presentación espectrofotometría UV-VIS

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Espectroscopía de absorción 
ultravioleta y visible
Dr. Paul Vargas Jentzsch
• La absorción de la radiación electromagnética 
por parte de la materia en el rango del 
ultravioleta cercano a infrarrojo muy cercano, 
entre 180 y 1100 nm, ha sido intensamente 
estudiado.
• Esta porción del espectro electromagnético 
aporta poca información estructural, pero es 
muy útil para mediciones cuantitativas.
• La concentración de un analito en solución 
puede ser determinada mediante la medición de 
la absorbancia a una longitud de onda 
determinada y aplicando la ley de Lambert-Beer.
Generalidades
• También se conoce con el nombre de 
colorimetría.
• Aplica, no solo a compuestos que absorben en 
el mencionado espectro sino también a aquellos 
compuestos que, por medio de una reacción 
química, pueden modificarse para tener 
absorción.
Generalidades
• Esta región del espectro es convencionalmente 
dividida en tres subdominos:
– Ultravioleta cercano (185-400 nm)
– Visible (400-700 nm)
– Infrarrojo muy cercano (700-1100 nm)
Espectro UV/Vis
• La mayor parte de los equipos comerciales 
cubre el rango 185-900 nm.
• Como el oxígeno y el vapor de agua absorben 
intensamente a longitudes de onda menores a 
190 nm, se alcanza un límite inferior de 150 nm 
teniendo sistemas que funcionan con vacío →
Dominio de vacío o ultravioleta lejano.
Espectro UV/Vis
• Los espectrómetros UV/Vis (o espectrofotómetros) 
obtienen datos en un rango requerido de 
longitudes de onda.
• La absorbancia (A) o transmitancia (T) de un 
compuesto en función de la longitud de onda es 
graficada → Espectro UV/Vis
Espectro UV/Vis
Absorbancia (nombre 
antiguo: “Densidad Óptica”)
o
Espectro UV/Vis
Espectro UV/Vis del benceno (en solución y como vapor) (Rouessac, 2007)
Espectro UV/Vis
• La Ley de Lambert-Beer indica 
cuantitativamente cómo la cantidad de 
atenuación depende de la concentración de las 
moléculas absorbentes y de la longitud de la 
trayectoria donde ocurre la absorción.
Ley de Lambert-Beer
A = ε l c
A = Absorbancia
ε = Coeficiente de absorción molar
l = longitud de paso óptico
Libro de Skoog (pag. 663):
Nota: En el libro de Skoog la ecuación de la Ley de Lambert-Beer es A = ε b c, 
donde b es la longitud de paso óptico.
Ley de Lambert-Beer
Límites de la Ley de Lambert-Beer:
• Hay pocas excepciones a la relación lineal entre 
la absorbancia y la longitud de la trayectoria a 
una concentración fija. 
• Pueden haber limitaciones reales a la Ley y 
otras resultado del método que se usa para 
medir la absorbancia (desviaciones 
instrumentales) o de cambios químicos que 
ocurren cuando cambia la concentración 
(desviaciones químicas).
Ley de Lambert-Beer
Límites de la Ley de Lambert-Beer (Cont.):
• La ley de Beer solo describe el comportamiento 
de la absorción de disoluciones diluidas, y en 
este sentido es una ley limitante.
• Otras especies (particularmente electrolitos) 
presentes en la muestra pueden estar en 
concentraciones altas e interferir.
Ley de Lambert-Beer
Problema:
Comúnmente, los nitritos son determinados por un procedimiento colorimétrico que 
utiliza una reacción llamada reacción de Griess. En esta reacción, la muestra que 
contiene nitrito reacciona con sulfanilamida y N-(1-Naftil) etilendiamina para formar 
una especie colorida que absorbe a 550 nm. Utilizando un instrumento de análisis 
de flujo automatizado, se obtuvieron los siguientes resultados para las disoluciones 
estándar de nitrito y para la muestra que contiene una cantidad desconocida:
a) Encuentre la pendiente, la ordenada al origen y la desviación estándar de la 
curva de calibración.
b) Grafique la curva de calibración.
c) Determine la concentración de nitritos en la muestra y su desviación estándar.
Cuantificación de un analito
Ayuda: Revisar el Método de Mínimos Cuadrados (pag. 171 del libro de Skoog)
• Para que una sustancia sea activa en el visible 
debe ser colorida. Eso es debido a que absorbe 
ciertas longitudes de onda del espectro visible y 
transmite otras. 
