diagnostico de laboratorio de enfermedades viridicas

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Diagnóstico de laboratorio de las enfermedades víricas (cap
39 micro)
microbiologia general (Universidad Nacional de Entre Ríos)
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Diagnóstico de laboratorio de las enfermedades víricas (cap
39 micro)
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Diagnóstico de laboratorio de las enfermedades víricas (cap 39 micro)
Las pruebas víricas de laboratorio pretenden: 
1) confirmar el diagnóstico identificando el agente vírico de la infección
2) seleccionar un tratamiento antiviral adecuado, 
3) comprobar el cumplimiento de la toma de los fármacos antivirales por parte del paciente 
4) definir la evolución de la enfermedad,
5) hacer un seguimiento epidemiológico de la enfermedad
6) educar a médicos y pacientes.
Los métodos de laboratorio permiten llevar a cabo las siguientes tareas:
1. Descripción de los efectos citopatológicos (ECP) inducidos por el virus en las células.
2. Detección de partículas víricas.
3. Aislamiento y crecimiento del virus.
4. Detección y análisis de componentes víricos (p. ej., proteínas (antígenos), enzimas, genomas).
5. Evaluación de la respuesta inmunitaria del paciente frente al virus (serología).
Los virus, los antígenos víricos, los genomas víricos y los ECP se pueden detectar mediante el estudio directo
de muestras clínicas y, en algunos virus, mediante la proliferación del virus en células de cultivos tisulares en
el laboratorio.
Obtención de muestras
La sintomatología del paciente y sus antecedentes de viajes, la estación del año y el diagnóstico de sospecha
ayudan a determinar las técnicas adecuadas para identificar a un agente vírico.La elección de la muestra
adecuada para el estudio acostumbra a ser complicada debido a que diversos virus son capaces de producir
un mismo cuadro clínico. Por ejemplo, la aparición de síntomas de meningitis durante el verano sugiere un
arbovirus, en cuyo caso se debería recoger una muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR) y sangre, o un
enterovirus, en cuyo caso se deberán tomar muestras de LCR, torundas de garganta y muestras de heces
para el análisis del genoma y el posible aislamiento del virus.
Una encefalitis focal con localización en el lóbulo temporal precedida de cefaleas y desorientación es
indicativa de una infección por el virus del herpes simple (VHS), para lo cual el LCR puede analizarse
relativamente rápido para determinar la presencia de secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) vírico
por medio de amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Las muestras se deben obtener en una etapa precoz de la fase aguda de la infección, antes de que deje de
difundirse el virus.
los virus respiratorios solamente se pueden diseminar durante un período comprendido entre 3 y 7 días, y
su diseminación puede interrumpirse con anterioridad a la desaparición de los síntomas
El VHS y el virus de la varicela- zóster (VVZ) no se pueden obtener de las lesiones transcurridos más de 5
días desde la aparición de la sintomatología.
Tan sólo es posible aislar un enterovirus del LCR 2-3 días después de la aparición de las manifestaciones
del sistema nervioso central. Además, el anticuerpo producido como respuesta a la infección puede impedir la
detección del virus. Cuanto menor sea el intervalo transcurrido entre la obtención de la muestra y su remisión
al laboratorio, mayor será la posibilidad de aislar un virus. Los motivos son que muchos virus son lábiles y que
las muestras son susceptibles de contaminación bacteriana o fúngica. 
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Citología
Muchos virus producen unos ECP característicos. Entre los ECP
característicos en las muestras tisulares o los cultivos celulares
figuran modificaciones de la morfología celular, lisis celular,
formación de vacuolas, sincitios y cuerpos de inclusion. 
Los sincitios son células gigantes multinucleadas formadas como
consecuencia de la fusión vírica de células individuales. Los
paramixovirus, el VHS, el VVZ y el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH) estimulan la formación de sincitios.
