Presentación biosurfactantes

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Becario: Augusto D`Ambrosio Ornass
Rita Victoria Wierna
Pablo Cuesta
Purificación y caracterización de biosurfactantes
Contenido
01
OBJETIVOS
Purificación y caracterización de las biomoléculas obtenidas
02
METODOLOGÍA
Centrifugación, Extracción, cromatografía TLC, Cromatografía en columna flash, Tensión Superficial
03
RESULTADOS
Tensión superficial, FTIR
04
CONCLUSIONES
Los microorganismos aislados y posteriormente estudiados, producen una gran cantidad de compuestos:
Introducción
Biosurfactantes: glicolípidos (ramnolípidos, soforolípidos, trehalolípidos, manosileritritolípidos, etc) lipopéptidos, fosfolípidos, ácidos grasos, lipopolisacáridos y compuestos del tipo proteínas.
Compuestos con actividad antimicrobiana: ácido láctico, peróxido de hidrógeno, bacteriocinas, etc..
 
Objetivos
Aislar, purificar y caracterizar los biosurfactantes producidos.
Cepa A1 : Lactobacillus paracasei
0.25 L cepa A1
Líquido sobrenadante
(Fracción 1)
Células
Experimental
Centrifugación
Extracción con PBS
Extracto PBS-bio
(Fracción 2)
Cepa A1 : Lactobacillus paracasei
Fracción 2
Precipitación ácida (4°C)
Experimental
Centrifugación refrigerada (4°C)
Lavados
Obtención sólido
Cepa A1 : Lactobacillus paracasei
La masa de precipitado a partir de la Fracción 1 no fue descartada, empleándola para realizar diferentes ensayos preliminares:
Solubilidad en múltiples solventes: hexanos, cloroformo, diclorometano, acetato de etilo, acetona y metanol, a fin de analizar los mejores solventes de extracción.
Experimental
Análisis cromatográficos del tipo TLC, tanto con solventes puros como con mezclas de solventes de diferentes polaridades.
Cepa A1 : Lactobacillus paracasei
Experimental
Fracción 2
10 mL solvente
Baño ultrasonido
Extracto Fracción 2
Evaporación del solvente
Extracciones sucesivas
MeOH / CH2Cl2 / Hexanos
Cepa A1 : Lactobacillus paracasei
Experimental
Redisolución en menor volumen posible de solvente
Cromatografía en columna flash (fase normal)
Deposición en 10 mg de Sílica-gel 60
Extracto Fracción 2
36 mg
Cepa A1 : Lactobacillus paracasei
Experimental
Se eluye con solventes y mezcla de solventes de polaridad creciente
Cromatografía en columna flash (fase normal)
Hexanos / CH2Cl2 / MeOH 
Cepa A1 : Lactobacillus paracasei
Experimental
Se eluye con solventes y mezcla de solventes de polaridad creciente
Cromatografía en columna flash (fase normal)
Se colectan múltiples fracciones ( 3mL)
Se evapora solvente a temperatura ambiente
Cepa A1 : Lactobacillus paracasei
Experimental
Se eluye con solventes y mezcla de solventes de polaridad creciente
Cada una de las fracciones es analizada por TLC
Radiación UV
señales presentes tras el revelado con óleum 	
Señales presentes tras el revelado con solución de anisaldehído 
Se reunen las fracciones con idénticas señales cromatográficas
Cepa A5 : Lactobacillus rhamnosus
Experimental
En virtud a la experiencia obtenida a partir de la cepa A1, se plantearon mejoras en la producción y el análisis de biomoléculas a partir de la cepa A5
Mayor volumen de cultivo (1 L)
Se trabajo con fracción correspondiente a PBS-bio
Precipitación ácida, centrifugación refrigerada y lavados.
Extracciones sucesivas con mayor volumen de solvente (15 mL)
115 mg de extracto PBS-bio
Cepa A5 : Lactobacillus rhamnosus
Experimental
Se procede al armado de la pastilla del extracto y su sembrado en columna flash, tal como se planteó para el caso de la cepa A1
Se realiza la elución con un volumen de solvente mayor, agregando además mezclas de solventes en nuevas proporciones
115 mg de extracto PBS-bio
Se analizan las múltiples fracciones obtenidas por TLC, reuniéndose aquellas con idénticas señales cromatográficas
	Extractos A1		
	Fracción	IFT (mN/m)	ΔIFT (mN/m)
	2-6	72.72	0.08
	7-8	72.11	0.69
	9-13	72.81	-0.01
	14-21	49.88	22.92
	23-29	52.56	20.24
	30-37	52.05	20.75
	44-45	72.72	0.08
Resultados
	Extractos A5		
	Fracción	IFT (mN/m)	ΔIFT (mN/m)
	1-5	49.4	23.4
	6-9	69.7	3.1
	10-11	67.9	4.9
	12-13	66.6	6.2
	14-18	74.0	-1.2
	21-22	60.5	12.3
	23-27	66.9	5.9
	28-32	69.7	3.1
	33-35	64.0	8.8
	36-39	67.1	5.7
	40-43	65.2	7.6
	45-49	62.5	10.3
	r2	53.9	18.9
Resultados
Se realizaron ensayos preliminares para la obtención de espectros FTIR de los extractos purificados, con el fin de observar la presencia de grupos funcionales característicos. 
Se está analizando el envío de las muestras a otros centros de investigación que posean el equipamiento adecuado para el estudio de los diferentes extractos.
Conclusiones
Se pudieron aislar compuestos con capacidad de modificar la tensión superficial, determinándose que la producción de los mismos es más efectiva sobre la pared celular de los microorganismos. 
Se los pudo purificar por medio de una cromatografía en columna flash.
Se mejoró cuantitativamente la producción de los compuestos.
Es necesario aplicar técnicas de análisis adecuadas para la elucidación estructural de los biosurfactantes presentes.