GuzmánVásquezJuanDavid2016

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CARACTERIZACIÓN FENOTIPICA DE UN CULTIVO DE PAPA CRIOLLA (Solanum tuberosum Grupo 
Phureja, variedad criolla Colombia) IRRADIADA CON COBALTO 60 UBICADO EN EL MUNICIPIO EL 
ROSAL, FINCA EL PINO KM 16 VÍA SUBACHOQUE CUNDINAMARCA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PRESENTADO POR: 
JUAN DAVID GUZMÁN VÁSQUEZ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS 
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN 
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA 
BOGOTÁ DC., 2016 
 
 
 
 
 
 
 
 
CARACTERIZACIÓN FENOTIPICA DE UN CULTIVO DE PAPA CRIOLLA (Solanum tuberosum Grupo 
Phureja, variedad criolla Colombia) IRRADIADA CON COBALTO 60 UBICADO EN EL MUNICIPIO EL 
ROSAL, FINCA EL PINO KM 16 VÍA SUBACHOQUE CUNDINAMARCA 
 
 
 
 
 
JUAN DAVID GUZMÁN VÁSQUEZ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Investigación para optar al título de 
LICENCIADO EN BIOLOGÍA 
 
 
 
 
 
 
 
 
Director: 
LUIS FRANCISCO BECERRA GALINDO 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS 
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN 
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA 
BOGOTÁ DC., 2016 
INDICE 
INTRODUCCIÓN 
1. PLANTEAMIENTO 
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
1.2 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 
1.3 OBJETIVOS 
1.3.1 OBJETIVO GENERAL 
1.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
2. MARCOS DE REFERENCIA 
2.1 ANTECEDENTES 
2.2 MARCO CONCEPTUAL 
2.2.1 DORMANCIA 
2.2.2 MUTAGÉNESIS 
2.2.3 MUTÁGENOS FÍSICOS 
 
3. MARCO METODOLÓGICO 
3.1 LOCALIZACIÓN DEL EXPERIMENTO 
3.2 MATERIALES Y RECURSOS 
3.3 EQUIPOS 
 
4. PROCEDIMEINTO 
4.1 IRRADIACIÓN DE TUBÉRCULOS 
4.2 PLANTACIÓN DE CULTIVO 
4.3 TOMA DE DATOS FENOTÍPICOS 
4.4 EXTRACCIÓN DE DNA 
4.5 CUANTIFICACIÓN DE DNA 
4.6 AMPLIFICACIÓN DE PCR DEL GEN EIN2 
4.7 ELECTROFORESIS 
4.8 ANÁLISIS DE DATOS 
 
5. ANÁLISIS Y RESULTADOS 
5.1 RESULTADOS FENOTÍPICOS 
5.1.1 ALTURA PROMEDIO DE LAS PLANTAS 
5.1.2 COLOR DE LAS FLORES 
5.1.3 SANIDAD DE LAS PLANTAS 
5.1.4 GERMINACIÓN DE LAS PLANTAS 
5.1.5 CAMBIO EN LAS HOJAS 
5.2 ANÁLISIS Y RESULTADOS MÓLECULARES 
5.2.1 CUANTIFICACIÓN 
5.2.2 ESTANDARIZACIÓN 
5.2.2.1 SINTESIS DEL PRIMER 
5.2.2.2 MARXTER MIX 
5.2.2.3 CONDICIONES DE PCR Y ELECTROFORESIS 
5.2.3 ELECTROFORESIS 
5.2.3.1 ACTINA 
5.2.3.2 GRADIENTE DE TEMPERATURA 
5.2.3.3 CONCENTRACIÓN DE CLORURO DE MAGNESIO (MgCl2) 
5.2.3.4 AMPLIFICACIÓN DE EIN2 
 
6. CONCLUSIONES 
 
7. ANEXOS 
 
8. BIBLIOGRAFÍA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INDICE DE IMÁGENES 
 
1 Ruta de Etileno y ABA 
2 Formación de tallo aéreo 
3 Flor de Solanum phureja 
4 Entrada Finca El Pino 
5 Finca el Pino, cultivo de Solanum phureja 
6 Tubérculos seleccionados para sembrar 
7 Tubérculos irradiados 
8 Documentador de geles 
9 Termociclador 
10 Fuente de poder 
11 Centrífuga 
12 Nanodrop 
13 Tubérculos irradiados 
14 Tubérculos sembrados y demarcados 
15 Flor con quimeras 
16 Recolección de material vegetal 
17 Cámara para preparación de Maxter Mix 
18 Tratamiento 1 – Semana 1 
19 Tratamiento 1 – Semana 4 
20 Tratamiento 1 – Semana 8 
21 Tratamiento 1 – Semana 12 
22 Tratamiento 2 – Semana 1 
23 Tratamiento 2 – Semana 4 
24 Tratamiento 2 – Semana 8 
25 Tratamiento 2 – Semana 12 
26 Tratamiento 3 – Semana 1 
27 Tratamiento 3 – Semana 4 
28 Tratamiento 3 – Semana 8 
29 Tratamiento 3 – Semana 12 
30 Tratamiento 4 – Semana 1 
31 Tratamiento 4 – Semana 4 
32 Tratamiento 4 – Semana 8 
33 Tratamiento 4 – Semana 12 
34 Control – Semana 1 
35 Control – Semana 4 
36 Control – Semana 8 
37 Control – Semana 12 
38 Flor Blanca, plantas irradiadas 
39 Flor fucsia, plantas control 
40 Flor con quimeras, planta irradiada 
41 Hojas con hongo 
42 Plantas con afectación en la sanidad 
43 Plantas germinadas 
44 Hojas de plantas irradiadas 
45 Hojas de plantas control 
46 Tubérculos seleccionados según la cantidad de brotes visibles 
47 Prueba de actina 
48 Gradiente de temperatura en actina 
49 Gradiente de temperatura 
50 Gradiente de temperatura positivo 
51 Corroboración del Gradiente de temperatura 
52 Resultado de temperatura final 
53 Concentración de MgCl2 
54 Prueba de EIN2 
55 Confirmación de la amplificación 
56 Amplificación positiva T1-3 
57 Prueba de marcadores de peso 
58 Amplificación de Q3-3, Q4-2, Q4-3 
59 Amplificación de T3-1, Q4-1, QC-2 
60 Amplificación positiva 
61 Amplificación control 
62 Amplificación de EIN2 positiva 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INDICE DE TABLAS 
 
1 Equipos para la investigación 
2 Matriz de datos fenotípicos 
3 Altura promedio de los tratamientos 
4 Secuencia del Primer 
5 Estandarización de la Maxter Mix 
6 Condiciones para el termociclador 
7 Reactivos y cantidad adecuada 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INDICE DE GRÁFICAS 
 
1 Porcentaje de sanidad en tratamiento # 1 
2 Sanidad en tratamiento # 2 
3 Porcentaje de sanidad en tratamiento # 3 
4 Sanidad en tratamiento #4 
5 Porcentaje de sanidad en plantas control 
6 Cuantificación de DNA para QC-2 
7 Cuantificación de DNA para T3-1 
8 Características del Primer diseñado 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CARACTERIZACIÓN FENOTIPICA DE UN CULTIVO DE PAPA CRIOLLA (Solanum tuberosum Grupo 
Phureja, variedad criolla Colombia) IRRADIADA CON COBALTO 60 UBICADO EN EL MUNICIPIO EL 
ROSAL, FINCA EL PINO KM 16 VÍA SUBACHOQUE CUNDINAMARCA 
 
SEMILLERO: GRUPO DE INVESTIGACIÓN DE BIOLOGÍA MOLECULAR (BIOMOL) 
DIRECTOR: LUIS FRANCISCO BECERRA GALINDO 
ESTUDIANTE: JUAN DAVID GUZMÁN VÁSQUEZ (20091140062) 
 
INTRODUCCIÓN 
 
La papa criolla (Solanum phureja) es una especie diploide originaria de América tropical, derivada 
de Solanum Stenotonum, se distribuye desde el norte de Bolivia hasta el suroccidente venezolano 
con una gran diversidad genética al sur de Colombia en el departamento de Nariño. Este cultivo 
presenta importantes características agronómicas y nutritivas, un significativo mercado interno en 
Colombia y un alto potencial como producto de exportación. La variedad criolla Colombiana es 
una nueva variedad de papa criolla, liberada comercialmente durante el primer semestre del año 
2005, que presenta un mayor periodo de reposo respecto a otras variedades cultivadas, alto 
rendimiento por cosecha, frescura duradera, consistencia solida del producto, resistencia a 
enfermedades que atacan al cultivo como la gota (Farfán & Chaparro, 2007). 
 
