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Cuerpo Animal

•

Vicente Riva Palacio

Estudante PD

26/3/2024

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Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

“Vertederos como puntos calientes para la
transmisión de patógenos – estudio de caso
en la cigüeña blanca (Ciconia ciconia)”

Máster Universitario en Investigación Básica
y Aplicada en Recursos Cinegéticos (MUIBARC)
Trabajo de Fin de Máster
2020/2021

Marta Oliván Nerín
Directora
Úrsula Höfle Hansen

“Vertederos como puntos calientes
para la transmisión de patógenos –
estudio de caso en la cigüeña
blanca”

VºBº Úrsula Höfle Hansen

Marta Oliván Nerín
Índice

1. Resumen ........................................................................................................ 1
Abstract .......................................................................................................... 2
2. Introducción .................................................................................................... 4
3. Material y métodos ....................................................................................... 12
3.1. Área de muestro y toma de muestras .................................................... 12
3.2. Ejemplares muestreados ....................................................................... 12
3.3. Toma de muestras ................................................................................. 13
3.4. Análisis de laboratorio ............................................................................ 13
3.3 Análisis de datos ..................................................................................... 19
4. Resultados ................................................................................................... 22
5. Discusión ...................................................................................................... 29
6. Conclusiones ................................................................................................ 34
Agradecimientos ............................................................................................... 35
Bibliografía ....................................................................................................... 36

Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

1. Resumen
Los vertederos suponen áreas de suministro constante y abundante de alimento
idóneas para la fauna silvestre. Este factor provoca la agregación de un elevado
número de animales de muchas especies diferentes y, por lo tanto, un potencial
escenario para la transmisión de patógenos entre ellos. Por esta razón, es
importante estudiar en estas áreas la posible transmisión de patógenos entre
ellos y la exposición a bacterias resistentes a los antimicrobianos, que ya ha sido
demostrada.
En este estudio evaluamos como la asociación con los vertederos y el diferente
comportamiento de las cigüeñas blancas puede afectar a la prevalencia de
diferentes patógenos en individuos muestreados de colonias del Sur de Portugal
con distinto uso de vertederos.
Para ello, se marcaron adultos de cigüeñas blancas con transmisores satélites,
gracias a los cuales se seleccionaron las colonias de muestreo y se obtuvieron
datos del comportamiento migratorio que presentan los padres de los pollos
muestreados y del uso de vertedero que realizan. Este último dato, junto con la
distancia a vertedero, se empleó para determinar la frecuencia de uso de
vertedero. De cada uno de los ejemplares muestreados se tomaron medidas
biométricas, muestras de pluma en crecimiento, sangre e hisopos orales y
cloacales, para realizar la determinación molecular del sexo y de presencia de
los patógenos los patógenos de Influenza aviar, Flavivirus, Avulavirus aviar-1,
Coronavirus aviar, Herpesvirus y Malaria aviar, detectar anticuerpos frente a
virus West Nile (WNV), Influenza aviar (VIA) y Avulavirus aviar-1 (AaV1), y
descubrir la presencia de las bacterias E. Coli y Salmonella spp., así como los
fenotipos de resistencia de los aislados de E. Coli a los antibióticos
Enrofloxacina, Cefotaxima y Gentamicina.
Del total de individuos muestreados (156), 48 fueron adultos y 108 pollos. Se
detectó una significativamente mejor condición física en los adultos que hacían
un mayor uso de los vertederos.
Se evidenció por PCR infección por WNV (0,64%, 1/156), AaV1 (1,28%, 2/156)
y Malaria aviar (3,87%, 5/129). Mediante ELISA se detectó la exposición a los
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

virus WNV (10,28%, 11/107), VIA 6,45%, 8/124) y AaV1 (31,25%, 35/112),
apareciendo significativamente mayores prevalencias en adultos.
E.coli se detectó con mayor frecuencia en los pollos que en los adultos y entre
los aislados de E.coli, los fenotipos de resistencia frente a los antimicrobiales
Enrofloxacina, Gentamicina y Cefotaxima, fueron significativamente más
frecuentes en los pollos de cigüeña blanca.
Nuestros datos sugieren que la asociación a vertederos no influye en la
susceptibilidad a patógenos característicos de la especie, pero sí en la de
fenotipos de resistencia, lo que evidenciaría el papel que pueden suponer estos
animales como potenciales centinela y dispersores de las mismas en el
ambiente. Por el riesgo que supone esto último tanto para la salud animal como
humana, se deberían tomar más medidas para el control la presencia de residuos
de antibióticos en las basuras.
Abstract
Landfills provide a constant and abundant food supply for wildlife adapted to
exploiting anthropized habitats. This causes the aggregation of a high number of
animals of many different species and, therefore, a potential scenario for the
circulation of pathogens. For this reason, in these areas is important to study if
the prevalence of transmission of pathogens in the species that exploit landfills
as well as the exposure to antimicrobials, which has already been demonstrated.
In this study we evaluate how landfill use and different behaviour of white storks
may affect the prevalence of different pathogens in individuals sampled from
colonies in southern Portugal with different landfill use.
For this purpose, adult white storks were camptured on landfills and marked with
satellite transmitters, which allowed for detection of their home colonies. In
addition, we obtained data on the migratory behaviour of the parents of the chicks
sampled and their use of the landfill. The latter data, together with the distance to
landfill, allowed us to calculate landfill use frequency. Biometric measurements,
pulp feathers, blood samples and oral and cloacal swabs were taken from each
of these individuals for molecular determination of sex and detection of avian
influenza, flavivirus, avian avulavirus-1, avian coronavirus, herpesvirus and avian
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

malaria, determination of antibodies against West Nile virus (WNV), avian
influenza virus (AIV) and avian avulavirus-1 (AaV1), detection of E. coli and
Salmonella spp, as well as the resistance phenotypes of the isolated E. coli to
the antibiotics Enrofloxacin, Cefotaxime and Gentamycin.
Of the total number of individuals sampled (156), 48 were adults and 108 chicks.
Higher frequency of landfill use was associated with better body condition in
adults.
WNV (0.64%, 1/156), AaV1 (1.28%, 2/156) and avian malaria (3.87%, 5/129)
infection was evidenced by PCR. Exposure to WNV (10.28%, 11/107), AIV
(6.45%, 8/124) and AaV1 (31.25%, 35/112) was detected by ELISA, with higher
prevalences in adults.
E.coli was detected more frequently in chicks than in adults and among E.coli
isolates, resistance phenotypes against the antimicrobials Enrofloxacin,
Gentamicin and Cefotaxime were significantly more frequent in white storkchickens.
Our data suggest that landfill association does not influence susceptibility to
pathogens characteristic of the species, but it does influence carriage of
multirestant bacteria, which would indicate the role of these animals as potential
sentinels and dispersers of pathogens in the environment. Because of the risk
posed by the latter to both animal and human health, more measures should be
taken to control the presence of antibiotic residues in litter.

Palabras clave: vertedero de residuos sólidos urbanos (VRSU), patógenos,
cigüeña blanca (Ciconia ciconia), virus, bacterias, virus de West Nile, Influenza
aviar, Avulavirus aviar-1, Herpesvirus, Coronavirus aviar, Malaria aviar, E. Coli,
Salmonella spp., fenotipos de resistencia a antibióticos.

Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

2. Introducción
El aumento de la población humana lleva consigo un incremento de los residuos
que se generan. Se estima que, de la cantidad total que se produce de alimentos,
un 30-40% se desperdicia (Parfitt et al., 2010). De estos desechos, el 59% se
elimina en vertederos (Hoornweg & Bhada-Tata, 2012), por lo que estas áreas
suponen un suministro constante y abundante de desechos orgánicos y, por lo
tanto, una fuente de alimento perfecta para la fauna silvestre.
En el caso de la cigüeña blanca (Ciconia ciconia), se trata de una buena especie
modelo para el estudio del uso de los vertederos ya que, desde que se
comenzaron a implementar estas áreas a finales de 1980, se ha ido
incrementando constantemente la presencia de estos animales en los mismos
(Tortosa et al., 2002).
En la bibliografía, se encuentran numerosos estudios de como los vertederos
pueden afectar o beneficiar a la cigüeña blanca en muchos ámbitos. De forma
positiva, los rellenos sanitarios facilitan el acceso de alimento para esta especie,
por lo que reduce tanto los costes energéticos asociados con la búsqueda de
alimentos en la naturaleza, como la competencia por los recursos alimenticios
(Gilbert et al., 2016). Menor coste energético en este tipo de actividades permite
el mejor desarrollo de otras como la reproducción.
Otro factor importante que se ha visto influenciado por la existencia de los
vertederos es el cambio en su comportamiento de migración, y muchas ya
permanecen el invierno en la Península Ibérica, lo que tiene también
consecuencias como la reducción de la mortalidad de estos individuos (Tortosa
et al., 2002; Vergara et al., 2007). Además, se ha visto que no solo mejora la
condición corporal de los animales que se alimentan en estas áreas, también se
ven mejorados los parámetros reproductivos, ya que la permanencia durante el
invierno permite la ocupación de los mejores lugares de anidación, lo que
proporciona un inicio más temprano de la reproducción, factor que se relaciona
con nidadas más grandes y mayor éxito reproductivo (Vergara et al., 2007;
Gilbert et al., 2016).
Sin embargo, los alimentos suelen ser de mala calidad, al final se trata de sobras
de origen antropogénico, y que además se mezclan con elementos perjudiciales
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

como productos tóxicos, metales pesados, plásticos, vidrios, que pueden acabar
provocando amputaciones, asfixia o intoxicación. De igual forma, se puede
relacionar con falta de micronutrientes esenciales (Tauler-Ametller, 2019) que,
aunque se ha dicho anteriormente que las cigüeñas que consumen estos
alimentos tienen mejores condiciones corporales, pueden poner en peligro la
supervivencia del individuo en el futuro.
No obstante, el factor más importante con relación a lo que se va a estudiar en
este documento, es que la presencia de vertederos favorece la agregación de un
elevado número de animales de muchas especies diferentes que puede dar lugar
a la transmisión de patógenos entre ellos (Plaza & Lambertucci, 2017; Höfle et
al., 2020), y con ello, la aparición de brotes que pueden afectar a las poblaciones
de la especie. Además, las cigüeñas pueden transportar estos patógenos desde
el vertedero al nido en su cuerpo, en el material de nidada o en la comida,
modificando de esta forma la microbiota del nido. De hecho, cada vez es más
frecuente la detección de microorganismos resistentes a antimicrobianos en
poblaciones de cigüeñas que se alimentan o anidan cerca de los vertederos
(Höfle et al., 2003; Camacho et al., 2016; Höfle et al., 2020; Martín-Maldonado
et al., 2020). Al final, esto representa una importante preocupación tanto por el
potencial de dispersión de patógenos por estas aves durante los movimientos
locales y migratorios como por los efectos potenciales sobre la supervivencia de
los pollos (Ciach & Kruszyk, 2010).

Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

Figura 1: Agregación de diferentes especies, cigüeñas blancas (Ciconia ciconia) y Garcillas
bueyeras (Bubulcus ibis), en un vertedero de la provincia de Ciudad Real. Fotografía de: Teresa
Cardona Cabrera.
Teniendo en cuenta los factores anteriores y que, además, las cigüeñas se
desplazan por otros ambientes como humedales en los que se encuentran otras
especies, localizaciones cerca de ganado o ambientes antropizados a parte de
vertederos, la transmisión de una gran variedad de patógenos por parte de estos
animales puede suponer un importante factor de riesgo.
En diferentes ocasiones se han detectado brotes causados por distintos
patógenos víricos en la cigüeña blanca (Kaleta et al., 1986; Malkinson et al.,
2002; Schoener et al., 2014). Por esta razón, a continuación, se va a resumir las
características y el efecto sobre la especie modelo de cada patógeno estudiado
en concreto.
INFLUENZA AVIAR
En el caso del virus de Influenza Aviar (VIA), se trata de un virus de ARN cuya
clasificación se basa en las propiedades de las glucoproteínas transmembrana
hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). El virus también se clasifica según su
patogenicidad para el animal en alta y baja patogenicidad. Los virus de baja
patogenicidad (vIABP) son los que generalmente circulan en los ecosistemas y
los de alta patogenicidad (vIAAP), que provocan una enfermedad sistémica cuya
mortalidad en aves domésticas puede alcanzar el 100% de las aves, aunque solo
es causada por algunas cepas de los subtipos H5 y H7 (Henriques et al., 2011).
La transmisión de los vIABP se da fundamentalmente por vía feco-oral ya que
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este virus se replica en el tracto intestinal de las aves y los viriones se liberan
con las heces (Webster et al., 1992).
El contacto con las aves silvestres, directo o indirecto, es la principal forma de
exposición al virus de las aves domésticas. Además, la coincidencia entre la
expansión de estas cepas a lo largo de las rutas migratorias demuestra que el
virus de la influenza aviar puede ser transmitido por los movimientos de estas
aves (Verhagen et al., 2021).
En el caso de la Península Ibérica, la prevalencia del virus fluctúa según la
época, la ubicación y las especies hospedadoras del patógeno, habiéndose
descrito prevalencias entre 0.60% hasta 7.67% en diferentes estudios (Pérez-
Ramírez et al., 2010; Busquets et al., 2010; Pérez-Ramírez et al., 2012; Bárbara
et al., 2017).
En el caso de nuestra especie modelo, la cigüeña blanca, existe un estudio en el
que se examinaron 191 muestras de plasma para la detección de anticuerpos
frente los subtipos H5 y H7, pero no se encontró ningún positivo (Kaleta et al.,
2012). Sin embargo, puntualmente se producen alertas, como es el caso de la
detección de la cepa H5N8 de alta patogenicidad en 3 cigüeñas muertas en
Cataluña este mismo año, 2021 (Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación,
2021).
Por esta razón, una monitorización del patógeno en las aves silvestres es
importante para evitar brotes que puedanperjudicar tanto animales domésticos
como humanos en el caso de cepas zoonóticas.
WEST NILE VIRUS
El virus de West-Nile o del Nilo occidental (WNV) tiene también importancia en
la fauna silvestre. Se trata de un flavivirus ARN que se caracteriza por
transmitirse fundamentalmente por mosquitos del género Culex. Este patógeno
tiene el potencial de infectar otros vertebrados, incluyendo humanos, los cuales
se consideran hospedadores accidentales dado que no desarrollan viremia
suficiente para infectar mosquitos. Sin embargo, las aves están reconocidas
como uno de los principales reservorios del virus (López et al., 2011).
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

Debido a su capacidad de infectar a una amplia gama de hospedadores y la
movilidad de sus reservorios aviares, este arbovirus está distribuido
mundialmente (Figuerola et al., 2008).
Uno de los brotes de fiebre del Nilo en aves más importantes que se han
documentado fue en Israel en 1998, en el que este virus fue aislado de individuos
fallecidos de una bandada de 1200 cigüeñas blancas que una tormenta había
desviado de su ruta migratoria (Malkinson et al., 2002). Debido al
comportamiento migratorio de esta especie, se responsabilizó a las cigüeñas
afectadas de la introducción del virus en este país.
En 1999, este virus fue detectado por primera vez en Estados Unidos (Gubler,
2009; Artsob et al., 2009), expandiéndose rápidamente por todo el país causando
recurrentes brotes en aves, équidos y humanos (Lindsey et al., 2008; Artsob et
al., 2009). Debido a su patogenicidad, este virus ha causado un impacto negativo
en las poblaciones de aves residentes del país y por lo tanto se considera un
importante patógeno emergente (Kilpatrick et al., 2019).
Sin embargo, en el caso de la Península Ibérica, aunque algunos autores han
documentado la circulación del virus en diferentes aves, como por ejemplo en el
estudio de López et al. (2011) en el que se demostró la presencia de anticuerpos
del virus en varias especies de aves silvestres, entre ellas la cigüeña blanca, el
impacto sanitario en las poblaciones aviares tanto en la península como en el
resto de Europa y África parece ser bajo a diferencia con Estados Unidos (Jurado
et al., 2016; García-Bocanegra et al., 2016).
Aunque el virus de West-Nile parece ser el flavivirus de mayor importancia en la
fauna silvestre, se han documentado otros que también causan un impacto
importante en distintas poblaciones de aves. En el caso de Europa, destaca el
virus de Usutu (USUV) por brotes como el de 2011 en Alemania que provocó
importantes mortalidades, sobre todo en mirlo común (Turdus merula) (Sieg,
2017) o el virus de Bagaza (BAGV), responsable de la muerte de un gran número
de perdices (Alectoris rufa) y faisanes (Phasianus colchicus) en el Sur de España
en 2010 (Agüero et al., 2011; Gamino et al., 2013).

Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

AVULAVIRUS AVIAR-1 (ENFERMEDAD DE NEWCASTLE)
La enfermedad de Newcastle está producida por el Avulavirus aviar tipo 1 (AvV-
1). Se trata de un virus ARN de importancia relevante debido al gran impacto que
causa en la producción avícola, y por ello, junto con la Influenza Aviar, ambos
patógenos son de notificación obligatoria según la Organización Mundial de la
Salud Animal (OIE). Los animales afectados pueden presentar síntomas
neurológicos, gastrointestinales, reproductivos o respiratorios (Miller & Koch,
2013).
En el caso de la cigüeña blanca, muy pocos casos de infección por este virus
han sido descritos. Uno de ellos en un estudio realizado por Kaleta y
colaboradores en 1983, en el que se consiguió aislar tres cepas distintas del virus
en cigüeñas aparentemente sanas, y que por lo tanto evidenció tanto la
susceptibilidad de la especie al virus como su potencial papel como dispersor del
mismo. En el caso de la Península Ibérica, en un estudio realizado por Camacho
y colaboradores en 2016, se evidenciaron anticuerpos frente al virus en 4/90 del
total de cigüeñas muestreadas en distintas colonias naturales y de vertederos,
demostrando de esta forma la circulación del virus por las poblaciones de
cigüeñas de la Península y por lo tanto evidenciando el riesgo de transmisión del
virus a poblaciones domésticas y otras aves silvestres.
CORONAVIRUS AVIAR
Los coronavirus son patógenos importantes de aves y mamíferos, e incluso
humanos. Se trata de virus ARN, y es por esta razón, existe una gran variedad
de serotipos (Woo et al., 2009; MacLachlan & Dubovi, 2011). Se clasifican en 4
géneros distintos, los α-coronavirus y β-coronavirus que se encuentran en
mamíferos, mientras que las aves se ven afectadas por los γ-coronavirus y δ-
coronavirus.
En el caso de las aves, estos patógenos son conocidos como virus de la
bronquitis infecciosa (IBV) debido a la enfermedad reproductiva y respiratoria
que provoca, síndrome descrito fundamentalmente dentro de la producción
avícola. Muchas aves tanto domésticas como silvestres son susceptibles al
patógeno, los cuales pueden infectarse a través de aerosoles o mediante la
ingestión de alimentos contaminados con heces (Cavanagh, 2007).
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

No existen datos específicos sobre la exposición de cigüeñas blancas a este
patógeno, pero sí que es conocida su circulación en otras aves del orden
Ciconiiformes, como garzas reales (Ardea cinérea) o espátulas de cara negra
(Platalea leucorodia) (Chu et al., 2011).
HERPESVIRUS
Los Herpesvirus aviares son virus ADN que muestran una elevada especificidad
según el huésped al que afectan (Mack et al., 2020), por lo que los signos clínicos
en los animales a los que infectan pueden ser extremadamente variables.
En el caso de la cigüeña blanca, se han descrito varios episodios causados por
Herpesvirus que, aunque serológicamente es idéntico al de la cigüeña negra
(Ciconia nigra), no se encuentra relacionado con ningún otro Herpesvirus aviar
(Kaleta et al., 1980). Un ejemplo, fue el estudio realizado por Kaleta et al., (1986),
en el que se aislaron 12 Herpesvirus de cigüeñas mantenidas en aviares del
norte de Alemania, pero ninguno de estos animales presentó signos de
enfermedad. Sin embargo, Gómez-Villamandos y colaboradores en 1998,
documentan un brote de mortalidad causado por este virus, con signos clínicos
como depresión, pérdida de apetito, alas caídas o diarrea hemorrágica. En los
ejemplares fallecidos se detectaron lesiones como necrosis hepática y esplénica
e inclusiones intranucleares en múltiples tejidos.
MALARIA AVIAR
Los parásitos de malaria aviar son protozoos sanguíneos pertenecientes a los
géneros Plasmodium, Haemoproteus y Leucocytozoon. Estos parásitos son
transmitidos por diferentes tipos de vectores, desde mosquitos del género Culex
en el caso de Plasmodium, hasta mosquitos de la Familia Ceratopogonidae e
Hippoboscidae en el caso de Haemoproteus (Rivero et al., 2018).
Se trata de una infección común entre las aves residentes y migratorias, y en la
mayoría de los casos, sin aparente patología e impacto poblacional asociado.
Sin embargo, este parásito sí causa una alta morbilidad y mortalidad en
hospedadores que nunca han sido expuestos al mismo, por lo que tiene un gran
impacto en áreas no endémicas en los que se introduce el patógeno por aves
exóticas. Este es el caso de Nueva Zelanda, donde la malaria aviar se ha descrito
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

en 35 especies de aves diferentes y ha sido responsable de la muerte de
individuos de especies amenazadas como el mohua (Mohoua ochrocephala) o
el dotterel (Charadrius obscurus) (Schoener et al., 2014). Esto mismo ocurrió en
Hawái, donde la malaria aviar es limitada, pero fue responsable de la disminución
y extinción de muchas poblaciones endémicas de mieleros hawaianos (Liao et
al., 2017).En el caso de nuestra especie modelo, la cigüeña blanca, aunque sí se han
encontrado distintas especies de hemosporidia en algunos individuos, son muy
pocos los casos que han sido reportados realmente (Jovani et al., 2002).
Recientemente se ha observado un impacto negativo de hemosporidia del
género Plasmodium en especies tan comunes el gorrión común (Passer
domesticus) (Dadam et al., 2019).

HIPÓTESIS
El uso de vertederos como fuente de alimento altera el comportamiento de la
cigüeña blanca. Por un lado, reduce sus movimientos migratorios y por lo tanto
la posibilidad de exposición a patógenos exóticos, mientras que por otro lado
favorece la agregación de muchos individuos, el uso continuo de los nidos y el
contacto directo e indirecto con un amplio número de individuos de otras
especies usuarios de los vertederos además de residuos de sustancias tóxicas.
Hipotetizamos que estos cambios también tendrán un profundo efecto sobre los
patógenos a los que la cigüeña blanca está expuesta y sobre su potencial sobre
ella y su papel en su dispersión.

OBJETIVOS
Nuestro objetivo en este estudio es evaluar como el uso de los vertederos y el
diferente comportamiento de cigüeñas blancas afecta a la prevalencia de
diferentes patógenos.
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

3. Material y métodos
3.1. Área de muestro y toma de muestras
El área de estudio se localiza en el Sur de Portugal (Figura 2). Concretamente
en cuatro distritos, Setúbal, Évora, Beja y Faro (Entre 38.868383, -8.042987 y
36.970266, -7.886860). Esta zona presenta un clima mediterráneo, aunque por
su posición marítima en contacto con el Océano Atlántico, el clima es más
húmedo y con amplitudes térmicas menos acusadas que en otras zonas de clima
mediterráneo. Así, se caracteriza por veranos largos y calurosos, entre 28ºC-
35ºC, e inviernos templados y cortos, alrededor de los 18ºC, y una precipitación
media de 500 mm, que se concentran sobre todo en primavera y otoño.

Figura 2. Área y puntos de muestreo de cigüeñas blancas. Elaboración propia (QGIS)
Para el estudio se tomaron muestras de cigüeñas blancas silvestres (pollos y
adultos) que pertenecían a colonias de diferentes emplazamientos, con distinto
grado de exposición a residuos humanos. En la Figura 2, se puede apreciar la
distribución de las colonias (símbolos de cigüeña) y su cercanía los vertederos
(símbolo verde), el vertedero de Évora (38.53598, -7.96873), el de Beja
(37.92575, -7.86656), el de Barlavento (37.213115, -8.522740), el de Sotavento
(37.269436, -7.977384) y el de Ermidas do Sado (38.021568, -8.353752).
3.2. Ejemplares muestreados
Se capturaron ejemplares de adultos de cigüeña blanca mediante trampas de
red en vertedero (y algunas en nido). En 2018, fue capturado solamente un
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

