Evaluación de la producción de flavonoides a partir de orégano (origanum vulgare) mediante la técnica de suspensiones celulares

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EVALUACIÓN DE LA PRODUCCION FLAVONOIDES A PARTIR DE ORÉGANO 
(Origanum vulgare) MEDIANTE LA TÉCNICA DE SUSPENSIONES CELULARES. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
YULIETH ALEJANDRA MANTILLA ARIAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DE SANTANDER 
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES 
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL 
BUCARAMANGA 
2018 
ii 
 
 
 
EVALUACION DE LA PRODUCCIÓN DE FLAVONOIDES A PARTIR DE ORÉGANO 
(Origanum vulgare) MEDIANTE LA TÉCNICA DE SUSPENSIONES CELULARES. 
 
 
 
 
YULIETH ALEJANDRA MANTILLA ARIAS 
 
 
TRABAJO DE GRADO 
Presentado como requisito Para optar al título de 
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL 
 
 
 
 
Director 
CHRISTIAN ANDREI CHACIN ZAMBRANO 
Ing. MSc en Biotecnología Microbiana 
 
 
 
UNIVERSIDAD DE SANTANDER 
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES 
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL 
BUCARAMANGA 
2018
iii 
 
 
 
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AGRADECIMIENTOS 
 
Quisiera agradecer a Dios, a mi familia por estar siempre a mi lado impulsándome y apoyándome 
a alcanzar estos logros. A mis padres, que más que una inspiración, se han convertido en mis 
asesores académicos y personales brindándome en todo momento lo necesario para convertirme en 
un gran ser humano. 
 
Agradezco a mi tutor Christian Andrei Chacín Zambrano por brindarme el apoyo y la confianza de 
desarrollar mi tesis profesional el espacio e impulso para llevar a cabo cada una de mis ideas y 
vivir en un ambiente idóneo la experiencia de la investigación. 
Gracias María Cañas por su acompañamiento y ayuda en todo el proceso con sus conocimientos, 
al profesor Fernando Acebedo por su apoyo y motivación, a Jesús Cano por su respaldo y paciencia 
y a la Universidad de Santander – Sede Bucaramanga. 
Al SENA Tecnoparque nodo Bucaramanga por su apoyo académico y técnico durante la ejecución 
de este trabajo. 
 
 
 
 
 
 
 
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DEDICATORIA 
 
A mis padres a quienes agradezco todas sus enseñanzas, y apoyo en mis decisiones sin ellos no 
habría llegado a ser la persona que soy hoy, a mis hermanos por acompañarme y alegrarme la vida 
a Dios por la sabiduría y la paciencia para continuar trabajando con esfuerzo alcanzando triunfos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
vi 
 
 
 
Contenido 
1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 1 
2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................................. 4 
3 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ....................................................................................... 7 
4 JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................................... 8 
5 MARCO TEÓRICO ................................................................................................................ 10 
5.1 Cultivo in vitro ............................................................................................................................. 10 
5.2 Cultivo en suspensión .................................................................................................................. 11 
5.3 Metabolitos primarios y secundarios en plantas ........................................................................ 13 
5.4 Fenoles ........................................................................................................................................ 15 
5.5 Flavonoides .................................................................................................................................. 16 
5.6 Origanum vulgare ........................................................................................................................ 17 
5.7 Diseño de Biorreactor Airlift para cultivo de células vegetales .................................................. 18 
6 MARCO REFERENCIAL ...................................................................................................... 20 
7 HIPÓTESIS ............................................................................................................................. 23 
NULA: ..................................................................................................................................................... 23 
ALTERNA: ................................................................................................................................................ 23 
8 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 24 
8.1 Objetivo General: ........................................................................................................................ 24 
8.2 Objetivos Específicos: .................................................................................................................. 24 
9 METODOLOGÍA ................................................................................................................... 25 
vii 
 
 
 
9.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN ............................................................................................................. 25 
9.2 Fases de investigación. ............................................................................................................... 25 
9.2.1 FASE I. Construcción del biorreactor ................................................................................. 25 
9.2.2 FASE II. Determinación de condiciones para la obtención de flavonoides de Origanum 
vulgare en biorreactor Airlift. ............................................................................................................. 25 
9.2.3 FASE III. Identificación preliminar de flavonoides por medio de métodos cualitativos. .. 28 
e. Determinación de fenoles y flavonoides totales ........................................................................ 30 
f. Condiciones de almacenamiento ................................................................................................ 30 
g. Análisis Estadístico ...................................................................................................................... 30 
10 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 31 
10.1 FASE I. Construcción del biorreactor .................................................................................. 31 
10.2 FASE II. Determinación de condiciones para la obtención de flavonoides de Origanum 
vulgare en biorreactor airlift. .................................................................................................................. 33 
10.3 Producción de biomasa por tratamiento en peso fresco ................................................... 34 
10.4 Incidencia de pH en la producción de flavonoides. ............................................................ 37 
10.5 Influencia de los grados Brix en la producción de flavonoides. .......................................... 40 
10.6 Influencia de azúcares reductores en la producción de flavonoides y crecimiento vegetal42 
10.7 Producción de flavonoides con diferentes concentraciones de oxígeno y temperatura. .. 44 
10.7.1 FASE III: Determinación de flavonoides totales en el extracto ......................................... 48 
a. Resultados del tamizaje químico ................................................................................................. 48 
11 CONCLUSIONES .............................................................................................................. 50 
12 RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 51 
viii 
 
 
 
13 ANEXOS ............................................................................................................................. 52 
13.1 Anexo 1. Análisis devarianza Fase II: producción de biomasa por tratamiento en Peso 
freso ............................................................................................................................................ 52 
13.2 Anexo 2. Análisis de varianza Fase II: influencia del de pH en la producción de flavonoides. .... 54 
flavonoides. 54 
13.3 Anexo 3. Análisis de varianza Fase II Brix en la producción de flavonoides y crecimiento 
vegetal ............................................................................................................................................ 55 
13.4 Anexo 4. Análisis de varianza Fase II: Curva de calibración de glucosa. .................................... 56 
13.5 Anexo 5. Análisis de varianza Fase II: Resultados estadísticos de azúcares reductores 
(DNS) ............................................................................................................................................ 57 
13.6 Anexo 6. Análisis de varianza Fase II: Curva de calibración catequina. ...................................... 58 
13.7 Anexo 7. Análisis de varianza Fase II: Producción de flavonoides.............................................. 59 
13.8 Anexo 8. Fase I: Diseño Biorreactor air-lift .................................................................................. 61 
14 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 63 
 
 
 
 
 
ix 
 
 
 
LISTA DE TABLAS 
Tabla 1 Temperatura y oxigenación estandarizados en los tratamientos para la producción de 
flavonoides a partir de Origanum vulgare. ................................................................................... 27 
Tabla 2 Pruebas colorimétricas para flavonoides. ......................................................................... 49 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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x 
 
 
 
 LISTA DE FIGURAS 
Figura 1 Prototipo del Biorreactor airlift para la producción de flavonoides. ............................. 32 
Figura 2. Producción de callos a partir de Origanum vulgare con una edad de dos meses en el 
laboratorio de tejidos vegetales, Universidad de Santander. ......................................................... 33 
Figura 3 Cinética de crecimiento de callo de Origanum vulgare en un periodo de 20 días A) proceso 
de crecimiento sin Oxígeno B) crecimiento con 0,1vvm de oxígeno C) crecimiento con 0,3vvm de 
oxígeno. ......................................................................................................................................... 34 
Figura 4 Resultados de pH del extracto de flavonoides obtenido a partir de Origanum vulgare en 
un periodo de 20 días A) pH sin Oxigeno B) pH con 0,1vvm de oxigeno C) pH con 0,3vvm de 
oxígeno. ......................................................................................................................................... 37 
Figura 5. Resultados de los Grados Brix del extracto de flavonoides obtenido a partir de Origanum 
vulgare en un periodo de 20 días A) Grados Brix sin Oxigeno B) Grados Brix con 0,1vvm de 
oxigeno C) Grados Brix con 0,3vvm de oxígeno. ......................................................................... 40 
Figura 6. Resultados de Azucares Reductores del extracto de flavonoides obtenido a partir de 
Origanum vulgare en un periodo de 20 días A) DNS sin Oxigeno B) DNS con 0,1vvm de oxigeno 
C) DNS con 0,3vvm de oxígeno. .................................................................................................. 42 
Figura 7. Producción de flavonoides obtenidos a partir de Origanum vulgare en un periodo de 20 
días A) Producción sin Oxigeno B) Producción con 0,1vvm de oxigeno C) Producción con 0,3vvm 
de oxígeno. .................................................................................................................................... 44 
Figura 8. Resultado positivo de la prueba de shinoda para el extracto obtenido mediante el proceso 
en biorreactor A) Extracto con la prueba de shinoda B) Patrón. ................................................... 48 
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xi 
 
 
 
 ANEXOS 
Anexo 1. Análisis de varianza Fase II: producción de biomasa por tratamiento en Peso freso .... 52 
Anexo 2. Análisis de varianza Fase II: influencia del de pH en la producción de flavonoides. ... 54 
Anexo 3. Análisis de varianza Fase II Brix en la producción de flavonoides y crecimiento vegetal
 .......................................................................................................................................................55 
Anexo 4. Análisis de varianza Fase II: Curva de calibración de glucosa. ................................... 56 
Anexo 5. Análisis de varianza Fase II: Resultados estadísticos de azúcares reductores (DNS) .. 57 
Anexo 6. Análisis de varianza Fase II: Curva de calibración catequina. ...................................... 58 
Anexo 7. Análisis de varianza Fase II: Producción de flavonoides. ............................................ 59 
Anexo 8. Fase I: Diseño Biorreactor air-lift .................................................................................. 61 
 
 
xii 
 
 
 
GLOSARIO 
 
Biorreactor: Es un sistema que mantiene un ambiente biológicamente activo, puede involucrar 
microorganismos, o sustancias bioquímicamente activas para generar diversos procesos 
biotecnológicos. 
Callos: Son agregados celulares a partir de células vegetales, siendo células somáticas no 
diferenciadas de un espécimen o plántula adulta. 
Cultivo de tejidos: cultivo de protoplastos, células, tejidos, órganos, embriones o semillas in vitro. 
Disgregación: Reducción de un fragmento vegetal, debido a la acción de agentes externos o 
componentes en el medio de cultivo. 
Micropropagación: Propagación vegetativa de plantas in vitro. 
Reguladores de crecimiento vegetal: son moléculas orgánicas que afectan en muy pequeña 
concentración, de manera profunda los procesos de la planta, tales como, el crecimiento, la 
organogénesis. 
Vitroplantas: son plantas que se obtienen mediante la propagación in vitro de micro plantas madre. 
 