A diferencia de otros productos vegetales, se almacena completamente hidratada, característica 
que dificulta su transporte y la convierte en un producto altamente perecedero. Las pérdidas 
anuales de estos tubérculos en poscosecha fluctúan entre el 10 y 15%, siendo la brotación 
prematura uno de los factores más limitantes (Rodriguez & Moreno, 2010). 
 
Solanum tuberosum grupo Phureja goza de gran aceptación en la canasta familiar debido a sus 
propiedades organolépticas, pero la ausencia del periodo de dormancia limita su transporte y 
distribución, debido a que el inicio de la tuberización se da gracias a señales ambientales, como 
cambios de temperatura, longitud del día o humedad relativa, desencadenando una rápida 
brotación del tubérculo. A su vez, esto determina que la comercialización y el procesamiento se 
deban realizar en el menor tiempo posible (Bonilla et al., 2009). 
 
Según la literatura la dormancia está determinada genéticamente con una influencia ambiental 
substancial, que es medida al menos en parte, por las fitohormonas ABA (ácido abscisico) y AG 
(ácido Giberelico). Debido a que este periodo está presente en todas las plantas superiores su 
ausencia o presencia está determinado por adaptaciones a ambientes divergentes. La mayoría de 
los genes involucrados en la dormancia, presentan también una función en la maduración e 
influyen en el metabolismo y percepción hormonal (Darinka, Covarrubias, & Beltran, 2013). La 
investigación acerca de los genes que intervienenen este periodo en solanum tuberosum grupo 
phureja es nula, es por esto que se tomará como patrón los reportes encontrados en Arabidopsis, 
planta utilizada como modelo para la investigación fitobiológica. 
 
En los tubérculos, las hormonas endógenas desempeñan un papel esencial en la regulación de la 
dormancia, especialmente en las fases de inducción y progresión, el periodo de dormancia del 
tubérculo está regulado por las concentraciones relativas de inhibidores y promotores de 
crecimiento, a esto se suma el hecho de que los tejidos de los tubérculos presentan sensibilidad 
diferencial a las hormonas, la cual además cambia según la edad fisiológica y el tiempo 
transcurrido después de la cosecha. Auxinas, giberelinas (GA), citoquininas, ácido abscísico (ABA), 
etileno y jasmonato han sido relacionados con el ciclo de vida del tubérculo. El ABA y el etileno se 
consideran inhibidores del crecimiento, mientras las giberelinas y las citoquininas actúan como 
promotoras del desarrollo de los brotes. El ABA es necesario para la iniciación y el mantenimiento 
de la dormancia, mientras que las citoquininas están implicadas en el cese de la misma. (Rodriguez 
& Moreno, 2010) 
En los ecotipos de Arabidopsis de baja dormancia y la accesión Cape Verde Island (Cvi) que 
presenta dormancia fuerte, se ha encontrado que el locus del gen DOG1 (Delay Of Germination) 
regula la latencia de las semillas. Alelos Mutantes que perdieron la función DOG1 (codifica para 
una proteína con función desconocida), son completamente no dormantes, sin fenotipos 
pleitrópicos obvios, lo que indica que DOG1 juega un papel crucial en la latencia. (Darinka, 
Covarrubias, & Beltran, 2013) 
 
Debido a la importancia del etileno en el proceso de dormancia y germinación, se debe tener en 
cuenta la ruta completa del mismo, pues en los genes y hormonas implicados puede haber uno o 
varios factores que se alterarían cuando se inhibe o acelera la germinación. 
 
 
 
Imagen 1: Ruta del Etileno y ABA. Fuente: (Arc et al, 2013).NCBI 
Gen EIN2: PROTEIN ETHYLENE 
INSENSITIVE2. Fuente: (Arc et al, 
2013).NCBI 
En esta imagen podemos observar como el etileno regula positivamente su propia biosíntesis, al 
actuar sobre la síntesis catalizada por la ACC ACS y su posterior conversión a etileno por ACO (Arc 
et al, 2013). 
Este último paso también está sujeto a la inhibición ABA. El etileno es percibido por los receptores 
(entre los que se encuentra ETR1) situados en el retículo endoplásmico; su unión conduce a la 
desactivación de los receptores que se convierten y se habilitan para reclutar CTR1 (Arc et al, 
2013). 
La liberación de la inhibición CTR1 permite que EIN2 actúe como un regulador positivo de la vía de 
señalización de etileno. EIN2 actúa aguas arriba de factores de transcripción nuclear, como EIN3, 
NDE, y ERBPs / ERF. El etileno regula a la baja acumulación de ABA, la inhibición de su síntesis, 
promover su inactivación, y también regula negativamente la señalización de ABA. En las semillas 
en germinación, NO aumenta el catabolismo de ABA y también puede regular negativamente la 
síntesis de ABA y la percepción (Arc et al, 2013). 
Según estudios realizados se analizaron los efectos de la radiación sobre semilla de papa criolla, se 
encontró una relación directa entre tiempo de exposición a los rayos gamma y aumento en el 
periodo de dormancia, gracias a la exposición de 10 genotipos de la Colección Central Colombiana 
de Papa a siete dosis de radiación gamma (Gomez, 1970). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 PLANTEAMIENTO 
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
 
La gran variabilidad genética de la papa permite su aprovechamiento en trabajos de resistencia o 
tolerancia a plagas, enfermedades y condiciones abióticas adversas; de igual forma posee 
características de tipo fenológico que permite adaptarlas a los requerimientos modernos. 
Cultivares de Solanum tuberosum Grupo Phureja, han sido ampliamente utilizados en 
investigaciones genéticas de la papa y en programas de mejoramiento; son una fuente valiosa por 
sus características de resistencia a plagas y a ciertas enfermedades virosas de la papa, 
adicionalmente, se ha reportado como fuente de tolerancia al calor (Piñeros, 2009). 
 
A diferencia de otros productos vegetales, la papa (Solanum tuberosum L.) se almacena 
completamente hidratada, característica que dificulta su transporte y la convierte en un producto 
altamente perecedero (Rodriguez & Moreno, 2010), de no ser así el tubérculo comienza a brotar 
rápidamente y pierde su condición como producto fresco. 
 
El 90% de la producción comercial de papa se realiza en terrenos de ladera y el 10% en suelos 
planos mecanizables. El marco socioeconómico bajo el cual se realiza la producción de papa criolla 
en Colombia se describe en una producción comercial que se realiza entre 2000 y 3500 msnm y la 
zona optima corresponde a zonas localizadas entre 2500 y 3000 msnm bajo diferentes esquemas 
de cultivo, según la tenencia de la tierra, principalmente en sistemas de arrendamiento y 
aparcería, así como en explotaciones de tierra propia; se desarrolla bajo esquemas de economía 
campesina, por parte de agricultores que trabajan en predios de minifundio. Las épocas de 
siembra están sujetas a las condiciones climáticas, especialmente régimen de lluvias y ocurrencia 
de heladas, ya que S. tuberosum grupo Phureja no presenta periodo de dormancia. Así mismo, 
predomina el sistema de producción con tecnología tradicional en cerca del 90% de los casos, 
mientras que el 10% adelanta el cultivo y las actividades complementarias con tecnología más 
avanzada (Piñeros, 2009). 
 
A pesar de los enormes progresos realizados en la última década, el conocimiento primario de los 
procesos que controlan la dormancia de este tubérculo es limitado. Se ha generado conocimiento 
reciente acerca de los efectos del estado de dormancia del tubérculo sobre la expresión de genes, 
niveles de proteína, actividad enzimática y contenido hormonal. Sin embargo, los procesos 
fundamentales que controlan la transición entre la detención del ciclo celular (depresión 
metabólica) y la reanudación del crecimiento de los meristemos y su actividad metabólica 
continúan sin conocerse por completo. (Rodriguez & Moreno, 2010). Según Freyre et al (1994) S. 
phureja contribuye con genes dominantes para la ausencia de dormancia en el tubérculo. Por lo 
tanto se hace necesario el desarrollo de nuevos cultivares de papa a nivel diploide que presenten 
periodo de dormancia. 
 