ejemplar, mientras que, en 2019, un total de 47 individuos fueron capturados
para su marcaje con transmisores satélite (Tabla 4).
Los datos de telemetría de los adultos fueron usados para localizar sus nidos en
diferentes colonias en los que después se muestrearon pollos, tanto los propios
de los adultos marcados como de otros de su colonia. Su muestreo se realizó
durante los meses de mayo y junio principalmente tanto en 2018 como 2019. Al
mismo tiempo, se procedió al anillamiento de los individuos. Se muestrearon un
total de 59 pollos de cigüeña blanca en 2018, y 49 pollos en 2019 (Tabla 4).
3.3. Toma de muestras
A todos los individuos en las colonias se les extrajo sangre de la vena braquial
que se transfirió inmediatamente a tubos estériles con heparina litio como
anticoagulante. Se muestreó la cloaca de cada uno de los individuos mediante
hisopo de algodón estéril conservado en medio de transporte AMIES. Se
obtuvieron hisopos cloacal y orofaríngeo en medio de transporte para virus
(Munster et al., 2007). Se obtuvieron también plumas en crecimiento, en el caso
de los pollos, conservadas en el mismo medio específico de virus, así como el
peso y medidas biométricas como la longitud del pico y el tarso.
3.4. Análisis de laboratorio
▪ Extracción y cuantificación de ADN y ARN
La extracción y cuantificación de ADN y ARN se llevó a cabo tanto en las
muestras de plumas, como de hisopos orales y cloacales.
En el caso de las plumas, se extrajo el material del interior del cañón de las
plumas en crecimiento para aislar simultáneamente el ARN y ADN de
acuerdo con el protocolo de Tri Reagent® (Sigma-Aldrich, Madrid, España).
Los sedimentos de ARN y ADN secados al aire se disolvieron en 40 μl agua
ultrapura con una concentración menor a 60 ng/dl, y se almacenaron a -
80°C y -20ºC respectivamente, hasta su uso posterior.
En el caso de los hisopos, tanto orales como cloacales, se realizaron pooles
de 5 muestras.
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

La cuantificación de ADN y ARN se realizó con el espectofotómetro “Thermo
Scientific Nanodrop OneTM” (ThermoFisher Scientific, Madrid, España)
siguiendo las instrucciones del fabricante.
▪ Determinación molecular del sexo
Las cigüeñas blancas no presentan un dimorfismo sexual marcado, aunque
los machos suelen ser un 5% más grandes que las hembras (Aguirre de
Miguel, 2006).
Por eso, para determinar el sexo de los animales se usó una pequeña
cantidad (2 μl) de sangre entera/pellet de eritrocitos diluida en 0.5 ml de
agua ultrapura que después de extraer el ADN mediante ebullición se
sometió a la PCR convencional descrita por Fridolfsson y Ellegren (1999).
En el caso de los individuos de los que no se disponía de muestra de sangre
se utilizaron las muestras de ADN extraídas de las plumas. Para ello se
empleó el kit Phusion blood direct PCR (ThermoFisher Scientific, Madrid,
España) en un volumen total de 10 μL que contenía: 0.5 μL de los primer
2550F (0.01 mM) y 0.5 μL de 2718R (0.01 mM), 3 μL de H2O, 5 μL de Buffer
(2x) y con 1 μl de ADN extraído y siguiendo el programa: 98°C/4min; 40
ciclos de 98°C/1s, 54°C/6s, 72°C/20s y un ciclo final de 72°C/1 min. Las
bandas se visualizaron mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa
al 1,5%.
▪ Detección molecular de patógenos
Para la detección de los patógenos presentes en las muestras extraídas, se
utilizaron dos metodologías distintas, RT PCR a tiempo real para los virus
de Influenza Aviar, Flavivirus, Coronavirus aviar y Avulavirus aviar-1 y PCR
convencional para Herpesvirus y parásitos de Malaria aviar.
o RT PCR a tiempo real
Esta metodología se realizó con las muestras de ARN extraídas tanto de
plumas almacenadas a -80°C cómo de los pooles de hisopos orales y
cloacales. La amplificación se realizó con dos termocicladores: C1000
TouchTM Thermal Cycler (Bio-Rad, Madrid, España) e iQTM5 Multicolor
Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Madrid, España).
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

Tabla 1: Resumen de los procedimientos de Real Time PCR para cada virus en las muestras de
cigüeñas blancas de colonias del Sur de Portugal.

o PCR Convencional
Esta metodología se realizó con las muestras de ADN extraídas y
almacenadas a -20°C.

Patógeno Referencia Kit
Composición y
volumen
Termociclador
20 μL:
- 5 μL MasterMix - 50°C/2min
Taqman
TM
Fast virus
1-step Kit
- 0.4 μL Primer 1073
(30pmol/ul)
- 60°C/30min
INFLUENZA
AVIAR
Munster et al., 2007
(ThermoFisher
Scientific,
- 0.4 μL Primer 1074
(40pmol/ul)
- 95°C/3min
(Modificación de Ward et
al., 2004)
(Madrid, España) - 0.4 μL Sonda 1293
(5 pmol/ul)
50 ciclos: 94°C/20”
- 8.8 μL H2O - 60°C/1min
- 5 μL ARN
20 μL:
- 10 μL MasterMix - 50ºC/1min
Biorad SYBR Green
- 1.1 μL Primer PF1S
(10pmol/ul)
- 95ºC/5min
FLAVIVIRUS Moureau et al., 2007
(Bio-Rad, Madrid,
España)
- 1.1 μL Primer PF2R
(10pmol/ul)
40 ciclos:95ºC/15”
- 0.25 μL RT
polymerasa
- 60ºC/1min
- 6.55 μL H2O- 1 μL ARN
25 μL:
- 12.5 μL MasterMix - 50ºC/2min
Biorad SYBR Green
- 1.75 μL Primer 11F
(10pmol/ul)
- 95ºC/5min
CORONAVIRUS
AVIAR
Escutenaire et al., 2007
(Bio-Rad, Madrid,
España)
- 1.75 μL Primer 13R
(10pmol/ul)
50 ciclos:94ºC/40”
- 0.5 μL RT
polymerasa
- 50ºC/40”
- 6 μL H2O - 72ºC/40”
- 2.5 μL ARN
20 μL:
- 10 μL MasterMix - 50ºC/15min
Biorad SYBR Green
- 1 μL Primer NDVR
(10pmol/ul)
- 95ºC/1min
AVULAVIRUS
AVIAR-1
Creelan et al., 2002
(Bio-Rad, Madrid,
España)
- 1 μL Primer NDVF
(10pmol/ul)
45 ciclos:95ºC/15”
- 0.25 μL RT
polymerasa
- 60ºC/20”
- 5.25 μL H2O
- 2.5 μL ARN
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

Tabla 2: Resumen de los procedimientos de PCR Convencional para cada virus en las muestras
de cigüeñas blancas de colonias del Sur de Portugal.

Patógeno Referencia Kit
Composición y
volumen
Termociclador
20 μL:
PRIMERA PCR:
- 10 μL MasterMix
- 0.5 μL Primer DFA
(10pmol/ul)
- 0.5 μL Primer ILK
(10pmol/ul) - 94ºC/2min
- 0.5 μL Primer KG1 45 ciclos: 94ºC/30”
HERPESVIRUS
VanDevanter et al.,
1996
Promega MasterMix (10pmol/ul) - 46ºC/1min
(Anidada)
(Promega Biotech
Ibérica,
- 5.5 μL H2O - 72ºC/30”
Madrid, España) - 3 μL ADN - 72ºC/10min
SEGUNDA PCR:
- 10 μL MasterMix x2 veces
- 0.5 μL Primer TGV
(10pmol/ul)
- 0.5 μL Primer IYG
(10pmol/ul)
- 6 μL H2O
- 3 μL producto PCR 1
20 μL:
PRIMERA PCR:
- 10 μL MasterMix
- 0.8 μL Primer HAEM
NF
(10pmol/ul)
- 0.8 μL Primer HAEM
NR2
- 94ºC/3min
(10pmol/ul) 35 ciclos: 94ºC/30”
- 6.4 μL H2O - 50ºC/30”
MALARIA
AVIAR
Waldentröm et al.,
2004
Promega MasterMix - 2 μL ADN - 72ºC/30”
(Anidada)
(Promega Biotech
Ibérica,
SEGUNDA PCR: - 72ºC/10min
Madrid España) - 10 μL MasterMix
- 0.8 μL Primer HAEM F x2 veces
(10pmol/ul)
- 0.8 μL Primer HAEM
R2
(10pmol/ul)
- 6.4 μL H2O
- 2 μL producto PCR 1
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

