilas). Se seleccionaron 5 de las 39 cepas con la mejor capacidad de disminuir la tensión superficial (TS). La medición de disminuir la TS en medios de cultivos en los que crecieron las cepas se realizó mediante la técnica de la gota colgante (ADSA). Se utilizó Goniómetro estándar con patrón de imagen DROP, [modelo 200-00, ramé-hart] y el software Opendrop.
Identificación molecular de las cepas seleccionadas
Se realizó la extracción de ADN de las cinco cepas previamente seleccionadas (Pospiech and Neumann, 1995). Los genes que codifican el ARNr 16S y 18S se amplificaron mediante PCR convencional, utilizando los cebadores universales. La PCR se realizó en un termociclador. El tamaño y la concentración de los productos de PCR se evaluaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Los productos de amplificación se enviaron a Macrogen (Seúl, Corea del Sur), donde se llevó a cabo su secuenciación. Las secuencias del gen del ARNr 16S y 18S se analizaron con el programa Chromas versión 2.6. Las secuencias de nucleótidos se analizaron mediante búsqueda BLAST (blastn) y se compararon con la base de datos GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) para su identificación parcial donde se cargaron.
Purificación y caracterización de las biomoléculas obtenidas
La precipitación de los biosurfactantes se realizó acidificando el sobrenadante a pH=2 con HCl (3N) a 4 °C, con lavados y centrifugación (10000 rpm a 4 °C por 15 minutos) (Smyth et al., 2010). Sobre este sólido se realizaron extracciones sucesivas con acetona y hexanos, utilizando un baño de ultrasonido. Luego se eliminó cada solvente por evaporación, obteniéndose un sólido conformado por biomoléculas. El sólido fue en CHCl3-MeOH, el cual se depositó sobre 10 mg de sílica gel 60 (230-400 mesh), la cual fue sembrada en una columna cromatográfica flash en fase normal (sílica-gel 60, 230-400 mesh). Para la elusión, se utilizaron, en orden creciente de polaridad, hexanos, diclorometano, metanol y sus mezclas. Se evaluaron las fracciones colectadas de aproximadamente 3 ml cada una, en cromatoplacas (TLC) de sílice, y posteriormente reveladas por su interacción con radiación UV, óleum y cinamaldehído. Posteriormente, se evaluó la capacidad de las fracciones obtenidas por su capacidad de reducir la TS en un goniómetro.
Optimización de laproducción de biosurfactantes 
En experimentos previos se probaron diferentes concentraciones de vinaza, rangos de pH, caldo nutritivo (CN), aceite y relación carbono nitrógeno (C/N). Se fijó la composición del medio de producción en 0,6 g/l de extracto de levadura; 0,5 g/l de NH4NO3; 0,4 g/l de NaCl; 1% de Vinaza (v/v); 2,5 g/l de aceite de oliva g/l; relación C/N =15. Se realizó un diseño factorial Box-Behnken de 3 factores y 3 niveles para evaluar la influencia de las variables T (30, 35 y 40 °C), pH (4, 4,5 y 5) y CN (0, 2 y 4 g/l) y sus combinaciones en la variación de: densidad óptica (DO) la cual indicó el crecimiento microbiano a 600 nm; disminución de la TS del sobrenadante (ΔTS) y disminución de TS del extracto con fosfato buffer salino PBS (ΔTS-PBS) mediante la técnica ADSA. Para ello se inocularon Erlenmeyers de 100 ml con 20 ml de medio de cultivo con un pre-inóculo de la cepa Lactobacillus paracasei a1 crecida en CN ajustando la DO a 0,2. Los Elermeyers se incubaron con agitación orbital a 200 rpm durante 2 días y dependiendo del Erlemeyer a 30, 35 o 40 °C. Los cultivos se centrifugaron a 10000 rpm durante 10 minutos a 20 °C, separando el medio de producción de las células. La parte del biosurfactante pegado a las células se recuperó con un lavado en PBS el cual se realizó incubando las células en un tercio del volumen inicial a 200 rpm y durante 2 horas a 37 °C. Se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) con intervalos de confianza del 95% para determinar la importancia de los efectos. La determinación de los coeficientes de regresión y la construcción de gráficos se realizaron con la ayuda del programa Design Expert versión 11.0.
Resultados y Discusión
Se identificaron molecularmente 5 de cepas: cuatro de ellas como bacterianas (a1, a5, b1 y b2) y una de levadura (a6). Dos de las cepas alcalófilas, b1 y b2, presentaron una alta homología con Bacillus safensis (99,97%) y Alkalihalobacillus halodurans (99,66%), respectivamente. La cepa a5 mostró una alta homología (99,60%) con Lactobacillus rhamnosus y la a1 con Lactobacillus paracasei (99,30%). Por último, el aislado a6 se identificó como Pichia sp. estrechamente relacionado con Pichia cecembensis. Se seleccionó la cepa Lactobacillus sp. a1, ya que presenta la ventaja de ser un organismo seguro (GRAS). Esta clasificación permite que tanto su uso como el de las sustancias producidas por ella, sean clasificadas como seguras por agencias regulatorias federales. Esta característica representa una ventaja respecto a otras cepas ya que presenta un mayor potencial de aplicación de sus productos (en este caso de los biosurfactantes) por ejemplo para alimentación, farmacéutica, cosmética etc. [Kachrimanidou et al., 2022].