Los cuerpos de inclusión constituyen cambios histológicos de las
células provocados por componentes víricos o bien alteraciones de
las estructuras celulares inducidas por los virus. Por ejemplo, los cuerpos de inclusión basófilos nucleares (en
ojo de búho) presentes en las células de tejidos infectados por citomegalovirus (CMV) o en el sedimento de la
orina de pacientes con una infección se identifican con facilidad. Las inclusiones nucleares de Cowdry de tipo
A en las células o en los grandes sincitios (múltiples células fundidas) son un hallazgo característico en las
células infectadas por VHS o VVZ.
La rabia se puede diagnosticar cuando se encuentran cuerpos de Negri
citoplasmáticos (inclusiones del virus de la rabia) en los tejidos cerebrales.
Microscopia electrónica
La microscopia electrónica no es una técnica de laboratorio estándar en la
clínica, si bien se puede utilizar para detectar e identificar algunos virus cuando
existe un número suficiente de partículas víricas. La adición de un anticuerpo
específico del virus a una muestra puede hacer que las partículas víricas se
agrupen, facilitando así la detección e identificación simultáneas del virus
(inmunomicroscopia electrónica). Los virus entéricos, como los rotavirus, que
se producen en abundancia y que tienen una morfología característica, pueden
detectarse en las heces mediante estos métodos. También se puede examinar
si un tejido adecuadamente procesado, procedente de una biopsia o una
muestra clínica, contiene estructuras víricas.
Aislamiento y cultivo del virus
Los virus pueden crecer en cultivos tisulares, huevos embrionados o animales de experimentación.
Formas de transmisión de los virus
-Personas
-Animales: vacas (p. ej., vacuna de la viruela de Jenner),
–pollos, ratones, ratas, ratones lactantes
-Huevosembrionados
-Cultivos de órganos
-Cultivos tisulares
-Primarios
-Líneas celulares diploides
-Líneas celulares tumorales o inmortalizadas
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Cultivo celular
Para cultivar virus se utilizan tipos específicos de células de cultivo tisular.
Los cultivos de células primarias se obtienen por tratamiento de algún órgano animal específico con tripsina
o colagenasa. Las células obtenidas con este método se cultivan en monocapa (fibroblastos o células
epiteliales) o en suspensión (linfocitos) en medios artificiales complementados con suero bovino u otra fuente
de factores de crecimiento. Las células primarias se pueden separar con tripsina, se diluyen y crecen en
nuevas monocapas (subcultivos) para convertirse en cultivos celulares secundarios. Las líneas de células
diploides son cultivos de un único tipo de célula con los que se puede hacer un gran número de pases,
aunque finito, antes de presentar signos de senescencia o experimentar cambios significativos en sus
características. Las líneas celulares tumorales y las líneas celulares inmortalizadas, generalmente iniciadas a
partir de tumores humanos o animales o tras el tratamiento de células primarias con productos químicos o
virus oncogénicos, se componen de células de un solo tipo que pueden ser sometidas a pases continuos sin
envejecer.
Las células primarias de riñón de mono son muy adecuadas para llevar a cabo el aislamiento del virus de la
gripe, paramixovirus, muchos enterovirus y algunos adenovirus. Las células diploides fetales humanas, que
generalmente son fibroblastos, permiten el crecimiento de un amplio abanico de virus (p. ej., VHS, VVZ, CMV,
adenovirus, picornavirus). Las células HeLa, una línea continua de células epiteliales derivada de un cáncer
humano, son excelentes para aislar el virus respiratorio sincitial, los adenovirus y el VHS. Muchos virus con
importancia clínica se pueden aislar, al menos, con alguno de estos cultivos celulares.
Detección vírica
Un virus se puede detectar e identificar inicialmente mediante la observación de los ECP que producen en la
monocapa celularbien mediante técnicas de inmunofluorescencia o de análisis genómico del cultivo celular
infectado.
