Método de secuenciación de Sanger

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Método de secuenciación de Sanger
Nociones básicas sobre el ADN
El genoma es el conjunto de genes de un organismo o especie. Estos se encuentran codificados en el ácido desoxirribonucleico (ADN), que está formado por cuatro tipos de subunidades, llamadas bases nitrogenadas. Las bases nitrogenadas del ADN son la adenina, timina, citosina y guanina. Cada secuencia de ADN que codifica una proteína se denomina gen. 
El ADN es una doble cadena en forma de hélice, a cada lado de la cadena hay dos bases nitrogenadas complementarias: la adenina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. Por lo tanto, si sabemos que en un punto de una de las dos cadenas hay una citosina, sabemos que en ese mismo punto de la cadena complementaria hay una guanina. Esto es importante para entender el método de secuenciación desarrollado por Sanger.
El método de Sanger
Frederick Sanger fue un bioquímico británico, que recibió el premio Nobel de química en 1958 por sus investigaciones sobre la estructura de las proteínas, y en 1980 recibió un segundo Nobel en química por el desarrollo de la primera técnica de secuenciación de ADN. Sus hallazgos sobre la secuenciación del ADN fueron publicados en 1975 y supusieron el inicio de numerosas investigaciones genéticas.
Secuenciación de Sanger
El método de secuenciación de Sanger partía de una única hebra de ADN, que habría sido separada previamente de su hebra complementaria. El proceso de síntesis de ADN es realizado por la enzima polimerasa (de la cual hablamos en este artículo sobre los test PCR), que es añadida a la hebra de ADN que se quiera secuenciar. La polimerasa, en presencia de una hebra de ADN, una secuencia a partir de la cual inicial la síntesis (llamada “cebador”) y bases nitrogenadas, es capaz de sintetizar la hebra complementaria de ADN.
Cómo obtener la secuencia de la hebra de ADN que se está sintetizando
Deteniendo la síntesis de ADN de forma que conozcamos cuál es el último nucleótido que ha sido añadido a la cadena, y poniendo las numerosas cadenas incompletas de diferente longitud en orden.
Para ello se realiza la síntesis de ADN en cuatro reacciones separadas. A cada una de ellas se añaden los cuatro nucleótidos, y un didesoxinucleótido (adenina, timina, citosina o guanina). Los didesoxinucleótidos carecen de una molécula que es necesaria para que la síntesis de ADN pueda continuar, de forma que cuando uno es añadido a la cadena, la síntesis se detiene y la hebra queda incompleta.
Los geles de acrilamida permiten ordenar moléculas por tamaño o peso molecular. Las diferentes moléculas aparecen ordenadas en el gel formando bandas (en esta imagen se pueden apreciar dos bandas, en la parte superior derecha). El resultado del método de secuenciación de Sanger serían marcas ordenadas en el gel, que indicarían el último nucleótido añadido a la secuencia.
En cada una de las cuatro reacciones se añade una concentración del didesoxinucleótido 100 veces inferior a la del nucleótido correspondiente. Esto facilita que se produzcan secuencias de la cadena de ADN de diferente longitud, pero sin forzar a que la hebra sea demasiado corta como para que la secuenciación se vuelva un proceso demasiado tedioso.
Una vez la reacción ha terminado, las cuatro muestras son colocadas en un gel de acrilamida, que mediante la aplicación de electricidad es capaz de separar moléculas de diferente tamaño (electroforesis). Esto permite ordenar las hebras incompletas de ADN por longitud y conocer la secuencia de nucleótidos. Se trataría, eso sí, de la secuencia complementaria a la hebra que se usó como molde para la síntesis de ADN.