Con este proyecto de investigación se busca ampliar el conocimiento acerca de los procesos 
moleculares que intervienen en el periodo de dormancia de S. phureja, identificando así, la 
intervención del gen EIN2 en estas dinámicas y la expresión fenotípica que se dan en el cultivo. 
Todo esto con el fin de ampliar su rango de distribución y comercialización. 
 
1.2 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 
 
¿Existe diferencia en la dormancia de un cultivo de papa criolla (Solanum tuberosum grupo 
Phureja, variedad criolla colombiana) tratada bajo condiciones de irradiación con cobalto 60 
respecto a una sin irradiar? 
 
1.3 OBJETIVOS 
 
1.3.1 OBJETIVO GENERAL 
Identificar preliminarmente los cambios a nivel fenotípico de un cultivo de Solanum phureja 
irradiado con cobalto 60 ubicado en el municipio de El Rosal Cundinamarca. 
1.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
Evaluar cambios fenotípicos y tiempo de dormancia con respecto a la dosimetría empleada. 
Comprobar la presencia o ausencia de los genes relacionados con la dormancia mediante 
extracción del ADN de plántulas de Solanum tuberosum Grupo Phureja, variedad criolla Colombia 
en condiciones controladas de laboratorio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. MARCOS DE REFERENCIA 
 
2.1 ANTECEDENTES 
Romero (1965), evaluó el efecto del Cloro IPC (Isopropil-N-3-clorofenil-carbamato Cl –IPC e 
Isopropil carbanilato IPC) en dosisde 50 y 100 mg de Cl-IPC/kg y 2 g de IPC/kg en aplicación 
impregnando los tubérculos mediante inmersión y aspersión, para la inhibición de la brotación del 
tubérculo de papa de las variedades Diacol Capiro y Carreta Criolla. 
En 1989 tubérculos dormantes de varios cultivares de papa fueron irradiados con rayos gamma 
60Co en diferentes dosis. Los nuevos clones, con alto rendimiento, buena calidad y resistencia a 
enfermedades, fueron seleccionados. En adición, algunos problemas envueltos en el 
mejoramiento de papa por irradiación fueron también discutidos basados en comparaciones de 
los principales rasgos entre los clones derivados de los cultivares irradiados y los cultivares 
originales (Xie et al., 1989). 
(Viola et al. 2007) demostraron que la inducción de la tuberización y la elongación del estolón 
están asociadas con un cambio en la descarga del floema (de apoplástica a simplástica) en la 
región subapical anterior al meristemo. Además la elongación del estolón se asocia con un 
meristemo apical activo que recibe un flujo simplástico continuo de metabolitos, y la tuberización 
con un meristemo apical dormante aislado simplásticamente hasta el inicio de la brotación 
(Hancock, Roberts, & Viola, 2008). 
En 1970 entre el ICA y el Instituto de Asunto Nucleares realizaron avances y experimentos con un 
proyecto de mejoramiento genético en papa criolla (S. tuberosum grupo Phureja), con interés 
agronómico por medio de la mutagénesis, consiguiendo grandes resultados y provocando una 
tuberización más tardía, de 7 meses (Gómez, 1970). 
En una revisión de las características de la dormancia, se encontraron muchas hormonas 
implicadas en este proceso, concluyendo que es posible que en tubérculos de papa criolla la 
dormancia esté relacionada con un desbalance en el equilibrio ABA-citoquininas, debido a que en 
la fase final del desarrollo del follaje se sintetizan en mayor cantidad los inductores de la 
dormancia y la cosecha se realiza con el follaje verde antes de alcanzar su senescencia. (Rodriguez 
& Moreno, 2010) 
En Colombia, los trabajos iniciales relacionados con la genética y fitomejoramiento del grupo 
Phureja fueron desarrollados por investigadores del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), 
quienes en algunos casos la utilizaron como puente para introducir características valiosas en 
variedades con series cromosómicas diferentes. (Fedepapa, 2009). 
(Estrada, 1988) reportó por primera vez el uso de las papas diploides cultivadas a fin de transferir 
genes de resistencia a heladas a la papa común (Solanum tuberosum), aprovechando la condición 
diploide de las papas amarillas y su fácil cruzabilidad, tanto con especies diploides y tetraploides, 
así como silvestres y cultivadas. 
Andina, subregión montaña antioqueña (frío moderado). De la misma manera, pero mediante la 
Resolución 079 de octubre 25 de 2006, se registraron los genotipos 98-68.3 (Criolla Galeras) y 98-
70.10 (Criolla Guaneña) como nuevas variedades de papa criolla, en el Registro Nacional de 
Variedades Comerciales de Colombia, para su comercialización en la subregión natural Nudo de los 
Pastos (Herrera & Rodriguez, 2011). 
 
2.2 MARCO CONCEPTUAL 
La Papa criolla es también conocida como solanum phureja, pertenece a la clase Magnoliophyta; 
orden Solanales; familia Solanaceae y género Solanum; su adaptación es de 2600 a 2800 msnm, lo 
que equivale a un rango de temperatura promedio de 10º a 20º centígrados, requiere además una 
precipitación promedio de 900mm de lluvia al año, sin embargo, el cultivo se desarrolla bien con 
precipitaciones superiores (Cabezas & Corchuelo, 2005). 
Respecto a su caracterización morfológica, la raíz de papa criolla, es escasa, de poco volumen de 
expansión e ineficiente a la hora de tomar y absorber agua y nutrientes. La planta se caracteriza 
por tener un juego de tallos verdaderos (aéreos) y tallos modificados (estolones y tubérculos), Los 
tallos aéreos son herbáceos, de longitud y diámetro variables. Las plantas provenientes del 
tubérculo-semilla presentan, en promedio, cinco tallos los cuales ramifican de acuerdo a la 
densidad de siembra. Cada tallo se considera una unidad de producción independiente y puede 
llegar a producir entre 2.5 y 8.0 tubérculos. Las plantas provenientes de semilla sexual solo 
desarrollan un tallo principal proveniente del epicotilo del embrión (Cabezas & Corchuelo, 2005). 
Los estolones son tallos modificados laterales, de crecimiento subterráneo cuyo origen tiene lugar 
en las yemas axilares de los nudos basales en los tallos principales; terminan en forma de ganchos 
y en el extremo apical se originan los tubérculos. Debido a que el grupo Phureja presenta 
estolones cortos, se tiene como resultado un hábito de tuberización poco expandido, los 
tubérculos son órganos subterráneos cuyo origen lo conforma la curvatura subapical de los 
estolones. Funcionalmente, son estructuras de almacenamiento y conforman la principal forma de 
propagación asexual de la especie, morfológicamente, este tallo modificado presenta dos caras 
bien definidas, una proximal o basal, en el punto de inserción con el estolón o una apical, en el 
extremo opuesto, la cual contiene yemas potencialmente habilitadas para generar nuevos tallos y 
raíces (Cabezas M, 2002). 
 
 Imagen 2: Formación de tallo aéreo Imagen 3: Flor de Solanum phureja 
 
Las estructuras reproductivas, flor y fruto, son terminales; su aparición y desarrollo se da con la 
formación de estolones y tuberización respectivamente. La flor del Grupo Phureja es 
hermafrodita. Completa, pentámera y de colores variados, estambres prominentes y ovario 
supero. La inflorescencia se organiza en cimas; los frutos son bayas de color verde, esféricas y 
biloculares, con abundantes semillas. La semilla está recubierta por arilo y en el mesocarpio y 
epicarpio se encuentran altas cantidades de alcaloides. En su mayoría tóxicos. (Cabezas M, 2002) 
El ciclo vegetativo en la papa criolla es corto, pues solo requiere de 4 meses desde la siembra 
hasta la cosecha. (Arias, Bustos & Ñustez, 1996) 
Colombia es el mayor productor comercial, mayor consumidor y explotador de papas diploides en 
el mundo; tiene ventaja competitiva por ser centro de diversidad de Solanum phureja y porque 
existe gran aceptación en los consumidores, debido a las características organolépticas y 
nutricionales del tubérculo. Adicionalmente, en el país se ha desarrollado una amplia tradición 
como cultivo tecnificado, con potencial de industrialización y exportación (Rodríguez et al, 2009). 
Los genotipos comerciales de papa criolla se destacan por sus cualidades culinarias, agradable 
sabor, textura harinosa, fácil preparación, y alto potencial de exportación bajo diversas formas de 
procesamiento. Es de resalar que en la especie Solanum phureja se han reportado importantes 
diversidad en caracteres de importancia como proteína total y materia seca, vitaminas y 
carotenoides. Debido a la presencia de metabolitos secundarios, tales como compuestos fenólicos, 
carotenoides y alcaloides, esta papa diploide se puede incluir dentro de los llamados alimentos 
funcionales. De igual forma en la especie se ha evidenciado diversidad en los caracteres para la 
calidad de frito y se han seleccionado parentales contrastantes para dichos caracteres (Rodríguez 
et al, 2009). 
 