Por ejemplo, un único virus infecta, se disemina y destruye las células circundantes (placa). Algunos virus
crecen lentamente, no lo hacen en absoluto o bien no provocan ningún ECP en las líneas celulares que
habitualmente se utilizan en los laboratorios de virología clínica. El diagnóstico de la infección por estos virus
casi siempre se basa en los resultados de las pruebas serológicas o en la detección de genomas o proteínas
víricos.
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Las propiedades víricas características también se pueden utilizar para identificar virus que no tienen ningún
ECP característico. Por ejemplo, el virus de la rubéola no causa ningún ECP, pero impide (interfiere) la
replicación de los picornavirus en un proceso conocido como interferencia heteróloga, fenómeno que se
puede utilizar para identificarlo.
Las células infectadas por el virus de la gripe, virus parainfluenza, virus de la parotiditis y togavirus expresan
una glucoproteína vírica (hemaglutinina) que aglutina los eritrocitos de determinadas especies animales en la
superficie de la célula infectada ( hemadsorción).
Cuando estos virus se liberan en el medio de cultivo celular, se pueden detectar gracias a la aglutinación de
los eritrocitos, un proceso denominado hemaglutinación. La cepa de virus se puede identificar por medio de
anticuerpos específicos que bloquean la hemaglutinación, un proceso denominado inhibición de la
hemaglutinación (IH).
Los virus se pueden cuantificar mediante la determinación de la dilución mayor que conserva las siguientes
propiedades (título):
1. Dosis de cultivo tisular (DCT50): título de virus que provoca efectos citopatológicos en la mitad de las
células de cultivo celular.
2. Dosis letal (DL50): título de virus que destruye el 50% de un conjunto de animales incluidos en la prueba.
3. Dosis infecciosa (DI50): título de virus que provoca un síntoma identificable, la formación de anticuerpos
u otra respuesta en el 50% de un conjunto de animales participantes en la prueba.
Interpretación de los resultados de los cultivos
La detección de cualquier virus en los tejidos, el LCR, la sangre o el líquido vesicular del organismo
hospedador se puede considerar un hallazgo altamente significativo. Sin embargo, la diseminación vírica
puede tener lugar sin que guarde relación con los síntomas de la enfermedad. algunos virus pueden
eliminarse de forma intermitente sin provocar síntomas en la persona afectada, durante períodos que oscilan
desde unas semanas (enterovirus en las heces) hasta muchos meses o años (VHS o CMV en la bucofaringe
y la vagina; adenovirus en la bucofaringe y en el tubo digestivo). Por otra parte, un resultado negativo puede
que no sea concluyente, ya que la muestra puede haber sido manipulada incorrectamente, puede contener
anticuerpos neutralizantes o puede haberse obtenido con anterioridad al comienzo de la diseminación de las
partículas víricas.
Detección de proteínas víricas
Durante la replicación vírica se sintetizan enzimas y otras proteínas
que se pueden detectar a través de métodos bioquímicos,
inmunológicos y de biología molecular.Las proteínas víricas se
pueden separar por electroforesis, y se pueden usar sus
configuraciones específicas para identificar y distinguir los distintos
virus. Por ejemplo, las proteínas de una célula infectada por el VHS
separadas mediante electroforesis y las proteínas del virión
presentan patrones diferentes en los distintos tipos y cepas del
VHS-1 y el VHS-2.
La detección y el análisis de las enzimas características o sus
actividades permiten identificar y cuantificar virus específicos. Por
ejemplo, la presencia de transcriptasa inversa en el suero o el
cultivo celular indica la presencia de un retrovirus o un
hepadnavirus.
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Los anticuerpos se pueden utilizar como instrumentos sensibles y específicos para detectar, identificar y
cuantificar virus y antígenos víricos en muestras clínicas o cultivos celulares (inmunohistoquímica).
Los antígenos víricos de la superficie celular o el interior de la célula se pueden detectar mediante técnicas de
inmunofluorescencia y enzimoinmunoanálisis (EIA).
El virus o el antígeno desprendido de las células infectadas se pueden detectar mediante un análisis de
inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA) y aglutinación con látex (LA).