Los tres modelos realizados para las respuestas DO, ΔTS y ΔTS-PBS resultaron estadísticamente significativos (p < 0,05), con un coeficiente de correlación (R2) mayor a 0,87 para las 3 respuestas. 
Los ensayos realizados a 35°C son los que mostraron los valores óptimos para DO, ΔTS y ΔTS-PBS (Figura 1). El aumento de la concentración de CN y pH produjeron mayores valores de DO observándose el mayor crecimiento de la cepa en condiciones de 4 g/l de CN y a pH=5. (Figuras 1A y 1B). La disminución del CN en la formulación del medio de producción y un pH de 4,5, produjo una ΔTS mayor (Figuras 1C y 1D). Para el ΔTS-PBS se observaron dos situaciones con los mejores valores: por un lado, a pH levemente por debajo de 4,5 y con concentración de CN cercana a los 2 g/l y por otro, a pH entre 4,5 y 5 y sin CN (Figuras 1E y 1F). El medio de producción optimizado para la producción de biosurfactantes por parte de Lactobacillus sp. a1, puede prescindir del CN y debería ajustar su pH en aproximadamente 4,7. En cuanto a las condiciones de crecimiento, los cultivos deberían ser incubados a una temperatura de 35 °C. La cromatografía en columna ayudó a separar diferentes fracciones del extracto que luego de ser analizadas por TLC. Estas se agruparon a partir de la presencia de iguales señales en idénticas condiciones de elución. A dichas fracciones, se les determinó la masa (comprendidas entre 1 y 11 mg) y tras la dilución correspondiente, se realizó la medición de TS determinando cuáles de ellas contenían compuestos con características propias de biosurfactantes. A partir de los resultados obtenidos, se planea continuar con la purificación y la caracterización de los biosurfactantes sintetizados por la cepa Lactobacillus sp. A1. 
FIGURA 1 | Superficie de respuesta (A, C y E) y gráficas de contorno (B, D y F) óptimas en función del pH, concentración de Caldo nutritivo (CN) y Temperatura (T). Respuestas: Densidad óptica (DO) (A y B), Disminución de la tensión superficial del sobrenadante (ΔTS) (C y D) y Disminución de la tensión superficial del PBS (ΔTS-PBS) (E y F). Se realizaron 16 corridas experimentales por triplicado bajo las condiciones establecidas por Box-Behnken.
Conclusiones 
Se lograron identificar 5 cepas microbianas a partir de vinaza y licor negro con capacidad de disminuir la TS de los medios de cultivos. Se seleccionó la cepa Lactobacillus sp. a1 con alta homología con Lactobacillus paracasei, para continuar con su estudio. La precipitación y extracción de los biosurfactantes producidos por a1 permitió conocer las fracciones con capacidad de disminuir la TS las cuales serán posteriormente caracterizadas. La mayor producción de biosurfactantes para Lactobacillus sp. a1 se obtuvo en un medio de cultivo formulado a 35°C, un pH entre 4,5 y 5 y una relación de C/N =15.
Agradecimientos
Este trabajo fue realizado en el marco de un Proyecto Interdisciplinario en Temas Estratégicos (PIE-CIUNSa N°2692) bajo la dirección de la Dra. Irazusta, con la participación de docentes-investigadores y estudiantes tanto de grado como de postgrado de tres facultades diferentes. Carla V. Coronel, Augusto E. D´Ambrosio-Ornass y Agustina S. Viltes Sánchez, contaron con beca de grado PIE-CIUNSa. El Ing. Mariano Rivero cuenta con beca Doctoral de CONICET. 
REFERENCIAS 
1. V. Kachrimanidou, A. Papadaki, I. Lappa, S. Papastergiou, D. Kleisiari, N. Kopsahelis, “Biosurfactant Production from Lactobacilli: an Insight on the Interpretation of Prevailing Assessment Methods.” Appl Biochem Biotechnol, (2022), 194, 882–900. (paper)
2. K. Liu, Y. Sun, M. Cao, J. Wang, J.R. Lu, H Xu. “Rational design, properties, and applications of biosurfactants: a short review of recent advances.” Current Opinion in Colloid & Interface Science, (2020), 45, 57–67. (paper)
3. Pospiech, Neumann, B. “A versatile quick-prep of genomic DNA from gram-positive bacteria”. Trends in genetics : TIG, (1995), 11, 217–218.(paper)
4. T.J.P. Smyth, A. Perfumo, R. Marchant, I.M. Banat, “Isolation and Analysis of Low Molecular Weight Microbial Glycolipids”, in: Timmis, K.N. (Ed.), Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg, (2010), pp. 3705–3723.