 
 
Juan Guzmán 
Juan Guzmán 
2.2.1 DORMANCIA 
El fenómeno de la dormancia es común, principalmente en semillas de determinadas hortalizas y 
forrajeras, algunas fruteras y de especies arbóreas y ornamentales, que no germinan después de la 
cosecha debido a los mecanismos internos, de naturaleza física o fisiológica, que bloquean la 
germinación (Merola & Diaz, 2012). 
Estos mecanismos son genéticos y acontecen durante el ciclo de vida de la especie, durante la 
maduración de la semilla, de modoque, después de la dispersión, la semilla todavía no estará apta 
para germinar (Merola & Diaz, 2012). 
La capacidad de las semillas para retrasar el proceso de germinación hasta que las condiciones 
ambientales sean ideales, que permitan los mecanismos de sobrevivencia de las plántulas, es 
conocida como dormancia. La dormancia puede ser clasificada en primaria y en secundaria, la 
dormancia primaria; es el tipo de dormancia más común en el que se puede encontrar las semillas, 
está dado por factores exógenos y endógenos. La dormancia exógena, hace referencia a las 
condiciones ambientales básicas que determinan el proceso de germinación como disponibilidad 
de agua, luz y temperatura. La absorción de agua por parte de la semilla está directamente 
influenciada por la presencia de la testa y la permeabilidad que ésta tenga al intercambio gaseoso; 
algunas familias como Fabaceae, Malvaceae, Chenopodiaceae y Liliaceae presentan problemas de 
permeabilidad del agua y son conocidas como semillas duras. El efecto de la testa puede ser 
mecánico, o químico debido a la presencia de inhibidores fenólicos, impidiendo el flujo necesario 
de agua y oxígeno para la germinación (Melgarejo & Suarez, 2014). 
La temperatura está frecuentemente asociada con el proceso de germinación por afectar el 
porcentaje de germinación, la tasa diaria de germinación, la tasa de absorción de agua, la 
velocidad de las reacciones enzimáticas y el transporte de las sustancias de reserva (Melgarejo & 
Suarez, 2014). 
En referencia a los requerimientos de luz necesarios para el proceso de germinación, las semillas 
se clasifican en tres grupos. El primer grupo corresponde o involucra a las semillas fotoblásticas 
positivas, ellas germinan como respuesta a la luz. En el segundo grupo están las fotoblásticas 
negativas, en él las semillas sólo germinan en oscuridad. En el tercer grupo están las semillas 
insensibles a la luz, germinan indistintamente bajo condiciones de luz u oscuridad (Melgarejo & 
Suarez, 2014). 
La dormancia endógena es el tipo de dormancia que es inherente a las características internas de 
la semilla, entre estos se encuentran: dormancia por embriones rudimentarios, dormancia por 
inhibición metabólica y dormancia por inhibición osmótica. Dentro de esta dormancia endógena 
se puede observar la inducida por embriones rudimentarios, la cual se presenta en algunas 
especies, en la cual el proceso de maduración morfológica del embrión ocurre después del 
proceso de dispersión, lo cual se convierte en un tipo de dormancia porque el embrión inmaduro 
es incapaz de germinar, algunas especies como Ranunculus, Plantago, Fraxinus, Viburnum, Ilex y 
Pinus presentan este tipo de dormancia que se caracteriza por la maduración del embrión días o 
semanas después del proceso de dispersión (Coopeland y McDonald1995). 
Respecto a la inhibición existen compuestos en las semillas que inhiben vías metabólicas 
específicas; por ejemplo, la presencia de cianuro en algunas semillas actúa inhibiendo la 
germinación debido a que bloquea la cadena de transporte de electrones en el proceso 
respiratorio; sin embargo, en muy bajas concentraciones el cianuro promueve el proceso de 
germinación (Coopeland y McDonald 1995). 
En los tubérculos, las hormonas endógenas desempeñan un papel esencial en la regulación de la 
dormancia, especialmente en las fases de inducción y progresión, el periodo de dormancia del 
tubérculo está regulado por las concentraciones relativas de inhibidores y promotores de 
crecimiento, a esto se suma el hecho de que los tejidos de los tubérculos presentan sensibilidad 
diferencial a las hormonas, la cual además cambia según la edad fisiológica y el tiempo 
transcurrido después de la cosecha. Auxinas, giberelinas (GA), citoquininas, ácido abscísico (ABA), 
etileno y jasmonato han sido relacionados con el ciclo de vida del tubérculo. El ABA y el etileno se 
consideran inhibidores del crecimiento, mientras las giberelinas y las citoquininas actúan como 
promotoras del desarrollo de los brotes. El ABA es necesario para la iniciación y el mantenimiento 
de la dormancia, mientras que las citoquininas están implicadas en el cese de la misma. (Rodriguez 
& Moreno, 2010) 
Finalmente, el tubérculo puede presentar una dormancia secundaria, la cual se caracteriza por 
presentarse en semillas no dormantes que encuentran condiciones óptimas para generar la 
inducción de la dormancia. Este tipo de situaciones puede ser causado por la exposición de las 
semillas a condiciones que favorecen la germinación junto con la exposición a un factor que 
bloquea y restringe el proceso de germinación. Aunque los mecanismos de dormancia secundaria 
pueden estar dados por el efecto de factores térmicos (temperatura), por presencia o ausencia de 
luz; este tipo de dormancia puede ser inducida por exceso o ausencia de agua, compuestos 
químicos y gases. (Melgarejo & Suarez, 2014) 
Durante el ciclo de vida los tubérculos de papa también pueden presentar tres tipos de dormancia: 
endodormancia, paradormancia y ecodormancia. Inmediatamente después de la formación del 
tubérculo, y por un periodo de tiempo determinado después de la cosecha, los meristemos de las 
yemas presentan endodormancia y no brotan. Durante un almacenamiento prolongado, los 
tubérculos pierden la endodormancia e inician la brotación. Por lo general, el brote apical se torna 
dominante e inhibe e crecimiento de los otros brotes, los cuales continúan en estado 
paradormante. Cuando los tubérculos son almacenados a temperaturas inferiores a 3°C no brotan, 
independientemente del grado de avance fisiológico de la dormancia, presentando un estado de 
ecodormancia (Rodriguez & Moreno, 2010) 
 
 
2.2.2 MUTAGENESIS 
Las mutaciones son cambios heredables en la secuencia de las bases de los ácidos nucleicos 
contenidos en el genoma de un organismo. Estas resultan ser la fuente más importante de 
variabilidad de todos los organismos y pueden ocurrir de manera espontánea durante la 
evolución, o ser inducidos mediante agentes físicos o químicos denominados mutagénicos. 
(Contreras, Caro, & Quevedo, 2006) Evolutivamente, las mutaciones más importantes son las que 
actúan de forma repetida sobre un determinado gen (mutaciones génicas recurrentes) y favorecen 
cambios rápidos (a escala evolutiva). 
La importancia de las mutaciones se pone de manifiesto en particular durante la adaptación de 
una población a un entorno nuevo, ya sea como consecuencia de importantes cambios 
medioambientales o por cambios de áreas geográficas. En estos casos, la presión selectiva 
aumenta extraordinariamente y favorece la supervivencia de aquellos individuos que portan las 
mutaciones adaptativas más favorables (Izquierdo, 2001). 
La inducción de mutaciones es una metodología muy importante en el mejoramiento de plantas, 
en especial cuando se desea mejorar una o dos características fácilmente identificables. 
Adicionalmente se caracterizan por ser un cambio, en general, irreversible de una característica 
del genoma. Este cambio, que por otro lado puede no ser observado inmediatamente a nivel de 
fenotipo, se transmite como un nuevo rasgo hereditario y se presenta bajo las formas más 
variadas y sutiles. Las mutaciones pueden ser espontáneas, si ocurren de modo natural, o 
inducidas por agentes específicos (Izquierdo, 2001). 
2.2.3 MUTÁGENOS FÍSICOS 
Los mutágenos físicos incluyen los diferentes tipos de radiaciones tales como rayos gamma, X, 
neutrones, ultravioleta, partículas alfa, beta y promotores o deuterones. Estas radiaciones pueden 
ser subdivididas en ionizantes y no ionizantes. Las radiaciones ionizantes tienen la capacidad de 
producir iones cuando interactúan con la materia, quitando electrones y dejando radicales libres, 
estas a su vez incluyen dos tipos diferentes de radiaciones: las radiaciones electromagnéticas y las 
radiaciones tipo partículas; las primeras involucran rayos X y rayos gammay las ultimas partículas 
como neutrones y protones. En las radiaciones no ionizantes no ocurre la remoción de electrones 
y la energía de estas radiaciones es transferida por un proceso denominado excitación (rayos 
ultravioleta) (Contreras, Caro, & Quevedo, 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
 