Detección de material genético vírico
La secuencia genética de un virus es una característica diferencial importante de la familia, el tipo y la cepa
del virus. Los patrones electroforéticos del ácido ribonucleico (ARN) (virus de la gripe, reovirus) o las
longitudes de los fragmentos de restricción resultantes de la digestión del ADN del genoma vírico por una
endonucleasa son semejantes a las huellas dactilares genéticas de estos virus.
Los nuevos métodos de detección de genomas víricos emplean sondas genéticas específicas de secuencias
y métodos de amplificación del ARN y el ADN semejantes a la técnica de PCR que hacen posible un análisis
más rápido y cuantitativo con un menor riesgo de infección por el patógeno vírico.
Las sondas de ADN con secuencias complementarias a regiones específicas del genoma vírico se pueden
utilizar como herramientas sensibles y específicaspara detectar un virus, igual que los anticuerpos. Estas
sondas son capaces de detectar el virus incluso en ausencia de replicación vírica. El análisis de las sondas de
ADN es especialmente útil para detectar virus de replicación lenta o no productivos, como el CMV y el
papilomavirus humano,o cuando no se puede detectar el antígeno vírico por medio de pruebas
inmunológicas.
Para muchos laboratorios, las técnicas de amplificación del genoma, como la PCR para genomas ADN y la
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para genomas ARN son el método de elección para la detección e
identificación de los virus.Esta técnica es especialmente útil para detectar secuencias latentes e integradas de
virus, como retrovirus, herpesvirus, papilomavirus y otros papovavirus, así como las secuencias de virus
presentes a bajas concentraciones y los virus cuyo aislamiento resulta complejo o peligroso a partir de
cultivos celulares.
La cuantificación de la cantidad de genoma en un paciente (carga vírica) se puede determinar a través de la
PCR en tiempo real. Por ejemplo, la concentración de genoma vírico (genoma ARN que se convierten en
ADN) es proporcional a la tasa inicial de amplificación por PCR del ADN genómico. Esta prueba es
especialmente importante para controlar la evolución de la infección por VIH.
Serología vírica
La respuesta inmunitaria humoral contiene los antecedentes de cuadros infecciosos del paciente. Se utilizan
estudios serológicos para identificar los virus difíciles de aislar y cultivar en cultivos celulares, así como para
aquellos virus que provocan enfermedades de larga duración. Las pruebas serológicas se pueden utilizar para
identificar un virus y su cepa o serotipo con el fin de determinar si se trata de una enfermedad aguda o
crónica y definir si la infección es de tipo primario o bien constituye una reinfección.
La detección de anticuerpos de tipo inmunoglobulina M (IgM) específicos del virus, que aparecen durante
las primeras 2 o 3 semanas de una infección primaria, generalmente indica una infección primaria reciente. La
seroconversión está indicada por al menos un incremento del cuádruple en el título de anticuerpos entre el
suero obtenido durante la fase aguda de la enfermedad y el obtenido por lo menos 2 o 3 semanas después
durante la fase de convalecencia. La reinfección o la posterior recurrencia a lo largo de la vida provocan una
respuesta anamnésica (secundaria o de recuerdo). Los títulos de anticuerpos pueden mantenerse altos en
pacientes que padecen recurrencias frecuentes de una enfermedad (p. ej., virus herpes).
Debido a la imprecisión inherente de los análisis serológicos basados en diluciones seriadas al doble, se
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necesita un aumento hasta el cuádruple del título de anticuerpos entre el suero agudo y el convaleciente para
indicar seroconversión. Por ejemplo, las muestras con 512 unidades y 1.023 unidades de anticuerpos
generarían una señal en una dilución de 1:512, pero no en una de 1:1.024, y en ambas el título se
consideraría 512. Por otro lado, las muestras con 1.020 y 1.030 unidades no son significativamente
diferentes, pero se identificarían como títulos de 512 y 1.024, respectivamente.
