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EXPRESIÓN DE GENES EN BIOPELÍCULAS CRECIDAS SOBRE 
PETRÓLEO CRUDO DE TRES CEPAS DE Pseudomonas aeruginosa 
 
Por: 
 
ANA CATALINA LARA RODRIGUEZ 
 
 
Trabajo de grado propuesto como cumplimiento parcial de los requisitos para optar por el título 
de: 
 
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
Área: Microbiología 
 
Directora: 
Martha Vives 
 
 
 
 
 
Facultad de Ciencias 
Departamento de Ciencias Biologicas 
Universidad de los Andes 
 
 
 
Noviembre 27, 2015 
 
 
2 
 
RESUMEN. 
 
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa, ubicua, y con un metabolismo altamente 
versátil que frecuentemente se aísla de muestras contaminadas con petróleo. Es especialmente 
efectiva para remover alcanos entre hidrocarburos (HC) 16 y 26 ya que posee los genes AklB1 y 
AlkB2 que son alcanohidroxilasas que funcionan entre HC12 y HC24. En el presente estudio, se 
probó la remoción de alcanos para tres diferentes cepas (cepas ambientales M8A1 y M8A4, y cepa 
clínica de referencia PAO1) y se encontraron diferencias importantes en la remoción: M8A4 removió 
en promedio un 82% de alcanos, PA01 un 57% y M8A1 un 42%. Paralelamente, un estudio en curso 
mostró que todas las cepas poseen los mismos genes para la degradación de hidrocarburos de la 
fracción de alcanos del petróleo, por lo que las diferencias en el desempeño podrían ser dadas por 
factores diferentes al nivel genético que afecta la degradación, como lo son diferencias en 
transcripción, diferencias en mecanismos de regulación genética, diferencias en producción de 
biosurfactantes y diferencias en la superficie de contacto (biopelícula) con el sustrato. 
La superficie de contacto entre las células y el hidrocarburo está dada por la biopelícula que crece 
en la interfaz sustrato aire o sustrato agua, y la eficiencia en la construcción de esta biopelícula 
puede afectar las tasas de difusión de los hidrocarburos al interior de la célula, ya que la creación 
de biopelículas por parte de Pseudomonas aeruginosa se relaciona con aumentos en la 
hidrofobicidad de la superficie celular, lo que aumenta la interacción directa de las células con el 
hidrocarburo resultando en un aumento de la tasa de difusión. Pseudomonas aeruginosa es capaz 
de utilizar hidrocarburos como fuente de carbono porque produce biosurfactantes que le permiten 
solubilizarlos al interior de biopelículas que están en contacto con el petróleo. 
La información sobre el comportamiento de biopelículas de cepas ambientales de P. aeruginosa es 
poca y es menor aún la información disponible de su comportamiento durante procesos de 
degradación de hidrocarburos, principalmente debido a la dificultad que existe al recoger material 
biológico de la interface agua/petróleo donde la biopelícula de estos microorganismos realiza la 
degradación activa del hidrocarburo. Para realizar estudios de expresión se estandarizó una técnica 
para la recolección de biopelículas que crecen directamente sobre petróleo. 
Utilizando el mismo montaje de los estudios de expresión se evaluó las diferencias en la producción 
de la superficie de contacto (biopelícula) con microscopia confocal de fluorescencia; sin embargo, 
los resultados no fueron concluyentes debido a la autofluorescencia del petróleo y de las bacterias. 
Se realizaron además ensayos de caracterización de propiedades asociadas con la formación de 
biopelículas, como la formación de colonias antes y después de estar en presencia de petróleo, el 
movimiento swarming, twitching y swimming. M8A1 muestra morfologías diferentes a las de M8A4 
y PAO1 en cuanto a la arquitectura de la biopelÍcula, formación de colonias y movimientos;factores 
que pueden estar asociados con las diferencias observadas en la remoción de alcanos pues una 
formación de biopelícula deficiente afecta de forma negativa la tasa de difusión de los mismos. 
La técnica utilizada para visualizar las biopelÍculas sobre las gotas de petróleo nos permitió aislar 
RNA y detectar la expresión de genes asociados con degradación de alcanos y factores de virulencia 
en las biopelículas sobre crudo utilizando como control biopelículas sobre aceite de girasol. Se 
encontró que en las biopelículas que crecen sobre petróleo se expresan todos los genes evaluados 
mientras que en las biopelículas de aceite de girasol los genes asociados a rutas de degradación de 
alcanos, las bombas de excreción MexCD-OprJ, MExX-oprm asociado a resistencia a antibióticos y 
los genes ExoS y ExoT de proteínas secretadas por el sistema de secreción tipo 3 no se detectan. 
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La mayoría de los determinantes de patogenicidad (factores de virulencia) fueron expresados tanto 
en biopeliculas asociadas a petróleo y de aceite vegetal. Estos genes están bajo la regulación de los 
sistemas quorum sensing que se activan durante la formación de biopelículas y puede que no 
cumplan ninguna función directa en la degradación aunque es adecuado pensar que pueden estar 
cumpliendo alguna función aún desconocida. La expresión del T3SS y bombas de excreción 
únicamente en las biopelículas crecidas en petróleo genera muchos interrogantes. 
La información sobre biopelículas de cepas ambientales de P. aeruginosa y su comportamiento en 
procesos de degradación de hidrocarburos es escasa. Este estudio aporta información nueva sobre 
el comportamiento de las biopelículas de cepas ambientales durante procesos de degradación de 
petróleo, en los que se evidencia la respuesta de estrés, la transcripción de genes asociados a la 
degradación y la expresión de determinantes de patogenicidad. Además, contribuye con una técnica 
para evaluar la formación de biopelículas sobre petróleo y abre la puerta a futuros estudios 
cuantitativos de expresión en biopelículas y optimizar los procesos de biorremediación 
 