3. MARCO METODOLÓGICO 
 
3.1 LOCALIZACIÓN DEL EXPERIMENTO 
 
La fase de campo de la investigación consistió en la plantación de los tubérculos seleccionados de 
Solanum phureja, previamente analizados fenotípicamente (caracterización de tamaño, número 
de brotes, etc), esta se llevó a cabo en el municipio el Rosal, finca EL PINO Km 16 vía Subachoque 
Cundinamarca. El rosal, se ubica a 20 km de Bogotá, a una altitud de 2685 msnm y una superficie 
de 86.48 Km2; donde se realizó la plantación de los tubérculos de Solanum phureja. 
 
 
Imagen 4: Entrada Finca El Pino Imagen 5: Finca El Pino, cultivo Solanum phureja 
Las imágenes 4 y 5 corresponden a la Finca en donde se realizó la siembre e investigación. La 
realización de la fase de laboratorio consistió en la extracción del DNA de las plántulas y los 
correspondientes análisis de Cuantificación, PCR (Reacción en cadena de polimerasa) y 
Electroforesis en los laboratorios de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, sede 
Macarena B. 
 
3.2 MATERIALES Y RECURSOS 
 
Material vegetal: Tubérculos de papa criolla (Solanum phureja) variedad Criolla Colombiana VM5, 
de diferentes tamaños y cantidad de brotaciones posibles. 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
 
Imagen 6: Tubérculos seleccionados para sembrar Imagen 7: Tubérculos irradiados 
En la imagen #6 se observan los tubérculos de la M2 sin empacar, posteriormente fueron 
agrupados y se sembraron para dar origen al cultivo que fue objeto de nuestro estudio. Los 
ejemplares de la imagen #7 son los tubérculos irradiados. 
 
3.3 EQUIPOS 
Los equipos a utilizar se encuentran relacionados en la tabla 1. 
 
EQUIPO MARCA 
kit extracción de ADN Mo Bio 
NanoDrop 2000C Thermo 
Termociclador ESCO 
Centrifuga Eppendorf 
Cámaras de electroforesis BIO RAD 
Fuente de poder BIO RAD 
 Tabla 1: Equipos para la investigación 
Para la investigación se utilizaron muchos equipos, todos proporcionados por la Universidad 
Distrital Francisco Jóse de Caldas, fueron usados desde la extracción de DNA, con la centrifuga; el 
NanoDrop 2000C para la cuantificación; para la PCR se uso el termociclador y para la electroforesis 
se necesito la fuente de poder y el documentador de geles. Cabe resaltar que no se denotan y 
muestran varios equipos e instrumentos que se utilizaron en la investigación, pues los descritos en 
la imagen 8,9,10,11 y 12 son los más relevantes. 
 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
 
Imagen 8: Documentador de Geles Imagen 9: Termociclador Imagen 10: Fuente de poder 
 
 
 Imagen 11: Centrífuga Imagen 12: Nanodrop 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Juan Guzmán Juan Guzmán Juan Guzmán 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
4. PROCEDIMIENTO 
 
4.1 IRRADIACIÓN DE LOS TUBÉRCULOS 
 
Los tubérculos previamente seleccionados por cantidad de brotes se llevaron al reactor nuclear de 
Ingeominas donde se produjo la irradiación, allí se ubicaron a una distancia adecuada según la 
carga, potencia y emisión de cobalto 60 del reactor; esta relación caracteriza la cantidad de grays 
que recibirán los tubérculos, en este caso fueron 25 gy, ya que en trabajos previos a esta 
investigación (Zabala, 2011) identificó que la cantidad de grays no letales y que generan cambios 
significativos es 25gy. El diferencial entre los tubérculos es la cantidad de brotes que tiene cada 
uno. De esta manera las semillas estaban listas para su adecuada siembra. 
 
 
 Imagen 13: Tubérculos irradiados 
 
4.2 PLANTACIÓN DEL CULTIVO. 
 
Tal como se muestra en la imagen #14 se 
plantaron 11 transeptos o surcos, cada uno 
determinado por la cantidad de brotes que 
presenta el tubérculo, donde el surco #1 y #2 
son el tratamiento 1, es decir poseen un solo 
brote a la vista, surco #3 y #4 tratamiento 2, 
surco #5 y #6 tratamiento 3, surco #7 y #8 
tratamiento 4, surco #9 tratamiento 5 y los 
surcos #10 y #11 son el control. 
 
 
Imagen 14: Tubérculos sembrados y demarcados 
 
 
Juan Guzmán 
Juan Guzmán 
4. 3 TOMA DE DATOS FENOTÍPICOS. 
Se llevó a cabo tomando las respectivas fotos y mediciones fenotípicas, teniendo en cuenta la 
diferencia entre las plantas irradiadas y las plantas control, finalmente se realizó una matriz de 
datos que nos permitió hacer una relación entre todas las plantas. 
 
Imagen 15: Flor con Quimeras 
 
4.4 EXTRACCIÓN DE DNA 
Para la extracción de ADN, se tomó una gran cantidad de hojas de la planta Solanum phureja 
(tanto irradiadas como no irradiadas) luego se maceraron agregando nitrógeno líquido, de esta 
manera se pudo obtener el ADN aislado y extraído por medio de un kit de extracción Mo Bio, este 
nos proporcionó lo adecuado para que se efectúe la ruptura de membrana, núcleo y precipitación 
de proteínas, posteriormente se dejaron en la nevera de -4°C (Iowa, 2007). Con algunas muestras 
de DNA fue necesario purificarlas para mejorar la calidad y condiciones, esto se explica en el 
Anexo 1. 
 
Imagen 16: Recolección de material vegetal 
 
Juan Guzmán 
Juan Guzmán 
4.5 CUANTIFICACIÓN ADN. 
Para la determinación de calidad y cantidad de la extracción del ADN se realizó el procedimiento 
por medio de una cuantificación del mismo, esta consistió en utilizar las muestras de extracción 
que estaban en la nevera a -4°C y tomar 2,0μl, posteriormente se analizaron en el equipo 
Nanodrop 2000C; con este procedimiento se evidencia la cantidad de ADN. Al final se pudo 
escoger la muestra con mejores resultados, es decir la que tuvo menor contaminación y buena 
concentración de ácidos nucleicos. (Somma, 2010) 
 
4.6 AMPLIFICACIÓN POR PCR DEL GEN EIN2 
Para la estandarización de la PCR utilizamos el ADN seleccionado en nuestra cuantificación, 
además se diseñó el Primer EIN2 para amplificar, todo esto acompañado de varios reactivos 
(Buffer, MgCl2, DNTPs, Taq, H2O) y el termociclador para finalizar con la electroforesis (Asuar, 
2007). 
 
Imagen 17: Cámara para preparación de Maxter Mix 
4.7 ELECTROFORESIS. 
Para este procedimiento se preparó un gel de agarosa al 2% con ayuda del TBE (Tris-Borato-EDTA) 
y agarosa; posteriormente se adicionó SYBR buffer, se esperó 50 minutos para ver el resultado. 
Finalmente las muestras obtenidas anteriormente en PCR se llevaron a la cámara y fueron 
analizadas con el documentador de geles, según el espectro que recorra cada una con respecto al 
marcador de peso (Hyperladear II). 
4.8 ANÁLISIS DE DATOS 
Para este último paso se organizaron los resultados, sus respectivo análisis y al final las 
recomendaciones. 
 