El curso crónico de la infección también puede determinarse a partir de un perfil serológico. Concretamente,
la presencia de anticuerpos frente a determinados antígenos víricos clave y sus títulos se pueden utilizar para
identificar la fase de la enfermedad provocada por determinados virus.
En general, los primeros anticuerpos que se detectan son los que van dirigidos contra los antígenos más
accesibles para el sistema inmunitario (p. ej., expresados en el virión o en las superficies de las células
infectadas). En una fase más avanzada de la infección, cuando las células han sido lisadas por el virus
infectante o por la respuesta inmunitaria celular, se detectan los anticuerpos frente a las proteínas y enzimas
víricas intracelulares.
Métodos de análisis serológicos
Los análisis de neutralización e IH estudian los anticuerpos
basándose en el reconocimiento y la unión a los virus. Los
anticuerpos que recubren el virus inhiben su unión a las
células indicadoras. La neutralización del virus por los
anticuerpos inhibe la infección y los efectos citopatológicos
en las células del cultivo tisular. 
Los anticuerpos del suero impiden que una cantidad
estandarizada de virus se una a los eritrocitos y los
aglutine.
El análisis de fluorescencia indirecta de anticuerpos y los
inmunoanálisis en fase sólida como la aglutinación con
látex y la técnica ELISA se utilizan habitualmente para
detectar y cuantificar el antígeno vírico y el anticuerpo
antivírico. La prueba de ELISA se utiliza para cribar las
donaciones de sangre con el fin de excluir a las personas
seropositivas para los virus de la hepatitis B, la hepatitis C
y el VIH. El Western blot es muy importante para confirmar
la seroconversión y, por tanto, la infección por VIH. La
capacidad de los anticuerpos del paciente de identificar
ciertas proteínas víricas separadas mediante electroforesis, transferidas (depositadas) a un papel de filtro (p.
ej., nitrocelulosa, nailon) y visualizadas por medio de un anticuerpo antihumano conjugado con una enzima
confirma el diagnóstico de la infección por VIH indicada por la prueba de ELISA.
Figura 47-6 Análisis de neutralización, hemaglutinación e inhibición de
la hemaglutinación. En el análisis presentado se incubaron diluciones 1/10
de suero con el virus. A continuación, se añadieron cantidades iguales de
la mezcla a cultivos celulares o eritrocitos. En ausencia del anticuerpo, el
virus infectó el cultivo monocapa (indicado por el efecto citopatológico
[ECP]) o provocó la hemaglutinación (es decir, formó una suspensión
de eritrocitos similar a un gel). En presencia del anticuerpo, se bloqueó la
infección, evitando el ECP (neutralización) o se inhibió la hemaglutinación,
permitiendo que los eritrocitos formaran grumos. El título del anticuerpo
en el suero era de 100. ufp, unidades formadoras de placa.
Limitaciones de los métodos serológicos
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La presencia de un anticuerpo antivírico indica una infección previa, pero no basta para indicar cuándo se
produjo la misma. El hallazgo de la IgM específica del virus, el incremento del título de anticuerpos al
cuádruple entre el suero de la fase aguda y de la fase convaleciente o los perfiles de anticuerpos específicos
son indicativos de infección reciente. Asimismo, en los análisis se producen resultados falsos positivos o
falsos negativos que también pueden confundir el diagnóstico. Por otra parte, los anticuerpos del paciente
pueden estar unidos al antígeno vírico (tal como sucede en los pacientes con hepatitis B) formando
inmunocomplejos que impiden la detección del anticuerpo. Las reacciones serológicas cruzadas entre los
distintos virus también pueden generar confusión con respecto a la identidad del agente infectante (p. ej., los
virus parainfluenza y de la parotiditis expresan antígenos similares). A la inversa, el anticuerpo utilizado en el
análisis puede ser excesivamente específico (como sucede en el caso de un gran número de anticuerpos
monoclonales) y es posible que no reconozca cepas de virus de la misma familia y dé lugar a un resultado
falso negativo (p. ej., rinovirus).
 
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