 
 
 
xiii 
 
 
 
RESUMEN. 
 
Título: Evaluación de la producción de flavonoides a partir de orégano (Origanum vulgare) 
mediante la técnica de suspensiones celulares. 
Autor: Yulieth Alejandra Mantilla Arias 
Palabras clave: Cultivo in vitro, flavonoides, Origanum vulgare, Biorreactor 
Descripción. 
El cultivo de células y tejidos in vitro en suspensión se convierte en una alternativa para la 
síntesis y obtención de metabolitos secundarios de interés industrial a partir de las plantas, dentro 
de estos metabolitos podemos encontrar los flavonoides los cuales son moléculas antioxidantes, 
eliminadores de radicales libres, antiinflamatorios empleados en la industria farmacéutica como 
cosméticos y medicamentos. Diferentes estrategias in vitro han sido desarrolladas con el fin de 
aumentar el contenido de metabolitos secundarios como el uso de biorreactores. Los cuales, 
generan condiciones ideales para procesos de producción. 
El objetivo de esta investigación producir flavonoides a partir de Origanum Vulgare (Orégano) 
por medio de suspensiones celulares en biorreactor airlift., como resultado realizaron pruebas 
colorimétricas como el ensayo de Shinoda, Álcalis, entre otros con resultado positivo, mostrando 
la posible presencia de flavonas, calconas, flavonoles y flavonoides, además se obtuvo un máximo 
de producción de flavonoides de 22,587,280 g de catequina por ml de extracto a partir de callos 
de Origanum vulgare en un periodo de 10 días a 18 ℃. 
Se evidenció que el oxígeno es una variable importante incidencia el proceso, pues se obtiene 
una ganancia de 5 días para la producción de flavonoides y existen diferencias significativas (p< 
xiv 
 
 
 
0,05) con respecto a la ausencia de aireación en el sistema; y la temperatura, así como la variable 
tiempo, se convierte en inductores de crecimiento y producción de flavonoides. De esta manera las 
aplicaciones de nuevas técnicas biotecnológicas generan nuevas posibilidades de desarrollo 
sostenible y contribuyen con la preservación del medio ambiente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xv 
 
 
 
ABSTRACT 
 
Title: Evaluation of the production of flavonoids from oregano (Origanum vulgare) using the 
technique of cell suspensions. 
Author: Yulieth Alejandra Mantilla Arias 
Key words: In vitro culture, flavonoids, Origanum vulgare, bioreactor. 
Description. 
The cultivation of cells and tissues in vitro suspension becomes an alternative for the synthesis 
and production of secondary metabolites of industrial interest from plants, inside of these 
metabolites can be found flavonoids which are molecules antioxidants, eliminators radical free, 
anti-inflammatory drugs used in the pharmaceutical industry such as cosmetics and medicines. 
Vitro, different strategies have been developed in order to increase the content of secondary 
metabolites such as the use of bioreactors. Which create ideal conditions for production processes. 
This work aims to produce flavonoids from Origanum Vulgare (Oregano) by means of cell 
suspensions in bioreactor airlift., as result tested colorimetric as the trial of Shinoda, alkalis, among 
others with positive result, showing the possible presence of flavones and Flavonols and calconas, 
flavonoids, also obtained a maximum of production of 22,587,280 g of catechin flavonoids per ml 
of extract from callus of Origanum vulgare in a period of 10 days to 18 ℃. 
It was evident that oxygen is a significant variable impact the process, because you get a gain 
of 5 days for the production of flavonoids and there are significant differences (p < 0,05) with 
respect to the absence of ventilation system; and temperature, as well as the variable time, becomes 
ii 
 
 
 
inducers of growth and flavonoids production. In this way, applications of new biotechnological 
techniques generate new possibilities. 
1 
 
 
 
1 INTRODUCCIÓN 
 
Las plantas generan sustancias vitales para todos los ciclos por medio de la fotosíntesis, 
constituyendo procesos bioquímicos y moléculas como proteínas, carbohidratos, grasas, vitaminas, 
así mismo se convierten en la base de la cadena alimenticia que sobrelleva todas las formas de vida 
de nuestro planeta, además mantienen la atmosfera deficiente en dióxido de carbono y rica en 
oxigeno permitiéndonos respirar (Martinez M, 2005). Podemos encontrar miles de especies de 
plantas, así mismo, Colombia es uno de los países que cuenta con una gran diversidad de especies 
vegetales (Rangel, 2005) lo cual hace que su flora tenga una diversidad genética muy alta. (Gil 
Gonzales & Miladys Esther, 2014). Una de las zonas con alta diversidad de especies aromáticas 
presente es la cuenca media del cañón del río Chicamocha, el cual presenta un clima seco, con una 
temperatura media de 25.4 ºC y una precipitación de 731 mm/año; en ella se asienta un tipo de 
vegetación característica de estos enclaves xerofíticos interandino, por lo tanto existe un fuerte 
interés en estudiar la composición y propiedades bioquímicas de distintas especies aromáticas 
nativas de esta zona, además de sus usos potenciales, La flora de esta zona ha sido recientemente 
estudiada para la obtención de compuestos de interés en el área de la medicina y la biotecnología. 
(Días, puerto, & fernandez, 2011) 
 Partiendo de lo anterior, las especies aromáticas productoras de metabolitos secundarios de 
interés industrial se encuentran las del género labiadas que pertenece a la familia Lamiaceae, la 
cual agrupa especies medicinales, las cuales han sido utilizadas como fuente de nuevas moléculas 
para la síntesis de drogas quimiopreventivas y anti-cáncer (Chacon sanchez & Vega vela, 2011) 
2 
 
 
 
Uno de los géneros de interés industrial el cual es Origanum perteneciente a la 
familia Lamiaceae, llamado comúnmente como Orégano, es una planta aromática, 
perenne y ramificada (Camacho & Chacín, 2016), herbácea, vivaz muy aromática (Acevedo, 
Navarro, & Monroy, Composición Química del Aceite Esencial de Hojas de Oregano 
vulgare), 2013). 
Entre las plantas aromáticas de interés industrial y en vía de extinción se encuentra Origanum 
vulgare la cual se considera una especie de importancia económica con una gran distinción entre 
otras, el mayor interés a nivel industrial es en el área farmacéutica por la producción de 
metabolitos secundarios,los cuales se emplean en jabones, perfumes, cosméticos, saborizantes, 
medicamentos entre otros (Garcia Pérez et al, 2012) además, posee propiedades antibacteriales, 
antifúngicas, antiparasitarias, antimicrobianas y antioxidantes. (Garcia Pérez et al, 2012). 
 Al igual que muchas especies aromáticas, constituye un reto en laboratorio al preservar y 
mantener sus características fisiológicas metabólicas y genéticas sin variabilidad además 
presentan una alta cantidad de compuestos y metabolitos secundarios potencialmente 
importantes (Chacon sanchez & Vega vela, 2011).La composición y la cantidad de los 
metabolitos secundarios de estas plantas dependen de factores climáticos, la altitud, la época de 
cosecha, y su estado de crecimiento. Por lo tanto, el estudio de dichos factores y su influencia 
en su cultivo es importante para su mejor aprovechamiento y explotación, así mismo las células 
vegetales en suspensión se han convertido en productores de valiosos metabolitos secundarios 
de extracción a partir de plantas silvestres (Rojas Idrogo, Kato, Delgado Paredes, Segal Floh, & 
Handro, 2014). 
3 
 
 
 
Refiriéndonos a los componentes esenciales del orégano y la producción de metabolitos 
secundarios se han identificado los flavonoides como la apigenina y la luteolina, agliconas, 
alcoholes alifáticos, compuestos terpénicos y derivados del fenilpropano (Acevedo, Navarro, & 
Monroy, Composición Química del Aceite Esencial de Hojas de Oregano (Origanum vulgare), 
2013) que presentan una capacidad antioxidante observada en propiedades antialérgicas necesarias 
en cosméticos y fármacos con el fin de obtener metabolitos segundarios como flavonoides los 
cuales se pueden generar a partir del cultivo in-vitro de células vegetales en suspensión, en especial 
cuando las plantas son nativas y silvestres, variando las condiciones ambientales, factores externos 
controlando las condiciones del cultivo y alcanzando una mayor calidad y rendimiento en los 
procesos de conservación, micropropagacion y obtención de metabolitos secundarios. (Arias M. , 
Aguirre, Angarita, Montoya, & Restrepo, 2008) 
Es importante mencionar la ejecución de este trabajo en comparación con otras investigaciones 
sobre la implementación de las técnicas de suspensiones celulares como una de las herramientas 
de innovación a nivel in vitro, reducción de costos, y obtención en mayores cantidades de estos 
compuestos de interés de una manera biológica con la metodología propuesta como una alternativa 
de mejoramiento genético y aporte a nuevas investigaciones en la biotecnología vegetal. 
 