 
Juan Guzmán 
 
5. RESULTADOS Y ANÁLISIS 
5.1 RESULTADOS FENOTIPÍCOS 
 
 
 Tabla 2: Matriz de datos Fenotípicos 
 
Datos tomados por cada visita que se realizó a la finca donde se encontraba el cultivo, se hizo con 
un tiempo moderado, para poder obtener resultados significativos y cambiables en cada toma de 
datos. Se creó un registro fotográfico y se tabularon los datos anteriormente mencionados en la 
matriz. 
 
 
 
5.1.1 ALTURA PROMEDIO DE LAS PLANTAS 
 
Tabla 3: Altura promedio de los tratamientos 
 
Como lo muestra la tabla # 3 se relacionan las alturas de los 4 tratamientos y el control, tomadas 
en 6 oportunidades, con un intervalo de 8 días entre ellas. A continuación se observa las 
diferencias en las alturas de cada tratamiento en tiempo diferente. 
TRATAMIENTO # 1 
 
Imagen 18: Semana1 Imagen 19: Semana 4 
 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
 
Imagen 20: Semana 8 Imagen 21: Semana 12 
 
TRATAMIENTOS # 2 
 
Imagen 22: Semana 1 Imagen 23: Semana 4 
 
 
Imagen 24: Semana 8 Imagen 25: Semana 12 
 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
TRATAMIENTO # 3 
 
Imagen 26: Semana 1 Imagen 27: Semana 4 
 
 
Imagen 28: Semana 8 Imagen 29: Semana 12 
 
TRATAMIENTO #4 
 
Imagen 30: Semana 1 Imagen 31: Semana 4 
 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
 
 
Imagen 32: Semana 8 Imagen 33: Semana 12 
 
CONTROL 
 
Imagen 34: Semana 1 Imagen 35: Semana 4 
 
 
Imagen 36: Semana 8 Imagen 37: Semana 12 
 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
5.1.2 COLOR DE LAS FLORES 
PLANTAS IRRADIADAS PLANTAS CONTROL 
 
Imagen 38: Flor Blanca plantas Irradiadas Imagen 39: Flor fucsia plantas Control 
 
 El color de las flores fue la característica fenotípica más notoria, pues en las referencias 
bibliográficas (Cabezas & Corchuelo, 2005), denotan las flores de la planta de color fucsia. En esta 
investigación las plantas irradiadas dieron flores color blancas, mientras los especímenes control 
siguieron con la misma tendencia normal de flores color fucsia. Finalmente se llegó a la conclusión 
que las semillas irradiadas de (Solanum tuberosum Grupo Phureja, variedad criolla Colombia) 
cambian de color sus flores de fucsia a blanco; todo esto argumentado en que el total de los 
tratamientos dieron la misma respuesta ante este estímulo, mientras las semillas irradiadas 
poseen al finalizar sus flores color fucsia. Presentándose así una alteración posible en el gen del 
color de las flores. 
QUIMERAS 
 
Imagen 40: Flor con Quimera, planta Irradiada 
En algunas plantas del cultivo se formaron 
quimeras, producidas en este caso porque la 
flor está constituida por dos tejidos de 
constitución genética diferente y se 
combinan en el mismo órgano (León, 2000), 
que en este caso son las flores. Estas 
quimeras se presentaron en todos los 
tratamientos, aunque con un bajo 
porcentaje, con un promedio del 5%. 
 
 
 
Juan Guzmán 
Juan Guzmán 
Juan Guzmán 
5.1.3 SANIDAD DE LAS PLANTAS 
 
Imagen 41: Hojas con hongo Imagen 42: plantas con afectación en la sanidad 
 
En las plantas es muy común encontrar enfermedades y plagas que afectan los cultivos, dañan las 
cosechas y perjudican a los cultivadores por ejemplo ( verticilllium spp.) en nuestra investigación. 
A pesar de que se realizaron las respectivas fumigaciones al iniciar la siembra y después de 
haberse hecho el aporque, se presentaron algunas plantas infestadas de este hongo. 
 
Gráfica 1: Porcentaje de Sanidad tratamiento #1 Gráfica 2: Sanidad en tratamiento #2 
En la gráfica #1 podemos observar que de las 107 plantas emergidas, 9 de ellas presentaron 
hongos en sus hojas, desarrollando así un porcentaje de sanidad del 92%. En cuanto a la imagen #2 
se observa enfermedad en el 11% de las plantas, correspondiente a 16 especímenes de 151 
sembradas. 
8% 
92% 
Tratamiento #1 
Plantas con hongo Plantas sanas
11% 
89% 
Tratamiento #2 
Plantas con hongo Plantas sanas
Juan Guzmán Juan Guzmán 
https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Verticilllium&action=edit&redlink=1
 
Grafica 3: Porcentaje sanidad tratamiento #3 Grafica 4: Sanidad en tratamiento #4 
 
La gráfica #3 nos muestra que el 11% (correspondiente a 9 plantas) representa la cantidad de 
ejemplares con hongo de las 81 germinadas; siendo este tratamiento y el tratamiento #2 los que 
presentaron mayor porcentaje de enfermedad entre todos los tratamientos. Por otro lado la 
gráfica #4 representa la sanidad del cuarto tratamiento, allí denotamos que de las 147 plantas 
germinadas 13 de ellas tuvieron hongo siendo así el 9%. 
 
 
Grafica 5: Porcentaje de sanidad Control 
 
En esta gráfica #5 podemos evidenciar el 
mayor porcentaje de plantas con hongo de 
toda la investigación, correspondiente a los 
ejemplares Control, con un 16% equivalente 
a 14 especímenes infectados con el hongo de 
86 germinados, con esto se corroboraría lo 
mencionado por (Xie et al., 1989) acerca de 
que la irradiación con rayos gamma 
proporciona resistencia a enfermedades. 
Todos las plantas presentaron hongos en las hojas al finalizar el ciclo, no existen diferencias entre 
los tratamientos sembrados, pues los porcentajes estan muy crecanos entre ellos. Las plantas 
control inversamente muestran una pequeña diferencia en la resistencia a este hongo 
(verticilllium spp.), fueron los especimenes con el mayor numero de plantas afectadas entre todo 
el cultivo; con un porcentaje del 16% no sanas. Esto podría llevar a concluir que en ciertas 
ocaciones la irradiaación puede otorgar un pequeño porcentaje de resistencia a afectaciones 
sobre las plantas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
11% 
89% 
Tratamiento #3 
Plantas con hongo Plantas sanas
9% 
91% 
Tratamiento #4 
Plantas con hongo Plantas sanas
16% 
84% 
Control 
Plantas con hongo Plantas sanas
https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Verticilllium&action=edit&redlink=1
5.1.4 GERMINACIÓN DE LAS PLANTAS
 
Imagen 43: Plantas germinadas 
Todas las plantas emergieron, algunas tardaron más tiempo que otras y con alturas variables. 
 
En cuanto a las plantas emergidas, se presenta un solo número por cada tratamiento, pues la 
misma cantidad de tubérculos sembrados se mantuvo hasta el momento de la cosecha. Este 
resultado demuestra que la irradiación de tubérculos y semillas no inhibe la germinación; sólo 
retrasa un poco el tiempo en que emergen los brotes y por consecuente el tiempo en que inicia su 
maduración. Así como lo menciona (Melgarejo & Suarez, 2014) diciendo que las semillas pueden 
retrazar su germinacion según las condiciones del ambiente. 
La letalidad de las plantas está directamente relacionada con el ítem anterior, como emergieron 
todos los tubérculos sembrados y se conservaron durante todo el ciclo, no hubo letalidad notoria; 
Esto sustentado en que se proporcionó la cantidad adecuada (25gy) de irradiación y se utilizó una 
mutación ya controlada para la última siembra, M2 (Xie et al., 1989). 
 