 
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Contenido 
 
RESUMEN. ....................................................................................................................................... 2 
INTRODUCCION. ............................................................................................................................. 6 
OBJETIVO GENERAL. ..................................................................................................................... 10 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS. .............................................................................................................. 10 
MATERIALES Y METODOS ............................................................................................................. 11 
1. Microorganismos: Cepas de Pseudomona aeruginosa ................................................... 11 
2. Remoción de alcanos ........................................................................................................ 11 
3. Estandarización de la formación de biopelícula sobre gota de petróleo. ...................... 12 
4. Morfología de Biopelículas............................................................................................... 13 
5. Determinación de características morfológicas y funcionales ........................................ 14 
6. Expresión de Genes de degradación y de virulencia en biopelículas. ............................ 15 
RESULTADOS ................................................................................................................................. 17 
1. Remoción de Alcanos ....................................................................................................... 17 
2. Estandarización de la formación de biopelícula sobre gota de petróleo. ...................... 18 
3. Morfologia de Biopelículas............................................................................................... 22 
4. Determinación de características morfológicas y funcionales........................................ 25 
5. Expresión de Genes de degradación y virulencia en biopelículas. ................................. 27 
DISCUSIÓN ....................................................................................................................................30 
CONCLUSIONES ............................................................................................................................. 34 
BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................... 35 
ANEXOS ......................................................................................................................................... 40 
 
 
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Lista de Figuras 
 
FIGURA 1: PORCENTAJE DE REMOCIÓN DE ALCANOS ___________________________________________ 17 
FIGURA 2: PETRÓLEO INMOVILIZADO EN GOTAS DE ALGINATO 4% ________________________________ 19 
FIGURA 3: BACTERIAS CRECIENDO SOBRE LA SUPERFICIE DE LAS PERLAS DE PETRÓLEO. _______________ 19 
FIGURA 4: BACTERIAS COLONIZANDO BOLSILLOS DE PETRÓLEO EN PERLAS DE ALGINATO. _____________ 20 
FIGURA 5: PETRÓLEO INMOVILIZADO EN AGAROSA 2% _________________________________________ 20 
FIGURA 6: MONTAJES UTILIZANDO CAPILARES DE VIDRIO _______________________________________ 21 
FIGURA 7: MONTAJE DE GOTAS DE PETRÓLEO. ________________________________________________ 21 
FIGURA 8: RECUPERACIÓN DE LA BIOPELÍCULA SOBRE Y ALREDEDOR DE LA GOTA DE PETRÓLEO ________ 22 
FIGURA 9: DIFERENCIAS DE MORFOLOGÍA DE LA BIOPELÍCULA DE HIDROCARBUROS DE LAS TRES CEPAS __ 23 
FIGURA 10: FOTOGRAFÍA UTILIZANDO SYTO9 DE LA BIOPELÍCULA DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA PAO1 
CRECIENDO SOBRE UNA GOTA DE PETRÓLEO. _________________________________________________ 24 
FIGURA 11: FOTOGRAMA DEL MODELO 3D DE LAS BACTERIAS (PAO1) SOBRE EL PETRÓLEO MOSTRANDO 
BACTERIAS AL INTERIOR DE LA GOTA DE PETRÓLEO. ____________________________________________ 24 
FIGURA 12: DEFINICIÓN DE VARIABLES DE MORFOLOGIA DE COLONIA Y MOVILIDAD. _________________ 25 
FIGURA 13: EXPRESIÓN DE GENES DE VIRULENCIA Y DEGRADACIÓN PARA RNA PROVENIENTE DE 
BIOPELÍCULAS DE PETRÓLEO Y ACEITE DE GIRASOL. ____________________________________________ 27 
FIGURA 14: CAMBIOS EN LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE PILB PARA M8A1 FRENTE A PAO1 Y M8A4 _ 28 
FIGURA 15: PREDICCIÓN ESTRUCTURAL DE PILB PARA M8A4 Y M8A1 BASADO EN SECUENCIA DE 
AMINOACIDOS __________________________________________________________________________ 28 
FIGURA 16: SIMILITUD ESTRUCTURAL DE LAS QUINOLONAS CON HIDROCARBUROS DE PETRÓLEO. ______ 32 
FIGURA 1 (Anexo): CROMATOGRAMAS DE M8A4 PARA LAS SEMANAS 1, 4 Y 8. ______________________ 40 
FIGURA 2 (Anexo): CROMATOGRAMAS DE M8A1 PARA LAS SEMANAS 1, 4 Y 8. ______________________ 41 
FIGURA 3 (Anexo): CROMATOGRAMAS DE PAO1 PARA LAS SEMANAS 1, 4 Y 8. _______________________ 42 
FIGURA 4 (Anexo): CAMBIOS EN LA MORFOLOGIA DE COLONIA DE PAO1 DESPUES DE ESTAR 7 DIAS EN 
PETRÓLEO. _____________________________________________________________________________ 44 
FIGURA 6 (Anexo): CAMBIOS EN LA MORFOLOGIA DE COLONIA DE M8A1 DESPUES DE ESTAR 7 DIAS EN 
PETRÓLEO ______________________________________________________________________________ 45 
 
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INTRODUCCIÓN. 
 