En el caso de las PCR convencionales, el producto se sometió a una
electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1.2%. Para visualizar las bandas
se empleó Gel RedTM (Biotium, Hayward, USA) en el gel y un transiluminador de
UV UVItec-Cambridge (Uvitec Ltd. Cambridge, U.K) con captador de imágenes.
Las muestras positivas en la PCR de hemosporidia se purificaron empleando un
kit comercial de purificación PCR QlAquick® (QIAGEN, Hilden, Alemania),
después se midió la concentración con el Nanodrop OneTM (Thermo Scientific,
Madrid, España) para cuantificar y evaluar la pureza de la muestra, y se enviaron
a secuenciar (Secugen SL, Madrid, España) con el objetivo de identificar la
especie de hemosporidio en las muestras positivas a la presencia de parásitos
de la malaria aviar. Las secuencias obtenidas se analizaron con el software
Chromas 2 (Technelysium Pty Ltd, South Brisbane, Australia) con la herramienta
de búsqueda de alineación local básica (BLAST) del Centro Nacional de
Información Biotecnológica (NCBI, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
▪ Serología
En una alícuota de plasma se estudió la presencia de anticuerpos de VIA,
AaV1 y WNV mediante ELISA de competición.
o Para la detección de anticuerpos frente a WNV se utilizó un ELISA
comercial de competición que emplea como antígeno virus entero
inactivado (ID Screen©®, West Nile Competition, IDVet, Montpellier,
France).
o Igualmente, para la detección de anticuerpos frente al virus AaV1 se
utilizó un ELISA comercial de competición específico (ID Screen©®,
Newcastle Competition, IDVet; Montpellier, France).
o Para la detección de anticuerpos frente al virus de VIA se utilizó un
ELISA comercial de competición para este virus (Ingezim Influenza A
1.0. FLU.K.3, Madrid, España).
▪ Microbiología

Se realizó el aislamiento e identificación de las enterobacterias E. coli y
Salmonella spp. según metodología ISO.
o Para el aislamiento de E. coli cada uno de los hisopos cloacales se
sembraron en placas de agar MacConkey (Scharlab S.L, Barcelona,
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

España) y se incubaron a 37º C durante 24 horas. Las colonias
consideradas E. coli por su morfología y color, fueron sometidas a
cultivo en medio MacConkey con antibiótico con el fin de determinar
fenotipos de antibiorresistencia.
o Salmonella spp: El aislamiento de Salmonella spp. fue realizado
conforme al método estandarizado ISO 6579 (2002). Primero se
realizó un pre-enriquecimiento de las muestras. Para ello, se
introdujo el hisopo cloacal en caldo de peptona y se incubó a 37º C
durante 24 horas. Después, 1ml de este caldo se homogeneizó y se
transfirió a caldo Rappaport Vassiliadis Soja (Scharlab, España) que
se incubó a 42º C durante 24 horas. Finalmente se sembró en placa
con agar XLD (Scharlab, España) y se incubó a 37º C durante 24
horas. Las colonias consideradas Salmonella spp. por su morfología
y color, fueron recogidas en agua ultrapura para la extracción del
ADN mediante la técnica de ebullición. El ADN así extraído fue
llevado a refrigeración hasta posterior confirmación mediante
reacción en cadena da la polimerasa (PCR) por amplificación del gen
invA.
La amplificación del gen InvA para la confirmación de las colonias
como Salmonella spp. fue llevada a cabo mediante PCR, según el
protocolo descrito por Rahn et al. (1992), en una mezcla de reacción
con un volumen total de 30 μl conteniendo: 2 μl de ADN; 0,2 μl
Enzima (5U/μl); 3 μl de cebador invA‐L (0,01 mM); 3 μl de cebador
invA‐R (0,01 mM); 3 μl Buffer (10x); 0.6 μl dNTP’s (10 mM); 0.9 μl
MgCl2 (50 mM); 17.3 μl ddH2O. La reacción se realizó en
termociclador Techne modelo TC-512 (Techne Inc. Cambridge, U.K)
siguiendo el siguiente protocolo: 94° C/3min.; 40 ciclos de 95°
C/30seg., 55° C/30seg., 72° C/30seg.; y un ciclo final de 72° C/10min.
Las muestras fueron sometidas a una electroforesis horizontal en gel
de agarosa al 2%. Las amplificaciones fueron teñidas con gel red y
leídas en un transiluminador de UV UVItec-Cambridge (Uvitec Ltd.
Cambridge, U.K) con captador de imágenes.

Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

▪ Patrones fenotípicos de antibiorresistencias
Se evaluó la susceptibilidad de las cepas aisladas de E. coli a
determinados antimicrobiales.
El patrón fenotípico de resistencia a los antimicrobiales de las cepas de E.
coli se evaluó mediante la siembra en medios de MacConkey
suplementados con tres antimicrobiales diferentes. Se prepararon placas
con una concentración en gentamicina de 16μg/ml (Sigma-Aldrich
química, Madrid, España), de cefotaxima 4μg/ml (Sigma) y MacConkey
con Enrofloxacina 4μg/ml (Sigma). Estas placas fueron incubadas a 37º C
durante 24 horas. Colonias morfológicamente compatibles con E. coli, que
crecieron con las concentraciones de antimicrobiales, fueron registradas
como indicio de resistencia al antibiótico en cuestión, y congeladas en
agar cerebro-corazón a -80º C para futuros análisis.
La elección de los diferentes antibióticos se basó en el uso frecuente que
en España se hace de ellos. Gentamicina y Enrofloxacina son utilizados
en ganadería y en animales de compañía. Cefotaxima o similares
Cefalosporinas se administran a humanos. Las concentraciones utilizadas
son las recomendadas por el National Antimicrobial Resistance Monitoring
System (NARMS, Food and drug administration, Centers for Disease
control and prevention, United States Department of Agriculture, 2017).

3.3 Análisis de datos
En primer lugar, para obtener un índice de condición corporal de los individuos
estudiados, se calculó un índice de masa corporal (SMI) de cada uno de los
ejemplares (Peig & Green, 2009). Este valor se calculó relacionando de forma
lineal el peso sobre la longitud del tarso, por un lado, los adultos y por otro lospollos.
Con el fin de comparar las prevalencias entre aves asociadas al uso de vertedero
y las que no y dado el gran número de colonias agrupamos las colonias según
su distancia al vertedero en dos grupos (cercano y alejado de vertedero). Con el
mismo fin y para comprobar la utilidad de la distancia al vertedero como
referencia para el grado de su uso creamos la variable de frecuencia de uso de
vertedero basada en los datos de telemetría de los adultos marcados. Esta
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

variable calculada por separado para el periodo reproductor y el de invernada es
el resultante de la división de los días con localizaciones en vertedero entre el
total de días con datos disponibles. Al igual que con la distancia al vertedero
creamos una variable de uso binomial basado en una frecuencia de uso mayor
o menor de 0,5.
Después de una inspección visual de la normalidad de distribución del SMI
empleamos modelos lineales generalizados con distribución normal y función de
enlace de identidad para detectar factores que influyen en la condición física de
las aves (Tabla 3, Tabla 7).
Analizamos factores que influyen en la seroprevalencia de los virus VIA, AaV1 y
WNV y otros Flavivirus usando modelos lineales generalizados con distribución
binomial y función de enlace logit. Para las prevalencias de Malaria aviar en PCR,
la prevalencia de E. Coli, Salmonella y los fenotipos de resistencia a los
antibióticos analizados se utilizó de la misma forma un modelo lineal
generalizado con distribución binomial y función de enlace logit. Los modelos se
construyeron por pasos excluyendo los factores recogidos en la tabla 1 según el
criterio Akaike (Akaike, 1974) (Tabla 3, Tabla 7).

Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

Tabla 3. Resumen de factores incluidos en los GLMM para estudiar la relación de las distintas
variables estudiadas en las cigüeñas blancas muestreadas en el Sur de Portugal.

Todos los análisis se realizaron usando el software IBM SPSS Statistic 21 (IBM®,
SPSS Inc. Chicago, USA), y la significancia se fijó en p ≤ 0,05.

Factores Descripción
SMI Índice de condición física
hembras
Sexo machos
pollos en nido
Edad adultos
poco uso (<0.5)
Uso de vertedero mucho uso (>0.5)
cerca de vertedero
Distancia a vertedero lejos de vertedero
residente
Migración de los individuos transaharianos
Marruecos
PCR Malaria aviar negativo al patógeno
positivo al patógeno
ELISA WNV, AaV1 e VIA seronegativos
seropositivos
E. Coli en flora cloacal negativos al patógeno
positivos al patógeno
Salmonella en flora cloacal negativos al patógeno
positivos al patógeno
Fenotipo de resistencia del E. Coli susceptibilidad al antibiótico
aislado a Gentamicina (GEN Res) resistencia al antibiótico
Fenotipo de resistencia del E. Coli susceptibilidad al antibiótico
aislado a Cefotaxima (CEF Res) resistencia al antibiótico
Fenotipo de resistencia del E. Coli susceptibilidad al antibiótico
aislado a Enrofloxacina (ENRO Res) resistencia al antibiótico
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

4. Resultados
En este estudio se muestrearon 156 ejemplares de cigüeña blanca, 48 adultos y
108 pollos. De estos individuos, el 52% eran machos (75/144) y el 47,9% fueron
hembras (69/144). Solamente 12 individuos no pudieron ser sexados por la falta
de muestra de pluma y/o sangre.
Tabla 4: Colonias de cigüeñas blancas muestreadas en el Sur de Portugal y resumen de sus
parámetros estudiados.