 
 
 
4 
 
 
 
2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
 
Los flavonoides son compuestos metabólicos presentes en plantas y alimentos con la 
de proteger al organismo del deterioro por rayos ultravioleta, agentes oxidantes sustancias 
químicas y polución ambiental (Martinez Flores, Gonzales Gallego, Culebras, & Tuñón, 
2002).Estas moléculas entregan sus electrones a radícales libres, finalizando la cadena de 
oxidación (Hess & Varas Pacheco, 2004) Así mismo, son empleados como compuestos de 
almacenamiento, mecanismos de defensa contra virus, hongos, bacterias, como sustancias 
alelopáticas, fitoalexinas o disuasorios nutritivos (Pérez Alonso & Jiménez, Producción de 
metabolitos secundarios de plantas mediante el cultivo in vitro, 2011). Este tipo de compuestos 
también pueden ser localizados de manera simultánea en las células fotosintéticas, cumpliendo 
un importante papel en la prevención de afecciones ocasionadas por radicales libres, resultantes 
de la exposición constante a radiación UV. (Martínez Garcia & Mosquera Manrtinez, 2014) 
Uno de los cultivos de interés industrial que posee un contenido importante de flavonoides 
es Origanum Vulgare (orégano), el cual presenta un gran potencial económico en la industria 
farmacéutica y cosmética principalmente por su capacidad antioxidante que contrarresta la 
formación de radicales libres, cuya influencia se revela en características antialérgicas, 
antivirales o vasodilatadores antimicrobianas, antiinflamatorias, antitumorales, estrogénicas, 
entre otras (Pérez Santiago, González Castillo, Alejandre iturbide, & González Güereca, 2011), 
teniendo demanda a nivel nacional como internacional por contribuir al desarrollo de nuevos 
compuestos con aplicaciones en la agronomía, medicina, (González, 2007). 
5 
 
 
 
Uno de los procesos de extracción de flavonoides es realizado por medio de métodos químicos, 
con solventes potencialmente explosivos y/o tóxicos (Martínez Garcia & Mosquera Manrtinez, 
2014) liberando compuestos que se evaporan rápidamente generando contaminación atmosférica, 
y riesgo para la salud por la inhalación, tienen una alta afinidad por las grasas, por ellos se acumulan 
fácilmente en tejidos del cuerpo humano, son altamente inflamables al contacto con el aire (Cevera 
Vidal, Beltran Arandes, & Hernández Hernández, 2015). A pesar del esfuerzo por obtener estos 
compuestos, existe una duración de largos periodos de tiempo generando gasto de energía y una de 
las mayores consecuencias como la producción de sustancias contaminantes con los suelos 
(Martínez Garcia & Mosquera Manrtinez, 2014), generando así, la formación de nuevas moléculas 
estables difícilmente degradadas por microorganismos o almacenadas por plantas. (Cevera Vidal, 
Beltran Arandes, & Hernández Hernández, 2015). Según un Estudio realizado en la Universidad 
Autónoma metropolitana de México (Lopez Naranjo, Moreno Aguilar, & Estrada Gonzales, 2007) 
determinó que los flavonoides de extractos por medio de electroforesis capilar entre estos se 
encuentra la extracción química, cromatografía liquida, cromatografía de capa fina, son métodos 
inadecuados al requerir grandes cantidades de reactivos, un largo tiempo de separación, además de 
tener una resolución limitada, baja sensibilidad y formación de compuestos contaminantes en el 
medio ambiente. 
6 
 
 
 
Sin embargo, Colombia con sus amplios recursos vegetales, carece de una activa 
participación en el mercado industrial con el gran potencial de los metabolitos que se podría 
obtener, debido a la falta de estrategias, proyectos, programas e incentivos, para el desarrollo de 
investigación en plantas condimentarías aromáticas y medicinales en nuestro país. ( Vega Vela 
& Chacón Sánchez, 2011) Por lo tanto, la falta de diseño y estandarización de procesos para 
producción de metabolitos de interés y la propagación genética de las especies aromáticas 
nativas de manera biológica limita el aprovechamiento de estos recursos con potencial de nuevas 
alternativas de producción de compuestos a nivel industrial en el área de la biotecnología 
vegetal. (Pérez Alonso & Jimenéz, Producción de metabolitos secundarios de plantas mediante 
el cultivo in vitro, 2011) 
Por consiguiente la obtención de metabolitos secundarios como los flavonoides a partir de 
Origanum vulgare no se ha implementado a nivel de Santander de manera biológica a su vez el 
laboratorio de tejidos vegetales de la UDES no cuenta con el diseño de un protocolo para la 
obtención de estos compuestos, delimitando la producción de una sustancia con un gran 
potencial industrial teniendo en cuenta el banco de germoplasma que dicho laboratorio posee 
actualmente, como una alternativa de conservación de especies en vía de extinción y el potencial 
que tiene la universidad con esta materia prima. 
 
 
 
7 
 
 
 
3 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 
 
¿Cuál es el efecto de la temperatura y la transferencia de oxígeno en la producción de 
flavonoides empleando la técnica de suspensiones celulares a partir de Origanum vulgare 
(Orégano)? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
 
 
 
4 JUSTIFICACIÓN 
 
En los últimos años se han hecho esfuerzos por generar sistemas de cultivo de células vegetales 
en suspensión lo cual se convierte en una herramienta biotecnológica que permite conocer diversos 
aspectosdel cultivo, como su comportamiento metabólico, fisiológico y bioquímico, así como 
controlar factores ambientales, abióticos (sequía, luz ultravioleta y temperaturas extremas) bióticos 
(interacción con patógenos) aprovechando las diferentes propiedades que estos metabolitos tienen 
y sus beneficios en la salud humana en la prevención de diversas enfermedades y control de las 
mismas con el fin de obtener un aumento considerable en el rendimiento de los metabolitos 
específicos como flavonoides (Pérez Alonso & Jimenez, Produccion de metabolitos secundarios 
de plantas mediante cultivo in vitro., 2011). Dada la importancia medicinal de Origaum vulgare se 
generó la necesidad de obtener un mayor conocimiento sobre los flavonoides como productos 
naturales o biopreparados generando generando posibles tratamientos para prevenir daños en la 
salud de la población, es por ello que se hace importante el desarrollo de este proyecto, con el fin 
de obtener flavonoides a partir de orégano (Origanum vulgare) mediante la técnica de suspensiones 
celulares, convirtiéndose esta investigación en uno de los pioneros a nivel de Santander al producir 
extracto crudo de flavonoides a partir de suspensiones celulares, sumado al hecho que la 
biodiversidad de Colombia es un recurso que de forma sostenible puede ser explotado 
benéficamente, teniendo en cuenta el mejoramiento de diversos procesos en futuras 
investigaciones. Así mismo, aportar nueva información para el laboratorio de tejidos vegetales e 
innovación en la producción de metabolitos secundarios, generando un protocolo estandarizado del 
proceso de producción una de las prácticas de innovación para la agricultura sostenible y 
9 
 
 
 
competitiva. También se contribuyó a la formación de recursos humanos en el área de cultivo in 
vitro de tejidos vegetales, incorporando nuevos conocimientos en el desarrollo de la técnica de 
micropropagación y a su vez la obtención del título de Microbióloga industrial 
10 
 
 
 
5 MARCO TEÓRICO 
 
5.1 Cultivo in vitro 
El cultivo in vitro es una de las aplicaciones biotecnológicas modernas el cual consiste en 
medios nutritivos artificiales y conjuntos de técnicas que permiten la propagación de cultivos 
diferentes plantas a partir de órganos, tejidos protoplastos o células en un ambiente estéril ( 
Navarro & Arias Zabala, 2008) en un medio de cultivo gelificado con condiciones ambientales 
controladas (Luz y temperatura). De esta manera, se induce a un proceso de adaptación al medio 
de cultivo seguido de la formación de brotes a partir de una planta madre, generando un proceso 
de multiplicación para obtener un óptimo crecimiento, a nivel exsitu se realiza una previa 
aclimatación y crecimiento donde finalmente serán para el consumo u obtención de compuestos 
interés industrial. (Estopá Bagot, 2005). 
El termino cultivo in vitro proviene de realizar la siembra de un cultivo a nivel de laboratorio 
en un recipiente de vidrio, actualmente se han venido implementando otros materiales como el 
propileno teniendo como factor común el crecimiento de una especie vegetal. (Estopá Bagot, 
Así mismo, el número de plantas que se puede obtener por medio del cultivo in vitro es 
prácticamente ilimitado y puede estar libre de virus y viroides. (Dominguez Rosales, y otros, 
 