Las biopelículas se encuentran en toda la naturaleza y ocurren en multitud de diferentes interfaces 
(liquido-solido, liquido-líquido y líquido-aire)(Dasgupta, Ghosh, & Sengupta, 2013; Macedo, 
Kuhlicke, Neu, Timmis, & Abraham, 2005; Rühs, Böcker, Inglis, & Fischer, 2014; Solano, Echeverz, & 
Lasa, 2014). Las bacterias forman biopelículas principalmente para defenderse del estrés ambiental 
como lo son los rayos UV o el choque osmótico(Hall-Stoodley, Costerton, & Stoodley, 2004; Parsek 
& Greenberg, 2005). El desarrollo de las biopelículas se lleva a cabo en varios pasos, desde la unión 
de las bacterias al sustrato hasta la separación de las bacterias y la colonización de nuevos 
sutratos(Parsek & Greenberg, 2005; Persat, Inclan, Engel, Stone, & Gitai, 2015; Stoodley, Sauer, 
Davies, & Costerton, 2002). La mayoría de las biopelículas bacterianas no son deseables ya que se 
forman en la superficie de los tubos de aguas potables o en superficies industriales y se convierten 
en la fuente de intoxicación o enfermedades en las poblaciones humanas o perdidas económicas en 
la industria(Stoodley et al., 2002). 
En general, las biopelículas pueden ser definidas como comunidades de microorganismos que se 
encuentran asociados a una superficie abiótica. Están formadas por una sola especie de organismos 
o por múltiples (Costerton, Stewart, & Greenberg, 1999; Grimaud, 2010) pero en el ambiente, las 
biopelículas de una sola especie son escasas. Por el contrario en medicina las biopelículas de una 
sola especie son muy importantes porque suelen estar asociadas a equipos médicos y se convierten 
en un factor de riesgo importante para los pacientes (George O'Toole, Kaplan, & Kolter, 2000). 
Pero las biopelículas también pueden tener un efecto positivo en los tratamientos de aguas y son 
claves para la ecología global. En biorremediación, las biopelículas bacterianas se utilizan para 
degradación de alcanos y compuestos aromáticos policíclicos. Bacterias capaces de formar 
biopelículas en la interface agua-crudo poseen diversos metabolitos que les permiten utilizar el 
crudo como fuente de carbono, estas bacterias forman biopelículas alrededor de las gotas de 
petróleo para optimizar su captura de carbono (Dasgupta et al., 2013; Macedo et al., 2005; Rühs et 
al., 2014). La efectividad de la formación de la biopelícula depende de la hidrofobicidad de la 
superficie celular, ya que bajo la mayoría de condiciones fisiológicas las interacciones electrostáticas 
son repulsivas (las bacterias y la mayoría de superficies poseen carga neta negativa) sin embargo, la 
adhesión biológica se ve facilitada por la complejidad de las superficies celulares (Pili, flagelos, 
diversidad de proteínas, polisacáridos y en el caso de las biopelículas sobre líquidos viscosos 
producción de biosurfactantes)(Rühs et al., 2014). 
La producción de ramnolípidos en presencia de líquidos viscosos hace parte del primer paso de la 
formación de la biopelícula. Este primer paso se denomina acondicionamiento, su objetivo es 
generar cambios en el sustrato que permitan a las bacterias establecerse más fácilmente. La 
producción de ramnolípidos genera entonces cambios en la hidrofobicidad y en la tensión superficial 
crítica del sustrato (Dasgupta et al., 2013; George O'Toole et al., 2000; Rühs et al., 2014). 
Los cambios en la tensión superficial crítica del sustrato permiten a las bacterias ingresar en la capa 
viscosa utilizando el mecanismo de difusión Eddy o difusión turbulenta (Rühs et al., 2014). En este 
caso hay una adsorción directa con el sustrato y la creación de una interface con niveles de 
hidrofobicidad, fluidez, humedad, emulsificación y solubilización intermedios entre el medio y el 
líquido viscoso. Esta interfaz permite a las bacterias iniciar la colonización del sustrato dando la 
señal para que un grupo de bacterias cambie su morfotipo de nadadoras/planctónicas a no 
nadadoras/biopelícula (Macedo et al., 2005). 
7 
 