Colonia/ Año
Distancia
vertedero
Meses de
muestreo
Nº Adultos Nº Pollos Nº Total PCR ELISA
Vertedero
St. Graca do
Pradoes
2018 Lejos Mayo - 7 7 -
1 pollo VIA
1 pollo WNV
Minas Nerves 2018 Lejos Mayo-Junio 2 9 11 1 pollo 2 pollos WNV
Corvo 2019 Abril Plasmodium sp 4 pollos AaV1
Laranjo Novo 2018 Lejos Mayo-Junio 1 18 19 1 pollo 2 pollos WNV
2019 Plasmodium sp 2 pollos VIA
10 pollos AaV1
Odiáxere 2018 Cerca Mayo-Junio 1 24 25 1 pollo Flavivirus 10 pollos AaV1
2019 3 pollo Plasmodium sp
Rasmalho 2018 Cerca Junio-Julio - 8 8 - 5 pollos AaV1
2019
Cerro dos
Zambujeiros
2018 Lejos Junio - 4 4 -
1 pollo AaV1
Ludo 2019 Lejos
Abril-Mayo-
Junio
2 3 5 -
1 adulto WNV
1 adulto AaV1
Sado 2019 Cerca Mayo - 2 2 - -
Alvalade 2019 Cerca Mayo-Junio 2 3 5 - -
Sao Domingos 2019 Cerca Abril-Junio 1 2 3 - -
1 adulto VIA
Évora 2019 Cerca Mayo-Junio 1 4 5 - 1 pollo AaV1
Monte do Gaviao 2019 Lejos Abril-Junio 1 3 4 - -
Aldeia dos
Fernandes
2019 Lejos Mayo-Junio 1 2 3 - 1 adulto WNV
1 adulto VIA
Canhestros 2019 Cerca Mayo-Junio 1 2 3 - -
Monte da Nobre 2019 Lejos Junio - 2 2 1 pollo Avulavirus aviar-1 -
1 adulto WNV
Casevel 2019 Lejos Mayo-Junio 2 2 4 - 1 adulto AaV1
1 adulto VIA
Albernoa 2019 Cerca Mayo - 2 2 1 pollo Avulavirus aviar-1 -
Coruche 2019 Lejos Junio - 5 5 - -
Porteirinhos 2019 Lejos Mayo-Junio 2 1 3 - 1 adulto AIV
Navarro 2019 Lejos Mayo-Junio 1 3 4 - 1 adulto AaV1
1 adulto WNV
Entradas 2019 Lejos Mayo 2 - 2 - 1 adulto VIA
1adulto AaV1
Silves 2019 Lejos Mayo 1 - 1 - -
Carregueiro 2019 Lejos Mayo 1 - 1 - -
Pequenino 2019 Lejos Abril 1 - 1 - -
Ermidas do
Sado
2019 Cerca Abril 1 - 1 - -
Beja, Vertedero 2019 Vertedero Enero-Abril 11 - 11 - -
Ermidas do
Sado, Vertedero
2019 Vertedero Febrero 3 - 3 - -
Évora, Vertedero 2019 Vertedero Febrero 6 - 6 - -
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

El índice de condición física (SMI) difiere significativamente para la edad y el uso
que los individuos muestreados hacen sobre el vertedero. En el primer caso, los
adultos tienden a tener condiciones corporales mejores que los pollos (Figura 3,
Tabla 7) y en el caso del uso de vertedero un menor uso de este provoca valores
de SMI más bajos (Figura 4, Tabla 7).

Figura 3: Índice de condición física (SMI) de cigüeñas blancas capturadas para marcaje
con transmisores de telemetría según grupo de edad. Las barras de error denotan el
error estándar. * : diferencia significativa. Error estándar representado.

Figura 4: índice de condición física (SMI) de cigüeñas blancas capturadas para marcaje
con transmisores de telemetría según uso de vertedero. Las barras de error denotan el
error estándar. * : diferencia significativa. Error estándar representado.

2900
3000
3100
3200
3300
3400
3500
3600
3700
3800
Adultos Pollos
Ín
d
ic
e
d
e
co
n
d
ic
ió
n
c
o
rp
o
ra
l (
SM
I)
3000
3100
3200
3300
3400
3500
3600
3700
Poco uso Mucho uso
Ín
d
ic
e
d
e
co
n
d
ic
ió
n
c
o
rp
o
ra
l (
SM
I)
*
*
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

En cuanto a las prevalencias de los patógenos analizados por técnica PCR
encontramos un 5.12% (8/156) de individuos positivos. Todos ellos fueron pollos.
Solo un individuo fue positivo a Flavivirus (1/156, 0.64%), dos Avulavirus aviar-1
(2/156, 1.28%) y un 3.20% (5/156) a Malaria aviar, concretamente a Plasmodium
sp. (Tablas 4 y 5). Al encontrarse prevalencias tan bajas, no nos permite realizar
análisis estadísticos.
Tabla 5: Patógenos analizados en muestras de cigüeñas blancas muestreadas en las colonias
del Sur de Portugal. Prevalencia de positivos en PCR.

N: Nº individuos totales; n: nº individuos positivos

PREVALENCIA SEXO
(n/N) (%) AFECTADO
129 plumas
Influenza 46 pooles orales 0% 2018 - -
aviar
38 pooles cloacales (0/156 individuos) 2019
129 plumas
Flavivirus 16 pooles orales 0,64% 2018 1 macho - Odiáxere
16 pooles cloacales (1/156 individuos)
129 plumas
Avulavirus 16 pooles orales 1,28% 2019 1 hembra - Monte da Nobre
aviar-1
16 pooles cloacales (2/156 individuos) 1 macho - Albernoa
129 plumas
Coronavirus 16 pooles orales 0% 2018 - -
aviar
16 pooles cloacales (0/156 individuos) 2019
Herpesvirus 129 plumas 0% 2018 - -
16 pooles cloacales (0/156 individuos) 2019
- Odiáxere (3)
Malaria aviar 129 plumas 3,87% 2018 3 machos- Minas Neves Corvo
(5/129 individuos) 2 hembras - Laranjo Novo
PATÓGENO
MUESTRAS
ANALIZADAS
AÑO COLONIA AFECTADA
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

Figura 5: Colonias de las cigüeñas blancas analizadas en el Sur de Portugal en las que se han
detectado positivos a diferentes virus mediante PCR y vertederos cercanos. Elaboración propia.
(QGIS)
En cuanto a las seroprevalencias de los virus West Nile (11/107), Influenza Aviar
(8/124) y Avulavirus aviar-1 (35/112), encontramos diferentes resultados (Tablas
4 y 6). Los adultos tienen con mayor frecuencia anticuerpos frente a WNV y VIA,
mientras que en el caso de los anticuerpos frente a AaV1 no hay diferencia
significativa entre pollos y adultos (Figura 6, Tabla 7). Lo mismo sucede con el
uso de vertedero, pero en este caso, la presencia de anticuerpos para West Nile
e Influenza aviar tiende a aumentar con un menor uso de los vertederos (Figura
7).

Figura 6: Seroprevalencias de WNV, VIA y AaV1 según edad (Pollos o adultos) de las cigüeñas
blancas analizadas en las colonias del Sur de Portugal. * : diferencia significativa.

0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
WNV AIV NDV
P
re
va
le
n
ci
as
%
Pollos Adultos
0
5
10
15
20
25
30
35
40
WNV AIV NDV
P
re
va
le
n
ci
as
%
Poco uso Mucho uso
* *
*
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

Figura 7: Seroprevalencias de WNV, VIA y AaV1 según uso de vertedero (poco uso o mucho
uso) en las cigüeñas blancas analizadas en las colonias del Sur de Portugal. * : diferencia
significativa.
Se detectó con más frecuencia E.coli en los pollos que en los adultos de cigüeña
blanca y entre los aislados de E.coli, los fenotipos de resistencia frente a los
antimicrobiales Enrofloxacina, Gentamicina y Cefotaxima, fueron
significativamente más frecuentes en los pollos de cigüeña blanca (Figura 8,
Tabla 6 y 7).
Los fenotipos de resistencia entre los E.coli tendían también a ser más
frecuentes en cigüeñas que realizan un mayor uso de los vertederos sin que esta
tendencia sea significativa (Figura 9, Tabla 6 y 7).
Salmonella spp. se detectó en un adulto (1 de 27, 3.70%) y en dos pollos (2 de
82, 2.43%) procedentes de colonias tanto de mucho uso como de poco del
vertedero, sin tendencia significativa para ninguna de las dos variables (Tabla 6).