 
 
11 
 
 
 
5.2 Cultivo en suspensión 
Existe gran diversidad de sustancias producto de las plantas con gran potencial industrial, y 
numerosas técnicas que permiten la producción de metabolitos secundarios de una manera más 
rápida, y amigable con el ambiente, para aprovechar esto surgen nuevos procesos de manipulación 
manipulación vegetal a nivel in vitro. Uno de ellos es la técnica de suspensiones celulares, las 
cuales permiten el crecimiento de células, protoplastos u órganos en condiciones asépticas de 
diversas especies de plantas utilizando medios de cultivos artificiales, (Arias Zabala & Perez 
Navarro, 2008) las cuales generalmente se inician mediante la incubación de trozos de callos 
friables en medios líquidos que se encuentran en movimiento continuo (Szabados, L; Mroginski, 
L.A; Roca, W;, 1991) por consiguiente, facilita la transferencia de nutrientes y oxigeno hacia el 
citoplasma, este tipo de cultivo permite el control de variables como pH, oxígeno disuelto dando 
mayor ventaja al proceso. (Arias M. , Aguirre, Angarita , Montoya , & Restrepo, 2009) Por otra 
parte, para seleccionar el material celular se efectúa en un medio solido mediante el plaqueo de 
suspensión para seleccionar la materia prima de mejor crecimiento celular para el proceso. 
(Szabados, L; Mroginski, L.A; Roca, W;, 1991). 
12 
 
 
 
Para obtener grandes poblaciones de células aglomeradas en callos se requiere llevar los 
tejidos a un estado de desdifereciación, alterando artificialmente su balance endógeno, de esta 
manera se genera un desequilibrio en la regulación del crecimiento, en este estado se genera el 
fenómeno denominado variación somaclonal, lo cual es una variación fenotípica desarrollada 
en los cultivos de plantas a nivel in vitro. Por lo tanto, esta técnica de suspensiones celulares se 
convierte en una de las metodologías para generar variabilidad genética, (Ruiz cerda, 1998) 
obtención de plantas libres de patógenos, conservación en germoplasma, propagación masiva, 
producción de metabolitos primarios y secundarios, mejoramiento genético siendo considerado 
una importante alternativa en la biotecnología vegetal (Arias Zabala & Perez Navarro, 2008) 
aplicada principalmente a plantas medicinales, las cuales tienen la ventaja de producir 
compuestos bajo condiciones controladas, puesto que la multiplicación celular es rápida, fácil y 
de allí, nace la producción de metabolitos secundarios específicos. (Delgado Paredes, Kato, 
Rojas Idrogo, & , 2013) 
 
 
13 
 
 
 
Las células vegetales en suspensión pueden caracterizarse por generar formación de agregados 
de manera natural, lo cual puede afectar la producción de diversos productos de interés 
consecuencia del estrés nutricional, las concentraciones de oxigeno entre otros factores importantes 
de controlar. (Delgado Paredes, Kato, Rojas Idrogo, & , 2013) De modo que la implementación de 
la técnica de suspensiones celulares en medio de cultivo líquido se convierte en una alternativa 
para el aprovechamiento de cultivos que en campo no poseen la suficiente producción de sustancias 
de manera industrial, por lo que no resulta económicamente viable (Arias Zabala & Perez Navarro, 
2008) 
5.3 Metabolitos primarios y secundarios en plantas 
Las plantas son organismos que presentan diversas rutas metabólicas comunes, en las que se 
producen diferentes compuestos necesarios para su desarrollo y su crecimiento, por consiguiente 
se generan los metabolitos primarios a partir de los cultivos de plantas a nivel exsitu e in-vitro a 
este grupo pertenecen los carbohidratos simples los nucleótidos, la clorofila aminoácidos y lípidos 
de membrana, encargados de procesos de respiración, fotosíntesis, transporte de solutos 
asimilación de nutrientes, translocación y diferenciación. (Hess & Varas Pacheco, 2004). 
Además, las rutas metabólicas primarias, las plantas pueden presentar otro tipo de rutas que 
conllevan a la formación de sustancias que no son necesarias para su crecimiento y desarrollo, 
como compuestos fenólicos, antioxidantes, compuestos nitrogenados y anti fúngicos empleados 
como mecanismos de defensa ante patógenos y mediadores de procesos de polinización, dichas 
producciones de estos metabolitos se conocen como rutas metabólicas secundarias. (Arias Zabala 
& Perez Navarro, 2008) 
14 
 
 
 
Estas moléculas no parecen tener una función directa en el desarrollo y crecimiento de la 
planta, convirtiéndose en mecanismos de defensa contra otros organismos, siendo almacenadas 
en vacuolas a medida que son sintetizadas (Arias Zabala & Perez Navarro, 2008). La 
acumulaciónde estos se presenta principalmente en la fase estacionaria, dependiendo del tipo 
de metabolito también puede generar liberación o reserva en la fase en la fase exponencial 
siendo proporcional a la producción de biomasa, esto en algunas líneas celulares. (Delgado 
Paredes, Kato, Rojas Idrogo, & , 2013) Además, presentan una restringida distribución en el 
reino vegetal, dentro de este grupo podemos encontrar los compuestos nitrogenados, terpenos, 
y la clasificación de fenoles y flavonoides (Hess & Varas Pacheco, 2004) 
A nivel industrial estos metabolitos secundarios son la principal fuente de producción de 
pesticidas, saborizantes, colorantes, agroquímicos, fármacos, aditivos de alimentos y perfumes, 
los cuales tienen bajo rendimiento a nivel in vitro por incluir un tratamientos con diversos 
factores como estrés abiótico, elicitores y factores de señalización. (Arias Zabala & Perez 
Navarro, 2008) 
 
 
 
 
 
15 
 
 
 
5.4 Fenoles 
Se denominan fenoles a todas las moléculas químicas orgánicas cuya estructura en particular 
se compone de un anillo aromático de benceno unido a varios grupos hidroxilo (Arias Zabala & 
Perez Navarro, 2008), los fenoles están implicados en procesos industriales siendo aquellas 
sustancias que poseen diversas funciones fenol, nombre común del hidroxibenceno, son originados 
originados en las plantas como los principales metabolitos secundarios, con función de defensa de 
ataques fúngicos o antibacterianos, también contribuyendo a la pigmentación de diversas partes de 
la planta (Gimeno Creus, 2004). 
Los fenoles se pueden clasificar según su estructura química formando nuevas moléculas más 
complejas denominadas polifenoles los cuales han sido considerados en la actualidad como 
antioxidantes, quelantes de metales y captadores de radicales libres. Las propiedades antioxidantes 
se convierten en fuente para el tratamiento de enfermedades en la salud humana como 
enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer), prevención de cáncer y enfermedades 
cardiovasculares. (Gimeno Creus, 2004). Sin embargo, estos compuestos en altas concentraciones 
se convierten en sustancias toxicas para los humanos, sin embargo en bajas concentraciones se 
convierten en medicamentos preventivos de enfermedades (Arias Zabala & Perez Navarro, 2008) 
 
 
 
 
16 
 
 
 
5.5 Flavonoides 
Una importante división de metabolitos secundarios en plantas son los flavonoides, los cuales 
son pigmentos encargados de dar coloración a las hojas, flores y frutos en las plantas en estado 
libre se pueden encontrar como formadores de glicosidos, sus potenciales beneficios en la salud 
humana y la presencia en la naturaleza han generado un creciente interés en su estudio. (Hess & 
Varas Pacheco, 2004). 
En cuanto a su función posee efectos bactericidas y antifúngicos en el organismo actuando 
como inhibidores enzimáticos en procesos de transferencia de energía, siendo participes del 
metabolismo celular, además tienen una importante capacidad como fijadores de metales como 
cobre y hierro. (Hess & Varas Pacheco, 2004) Además estas moléculas generan respuesta a 
señales moleculares o elicitores, por causa del ambiente, microorganismos patógenos, gracias a 
señales receptoras de la planta en las células ( Ávalos García & Pérez Urria Carril, 2009) 
Hay que mencionar, además su función de absorber una longitud de onda corta de radiación 
UV-B no visible para el ojo humano generando protección de las células, así mismo realizan un 
proceso de acumulación en el estrato epidérmico de los tallos y las hojas verdes absorbiendo la 
luz fuertemente en la región UV-B permitiendo el paso de la luz con mayor longitud de onda a 
las células fotosintetizadoras. (Hess & Varas Pacheco, 2004) 
17 
 
 
 
Por otro lado, en el área de la farmacología estos compuestos se encuentran alojados en el 
interior de la célula actuando como antioxidantes presentando la propiedad de apagar los radicales 
radicales libres altamente tóxicos para las células causantes de enfermedades, por su acción de 
protección y la incapacidad de producción del organismo humano de estos compuestos los 
flavonoides merecerían ser incorporados al grupo de nutrientes esenciales (Hess & Varas Pacheco, 
Pacheco, 2004) Así por ejemplo, estudios in vitro e in vivo demuestran el papel protector de la 
quercitina, con efectos ante células cancerígenas y la inhibición de estas (Martinez Flores, Gonzales 
Gonzales Gallego, Culebras, & Tuñón, 2002) 
5.6 Origanum vulgare 
Las plantas aromáticas poseen esencias características en su raíz, fruto, semillas, flores, hojas, 
rizomas, bulbos los cuales son principios activos destinados a la preparación de infusiones. (Nuñez 
& Tonguino Borja, 2011) Siendo las principales productoras de una serie de principios activos con 
diversas aplicaciones en la industria alimentaria y farmacéutica médica. 
 Los metabolitos secundarios de estas plantas son la base del rendimiento y cultivo selección de 
mejora en procesos ( Ávalos García & Pérez Urria Carril, 2009) convirtiéndose en materia prima 
productora de metabolitos secundarios, de interés industrial como los flavonoides. Santander es 
uno de los departamentos que cuenta con especies de plantas aromáticas con un importante 
contenido de flavonoides, las cuales se encuentran en vía de extinción como es la especie 
Origanum vulgare (Orégano). 
18 
 