Poca información existe sobre biopelículas asociadas a petróleo crudo dado que el petróleo es un 
compuesto muy complejo y varia de un punto de extracción al otro, en general se prefiere simplificar 
los ensayos al evaluar el crecimiento en hidrocarburos sencillos o aceites como fuente de carbono. 
En modelos de aceite-agua el morfotipo de nadado libre facilita la difusión turbulenta utilizando 
flagelos como propulsores y mezcladores de los dos horizontes fluidos (Rühs et al., 2014); una vez 
la señal ambiental es dada, una o múltiples bacterias pierden su morfotipo de nadado libre - pierden 
los flagelos - y desarrollan un morfotipo con mayor expresión de pili, es aparente entonces que las 
células cambian de motilidad swimming a motilidad Twitching (Eric Deziel, Comeau, & Villemur, 
2001; Drenkard & Ausubel, 2002; Klausen et al., 2003; GA O'Toole & Kolter, 1998). Estas células que 
han perdido el morfotipo de nadado son el inicio de una microcolonia. La presencia de esta 
microcolonia es la primera fase de la formación de la biopelícula(Grimaud,2010; Klausen et al., 
2003; Macedo et al., 2005). 
La microcolonia que se establece produce un exopolisacárido llamado alginato, este alginato es 
utilizado como matriz extracelular de la biopelícula y da protección a la misma (George O'Toole et 
al., 2000; GA O'Toole & Kolter, 1998; Prigent-Combaret, Vidal, Dorel, & Lejeune, 1999; Selezska et 
al., 2012; Stoodley et al., 2002; Vallet et al., 2004; Vallet, Olson, Lory, Lazdunski, & Filloux, 2001; R. 
Waite et al., 2006). 
P. aeruginosa muestra al menos tres fenotipos durante el ciclo de vida de una biopelícula: (a) 
planctónica, (b) biopelícula madura, y (c) dispersión. Estos fenotipos muestran patrones de 
expresión tan diferentes entre ellos, que son comparables a las diferencias que muestran especies 
diferentes del género Pseudomonas en estadios similares de crecimiento. (Drenkard & Ausubel, 
2002; Sauer, Camper, Ehrlich, Costerton, & Davies, 2002; Stoodley et al., 2002). 
Este modelo de formación de biopelícula es el comúnmente utilizado para todos los estudios y 
aunque se construyó sobre estudios con cepas clínicas, superficies solidas o aceites vegetales, es 
interesante pensar en la nueva información que pueda aportar el estudio de las biopelículas sobre 
las gotas de petróleo. La formación de una biopelícula es una respuesta fisiológica muy compleja 
que implica la interacción de múltiples rutas genéticas. El origen de una biopelícula es tan complejo 
que ha sido comparado con la estructura compleja de los tejidos en eucariota (George O'Toole et 
al., 2000). 
La formación de biopelículas en Pseudomonas aeruginosa está regulada por quorum sensing (QS). 
Quorum sensing es uno de los mecanismos globales de regulación que P. aeruginosa utiliza para 
regular cientos de genes, entre ellos la mayoría de factores de virulencia, en respuesta al tamaño 
de la población (Schuster y Greenberg, 2006). El sistema de regulación QS mide la cantidad de 
individuos que rodea a una célula dada, está compuesto por dos circuitos interregulados 
relacionados llamados sistema las y sistema rhl que dependen de moléculas de N-Acil Homoserina 
Lactona (AHL) (Chugani & Greenberg, 2010; Diggle, Winzer, Lazdunski, Williams, & Camara, 2002). 
También participa en la regulación una molécula señal tipo quinolona y por otros reguladores 
transcripcionales y pos-transcripcionales (Yarwood et al., 2005, Schuster et al., 2003). El sistema las 
está compuesto por el activador transcripcional LasR y la sintetasa AHL LasI que controla la síntesis 
de N-3-oxo-dodecanoyl-homoserin lactona (3-oxo-C12-HSL). El sistema rhl consiste del regulador 
transcripcional RhlR y de la sintetasa AHL Rhl que controla la síntesis de N-butanoyl-homoserin 
lactona (C4-HSL). Dado que el complejo LasR-3-oxo-C12-HSL regula de forma positiva la 
transcripción de RhlR y Rhll, los dos sistemas se encuentran interconectados y el gen rhrlR depende 
no solo de LasR para su expresión sino también de Vfr y del mismo RhlR (Juhas et al., 2005). Además, 
Dong et al., en el 2005 encontraron que el regulador de respuesta PprB y el activador transcripcional 
VqsM son moduladores de los genes lasI, rhlI, rhlR entre otros. 
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Se ha encontrado que además de la densidad poblacional la activación del circuito Las/Rhl es 
dependiente del medio de cultivo de la bacteria. Utilizando 40 diferentes condiciones de 
crecimiento en cultivos de flujo continuo Duan y Surette (Duan & Surette, 2007) mostraron que la 
expresión de lasR, lasI, rhlI y rhlR variaba en gran mediad dependiendo de si se trataba de medios 
de cultivo ricos o pobres en nutrientes. En medios pobres la transcripción de estos genes iniciaba 
más temprano que en medios ricos y no se halló correlación alguna entre la densidad poblacional y 
la expresión de genes QS, lo que indica que bajo las condiciones evaluadas, no había un pre-requisito 
de densidad poblacional para la expresión de dichos genes (Duan & Surette, 2007). Por lo que 
podemos afirmar que en P. aeruginosa muchos procesos fisiológicos dependen de QS pero QS no 
depende únicamente de la densidad celular. Muchos otros parámetros son necesarios y esos 
parámetros pueden cambiar con el medio que las células habitan, esto quiere decir que QS no solo 
es un sistema global de regulación, sino que es una respuesta adaptativa a un medio en cambio 
continuo (E. Deziel et al., 2004; Wilder, Diggle, & Schuster, 2011; Williams & Cámara, 2009). 
Además de presentar QS, Pseudomonas aeruginosa posee una alta versatilidad metabólica con solo 
5000 a 6000 genes (Alonso et al., 1999). Es aislada de forma repetitiva en estudios enfocados al 
aislamiento e identificación de microorganismos capaces de degradar hidrocarburos y es un 
patógeno oportunista (Obuekwe et al., 2009; Sobiecka et al., 2009; AL-Saleh et al., 2009). 
Pocos genes son asociados de forma tradicional a la degradación de hidrocarburos, y su presencia 
puede ser utilizada como medida del potencial de degradación de un microorganismo o una muestra 
ambiental. La degradación de n-alcanos está asociada al grupo de genes alk (C16 a C26 genes alkB1 
y alkB2) (Staijen, Hatzimanikatis, & Witholt, 1997), la degradación de catecol está asociada al gen 
xylE que codifica para catecol dioxigenasa (Okuta, Ohnishi, & Harayama, 1998), la degradación de 
hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH) está asociada a genes de dioxigenasas como naftaleno 
dioxigenasa nahAa (reductasa), nahAb (ferrodoxina), and nahAc (subunidad grande de dioxigenasa) 
(Daane, Harjono, Zylstra, & Haggblom, 2001); el operón xyl codifica genes de oxidación de tolueno 
(Farhadian, Vachelard, Duchez, & Larroche, 2008), genes nbz (nbzA, nbzB, nbzC) codifican para 
nitrobenceno nitrorreductasas, 2–aminofenol 1,6–dioxigenasa e hidroxilaminobenceno mutasa (Ju 
& Parales); finalmente, la degradación de fenol está asociada a genes de fenol hidroxilasa (PHs) 
(Caldwell, Garrett, Prince, & Suflita, 1998). 
Dado su potencial de utilización en procesos de biorremediación pues presenta los genes alkB1 y 
alkb2, se han realizado estudios buscando diferenciar los aislamientos clínicos (“peligrosos”) de los 
ambientales (“inocuos”). Estos estudios han mostrado que no existe una diferencia detectable entre 
la virulencia de las cepas ambientales y las cepas clínicas asociada a la presencia de genes específicos 
de los determinantes de virulencia como lo son la resistencia a antibióticos por bombas de excreción 
(Mex, Opr), sistemas de secreción tipo 3 (ExoS y ExoT), pili tipo IV (PilB), flagelos (FliA), movilidad 
tipo swarming, swimming y Twitching (pilB, FliA, RhlA), varias proteasas (LasA, LasB, ToxA), 
ramnolipidos (Rhl) o hemolisinas (ToxA), elastasas (LasA) (A Alonso, Campanario, & Martinez, 1999; 
Ana Alonso, Rojo, & Martínez, 1999; Feltman et al., 2001; Vives-Flórez & Garnica, 2006). Pero estos 
estudios se centran en la utilización de cepas de origen clínico. Estos determinantes de virulencia 
están asociadas a la colonización de células eucariotas, pues los estudios se centran en cepas y/o 
ambientes clínicos, y muy poco se conoce sobre su función en otros ambientes de crecimiento. 
En general los estudios de degradación de hidrocarburos se realizan en modelos simplificados 
agregando al medio únicamente uno de los compuestos anteriormente nombrados y sobre los 
cuales se describió la ruta metabólica (fenol, tolueno, naftaleno, catecol, n-alcanos hasta C30). Los 
modelos simplificados permiten la evaluación de rutas metabólicas precisas, sin embargo, la 
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complejidad del petróleo crudo puede otorgar condiciones de crecimiento muy diferentes a 
aquellas evaluadas en los modelos simplificados y las respuestas metabólicas o fisiológicas de los 
organismos pueden cambiar. 
Es importante entonces contar con una metodología que permita la recolección de material 
genético de buena calidad de muestras directamente contaminadas con petróleo para poder 
evaluar si en efecto la complejidad del petróleo afecta lo que se conoce actualmente o si por el 
contrario,los modelos actuales son suficientes para explicar la respuesta metabólica de los 
organismos capaces de aprovechar el petróleo como fuente de carbono. Dado que el 
aprovechamiento del petróleo está asociado a la biopelícula que las bacterias forman sobre él, el 
estudio de lo que sucede al interior de estas biopelículas se hace de vital importancia. 
La información sobre el comportamiento de biopelículas de cepas ambientales de P. aeruginosa es 
poca y es menor aun la información disponible de su comportamiento durante procesos de 
degradación de hidrocarburos debido a la dificultad que existe al recoger material biológico de 
muestras contaminadas. Por lo tanto es importante el aportar al conocimiento del comportamiento 
de cepas ambientales al determinar el perfil de expresión de genes asociados con la degradación de 
alcanos y la virulencia en la biopelícula de tres cepas de Pseudomonas aeruginosa asociada a gotas 
de petróleo, lo que permitirá en el futuro optimizar los procesos de biorremediación. 
 