Figura 8: Prevalencia de bacterias y resistencias a antibióticos según grupo de edad (Pollos o
adultos) de las cigüeñas blancas analizadas en las colonias del Sur de Portugal. * : diferencia
significativa.
0
10
20
30
40
50
60
70
E. Coli CEFRes ENRORes GENRes Salmonella
P
re
va
le
n
ci
as
%
Pollos Adultos
*
*
* *
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

Figura 9: Prevalencia de bacterias y resistencias a antibióticos según uso de vertederos de las
cigüeñas blancas analizadas en las colonias del Sur de Portugal.

Tabla 6: Prevalencia de anticuerpos frente a WNV, VIA y AaV1, aislamiento de E. coli, y
Salmonella spp. y patrones de antibiorresistencias de los individuos de cigüeña blanca
analizados en las colonias del Sur de Portugal según su edad y uso de vertedero. Intervalos de
confianza ((IC95%) edad y (IC95%) uso de vertedero) para seroprevalencias y bacterias.

0
10
20
30
40
50
60
E. Coli CEFRes ENRORes GENRes Salmonella
P
re
va
le
n
ci
a
%
Poco uso Mucho uso
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

Tabla 7: Estadísticos del modelo que mejor explica las distintas variables estudiadas en las
cigüeñas blancas muestreadas en el Sur de Portugal. Los datos significativos están resaltados
en negrita.

Modelo Predictor
Test de
efectos
del
modelo
(F)
B
(Coeficie
nte)
Error
estándar
p AIC
Adultos 466,210
Edad 42,294 Pollos 0 71,687 0,000
SMI
Uso de vertedero Poco uso -255,677 1096,74
12,791 Mucho uso 0 71,488 0,000
Adultos -3,459
Edad 7,538 Pollos 0 1,259 0,006
Uso de vertedero 3,910 Poco uso -2,669
ELISA WNV Mucho uso 0 1,349 0,048 20,356
E. Coli 1,148 Negativo 1,329 1,329 0,284
Positivo 0
ELISA VIA Edad 14,671 Adultos -3,355 0,8758 0,000 9,921
Pollos 0
E. Coli Edad 15,740 Adultos 1,596 0,4022 0,000 13,018
Pollos 0
Adultos 1,158
Edad 4,163 Pollos 0 0,5675 0,041
GEN Res 21,702
Uso de vertedero 0,036 Poco uso 0,098
Mucho uso 0 0,5132 0,849
CEF Res Edad 4,465 Adultos 1,260 0,5964 0,035 11,657
Pollos 0
ENRO Res Edad 7,531 Adultos 1,802 0,6566 0,006 11,504
Pollos 0
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

5. Discusión
En este estudio se evalúa la importancia de los vertederos en la transmisión de
patógenos, así como la exposición a bacterias resistentes a antibióticos. Para
ello, se examinan pollos y adultos de cigüeñas blancas procedentes de colonias
del Sur de Portugal con diferente grado de uso de los vertederos. Nuestros
resultados muestran que la asociación a vertederos no parece influir en la
transmisión de patógenos generales de la especie, pero sí en la de los fenotipos
de resistencia a antimicrobianos.
Los individuos establecidos en colonias cercanas a vertederos presentan un
mayor índice corporal que los establecidos en colonias naturales. Esto puede
deberse tanto a la facilidad de acceso como a la abundancia de comida que se
da en los vertederos (Pineda-Pampliega et al., 2021). De igual forma, los costes
energéticos relacionados con la búsqueda de alimentos en la naturaleza se
reducen (Gilbert et al., 2016).

En los análisis de patógenos no detectamos infección mediante PCR de los virus
VIA, Coronavirus aviar y Herpesvirus, pero sí en WNV (0,64%, 1/156), AaV1
(1,28%, 2/156) y Malaria aviar (3,87%, 5/129), no existiendo una diferencia
significativa entre los individuos analizados. Sin embargo, mediante ELISA sí que
detectamos la exposición a los virus WNV (10,28%, 11/107), VIA (6,45%, 8/124)
y AaV1 (31,25%, 35/112).

En cuanto al virus de Influenza Aviar, ningún positivo fue detectado mediante
PCR y solamente 8 individuos presentaban anticuerpos. Aunque la época en la
que se encuentran picos de prevalencia para VIA tiene lugar en los meses de
octubre y noviembre (Pérez-Ramírez et al. 2012), cuando miles de aves
migratorias llegan a España para invernar, en el caso de nuestro estudio,
ninguno de los adultos muestreados durante estos meses presentaba
anticuerpos frente al virus, sino que tanto adultos como pollos con anticuerpos
fueron muestreados en el mes de mayo de 2018 (2 pollos) y 2019 (6 adultos). A
diferencia de otros estudios (Bárbara et al., 2017) en los que sí se detectaron
positivos a VIA mediante PCR en heces en individuos relacionados con
vertederos del Sur de España. Generalmente, la prevalencia de VIA es muy
variable dependiendo tanto de la ubicación, de la época del año como de las
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especies analizadas (Busquets et al., 2010; Pérez-Ramírez et al., 2012).
Además, la alta variabilidad interanual causa variaciones significantes en la
prevalencia de este patógeno (Bárbara et al., 2017).
Sin embargo, hay estudios que demuestran que, aunque la prevalencia tanto del
virus como de sus anticuerpos sea baja en las poblaciones (Müller et al., 2009;
Kaleta et al., 2012), esporádicamente aparecen cigüeñas blancas muertas, como
en el estudio de Müller et al., en 2009, donde fueron hallados dos individuos
muertos positivos a H5N1 o más recientemente, en Cataluña este año, 2021, 3
cigüeñas blancas muertas positivas a H5N8 (Ministerio de Agricultura, Pesca y
Alimentación, 2021). Por esta razón, la cigüeña blanca no parece servir como
vector ni como reservorio para estas cepas VIAAP, pero sí pueden ser especie
centinela, ya que por su tamaño son fáciles de detectar.

Para la seroprevalencia de WNV, que los individuos que presentan una
alimentación más natural tiendan a presentarun mayor número de anticuerpos,
puede deberse al desplazamiento que estos realizan para la búsqueda de
alimento o incluso durante la migración, ya que, al estar en contacto con otros
ambientes e individuos, puede aumentar su probabilidad de exposición al
patógeno transmitido por vectores mosquitos, especialmente en cercanía de
humedales. Estos resultados están de acuerdo con otros estudios anteriores
(Figuerola et al., 2008), en los que se muestra que aparecen mayores
prevalencias de anticuerpos al virus de West Nile en aquellos individuos que
migran. El hecho de que en las colonias aparezca un mayor nivel de anticuerpos
en adultos corrobora que estos individuos han estado en contacto con el virus a
lo largo de su vida, quizás también a través de sus rutas migratorias, como se ha
descrito anteriormente (Figuerola et al., 2007; 2008). Los anticuerpos frente a
WNV encontrados en 5 pollos, pueden evidenciar que los pollos al estar más
inmóviles son más vulnerables a las picaduras de los vectores. Un estudio en
cernícalos patirrojos (Falco vespertinus) evidencia esto último, los mosquitos
vectores del patógeno, en este caso también del virus de West Nile, se ven más
atraídos por los polluelos debido a su plumaje, ya que al ser menor tienen mayor
superficie corporal donde alimentarse, y a su inmovilidad, ya que la probabilidad
de alimentación exitosa es mayor que en individuos de más edad y que vuelan
(Soltész et al., 2017). Estos resultados están acordes con trabajos anteriores
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