 
 
Está planta aromática se caracteriza en particular por ser perenne, polimorfa, dicotiledónea 
y ramificada, con unos pelos granulares especiales que le dan la esencia característica, con tallos 
que alcanzan de 30 a 80 cm de altura (Chacin & Camacho, 2016) generalmente el cultivo de 
orégano es considerado marginal, porque se puede desarrollar en suelos pobres de topografía 
accidentada, incluso puede vivir en condiciones de baja fertilidad (Chacin & Camacho, 2016), 
en cuanto a su composición química se compone principalmente de ácidos fenólicos, 
flavonoides como aspergenina y luteolina, Acido ursolico, aceites esenciales como carvacol y 
timol , su raíz contiene estaquiosa y los tallos sustancias tánicas (Nuñez & Tonguino Borja, 
2011) Diversos estudios sobre la bioactividad del Orégano, muestran su actividad ante diversas 
bacterias patógenas, antitripanosoma y antioxidante ( Acevedo, Navarro, & Monrroy, 
Composición Química del Aceite Escencial de Hojas de Orégano (Origanum vulgare), 2013) 
5.7 Diseño de Biorreactor Airlift para cultivo de células vegetales 
Los procesos y técnicas implementadas para el cultivo de células vegetales en suspensión se 
han desarrollado a partir de la adaptación celular, teniendo en cuenta características importantes 
en cada uno de los procesos, como la formación de agregados de manera natural, el tiempo de 
duplicación de 20 a 100 horas y su crecimiento y diámetro. (Delgado Paredes, Kato, Rojas 
Idrogo, & , 2013) 
19 
 
 
 
Partiendo de lo anterior uno de los sistemas apropiados para la producción de metabolitos 
secundarios de interés es el reactor airlift el cual se compone de un reactor agitado neumático, con 
con una fase gaseosa continua en forma de burbujas, lo cual produce una expansión isotérmica para 
para mantener homogeneidad (Rojas Gutierrez & Jimenez lizardi, 2011) este tipo de biorreactor 
acepta una mayor aireación menor daño celular y menor costo energético. La fluidización se genera 
genera por la circulación del líquido dentro del biorreactor y no por la inyección de gas por lo tanto 
tanto mantiene una constante homogenización simple de alta eficiencia, la distribución de energía 
energía en el proceso se realiza por medio del gas y no con movimiento cinético, lo que evita 
cambios metabólicos y morfológicos en las células de cultivos. (Gutierrez rojas & Lizardi Jímenez, 
2011) 
 
En cuanto al funcionamiento a nivel biotecnológico y el mejoramiento del diseño es 
recomendable establecer modelos matemáticos del sistema global. Eldiseño de un biorreactor se 
convierte en un modelo el cual es un conjunto de relaciones de un sistema que está siendo estudiado 
y contiene variables que se relacionan entre sí, también específicas como causa/efecto empleadas 
en el manejo de procesos. Algunas de las variables implicadas pueden ser temperatura pH 
agitación, concentración de sustrato, etc., convirtiéndose este en un biorreactor multipropósito se 
el cual tiene la capacidad de modificar tanto sus relaciones geométricas internas como las variables 
de operación con el fin de lograr una mayor versatilidad del equipo, transformándose en un equipo 
apto para diversos procesos, sin estar limitado a uno en específico (Gutiérrez, Rodríguez , & Ordaz 
, 2004) 
20 
 
 
 
6 MARCO REFERENCIAL 
 
La implementación de modelos de investigación ha permitido la formación de nuevos 
protocolos y el establecimiento de nuevas técnicas que generan diversos compuestos y 
productos de interés, desde el año 1939 con la inducción de los primeros cultivos de callo 
exitosos, originados de plantas de zanahoria y tabaco, descubriendo la implementación de 
auxinas como hormonas reguladoras del crecimiento vegetal y las vitaminas como 
complemento del complejo (García Borges, 2016) 
 Con respecto a lo anterior Uribe moraga & Cifuentes, 2004 demuestran en sus 
investigaciones realizadas que en procesos de crecimiento celular in vitro empleando la técnica 
de suspensiones celulares poseen una mejor respuesta de crecimiento los explantes, utilizando 
el medio MS y dos combinaciones hormonales como 0,1 y 0,5 mg/l de AIB Y 6-BAP 
respectivamente. 
Arias Zabala & Perez Navarro, 2008 Implementan en una de sus investigaciones la 
utilización de células en suspensión con el establecimiento de callos para la producción de 
metabolitos secundarios como los ácidos fenólicos, quercetina, flavonoides, kaempferol entre 
otros. 
21 
 
 
 
En cuanto a la producción de metabolitos secundarios generados por plantas, en el año 1930 son 
descubiertos los flavonoides por el premio nobel Szent- Georgy, el cual aisló de la cascara de limón 
una sustancia que regulaba la permeabilidad de los capilares sanguíneos denominada la citrina. A 
comienzos eran denominados vitamina P (por permeabilidad) y también vitamina C, sin embargo 
no pudo ser confirmado, las dos denominaciones en 1950 fueron abandonadas. (Hess & Varas 
Pacheco, 2004). En la actualidad se han implementado estudios realizados por Soto Vásquez, 2015 
analizan y cuantifican metabolitos secundarios entre estos fenoles y flavonoides totales en extractos 
de propóleos de tres localidades del Perú adoptando métodos de coloración y precipitación, 
encontrando alta diversidad de catequinas, esteroides, antocianidinas ,fenoles y taninos. 
También se demostró la presencia de flavonoides totales por medio de técnicas colorimétricas 
y espectrofotometría, presentes en la flor de pomo (Syzygium jambos) identificando pigmentos 
como catequinas, antocianinas calconas, flavononas y un total de flavonoides de 3,580,8614 mg de 
catequina por gramo de extracto. (Bonilla Rios, Varón, & Garzón, 2014) 
Otra de las investigaciones fue acerca de la producción de biomasa y metabolitos secundarios 
de tipo glicósidos cardiotónicos a escala de matraz agitado, en el cual se determinó la producción 
de flavonoides en tanque agitado a partir de Thevetia peruviana, y no se encuentran diferencias en 
cuanto a la aireación y la fuente de carbono así mismo, resaltan la influencia del tapón del 
biorreactor con diferencias significativas en el crecimiento celular observándose mayor 
crecimiento con el tapón de aluminio el cual ofrecía menor transferencia de oxígeno. (Arias Zabala 
& Perez Navarro, 2008) 
22 
 
 
 
Investigaciones acerca de la planta Lippia alba (Orégano de cerro) caracterizada por ser un 
arbusto muy aromático e investigada por su efecto antiespasmódico en infusión, sedante y 
desinfectante, determinando que la composición química de los compuestos que produce la 
dependen de sus condiciones de cultivo edad, parte de la planta empleada para la extracción y 
demás factores geobotánicos, realizadas estas investigaciones en Guatemala. (Stashenko, 
Jaramillo, & Martínez, 2003) 
Por otro lado, un estudio realizado en la universidad de Santander evaluó el crecimiento in 
vitro del cultivo de Orégano (Origanum vulgare) a partir de la técnica de Organogénesis y 
diferentes tratamientos de desinfección determinando que el mejor crecimiento se generó en el 
medio de cultivo T1 y se dio como producto vitroplantas libres de patógenos u otros 
contaminantes ambientales. (Camacho & Chacín, 2016) 
 
 
 
 
 
 
 
 
23 
 
 
 
7 HIPÓTESIS 
NULA: La temperatura y la oxigenación, no generan un efecto en la producción de flavonoides 
flavonoides por medio de la técnica de suspensiones celulares a partir de la planta Origanum 
vulgare. 
 
ALTERNA: El efecto de la temperatura y la oxigenación genera producción de flavonoides por 
medio de la técnica de suspensiones celulares a partir de la planta Origanum vulgare. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
 
 
8 OBJETIVOS 
8.1 Objetivo General: 
Evaluar la producción de flavonoides a partir de Origanum Vulgare (Orégano) por medio de 
suspensiones celulares en biorreactor airlift. 
 
8.2 Objetivos Específicos: 
 Diseñar y construir un prototipo de biorreactor airlift para el proceso de 
obtención de flavonoides a partir de suspensiones celulares. 
 Determinar condiciones ideales de Aireación y temperatura para la obtención de 
flavonoides de Origanum vulgare en biorreactor Airlift. 
 Identificar por medio de métodos cualitativos directos la presencia de 
flavonoides en suspensiones celulares de origanum vulgare. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
 
 
9 METODOLOGÍA 
9.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN 
 
El proyecto es experimental, debido a que estudia las alteraciones de las variables en 
temperatura, aireación, azucares reductores al mismo tiempo, en un ambiente controlado, lo cual 
permite evaluar el desarrollo de un proceso en particular, se desarrolló en el laboratorio de tejidos 
vegetales, ubicado en el la Universidad de Santander campus Bucaramanga. 
 