Juan Guzmán 
5.1.5 CAMBIOS EN LAS HOJAS 
 
 Imagen 44: hojas de plantas irradiadas Imagen 45: Hojas de plantas Control 
 
Las hojas de las plantas se analizaron y documentaron tanto en los especímenes control como en 
los irradiados, dando como resultado la ausencia de cambios morfológicos notables en ellas, 
presentando entre cada tratamiento un tamaño igual y coloración idéntica tal cuál como se 
observa en las imágenes 44 y 45. Se analizaron cada 8 días por un periodo de 4 meses, que 
corresponde al ciclo vegetativo de Solanum phureja según (Arias, Bustos & Ñustez, 1996). 
La cantidad promedio de brotes no parece ser un dato significativo, sino se tiene en cuenta el 
momento de la siembra, pues en la matriz de datos se encuentra constante en cada tratamiento y 
en las plantascontrol. Inicialmente se separaron y plantaron los tubérculos de acuerdo a la 
cantidad de brotes que presentaban en ese momento; si los tubérculos con un sólo brote visible 
germinaron y dieron origen a 7 brotes desde las primeras tomas de datos, quiere decir que la 
dormancia de la semilla se alargo un poco más, pero cuando terminó la latencia no perdio 
capacidad de germinación y brotó más que las plantas control. Este aconteciemiento se repite en 
los 3 tratamientos restantes, siendo así el control quien menos brotes originó. De esta manera se 
corroboraría lo mencionado por (Xie et al., 1989), que la irradiación afecta positivamente la 
dormancia y germinación de las plantas de (Solanum tuberosum grupo phureja, variedad criolla 
Colombiana) ya que reflejan un alto rendimiento, buena calidad y resistencia a enfermedades. 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
 
Imagen 46: Tubérculos seleccionados según la 
cantidad de brotes visibles 
 
En la imagen #46 se encuentran los 
tubérculos seleccionados por la cantidad de 
brotes visibles para su respectiva siembra, de 
esta manera dar inicio al ciclo vegetativo de 
la M2 irradiada, de la cual derivan los 
resultados de la investigación. 
 
5.2 RESULTADOS Y ANÁLISIS MOLECULARES 
5.2.1 CUANTIFICACIÓN 
 
 
 
 
Gráfica 6: Cuantificación de DNA QC-2 Gráfica 7: cuantificación de DNA T3-1 
 
Juan Guzmán 
 La determinación de calidad y cantidad de DNA se realizó con todas las muestras a las que se les 
hizo extracción de material genético; En la gráfica número 6 y 7 se observan de izquierda a 
derecha dos muestras, QC-2 y T3-1 respectivamente. Poseen un alto porcentaje de ácidos 
nucleicos, además las relaciones de absorbancia están en los niveles adecuados. 
Comprendiendo de esta manera que la relación de absorbancia a 260/280 se utiliza para evaluar la 
pureza de ADN. Una proporción de 1.8 está generalmente aceptada como "Puro" para el ADN. Si la 
relación es apreciablemente menor en cualquiera de los casos, esto puede indicar la presencia de 
proteína, fenol u otros contaminantes. Por otra parte La relación 260/230 se utiliza como una 
medida secundaria de la pureza del ácido nucleico. Los valores de para el ácido nucleico "puros" 
son a menudo más altos que la relación 260/280. De esta manera para al absorbancia de 260/230 
los valores esperados son comúnmente en el rango de 2.0-2.2. Si la proporción es sensiblemente 
inferior indica la presencia de contaminantes que absorben a 230 (Technical support bulletin, 
2007). 
 
En la parte molecular se cumplió con el objetivo estipulado, se logró en primera instancia 
estandarizar todos los reactivos y procedimientos correspondientes a la PCR y Electroforesis, para 
finalmente obtener una amplificación del gen EIN2. 
5.2.2 ESTANDARIZACIÓN 
5.2.2.1 SINTETIZACIÓN DEL PRIMER 
Nombre Secuencia 
EIN2F CACCATCTCCTCGTTCTGTATC 
EIN2R CCACAACTCTGGCCTACTTT 
Tabla 4: Secuencia del Primer 
Por medio del programa IDT (INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES) y NCBI (NATIONAL CENTER FOR 
BIOTECHNOLOGY INFORMATION) se obtuvo la secuencia del Primer, ésta se mandó a sintetizar a 
la empresa (Biosearch Technologies). 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
 
Grafica 8: Características del Primer diseñado (Tomado de: IDT/INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES) 
 
5.2.2.2 MAXTER MIX 
REACTIVOS CONCENTRACIÓN VOLUMEN (x tubo) 
H2O 8.75 μl 
BUFFER 5 X 5 μl 
MgCl2 25 mM 3,4 μl 
DNTPs 10 mM 0,5 μl 
PRIMER F 5 μM 3 μl 
PRIMER R 5 μM 3 μl 
TAQ 5 U 0,25 μl 
DNA 50 μM 2 μl 
Total 25 μl 
Tabla 5: Estandarización de la Maxter Mix 
En la tabla #5 se observa la concentración a la que se utilizó cada uno de los reactivos, también se 
encuentra el volumen de estos, pueden ser modificables de acuerdo a la concentración que 
tengan los reactivos desde su fabricación. Aunque cabe resaltar que la concentración del DNA 
puede ser modificada dependiendo de su estado, relación de proteínas y calidad. 
5.2.2.3 CONDICIONES DE PCR Y ELECTROFORESIS PARA EIN2 
CICLO TEMPERATURA TIEMPO 
1 94°C 1 min 
2 94°C 30 seg 
3 61°C 45 seg 
4 72°C 1 min 
5 72°C 7 min 
6 04°C 8 min 
7 04°C 10 min 
Tabla 6: Condiciones para el termociclador 
 
 
Temperatura de anillamiento: 61°C 
Cantidad de ciclos: 35 
 
En la tabla #6 se encuentra especificado el 
tiempo y temperatura que requiere cada 
ciclo para poder amplificar el segmento 
requerido. 
 
ELECTROFORESIS 
Marcador de peso: Hyperladear II -- 3 μl 
 
Voltaje: 110 v 
 
Producto de PCR: 5 μl 
 
Miliamperios: 150 mA 
 
Buffer: 3 μl 
 
Tiempo: 50 min 
 
Gel: Agarosa -- 2% 
 
 
Tabla 7: Reactivos y cantidad adecuada
En la tabla #7 están descritos los reactivos con el respectivo volumen que se utilizó para 
estandarizar la electroforesis, con esto se aseguraría que las muestras corrieran a través del gel y 
el marcador de peso mostrara las bandas de pares de bases correctas. 
5.2.3 ELECTROFORESIS
 
 
5.2.3.1 ACTINA 
PRUEBAS PARA AMPLIFICACIÓN DEL GEN CONTROL- ACTINA 
 
Imagen 47: Prueba de Actina 
 
Podemos observar una amplificación de la 
proteína Actina. Se utiliza esta proteína por 
varias razones, en primera instancia para 
optimizar la técnica de PCR, también se usa 
para estandarizar los reactivos, comprobar la 
eficacia y buen estado de estos, finalmente 
para corroborar que el DNA a utilizar está en 
buenas condiciones. Se utilizó el marcador 
de peso Hyperladder II; la Actina amplifica 
para una cantidad de 300bp (pares de bases). 
Después de varios intentos en la imagen #47 
de izquierda a derecha se muestra la 
amplificación de una de las tres muestras de 
DNA. Siendo un resultado positivo, ya que la 
Actina es un gen constitutivo y normalizador 
que está presente en el desarrollo de todas 
las plantas y así continuar el proceso de 
amplificación.
5.2.3.2 GRADIENTE DE TEMPERATURA 
 
 
Juan Guzmán 
PRUEBAS DE ACTINA Y EIN2 CON GRADIENTE DE TEMPERATURA 
 
 
Imagen 48: Gradiente de temperatura en actina Imagen 49: Gradiente de temperatura 
En la imagen #48 y #49 de izquierda a derecha se encuentra el marcador de peso, luego las 
muestras de PCR a diferente temperatura de anillamiento, con el fin de encontrar la temperatura 
en la que mejor amplifica la muestra y donde más nítida se observe la banda. Se puede observar 
una amplificación de Actina con bandas poco visibles, amplificando desde un gradiente de 59°C a 
61°C. 
 