(Höfle et al., 2008; López et al., 2011; Jurado et al., 2016; García-Bocanegra et
al., 2016) en los que se ha documentado la circulación del virus en diferentes
aves, entre ellas, la cigüeña blanca.
En cuanto a Avulavirus aviar-1, no se han encontrado diferencias significativas
entre las poblaciones estudiadas para las variables analizadas. En este estudio,
2 pollos fueron positivos mediante PCR, que además también fueron positivos a
la serología, donde sí encontramos una prevalencia más alta (31,25%, 35/112).
Sin embargo, existen pocos documentos que evidencien casos de infección en
la cigüeña blanca (Kaleta et al., 1983; Camacho et al., 2016), pero que
demuestran, incluyendo nuestros resultados, la susceptibilidad de la especie al
virus y la circulación de este por sus poblaciones. En este caso, con la presencia
de anticuerpos no se puede diferenciar si el virus al que han estado expuestos
sea Avulavirus aviar-1, patógeno para aves domésticas, la variante de palomas
del AaV1 (Alexander et al., 1986) o incluso un virus vacunal (Ayala et al., 2016)
ya que existen diferentes patotipos del virus. Sería necesario el aislamiento y
una caracterización más amplia del virus en las muestras de las aves con PCR
positivos.
Para la prevalencia del parásito de malaria aviar Plasmodium spp. tampoco se
han encontrado diferencias significativas entre las poblaciones estudiadas para
las variables analizadas. Sin embargo, es el patógeno con mayor prevalencia de
los analizados mediante PCR (5 pollos). Esta baja prevalencia coincide con los
pocos estudios encontrados sobre la infección por hematozoos en las
poblaciones de cigüeña blanca (Jovani et al., 2002). Sin embargo, que el parásito
se encuentre en pollos y no adultos, puede a la misma razón descrita
anteriormente para los pollos expuestos al virus de West Nile, que los pollos al
estar más inmóviles son más vulnerables a las picaduras de los vectores (Soltész
et al., 2017). Aunque generalmente la circulación de estos parásitos ha sido
silenciosa, más recientemente varias especies se han visto afectadas
negativamente como es el caso del gorrión común (Passer domesticus) (Dadam
et al., 2019).
No se ha encontrado ningún individuo positivo para Coronavirus aviar y
Herpesvirus en las cigüeñas blancas analizadas de colonias del Sur de Portugal.
En el caso de Coronavirus aviar, esto corrobora la no existencia de datos
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

específicos en estudios anteriores sobre este patógeno en nuestra especie
modelo (Chu et al., 2011). En el caso de Herpesvirus, aunque sí que ha sido
documentado en la especie, (Kaleta et al.,1986; Gómez-Villamandos et al.,
1998), nuestros resultados no demuestran la presencia del patógeno en las
colonias analizadas. Sin embargo, por la susceptibilidad de la especie al
patógeno reportada en los estudios mencionados se debería estudiar en
profundidad todos los factores que pueden estar asociados para determinar una
epidemiología conocida del mismo.
En el caso de la prevalencia de E. Coli, la ausencia de relación significativa entre
individuos vinculados con vertederos y los que no lo están puede deberse a que
esta enterobacteria se encuentra ampliamente distribuida en todos los tipos de
ambientes. Han et al. (2011) aislaron E. coli en la mayoría de las cigüeñas
analizadas y concluyeron que forman parte de la flora permanente de éstas. El
que los valores de prevalencia de E. coli sean mayores en pollos que en adultos
podría estar asociado a una mayor diversidad de la flora en los individuos adultos
como se ha visto en estudios anteriores (van Dongen et al., 2013). Estos
resultados coinciden con otros anteriores (Camacho et al., 2016).
Salmonella spp. se detectó tanto en poblaciones con alimentación más natural
(1 pollo) como en poblaciones relacionadas a vertedero (1 pollo), pero con
prevalencias muy bajas en ambos tipos de hábitat. En otros estudios anteriores
(Pineda-Pampliega et al., 2021) se obtuvieron prevalencias similares (2,91%,
3/103). Estas bajas prevalencias pueden ser debidas una baja presencia de la
bacteria en el ambiente.
Los vertederos son puntos de agregación de multitud de especies silvestres,
pudiendo incrementarse el riesgo de infección de ciertos patógenos tanto
bacterianos como víricos por transmisión feco‐oral (Plaza & Lambertucci, 2018;
Höfle et al., 2020), sin embargo, a partir de los resultados de este estudio, no se
puede afirmar que los vertederos tengan una mayor influencia en la transmisión
de los patógenos analizados.
Aunque los vertederos no parecen tener una influencia clara sobre la transmisión
de patógenos propios de las especies que frecuentan este tipo de recurso, este
estudio, sí puede evidenciar una tendencia positiva, aunque no significativa de
Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

patrones de antibiorresistencias a Gentamicina, Cefotaxima y Enrofloxacina en
aquellos individuos de cigüeñas blancas que realizan un mayor uso de los
vertederos. Esto anterior coincide con los resultados de estudios anteriores
(Camacho et al., 2016; Pineda-Pampliega et al., 2021). La presencia de mayores
prevalencias en los pollos de cigüeñas blancas puede ser consecuencia de que
al tener una flora menos diversa que los adultos, sean propensos a mantener
estas cepas resistentes durante más tiempo. Además, como se ha visto
anteriormente, las prevalencias de E. Coli también eran mayores en los pollos,
por la misma razón, puede implicar que las prevalencias de fenotipos de
resistencia a antibióticos sean menos frecuentes en los individuos adultos.
Nuestros datos sugieren que la asociación a vertederos no influye en la
susceptibilidad a patógenos característicos de la especie, pero sí en la de
fenotipos de resistencia, por lo que una vez más se evidencia la presión antrópica
de las actividades humanas, y en particular la exposición a los desechos
humanos sobre la fauna silvestre, que finalmente se ve perjudicada por ellas
(Pineda-Pampliega et al., 2021).
Este estudio evidenciaría el papel que pueden suponer estos animales como
potenciales centinelas de bacterias resistentes y que además por su movilidad y
contacto con otros ambientes como humedales o zonas antropizadas, pueden
actuar como dispersores de las mismasen el ambiente, lo que implica un riesgo
importante tanto para la salud animal como humana (Tryjanowski et al., 2006;
Keller et al., 2011).
Los resultados de este análisis sugieren la necesidad de estudios adicionales
sobre las consecuencias de la asociación de cigüeñas y otras especies a
vertederos.

Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

6. Conclusiones
▪ Las cigüeñas blancas que usan con mayor frecuencia los vertederos
presentaban mejor índice de condición corporal, posiblemente debido a la
disponibilidad abundante y continua de alimentos

▪ La cigüeña blanca puede actuar como centinela de patógenos como
Influenza Aviar, virus de West Nile, Avulavirus aviar-1 y Malaria aviar.

▪ El cambio en el comportamiento de migración observado en las cigüeñas
blancas parece estar relacionado con una disminución en la exposición a
patógenos durante la migración, como en el caso del virus de West Nile o
Influenza aviar.

▪ La alimentación en vertederos parece no influir en la transmisión de
patógenos característicos de las especies que cohabitan en ellos.

▪ La alimentación en vertederos sí parece influir en la exposición a bacterias
resistentes a antibióticos, por lo que los individuos que se alimentan en
vertederos pueden actuar como especie centinela y como dispersores de
las mismas, debido a su movilidad y contacto con otros ambientes, lo que
implica un riesgo importante tanto para la salud animal como humana.

▪ La potencial presencia de antimicrobianos en los vertederos en los que se
alimentan estos individuos y la exposición por lo tanto a bacterias
resistentes a los mismos hace pensar que se deberían tomar más medidas
para el control de este tipo de desechos en las basuras.

Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

Agradecimientos
Este trabajo se realizó en el marco del proyecto: ICETA 028176 BIRDS ON THE
MOVE: adaptive migratory behaviour in response to global environmental
change.
En primer lugar, gracias al equipo de Patología aviar por darme la oportunidad y
confiar en mí para realizar este trabajo. Gracias por enseñarme no solo todo lo
realizado en el laboratorio que es lo que finalmente se plasma aquí, sino que
también por todos los conocimientos que he podido adquirir tanto en campo
como en necropsias.
Al personal del Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos,
Vairão, Portugal, por facilitarnos las muestras y datos de los ejemplares de
cigüeñas blancas utilizadas en el estudio.
A la gente del laboratorio de genómica por su infinita paciencia y por siempre
estar dispuestos a ayudarme ante cualquier duda e incluso problema que me ha
podido surgir durante este periodo.
También a toda la gente que he podido conocer en el IREC, y que me ha
permitido ver otras áreas distintas de las cuales he podido aprender aún más.
Pero, sobre todo, gracias a los que me habéis acompañado y aguantado
intensamente siempre, tenéis un trozo de cielo ganado seguro.

Trabajo de Fin de Máster, 2021 Marta Oliván Nerín

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