9.2 Fases de investigación. 
 
Para el desarrollo del proyecto se realizó las siguientes etapas: 
 
9.2.1 FASE I. Construcción del biorreactor 
Se realizó diseño y construcción de un biorreactor airlift estandarizado por Acuña, R. (2004) 
controlando las variables de temperatura y aireación de dicha investigación para procesos de 
obtención de metabolitos secundarios a partir de suspensiones celulares. 
9.2.2 FASE II. Determinación de condiciones para la obtención de flavonoides de 
Origanum vulgare en biorreactor Airlift. 
Se definieron las condiciones ideales de aireación y temperatura para la obtención de flavonoides, por 
medio de la técnica de suspensiones celulares de Origanum vulgare en biorreactor airlift en un periodo de 
20 días. 
 
 
 
26 
 
 
 
Preparación de las células en suspensión de Origanum vulgare 
Se utilizaron callos jóvenes (2 meses de crecimiento) obtenidos a partir de Origanum vulgare, 
procedentes del laboratorio de tejidos vegetales. A estos tejidos, se les realizó un proceso de 
desinfección de acuerdo al estandarizado por (Camacho, H y Chacín, C, 2017). Seguidamente 
se dejaron en agua destilada estéril hasta la puesta en marcha del biorreactor. La cantidad de 
callo que se usó como inóculo son 0,5g de callo por tratamiento. 
 
Preparación de medio de cultivo líquido para producción de flavonoides: 
 
El medio cultivo líquido se realizó a partir del medio basal MS (Murashige and Skoog, 1964), 
formulado y estandarizado por (Camacho. H y Chacín, C, 2017) para su proyecto de grado. 
 
Puesta en marcha del biorreactor airlift con suspensiones celulares de Origanum vulgare 
 
Las células orégano se cultivaron en el biorreactor de 1 litro, con un volumen efectivo detrabajo aproximado de 50ml, se adiciono el preinóculo establecido anteriormente en cámara de 
flujo laminar desarrollando 9 ensayos en 3 diferentes tratamientos los cuales tuvieron variación 
en temperatura y transferencia de oxígeno. 
 
27 
 
 
 
Tabla 1 
Tabla 1 Temperatura y oxigenación estandarizados en los tratamientos para la producción de 
flavonoides a partir de Origanum vulgare. 
Tratamientos 
Temperatura Transferencia de oxigeno 
18 °C 0.1 vvm 
 18 °C 0.3 vvm 
18 °C Sin oxigeno 
26 °C 0.1 vvm 
26 °C 0.3 vvm 
26 °C Sin oxigeno 
22 °C 0.1 vvm 
22 °C 0.3 vvm 
22 °C Sin oxigeno 
 
 
 
 
 
28 
 
 
 
Para determinar el mejor desempeño en cada uno de los tratamientos se realizaron mediciones 
a partir de las siguientes variables: Concentración máxima de biomasa, presencia de 
flavonoides, Grados Brix, azúcares reductores (DNS) peso fresco y pH al finalizar el proceso 
con intervalos de 5 días. 
9.2.3 FASE III. Identificación preliminar de flavonoides por medio de métodos 
cualitativos. 
 
Separación de biomasa al extracto 
Se realizó un proceso de centrifugación del extracto crudo del producto, extrayendo el 
sobrenadante de éste. 
Ensayos de coloración para determinar la presencia de flavonoides en el extracto crudo. 
a. Ensayo de Shinoda 
Se realizó la adición de 1 mL de extracto etanolico y metanolico 1 limadura de Mg, 3 gotas 
de HCL concentrado, los flavonoides con el núcleo benzopirona (p. ej. flavonas, flavonoles, 
flavanonas, etc.) Producen coloraciones rojizas cuando a sus disoluciones acuosas o alcohólicas 
se les Adiciona magnesio seguido de HCl concentrado 37%. Aunque no se conoce el mecanismo 
de esta Prueba, es muy utilizada para reconocer esta clase de compuestos. (Bonilla Rios, Varón, 
& Garzón, 2014) 
 
 
 
29 
 
 
 
b. Ensayo de Mg/HCl 
Se adicionó 1ml de suspensión, 1 mL de HCL 15%, posterior a ello, se adicionó 5 virutas de 
magnesio, en un tiempo de 5 minutos de inmovilidad, finalizado este tiempo se agitó y se adicionará 
adicionará 1ml de alcohol isoamílico. La producción de color amarillo se tomó como positivo 
(presencia de flavonoides) y una coloración transparente es negativo. (Bonilla Rios, Varón, & 
Garzón, 2014) 
c. Ensayo de Pacheco 
El sólido flavonoide se calentó sobre una llama con unos pocos cristales de AcONa (Acetona) 
y 0.1 mL De anhídrido acético. Luego con 0.1 ml de HCl al 20%. Los dihidroflavonoles producen 
un color rojo característico. (Bonilla Rios, Varón, & Garzón, 2014) 
 
d. Ensayo con Zn/HCl 
Se adicionó 1 mL de suspensión, 1mL de HCL 15%, posterior a ello, se adicionó 5 virutas de 
Zn, en un tiempo de 5 minutos de inmovilidad, finalizado este tiempo se agitó y se adicionará 1ml 
de alcohol isoamílico. Los dihidroflavonoles (o flavonoles) producen coloraciones rojo-violetas. 
Las flavanonas y flavanoles no producen color o producen coloraciones rosadas débiles. (Bonilla 
Rios, Varón, & Garzón, 2014) 
 
 
 
 
30 
 
 
 
e. Determinación de fenoles y flavonoides totales 
La mezcla de reacción consistió en 400 μL de agua destilada, seguidamente se adicionó de 
100 μL de extracto (Completando a volumen de 500 μL), luego, se agregó 30 μl de NaNO2 5% 
esperó 5 min), luego 30 μL AlCl3 al 10% (Se esperó 5 min.), después se agregó 200 μL NaOH 
(Se esperó 15 min) y por último se adicionó 240 μL de agua destilada. Se guardó en la oscuridad 
y a temperatura ambiente, por 30 min. Se leyó, la Absorbancia a 510 nm (ZHISHEN et al, 1998). 
Se realizó una curva patrón usando como referencia (+)-catequina, con un rango de 
concentración (5-80 μg/ml), donde se obtuvo la siguiente ecuación lineal y = 0,0250x - 0,0578, 
R² = 0,9981 (Bonilla Rios, Varón, & Garzón, 2014) 
 
f. Condiciones de almacenamiento 
Una vez obtenido el extracto, para evitar la degradación por efecto de la luz, absorción de 
humedad, evaporación de constituyentes volátiles, oxidación debida al aire y cambios debido a 
la acción de microorganismos. Para ello se depositó el metabolito secundario en frascos de 
vidrio tapa rosca color ámbar en un ambiente fresco (temperatura ambiente). 
 
g. Análisis Estadístico 
Para el análisis estadístico se realizó un diseño factorial 32, donde se realizó un análisis de 
varianza mediante una ANOVA y las diferencias significativas a partir de la prueba de Fisher 
en el software Infostat. 
 
31 
 
 
 
10 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
10.1 FASE I. Construcción del biorreactor 
Con base en lo descrito por (Acuña, 2004) y los cálculos detallados en la metodología, se 
definieron las medidas y volúmenes necesarios para la construcción del sistema de airlift. Este 
instrumento se desarrolló en compañía de la facultad de ingeniería de la universidad de Santander. 
Los resultados de los cálculos fueron los siguientes: 
 Diámetro del tanque Dt = Ht. 0,25 
 Altura de trabajo Ht = Dt / Ht 
 Altura de columna interna (tubo draft) Hd = 0,66 Ht 
 Volumen de trabajo V = π. r2.A 
 Coeficiente de transferencia de masa KLa= 15.8 
 Coeficiente de variación = 3,75 
De acuerdo a los anteriores parámetros se realizó la construcción de un prototipo de biorreactor 
airlift para llevar a cabo el proceso de producción de flavonoides ya que permite controlar y 
monitorear el funcionamiento de las variables fundamentales como pH, temperatura, aireación, y 
además de ello reduce variaciones metabólicas genéticas y ruptura celular generando un mayor 
rendimiento en la obtención de metabolitos secundarios, beneficiando el aprovechamiento del 
material celular, como se muestra en la figura 1. 
32 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El sistema está compuesto por dos llaves de paso tipo esfera, ubicadas en la zona media del 
biorreactor, con una distancia de 10 cm cada una; un diámetro de salida interno del efluente de 
1,27cm. Consta de una altura desde el fondo de 0,54 cm donde se encuentra ubicado el difusor 
de oxigeno especializado en la regulación y formación de burbujas de 1 y 2 mm de tamaño, el 
cual permitió la distribución homogénea de oxigenación en el medio, con una manguera de 2 
mm de grosor y 40 cm de larga; el motor marca Airpo modelo D20285 con un voltaje de 12 
VDC, se compone también de un termómetro que mantiene la temperatura constante en el 
proceso y un regulador de pH que calibra el mismo si los valores se reducen o se aumentan a 
medida que el proceso se encuentra en marcha, el biorreactor consta de un filtro de membrana 
de 25mm de diámetro de teflón PTFE 0,2um de poro para prevenir contaminación por 
microorganismos en el aire que va dirigido al medio de cultivo de manera directa. El volumen 
total del prototipo es de 1500 mL. (Anexo 8) 
Figura 1 Prototipo del Biorreactor airlift para la producción de 
flavonoides. 
33 
 