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OBJETIVO GENERAL. 
Determinar la expresión de genes asociados con la degradación de alcanos y la virulencia en tres 
cepas de Pseudomonas aeruginosa cuando crecen en biopelícula sobre gotas de petróleo, y su 
relación con la degradación de los alcanos. 
 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 
1. Medir la remoción de hidrocarburos totales de petróleo para las cepas P. aeruginosa PA01, 
P. aeruginosa M8A1 y P. aeruginosa M8A4. 
2. Estandarizar una metodología para la formación y separación de biopelículas crecidas sobre 
petróleo. 
3. Determinar el presencia de transcritos por medio de RT-PCR de las biopelículas de tres cepas 
P. aeruginosa PA01, P. aeruginosa M8A1 y P. aeruginosa M8A4 en medio con y sin petróleo 
para genes asociados a QS, virulencia, movilidad y degradación de alcanos. 
4. Identificar diferencias en morfología de colonia y tipos de movilidad asociada a formación 
de biopelículas para las cepas P. aeruginosa PA01, P. aeruginosa M8A1 y P. aeruginosa 
M8A4 después de crecer en presencia de petróleo. 
5. Asociar diferencias en la remoción de alcanos con diferencias en la morfología de las 
biopelículas de las cepas P. aeruginosa PA01, P. aeruginosa M8A1 y P. aeruginosa M8A4 y 
sus perfiles de expresión. 
 
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MATERIALES Y METODOS 
1. Microorganismos: Cepas de Pseudomona aeruginosa 
TABLA 1: CEPAS DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA UTILIZADAS EN ESTE ESTUDIO. 
Nombre de la 
cepa 
Origen Publicación original 
PAO1 
Nosocomial, Australia. Aislada en 
1955 
Stover C K, Pham X Q, Erwin A L, Mizoguchi 
S D, et al., (2000) (secuenciación del 
genoma) aislamiento de 1955 por B. W. 
Holloway. 
PaM8A1 
Ambiental, Colombia, aguas 
residuales de explotación petrolera 
Vives-Flores, (2006) 
PaM8A4 
Ambiental, Colombia, Aguas 
residuales de explotación petrolera 
Vives-Flores, (2006) 
 
1.1. Activación de las cepas 
Las cepas se mantienen congeladas a -80°C. Para su activación se inocularon 5ml de medio LB (10g 
NaCL, 10g Triptona, 5g extracto de levadura) con cada una de las cepas y se incubaron ON a 30°C 
con agitación de 150rpm 
2. Remoción de alcanos 
El petróleo utilizado en este estudio fue tipo Trinidad, grado API 33 proveniente de Yopal, Casanare. 
El petróleo asociado al campo petrolero de Cusiana posee las siguientes características físicas: 
densidad a 15°C 0.8056, azufre total wt%:0.11, mercaptanos/tioles ppm:0.0001, viscosidad a 20°C: 
2.44, viscosidad a 30°C 2.04, ceras wt%:10.0, nitrógeno total ppm(wt): 232, nitrógeno básico 
ppm(wt): 68, azufre total wt %: 0.11, mg KOH/g: 0.01, residuos de carbón wt %: 0.595, asfaltenos 
wt %: 0.212, niquel ppm (wt): 0.8, hierro ppm (wt): 1.1 (Corporation, 2011). 
Para los montajes, el petróleo fue esterilizado en un ciclo de autoclave (30min, 121°C) utilizando 
botellas selladas de vidrio con atmosfera anaeróbica (CO2). El CO2 se burbujea en la botella antes de 
sellarla y una vez sellada el CO2 es inyectado a presión para saturar la atmosfera de la botella. 
Se realizaron pruebas de esterilidad en las cuales 10ul de petróleo fueron sembrados en cajas de 
Petri de LB, cetrimide, agar nutritivo y PDA. Ninguna de las cajas mostró crecimiento después de 12, 
24 y 48 horas en incubación a 30°C. La caja de PDA fue mantenida en incubación durante 8 días más 
y no mostró crecimiento de ningún microorganismo. 
Los ensayos de degradación fueron montados en erlenmeyer de 250ml. y 100ml de medio mínimo 
de sales (MMS) (K2PO4, NH4Cl, Na2SO4, KNO3, CaCl2.6H2O, MgSO4, FeSO4); fue enriquecido con 1ml 
de petróleo estéril e inoculado con las células previamente crecidas en LB a una concentración final 
de 107ufc/ml. Antes de la inoculación estas células fueron centrifugadas 30min a 12000rpm y 
lavadas dos veces con buffer fosfato salino (PBS) 1X para asegurar que no se arrastrará LB a los 
ensayos. 
12 
 