 
Imagen 50: Gradiente de temperatura positivo Imagen 51: Corroboración del Gradiente de temperatura 
Debido a que la temperatura de anillamiento que nos proporciona el programa (IDT) es diferente a 
la obtenida por la fórmula: 2(A + T)+ 4 (C + G) procedimos a realizar pruebas de actina con 
gradiente de temperatura. En la imagen #50 se utilizó un gradiente de temperatura desde 58°C a 
63°C para EIN2; dando como resultado positivo amplificación muy notoria para las temperaturas 
de 61°C, 62°C y 63°C. Se repitió el procedimiento como se ilustra en la imagen #51 para confirmar 
y escoger una de estas tres temperaturas que nos arrojaron buen resultado, siendo así la banda de 
amplificación de 61°C la que mejor corrió, se ve más nítida, menos concentrada y nada 
distorsionada. 
Juan Guzmán 
Juan Guzmán 
Juan Guzmán 
Juan Guzmán 
 
Imagen 52: Resultado de temperatura final 
 En la imagen #52 se realiza la última 
conformación de temperatura utilizando solo 
la de 61°C pero a una concentración de DNA 
diferente. El marcador de peso no corrió bien 
y no permite observar la cantidad exacta de 
pares de bases que amplifica cada banda de 
EIN2 y corroborar así que la muestra tenga 
974bp aproximadamente, pero si muestra 
una amplificación nítida y positiva. 
 
 
5.2.3.3 CONCENTRACIÓN DE CLORURO DE MAGNESIO (MgCl2) 
 
AMPLIFICACIÓN DE ACTINA CON DIFERENTECONCENTRACIÓN DE MgCl2 
 
 
Imagen 53: Concentración de MgCl2. 
Se realizaron varias pruebas y a diferentes concentraciones de MgCl2, entre ellas la imagen #52 
muestra la concentración que dio mejor resultado entre las amplificaciones de Actina; en todas se 
alcanzaba a denotar banda en 3,3μl y 3,5μl (microlitros) de MgCl2 para las 300 bp que debe correr 
la actina, conllevando de esta manera a que optáramos por utilizar el promedio de 3,4μl para 
nuestras PCR futuras. 
 
Juan Guzmán 
Juan Guzmán 
5.2.3.4 AMLPIFICACIÓN DE EIN2 
PRUEBAS DE AMPLIFICACIÓN DE EIN2 
 
 
Imagen 54: Prueba de EIN2 Imagen 55: Confirmación de la amplificación 
 
 
En esta etapa se realizaron pruebas para amplificar, con un ADN de las plantas en estudio pero, 
sin denotar específicamente cuál de ellos era, pues el objetivo era observar que el Primer 
amplificó para las 974 bp aproximadamente que teóricamente debería mostrar según el programa 
IDT, todo esto con las condiciones, concentración y volumen que nos habían arrojado la 
estandarización expresada en la Maxter Mix. 
La imagen #54 de izquierda a derecha, el MP II (marcador de peso) y luego dos productos de PCR 
que muestran la amplificación de EIN2 a dos concentraciones diferentes 50 μM y 15 μM 
respectivamente. Como el marcador de peso no corrió de la manera adecuada y denota una 
amplificación de más de 1000bp; por este motivo nuestras bandas podrían no ser DNA amplificado 
sino dímeros. La prueba siguiente consistía en montar una PCR como la anterior más un tubo igual 
pero sin DNA, todo esto con el fin de cerciorarnos de que lo amplificado no son dímeros y que el 
marcador de peso nos muestre las bandas correctas. El resultado fue positivo como lo muestra la 
imagen 55 de izquierda a derecha, la primer banda es el marcador de peso, luego tenemos las dos 
bandas de EIN2 amplificado a 1000bp, después está la muestra de PCR sin DNA, donde se ve una 
banda en la parte inferior que corresponde a los dímeros y finalmente están dos bandas de HC 
(Hormona de crecimiento) se puso para comprobar que todos los reactivos están funcionando 
correctamente y que las siguientes amplificaciones deben salir positivas si el gen se expresa para 
las muestras de DNA en estudio. 
 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
AMPLIFICACIÓN FINAL DE EIN2 
 
 
 Imagen 56: Amplificación positiva de T1-3 Imagen 57: Prueba de marcador de peso 
 
En la imagen #56 se observa la amplificación de una sola muestra, correspondiente a T1-3, ubicada 
después del marcador de peso de izquierda a derecha; amplificó aproximadamente 1000bp, es 
decir amplificó para el gen EIN2 en Solanum phureja, las otras muestras no corrieron y algunas 
marcaron sólo dímeros. Por otro lado en la imagen #57 se encuentra la última prueba del 
marcador de peso para estandarizarlo, dando mejor resultado el MPII, con adición de Buffer y con 
un volumen de 3 μl, de ahí en adelante todas las electroforesis se corrieron siguiendo estas 
condiciones para el marcador de peso. 
 
 
 Imagen 58: Amplificación de Q3-3, Q4-2, Q4-3 Imagen 59: Amplificación de T3-1, Q4-1, QC-2 
Juan Guzmán Juan Guzmán 
Juan Guzmán 
Juan Guzmán 
Se procedió a sembrar por grupos las muestras amplificadas, obteniendo algunas muestras 
positivas y otras negativas, en la imagen #58 vemos de izquierda a derecha el MPII, luego dos 
muestras que no dieron buen resultado y posteriormente 3 DNA que si amplificaron para el gen 
EIN2, de la misma manera ocurrió en la imagen #59 donde se observan 3 bandas de amplificación 
positivas para el gen EIN2. Todos los ejemplares tienen una buena expresión de las bandas de DNA 
amplificado. 
 
 Imagen 60: Amplificación positiva Imagen 6156: Amplificación control 
En esta imagen #60 se obtuvo un mejor resultado, pues de las 9 muestras sembradas en la 
electroforesis, 7 de ellas amplificaron para el gen EIN2 correctamente, además se observa algo 
muy importante, una amplificación de C2 (una de las muestras control) y QC-3 (muestra control de 
quimeras), su banda es menos nítida, lo que llevaría a deducir que posee menor capacidad de 
expresión al gen que los tratamientos que fueron irradiados. En cuanto a la imagen #61 podemos 
corroborar lo mencionado anteriormente, de todas las muestras sembradas, sólo amplificó una 
control correspondiente a C1; allí se denota que la amplificación es correcta y con la cantidad de 
pares de bases adecuadas para el gen y primer utilizados, pero igual que en la anterior imagen se 
expresa en menor proporción que las muestras irradiadas. 
 
 Imagen 57: Amplificación de EIN2 positiva 
 
En esta última imagen (#62), se recopiló las 
muestras que anteriormente habían 
amplificado pero el marcador de peso no 
corrió de la manera adecuada para denotar 
la cantidad exacta o aproximada de pares de 
bases. Aquí observamos 7 bandas de DNA 
que presentan una alta expresión ante el gen 
EIN2, sustentado la teoría de afectación de la 
irradiación en la ruta del etileno. 
 
 
 
Juan Guzmán 
Juan Guzmán 
Juan Guzmán 
CONCLUSIONES 
 
La irradiación con cobalto 60 afecta positivamente la dormancia, permitiendo así que la 
germinación se atrase un poco. Se presentaron cambios fenotípicos muy notorios (color de las 
flores), mientras las plantas irradiadas tienen color blanco en las flores, los ejemplares control 
poseen las flores color fucsia. 
 
Se estandarizó la Maxter MIx, las concentraciones y volúmenes adecuados para la correcta 
amplificación. Además se estandarizaron las condiciones de la electroforesis, voltaje, miliamperios, 
tiempo, marcador de peso y porcentaje del gel. Esto incluyó también el diseño del Primer y su 
respectiva síntesis. 
 
Se logró amplificar el gen EIN2, con esto se cumplió con el objetivo y se comprobó la presencia del 
gen implicado en la ruta del etileno, mostrándose una diferencia cualitativa en la expresión de las 
plantas control y las irradiadas. De esta manera el paso siguiente sería determinar por medio de 
una PCR Real Time la diferencia cuantitativa de la expresión del Gen EIN2 entre los especímenes 
irradiados y los ejemplares control. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANEXOS 
 
ANEXO 1 
 
PROTOCOLO PARA PURIFICACIÓN DEL DNA 
 
1 Adicionar 200 μl de etanol frío 
 
2 Adicionar 10 μl de acetato de sodio 
 
3 Mezclar por inversión 
 
4 Incubar a -80°C por 10 minutos 
 
5 Centrifuga a 14000 rpm por 20-30 minutos a 4°C 
 
6 Descartar Líquido por baño seco 
 
7 Resuspender en 20 μl de H2O estéril o en lisis 6 (también puede ser la solución PD7) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
 
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