 
 
10.2 FASE II. Determinación de condiciones para la obtención de flavonoides de Origanum 
vulgare en biorreactor airlift. 
 
El material vegetal empleado presentaba una edad de un mes de formación de callo, el cual fue 
fue sometido a un proceso de desinfección estandarizado por (Chacin & Camacho, 2016) con el fin 
de eliminar diferentes microorganismos que podían interferir en el proceso, y alterar la producción 
del metabolito secundario. Los callos presentaban una textura suave, de color café, los cuales se 
consideran friables (figura 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Los resultados obtenidos en los ensayos para determinar las condiciones iniciales de operación 
en la producción de los flavonoides se muestran a continuación: 
 
 
 
Figura 2. Producción de callos a partir de Origanum vulgare con una edad de 
dos meses en el laboratorio de tejidos vegetales, Universidad de Santander. 
34 
 
 
 
10.3 Producción de biomasa por tratamiento en peso fresco 
 
 
 
 
 
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
0 5 10 15 20
p
es
o
 e
n
 (
g)
Tíempo (Días)
Peso fresco/ Sin O2
18°C 22°C 26°C
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
0 5 10 15 20
P
es
o
 en
 (
g)
Tíempo (Días)
Peso fresco 0.1vvm
18 °C 22°C 26°C
B A 
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
0 5 10 15 20
P
es
o
 (
g)
Tiempo (Días)
Peso fresco 0,3vvm
18°C 22°C 26°C
C 
Figura 3 Cinética de crecimiento de callo de Origanum vulgare en un periodo de 20 días A) proceso de 
crecimiento sin Oxígeno B) crecimiento con 0,1vvm de oxígeno C) crecimiento con 0,3vvm de oxígeno. 
35 
 
 
 
En la figura 3, Se observa la producción de biomasa (peso fresco) en cada uno de los 
tratamientos a raíz de la división celular activa, a partir del análisis estadístico no se observan 
diferencias significativas de crecimiento en los tres tratamientos con las diferentes concentraciones 
de oxígeno aplicadas (p>0,05) por lo tanto el crecimiento fue continuo en los tres tratamientos con 
las 3 concentraciones de oxigeno implementadas ver (Anexo 1). Por lo tanto, se puede inferir que 
la aireación no es una variable que induce el proceso de crecimiento de los callos de Origanum 
vulgare. A pesar que se observó que la inyección de aire que presentó mayor respuesta fue 0,1vvm 
en cuanto a la producción de biomasa a partir de las suspensiones celulares de callos de orégano. 
En la cinética de crecimiento de callos de Origanum vulgare en los tres tratamientos, se presenta 
presenta una etapa lag desde el día 5. Como se observa en la figura 3 imágenes A, B, C posterior a 
la fase lag inicia la etapa de crecimiento exponencial, en la que se observan los valores de peso 
fresco más significativos. Según (Chamorro, Martínez, Fernández, & Mosquera, 2007) en esta fase 
ocurre el proceso de división celular de manera más acelerada. En el día 10, se obtuvo el mayor 
valor en peso fresco el cual fue 1,55g, a la temperatura de 26ºC respectivamente, presentando 
diferencias significativas (p < 0,05) en comparación con los otros tratamientos. La ecuación 
establecida de acuerdo al análisis estadístico es la siguiente: 
𝑃𝑓 = 0,45 + 2,9𝑥10 − 3Oxig + 0.06 Tiemp + 039 Temp + 2,92 
36 
 
 
 
Así mismo, otro factor importante al cual se le puede atribuir el crecimiento de los callos, 
es la adición de reguladores de crecimiento vegetal como hormonas, se emplearon 2,4 D 
(2.500ul/l) y 6-BAP (500ul/l) respectivamente, una de sus funciones principales fue acelerar el 
proceso de división celular, generando callogénesis y a su vez la activación del metabolismo 
secundario de la planta en un menor tiempo; lo anterior se observó en los tres tratamientos 
empleados. (Gómez Zeledón & Jiménez, 2011) 
De acuerdo con investigaciones realizadas por (Gómez Zeledón & Jiménez, 2011) se 
que la adición de la hormona 6BAP en combinación con 2,4-D en fresa (Fragaria ananassa cv. 
Shikinari) obtiene un aumento de callos en la suspensión celular y la producción de flavonoides 
(Antocianinas) 7 veces mayor a la producción del pigmento obtenido en el medio libre de 
reguladores. Con base en lo anterior el crecimiento es un signo de la activación del metabolismo 
primario de la planta a medida que trascurre el tiempo, ocurriendo una transición directa hacia 
el metabolismo secundario de manera productiva. 
Según Mizukami y colaboradores 1988 observaron un aumento en el crecimiento vegetal de 
callos y un incremento en la síntesis de flavonoides de Hibiscus sudariffa utilizando 1 µM de 
2,4-D al combinar esta hormona con kinetina también son estimuladores de la síntesis de 
flavonoides en un mayor grado de producción. (Gómez Zeledón & Jiménez, 2011) 
 
 
 
37 
 
 
 
10.4 Incidencia de pH en la producción de flavonoides. 
 
 
 
 
 
 
 
 
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20
p
H
Tiempo (Días)
pH / Sin O2
18°C 22°C 26°C
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20
p
H
Tiempo (Días)
pH / 0,1vvm
18°C 22°C 26°C
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20
p
H
Tiempo (Días)
pH / 0,3vvm
18°C 22°C 26°C
A B 
C 
Figura 4 Resultados de pH del extracto de flavonoides obtenido a partir de Origanum vulgare en un 
periodo de 20 días A) pH sin Oxigeno B) pH con 0,1vvm de oxigeno C) pH con 0,3vvm de oxígeno. 
38 
 
 
 
En la figura 4 las gráficas A, B, C permite analizar la influencia de pH en el proceso de 
crecimiento y producción de metabolitos secundarios, se determinó que existen diferencias 
significativas en los grados de oxigenación aplicados en los ensayos (p<0,05) ver (Anexo 2) 
Partiendo de 5,6 a 3,2 valor final del proceso. Se observó que al realizar una inyección de aire 
(0,1vvm) generó mayor respuesta en comparación con las otras aplicaciones de aire 
respectivamente, en el medio de cultivo el pH se reduce de una manera más acelerada por lo 
en los 5 primeros días del proceso se evidenció reducción, sin embargo en el 10 día se generó 
mayor reducción de los valores de pH convirtiéndose en la inyección de aire capaz de generar 
ambiente ideal para la formación de nuevos compuestos, y un signo de actividad metabólica 
vegetal, manteniéndose de manera constante y sin variaciones, en lo que restó del proceso al 
aumentar las diferentes inyecciones de aire afectan la variabilidad del pH permitiendo que los 
valores del mismo no disminuyan de una manera acelerada, en el caso de crecimiento no 
interfiere de forma directa pero en la producción de metabolitos secundarios, retardaría el 
proceso de producción, esto por causa del consumo de amonio, nitrato por parte de la planta. 
(Zabala Arias, Angarita Velázques, Aguirre Cardona, Restrepo Floréz, & Montolla Vallejo, 
2009) y utilización de otro tipo de compuestos para el crecimiento celular. 
 De igual manera, se observó que la temperatura no tiene diferencias significativas en cuanto 
a la reducción o aumento de pH, convirtiéndose en una variable que no generó cambios a lo 
largo del ensayo. La ecuación establecida de acuerdo al análisis estadístico es la siguiente: 
𝑝𝐻 = 3,46 + 0,26 𝑇𝑒𝑚𝑝 + 0,86 𝑂𝑥𝑖𝑔 + 2,38 𝑇𝑖𝑒𝑚 + 7,78 
 
39 
 
 
 
La reducción del pH con respecto a la producción de flavonoides se convierte en un inductor el 
cual tiene efecto en la estabilidad y estructura de los flavonoides, al estar expuestos a valores ácidos 
de pH se genera un efecto protector sobre la molécula, según (Acosta Pushaina, Arias Martinez, 
Gomez Arias, Gutierrez Romero, & Parra Rincones, 2014) estas reducciones permiten la 
formación de nuevas moléculas un ejemplo es el paso de flavilio a chalcona por la desprotonación, 
Así, elevados valores de pH provocan la formación de compuestos quinoidales de coloración 
purpura que se degradan rápidamente por oxidación del aire. Como se puede observar en la figura 
4, las gráficas A B y C la reducción se genera hasta el valor de 3.0 manteniéndose en este rango lo 
cual indicó ser un medio acuoso con características que favorecieron la obtención de flavonoides 
y el crecimiento vegetal. (Acosta Pushaina, Arias Martinez, Gomez Arias, Gutierrez Romero, & 
Parra Rincones, 2014). En otro estudio por (Marero et al., 1997), se demuestra que los cambios de 
pH inicial en el medio de cultivo pueden afectar la producción y acumulación de metabolitos 
secundarios como es el caso de la producción de indirubina por suspensiones de Indigo 
chino (Polygonum tinctorium) en las cuales la producción aumenta 20% y un 30% de pH optimo 
comparada con otros pH evaluados. (Zabala Arias, Angarita Velázques, Aguirre Cardona, Restrepo 
Floréz, & Montolla Vallejo, 2009). Por esta razón un aumento en los valores de pH disminuye la 
efectividad en el proceso de producción generando volatilización de compuestos de interés 
industrial. Otro factor importante es la temperatura, en este caso tiene influencia directa con la 
variación de pH, por lo tanto la temperatura de 26 ºC se convierte en la más óptima para estabilizar 
y mantener por más tiempo el valor constante de pH a lo largo del proceso, sin embargo la 
temperatura afecta la producción de metabolitos secundarios, aunque no se conocen con claridad 
40 
 
 
 
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20
G
ra
d
os 
B
ri
x
Tiempo (Días)
Grados Brix / 0,3vvm
18°C 22°C 26°C
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20
G
ra
d
o
s 
B
ri
x
Tiempo en (Días)
Grados Brix / Sin O2
18°C 22°C 26°C
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20
G
ra
d
o
s 
B
ri
x
Tiempo (Días)
Grados Brix / 0,1vvm
18°C 22°C 26°C
los mecanismos bioquímicos por los que esto ocurre. (Zabala Arias, Angarita Velázques, 
Aguirre Cardona, Restrepo Floréz, & Montolla Vallejo, 2009) 
10.5 Influencia de los grados Brix en la producción de flavonoides. 
 