Se realizaron 3 réplicas de cada cepa semanalmente durante 8 semanas (En total se realizaron 96 
cultivos = 12 erlemeyer (3xcepa+control) X 8 semanas). Semanalmente los cultivos de los ensayos 
de degradación (12 erlenmeyer) fueron retirados de la incubadora para realizar una extracción 
destructiva. Cada cultivo fue sometido a un tratamiento de 10ml de NaCl 5M para matar las 
bacterias antes del proceso de extracción. Para la extracción de los alcanos a una fase líquida de 
cromatografía los cultivos fueron tratados con 10ml de hexano por cada 1% de petróleo durante 
24h. 
La cromatografía de gases se corrió en el Mass Spect Facility de la Universidad Estatal de Michigan. 
La temperatura inicial fue de 50ºC y la máxima fue de 350ºC, en incrementos de temperatura cada 
2 minutos. La columna utilizada fue DB-5m de 30m de longitud y 250um de diámetro. Como control 
interno de tiempo de retención se utilizaron alcanos de 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26 carbonos 
además de estearato de 18C. 
Además del tiempo de retención con respecto a los patrones, se confirmó la identidad de cada pico 
utilizando el espectro de masas. 
La concentración total de alcanos fue cuantificada utilizando las áreas bajo la curva y la fórmula 
para hidrocarburos totales de petróleo (TPH). Los porcentajes de remoción fueron calculados 
utilizando la siguiente expresión: 
 % de remoción = [(alcanos control – alcanos tratamiento)/alcanos control]*100 (Drews; Zhengzhi 
Zhang et al., 2010). 
3. Estandarización de la formación de biopelícula sobre gota de petróleo. 
El estudio de las biopelículas formadas por Pseudomonas aeruginosa rutinario en los laboratorios 
de microbiología médica alrededor del mundo. La inclusión del petróleo en nuestro ensayo hace 
que la utilización de técnicas como la microtitulación en pozos de fondo plano sea imposible de 
utilizar pues el petróleo tiñe los pozos de microtitulación y no permite la lectura clara de las placas. 
 
El petróleo aporta contaminantes al medio (azufre, partículas sólidas) que dificultan e interfieren 
con la purificación de material genético de las células al coprecipitar o cambiar las condiciones de 
reacción. Es por esto que los estudios de biopelículas durante degradación de hidrocarburos se 
centran en las células planctónicas que no están directamente en contacto con el petróleo; en 
células que han formado biopelícula sobre otros materiales en medios contaminados con petróleo 
(laminillas de vidrio (Dasgupta et al., 2013), láminas de polietileno (Macedo et al., 2005), células 
HeLa o en colonias recuperadas después de múltiples repiques en medio con petróleo como única 
fuente de carbono. 
 
Parte de lo que se busca es que la metodología finalmente escogida permita la recuperación de la 
biopelícula que crece directamente sobre el petróleo para posteriormente realizar extracciones de 
material genético de la misma. 
 
3.1. Perlas de alginato. 
El petróleo se inmovilizó en perlas de alginato al 4%, la cantidad de petróleo inmovilizada es 1ml de 
crudo por cada 100ml de MMS. 
En promedio cada perla pesó 0,64g y se realizaron aproximadamente 115 perlas por cadamililitro 
de petróleo a inmovilizar. Las perlas fueron agregadas a 100ml de medio mínimo de sales en 
13 
 
erlenmeyer de 250ml y los ensayos fueron inoculados con 107 ufc/ml con las cepas de interés. Al 
final de este ensayo (ocho días) se observó que la población bacteriana planctónica había disminuido 
hasta 104 ufc/ml. Los erlenmeyer fueron incubados a 25°C sin agitación. 
3.2. Láminas de agarosa. 
El petróleo se inmovilizó en agarosa al 2%. El 1% de petróleo v/v con respecto al volumen total de 
la caja de Petri fue servido de forma tal que cubría todo el fondo de la caja. La agarosa a 60-70ºC 
fue vertida sobre el petróleo y la caja fue agitada para asegurar que la agarosa se mezclara con el 
petróleo a medida que iba solidificando. 
Este ensayo fue inoculado por siembra masiva sobre la agarosa solidificada a partir de un cultivo 
con 107ufc/ml e incubado a 25°C. 
3.3. Capilares de vidrio. 
En un erlenmeyer de 50ml, se inocularon 25 ml de MMS con 107ufc/ml de la bacteria. Luego se 
puso un tapón de goma que sostenía un capilar de vidrio que anteriormente se había dejado 
absorber petróleo. Cada capilar cargaba en promedio 25ul de petróleo. Estos ensayos se incubaron 
a 25°C, sin agitación. 
3.4. Gotas de petróleo. 
El montaje consistió en una modificación del protocolo de Macedo (Macedo et al., 2005) en el que 
se cambian las láminas de Permanox por láminas de polipropileno, la fuente de carbono por 
petróleo y el volumen de medio de 1L a 60ml así: poner una gota de petróleo sobre una matriz 
adherente (tapa de una caja de Petri de 5cm de diámetro en polipropileno), y dejar la tapa de Petri 
flotando sobre la superficie del MMS. Cada caja de Petri profunda tiene 2 tapas de cajas de Petri 
mini y 2 gotas de 30ul de petróleo cada una. 
Cada caja de Petri fue inoculada con 107ufc/ml de la cepa de interés. La biopelícula se dejó crecer 
durante 13 días a 25°C sin agitación y luego fue recuperada utilizando un aplicador estéril. Las 
biopelícula recuperadas fueron cuantificadas utilizando ufc, se sembraron solo las diluciones de 10-
7 a 10-10 y tres replicas por dilución. 
4. Morfología de Biopelículas. 
4.1. Fotografías arquitectura macro. 
Se realizó el ensayo de formación de biopelícula siguiendo las instrucciones de Macedo y 
colaboradores, 2005(Macedo et al., 2005) y con las siguientes modificaciones: Láminas de 
polipropileno como soporte para las gotas de petróleo, Medio mínimo de sales (composición por 
litro: 0,5g K2PO4, 1g NH4Cl, 2g Na2SO4, 2g KNO3, 0,001g CaCl2.6H2O, 1g MgSO4, 0,0004gFeSO4). 
 