• Por ejemplo, una solución es amarilla debido a 
que dentro de la región visible absorbe radiación 
en el rango de 435 a 480 nm. En este rango de 
longitud de onda se encuentra el color azul del 
visible, por lo que el compuesto absorbe el color 
azul y transmite los colores complementarios 
que dan origen al color amarillo de la solución 
mencionada.
Origen del color
Diferentes regiones del espectro ultravioleta y 
visible y sus rangos o zonas comprendidas
Origen del color
• La coloración de la solución se debe a la 
especie absorbente y esta coloración puede ser 
natural o inducida. La coloración natural puede 
ser la base de la cuantificación de una especie, 
por ejemplo, la clorofila en plantas, los 
complejos metálicos que se encuentran 
presentes en solución acuosa, como son los 
iones de Cobre (II), Manganeso (VII), Cobalto 
(III), etc.
Origen del color
• Frecuentemente, se induce a la formación de un 
complejo colorido que absorba en el visible, y 
que sea específico para el elemento o 
compuesto que se desea cuantificar 
colorimétricamente. 
• Por ejemplo, la cuantificación de glucosa en la 
sangre y orina por la acción del molibdato (en 
determinadas condiciones), o la intensificación 
del color del ion cobre, al formar un complejo 
amoniaco-cobre, el cual se forma cuando a una 
solución acuosa que contiene iones cobre se le 
agrega hidróxido de amonio.
Origen del color
• Se requiere controlar ciertas condiciones, que 
inhiben o favorecen la formación de compuestos 
coloridos:
– pH: Es un factor determinante en la formación de ciertos 
complejos o compuestos coloridos. Cuando el pH influye 
en la técnica analítica, se requiere de un control adecuado 
de este valor para lo cual se agrega alguna solución 
buffer, o estabilizador de pH.
– Temperatura: La temperatura es factor importante, sobre 
todo en reacciones en las cuales el factor cinético es la 
base del análisis.
– Tiempo: En ciertas reacciones, se requiere de un tiempo 
determinado para que se tenga una lectura estable de 
absorbancia de la solución producida.
Origen del color
• Es también factible que los complejos o 
compuestos formados sean lábiles, estos es que 
después de un cierto tiempo se descompongan 
a otros productos diferentes, por lo que el 
tiempo indicado al que debe hacerse la lectura 
debe establecerse con base a la experiencia y 
los resultados que se tengan.
Origen del color
• El espectro ultravioleta y visible de las 
moléculas está asociado a transiciones 
electrónicas entre los diferentes niveles 
energéticos en ciertos grupos o átomos de la 
molécula y no caracterizan a la molécula como 
entidad.
• En contraste la absorción de energía en la 
región Infrarroja estimulan la molécula completa 
y causa cambios vibracionales y rotacionales en 
esta lo cual caracteriza la entidad estructural de 
dicha molécula.
Transiciones electrónicas de los 
compuestos orgánicos
Espectroscopía Infrarroja
• Los grupos de átomos que dan origen a la 
absorción en el UV cercano, se conocen como 
grupos cromóforos. 
• La mayoría de los grupos insaturados y 
heteroatómicos que tienen pares de electrones 
no compartidos, son cromóforos potenciales y 
estos grupos son la base de la elucidación de 
grupos estructurales en las moléculas activas en 
el UV cercano.
Transiciones electrónicas de los 
compuestos orgánicos
• Cuando dos átomos forman un enlace químico, 
los orbitales atómicos de cada uno de ellos se 
combinan para formar dos orbitales 
moleculares, uno de baja energía que es el 
orbital enlazante y otro de energía mayor, que 
es el orbital antienlazante.
• Los enlaces covalentes que se originan entre 
los orbitales de dos átomos que se enlazan 
químicamente pueden ser de dos tipos y se 
conocen como enlaces σ y enlaces π.
Transiciones electrónicas de los 
compuestos orgánicos
• Al efectuarsedicho enlace covalente se forman 
simultáneamente orbitales antienlazantes, σ* en 
el caso de un orbital molecular enlazante σ, y π*
en el caso de un orbital moleculare nlazante π.
• Los electrones que no participan en la formación 
de enlaces covalentes en la molécula, se 
denominan electrones n o no enlazantes. En las 
moléculas orgánicas los electrones n están 
localizados principalmente en los orbitales 
atómicos de átomos como: Nitrógeno, Oxígeno, 
Azufre y del grupo de los halógenos.