 
 
 
 
 
 
A B 
C 
Figura 5. Resultados de los Grados Brix del extracto de flavonoides obtenido a partir de Origanum vulgare 
en un periodo de 20 días A) Grados Brix sin Oxigeno B) Grados Brix con 0,1vvm de oxigeno C) Grados 
Brix con 0,3vvm de oxígeno. 
41 
 
 
 
Los resultados obtenidos permiten determinar que no hay diferencias significativas en la 
aireación con respecto a la disminución de los grados Brix. Por otra parte, una de las variables 
influyentes es la temperatura; a los 26 ºC existe diferencia significativa (p < 0,05) frente a los demás 
demás tratamientos evaluados manteniendo una media de 3,81 a diferencia de las otras 
temperaturas aplicadas, también se observó en el periodo de 20 días un aumento de los grados Brix 
Brix con respecto a los demás tratamientos evaluados, esto producto de la segregación de 
sustancias, y reducción del metabolismo primario en el proceso. Por lo tanto, los grados Brix se 
se convierten en uno de los indicadores de actividad metabólica en células vegetales, al utilizar 
azucares circundantes en el medio para procesos de crecimiento celular y producción de 
compuestos, como se observa en la gráfica 3 los valores iniciales de grados Brix en el proceso se 
se encontraban en un rango de 4,0 como se puede observar son inversamente proporcionales al 
tiempo y a la reducción de azucares con la prueba de DNS observando una disminución de los 
grados brix y un aumento de azucares como glucosa a los 26 ºC en un periodo de 10 días, esto en 
en consecuencia de la utilización de azucares por parte del material vegetal para la obtención de 
energía y la formación del protoplasma celular. (Angulo Montoya, y otros, 2013) Otra de las 
variables en aplicadas es la temperatura, en este caso no actúa ni tiene relación directamente con 
la reducción de los grados Brix, pero se convierte en un factor que estabiliza y mantiene el proceso 
de producción de flavonoides, La ecuación establecida de acuerdo al análisis estadístico es la 
siguiente: 
𝐵𝑟𝑖𝑥 = 4,89 + 0,01 𝑂𝑥𝑖𝑔 + 2,19 𝑇𝑒𝑚𝑝 + 2,69 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝 + 7,15 
 
42 
 
 
 
10.6 Influencia de azúcares reductores en la producción de flavonoides y crecimiento 
vegetal 
 
 
 
 
 
 
 
 
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15 20A
b
so
rb
an
ci
a 
(n
m
)
Tiempo (Días)
Azúcares Reductores/ Sin O2
18°C 22°C 26°C
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15 20
A
b
so
rb
an
ci
a 
(n
m
)
Tiempo (Días)
Azúcares Reductores/ 0,1vvm
18°C 22°C 26°C
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15 20A
b
so
rb
an
ci
a 
(n
m
)
Tiempo (Días)
Azúcares Reductores / 0,3vvm
18°C 22°C 26°C
A 
C 
B 
Figura 6. Resultados de Azucares Reductores del extracto de flavonoides obtenido a partir de Origanum 
vulgare en un periodo de 20 días A) DNS sin Oxigeno B) DNS con 0,1vvm de oxigeno C) DNS con 
0,3vvm de oxígeno. 
43 
 
 
 
Con la finalidad de analizar el comportamiento de los azucares reductores por medio del método 
(DNS) se realizaron una serie de soluciones patrón de glucosa las cuales se utilizaron directamente 
mediante una interpolación, de lo anterior se determinó los equivalentes de la glucosa formados en 
el medio de reacción del DNS, en el (Anexo 4) se presenta la curva patrón de glucosa con la cual 
se realizaron los análisis y la obtención de los resultados, como se puede observar en el (Anexo 5) 
existen diferencias significativas en la temperatura como se observa en la figura 6, representando 
los 26 ºC como una de las variables que permiten la formación de glucosa en el medio, así mismo 
la oxigenación y el número de días también generan formación de la molécula y reducción del DNS 
de una manera constante lo que mantiene el proceso con una estabilidad en cuanto a la formación 
de nuevos productos. 
Se pudo observar que a diferentes concentraciones los azúcares reductores presentes en los 
hidrolizados, muestran la mayor actividad óptica en una longitud de onda de 540nm estando acorde 
con los datos suministrados por la literatura, así mismo el método se basa principalmente en la 
reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa al ácido 3-amino-5- nitrosalicílico (de color 
rojo ladrillo), lo cual se observó al ver un cambio de coloración, La ecuación establecida de acuerdo 
al análisis estadístico es la siguiente: 
𝐷𝑁𝑆 = 4,89 + 0,01 𝑂𝑥𝑖𝑔 + 2,19 𝑇𝑒𝑚𝑝 + 2,69 𝐷í𝑎𝑠 + 7,15. 
 
 
 
44 
 
 
 
10.7 Producción de flavonoides con diferentes concentraciones de oxígeno y temperatura. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20
(m
g)
 C
at
eq
u
in
a
Tiempo (Días)
Producción de flavonoides sin O2
18℃ 22℃ 26℃
A 
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20(
m
g)
 C
at
eq
u
in
a
Tiempo ( Días)
Producción de flavonoides / 
0,1vvm
18℃ 22℃ 26℃
B 
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20
(m
g)
C
at
eq
u
in
a
Tiempo (Días)
Producción de flavonoides / 
0,3vvm.
18℃ 22℃ 26℃
C 
Figura 7. Producción de flavonoides obtenidos a partir de Origanum vulgare en un periodo de 20 días A) 
Producción sin Oxigeno B) Producción con 0,1vvm de oxigeno C) Producción con 0,3vvm de oxígeno. 
45 
 
 
 
La producción de metabolitos secundarios se encuentra asociada con el crecimiento y el tipo de 
material vegetal empleado a lo largo del proceso, como se observa en la figura 7, muestra la 
producción de flavonoides por Origanum vulgare, la cual presentó un incremento constante, en 
todos los ensayos realizados. Sin embargo, se observa una mayor producción del metabolito 
secundario en la temperatura de 18ºC alcanzando un máximo de producción de 22,587,280 g de 
catequina por mL de extracto crudo de Origanum vulgare en el día 10 del proceso convirtiéndose 
en la mejor temperatura para la producción de flavonoides, a diferencia de 22ºC y 26ºC que no 
representan diferencias significativas en cuanto a la producción del metabolito (Anexo7), La 
ecuación establecida de acuerdo al análisis estadístico es la siguiente: 
𝐹𝑙𝑎𝑣𝑜𝑛𝑜𝑖𝑑𝑒𝑠 = 402,73 + 1,54 𝑂𝑥𝑖𝑔 + 75,14 𝑇𝑒𝑚𝑝 + 325,46 𝐷í𝑎𝑠 + 512,19 
Se observó que el tiempo en días se convierte en un factor de producción determínate en el proceso, 
obteniendo diferencias significativas en el día 10 y 15 de los tratamientos, sin embargo el 10 día 
generó mayor respuesta en cuanto a producción de metabolitos secundarios y una reducción de 5 
días de proceso de producción de flavonoides en comparación con los demás tratamientos , 
refiriéndonos a la variable de oxigenación, se observan diferencias significativas en cuanto a 
obtención convirtiéndose 0,1 vvm en la inyección de aire con mayor respuesta en la obtención de 
flavonoides (Anexo7) por lo tanto el oxígeno se convierte en un factor importante en el 
metabolismo primario de la planta para el crecimiento y un inductor esencial para la producción de 
flavonoides a nivel in vitro. 
46 
 
 
 
Con base a lo anterior se presenta este comportamiento en respuesta a los diferentes tipos de 
nutrientes expuestos en el medio de cultivo, jugando un papel fundamental en el crecimiento 
vegetal, la estabilidad de las proteínas la activación de la trascripción de genes en los procesos 
transferencia de masa y calor. (Zabala Arias, Angarita Velázques, Aguirre Cardona, Restrepo 
Floréz, & Montolla Vallejo, 2009) 
El rango de temperaturas generalmente empleado está entre 15-35 ºC, sin embargo, esta 
puede afectar la acumulación de compuestos intracelulares de reserva (biomasa inactiva) y la