Las fotografías de la arquitectura macro de la biopelícula fueron tomadas utilizando un microscopio 
óptico en el cual se montó la lámina de polipropileno con la biopelícula madura. Las fotografías 
fueron tomadas sobre el borde de la gota de petróleo, lo que permitio observar la biopelícula 
alrededor de la misma. 
4.2. Fotografías de fluorescencia. 
Se realizó microscopia de fluorescencia sobre los montajes de formación de biopelículas utilizando 
Syto9 para teñir el DNA de las células. 
14 
 
Los stacks para modelamiento de las biopelículas fueron tomados con el microscopio Olympus 
FluoView 1000 Filter-based CLSM. 
 
El análisis preliminar de las imágenes se realizó con el software ImageJ, el modelamiento de la 
biopelícula sobre la gota de petróleo se realizó utilizando el software Imaris. 
 
Las características de imagen fueron: 1024x1024um, lectura en un canal, tamaño de Z 43 (número 
de imágenes tomadas en profundidad), profundidad 45,88um, distancia entre puntos Z 1,07um, 
distancia entre puntos X 0,22um, distancia entre puntos Y 0,22um. 
 
Los modelos se construyeron buscando partículas de 0.5um por 1.5um (dimensiones de las células 
de Pseudomonas aeruginosa) en las imágenes del stack. 
 
5. Determinación de características morfológicas y funcionales 
5.1. Morfología de colonia 
Las fotografías de morfología de colonia se realizaron sobre el medio de contraste descrito por 
Dietrich y colaboradores, 2008 (Dietrich, Teal, Price-Whelan, & Newman, 2008). Para el control 10ul 
de un over night de bacterias crecidas en LB fueron sembrados en el centro de la caja y las fotografías 
se tomaron 24 horas después de ser inoculadas. Los cultivos fueron mantenidos a 25°C. 
 
Para determinar cambios en la morfología de colonia después de estar en petróleo, las cajas con 
medio de contraste se inocularon con 10ul de bacterias que habían estado creciendo durante 7 días 
en petróleo. Cada ensayo se montó 5 veces. 
 
5.2. Movilidad 
Los ensayos de movilidad se realizaron siguiendo las indicaciones de Rashid y Kornberg, 2000 
(Rashid, Rao, & Kornberg, 2000). Se compararon los grados de movilidad swimming, swarming y 
twiching para bacterias que habían estado creciendo durante 7 días, en presencia de petróleo. 
Swimming: Triptona 10g/L, NaCl 5g/L, agarosa 0.3% p/v. lo que permite que el medio de crecimiento 
no sea del todo sólido y las bacterias puedan “nadar” en el medio. Se midio principalmente el halo 
de nadado con respecto al punto de inoculación (distancia entre el punto de inoculación y el borde 
de la “colonia”) donde mayores halos de nadado indican mayor capacidad de swimming de las 
células y están relacionados a morfotipos donde los flagelos están presentes. Estas cajas de Petri se 
incubaron a 30°C sin agitación durante 14h. 
 
Swarming: Agarosa 0.5% p/v, 8 g/L caldo LB, 5 g/L glucosa. Las cajas de petri fueron dejadas secar 
a temperatura ambiente durante 12h antes de ser utilizadas. Estas cajas se incubaron a 30°C 
durante 14h 
 
Twitching: Caldo LB (10 g/L triptona, 5 g/L extracto de levadura, 10 g/L NaCl), 1% (p/v) agar. Las cajas 
de petri se dejaron secar durante un par de horas antes de ser inoculadas. Se inocularon las cajas 
utilizando un palillo estéril para llegar al fondo de la caja. Se incubaron a 37°C durante 24 h. Se 
midio la zona de movilidad entre el agar y la caja de Petri. 
 
15 
 
Cada ensayo se montó cinco veces. 
 
6. Expresión de Genes de degradación y de virulencia en biopelículas. 
6.1. Extracción de RNA. 
 
Para la extracción de RNA se utilizó el kit RNeasy Midi de Quiagen, según instrucciones del 
fabricante. El material a extraer consistia en la biopelícula recuperada de los ensayos de gotas de 
petróleo (título anterior 3.4) y montajes similares realizados utilizando en vez de petróleo aceite de 
girasol. 
 
6.2. Determinación de la expresión de genes. 
 
La presencia/ausencia de transcritos de los genes de interés se evaluó por medio de RT-PCR. Para 
esto se utilizó el kit Acces quick Rt-PCR de Promega de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 
 
Los genes evaluados fueron los mismos de un trabajo anterior (Rojas, 2008). Sin embargo, es la 
primera vez que se evalúaban en RNA extraído de la biopelícula ya que anteriormente se trabajaba 
con material de las células planctónicas para evitar la contaminación con petróleo. Tabla 2. 
 