Transiciones electrónicas de los 
compuestos orgánicos
• La absorción de energía radiante en el 
Ultravioleta o Visible por los electrones n, σ o π
resulta en la excitación de éstos, los cuales 
pasan a ocupar alguno de los orbitales 
antienlazantes. La absorción de radiación 
ultravioleta o visible es capaz de efectuar dichas 
transiciones.
Transiciones electrónicas de los 
compuestos orgánicos
• Mientras mayor sea la energía requerida para 
una determinada transición, menor es la 
longitud de onda de la radiación que debe 
suministrarse para conseguir tal fin, por ejemplo, 
la transición σ→σ* para el propano requiere de 
radiación de 135 nm, la cual se encuentra en la 
región del ultravioleta lejano (es necesario un 
equipo de alto vacío si se desea estudiar dicha 
región del espectro).
Transiciones electrónicas de los 
compuestos orgánicos
Comparación de las transiciones que se encuentran más frecuentemente en compuestos orgánicos 
simples (Rouessac, 2007)
Transiciones electrónicas de los 
compuestos orgánicos
• Los grupos funcionales de compuestos 
orgánicos responsables de la absorción en 
UV/Vis son llamados cromóforos.
• Una especie formada por un esqueleto de 
carbonos transparente en el UV cercano al cual 
están unidos uno o varios cromóforos constituye 
un cromógeno.
Grupos cromóforos
Fuente: Rouessac (2007) 
Grupos cromóforos
• Cromóforos aislados: Para una serie de 
moléculas teniendo el mismo cromóforo, la 
posición y la intensidad de las bandas de 
absorción permanecen contantes. Cuando una 
molécula posee muchos cromóforos aislados, 
esto es, cuando no interactúan entre si porque 
están separados por al menos dos enlaces 
simples en el esqueleto, entonces la 
sobreposición de efectos de cada cromóforo 
individual es observada.
Grupos cromóforos
• Sistema de cromóforos conjugados: Cuando los 
cromóforos interactúan entre sí, el espectro de 
absorción es desplazado a longitudes de onda 
más largas (efecto batocrómico) con un 
incremento en la intensidad de absorción (efecto 
hipercrómico). Un caso particular es aquel de 
moléculas conteniendo varios cromóforos 
insaturados adyacentes separados de enlaces 
simples.
Grupos cromóforos
• Se sabe que cada solvente tiene su propia 
característica polaridad
• Como es sabido que todas las transiciones 
electrónicas modifican la distribución de cargas 
del compuesto en solución, es obvio que la 
posición e intensidad de las bandas de 
absorción van a variar un poco con la naturaleza 
del solvente usado.
• Dos efectos pueden ser distiguidos.
Efectos del solvente: 
Solvatocromismo
• Efecto hipsocrómico (blue shift): Si el cromóforo 
responsable de la transición observada es más 
polar en su estado fundamental que cuando 
está excitado, entonces un solvente polar 
estabilizará, por solvatación, la forma antes de 
la absorción del fotón. Más energía será 
necesaria para lograr la transición electrónica, lo 
que causa el desplazamiento de la máxima 
absorción a longitudes de onda más bajas que 
las que se tendrían con un solvente no polar.
Efectos del solvente: 
Solvatocromismo
• Efecto batocrómico (red shift): Para compuestos 
menos polares el efecto del solvente es débil. 
Sin embargo, si el momento dipolar de un 
cromóforo incrementa durante la transición, el 
estado final estará más solvatado. Un solvente 
polar puede por tanto estabilizar la forma 
excitada, lo que favorece la transición y 
desplazamientos a longitudes de onda más 
grandes que las que se tiene en solventes no 
polares es observado.
Efectos del solvente: 
Solvatocromismo
Espectro de la benzofenona en ciclohexano y etanol (Rouessac, 2007)
Efectos del solvente: 
Solvatocromismo
• ELISA → “ensayo por inmunoabsorción ligado a 
enzimas”
• Se basa en el uso de anticuerpos y sus
antígenos.
• Un antígeno es una sustancia que desencadena 
la formación de anticuerpos y puede causar una 
respuesta inmunitaria. Un antígeno suele ser una 
molécula ajena o tóxica para el organismo (por 
ejemplo, una proteína derivada de una bacteria) 
que, una vez dentro del cuerpo, atrae y se une 
con alta afinidad a un anticuerpo específico.
ELISA (Enzyme-linked
immunosorbent assay)
ELISA competitivo
ELISA (Enzyme-linked
immunosorbent assay)
Más informacion: http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html
Suponga que acá va el analito, por 
ejemplo, un antibiótico
Deteccion 
colorimétrica: 
Mayor 
concentración 
del analito, 
menor color