TABLA 2: GENES EVALUADOS Y SU FUNCIÓN 
 Gen Función Referencias 
LasI 
Síntesis de las moléculas auto inductoras que se unen a RhlR. Necesario para 
QS. Regulador de la biosíntesis de elastina 
(Chugani & 
Greenberg, 
2010) 
LasR Activador trascripcional del gen estructural de la elastina. Necesario para QS 
(Chugani & 
Greenberg, 
2010) 
ToxA Exotoxina A. Inhibe la expresión de proteínas en células eucariotas. 
(Rahme et al., 
1995) 
LasA Proteólisis y elastólisis. Ataca surfactantes pulmonares. 
(Solano et al., 
2014) 
LasB 
Hidrolisis de proteínas incluyendo elastina, colágenos tipos III y IV, fibronectina 
e inmunoglobulina A. Ataca surfactantes pulmonares. 
(Bastaert, 
Chignard, & 
Sallenave, 2015) 
RhII 
Cataliza la síntesis del autoinductor butirilhomoserin lactona que es necesario 
para QS. Se requiere para la síntesis de las moléculas auto inductoras que se 
unen a RhlR actuando como regulador de la biosíntesis de elastina y la 
producción de ramnolípidos 
(Solano et al., 
2014) 
RhlA 
Se requiere para la producción delsegmento hidrofóbico de ramnolípidos. 
Promueve movilidad Swarming. 
(E Deziel, Lepine, 
Milot, & 
Villemur, 2003) 
RhlB 
Ramnosiltransferasa. Asociado a la producción del segmento hidrofílico de 
ramnolípidos Componente del complejo de degradación de RNA. 
(Zhao et al., 
2015) 
ExoS 
Exoenzima secretada por el sistema de secreción tipo 3, funciona como efector 
del sistema. 
(Feltman et al., 
2001) 
ExoT 
Exoenzima secretada por el sistema de secreción tipo 3. Bloquea toxicidad 
necrótica y lleva a apoptosis, previene migración celular, interfiere con los 
contactos célula-sustrato, interfiere con el citoesqueleto. 
(Feltman et al., 
2001) 
16 
 
PilB Movilidad Twitching. Translocador de Pilin Tipo IV. 
(Persat et al., 
2015) 
FliA 
(rpoS) 
Movilidad Swimming. Factor sigma requerido para la expresión de FliC 
(flagelina) 
(Roberts, 
Maddocks, & 
Cooper, 2014) 
MexX 
Componente de la bomba de excreción MexXY-oprM. Transporta a través de 
membrana un grupo específico de antibióticos 
(Hocquet et al., 
2003) 
MexY 
Componente de la bomba de excreción MexXY-oprM. Transporta a través de 
membrana un grupo específico de antibióticos 
(Masuda et al., 
2000) 
MexC 
Componente de la bomba de excreción MexCD-OprJ Transporta a través de 
membrana un grupo específico de antibióticos 
(Masuda et al., 
2000) 
OprJ 
Componente de la bomba de excreción MexCD-OprJ Transporta a través de 
membrana un grupo específico de antibióticos 
(Masuda et al., 
2000) 
MexA 
Componente de unión periplasmática del sistema de excreción MexAB-OprM 
Transporta a través de membrana un grupo específico de antibióticos 
(Masuda et al., 
2000) 
OprM 
Componente de membrana externa del sistema de excreción MexAB-OprM. 
Sistema de excreción principal de n-hexano y p-xyleno. Puede remplazar el 
componente externo de membrana OprJ de la bomba MexCD-OprJ. Funciona 
como componente externo del sistema de excreción MexXY. Implicado en la 
secreción del sideróforo pyoverdina. 
(Hocquet et al., 
2003) 
Alkb1 
Alcano hidroxilasa C16 - C24. Hidroxila transfiere un átomo de oxígeno desde 
el oxígeno molecular al carbono terminal de hidrocarburos alifáticos 
conduciendo a la formación de un alcohol primario 
(Ji, Mao, Wang, 
& Bartlam, 2013) 
Alkb2 
Alcano hydroxilasa C12 – C-20 transfiere un átomo de oxígeno desde el 
oxígeno molecular al carbono terminal de hidrocarburos alifáticos 
conduciendo a la formación de un alcohol primario 
(Ji et al., 2013) 
NadB 
Produce L-aspartato oxidasa que se utiliza en el metabolismo de alanina y 
aspartato. Housekeeping. 
(Wang, Seeve, 
Pierson, & 
Pierson, 2013) 
 
 
Para la visualización de los resultados de RT-PCR se utilizaron geles de agarosa al 1% que se corrieron 
a 60V durante 1h. La presencia de bandas en el gel del tamaño esperado y sin bandas inespecíficas 
se tomó como un resultado positivo a la presencia de transcritos asociado al gen que se estuviese 
probando. Los productos de PCR se secuenciaron y anotados utilizando BLAST. 
 
Las secuencias de los genes de alkb1, alkb2, pilB, fliA de las tres cepas se alinearon utilizando el 
software MEGA y el algoritmo de alineamiento MUSCLE. Se realizó la predicción estructural del gen 
PilB en las tres cepas utilizando el servidor RaptorX y utilizando como templado la estructura 4HPTA 
que corresponde a la ATPasa GspE del complejo citoplasmático del sistema de secreción II de Vibrio 
vulnificus que es la secuencia más homologa a pilB en bases de datos que posee una estructura 
cristalina ya dilucidada. 
 
17 
 
 
RESULTADOS 
1. Remoción de Alcanos 
Se realizó un ensayo de remoción de alcanos y se siguió el resultado del mismo a través de de 
ochosemanas utilizando la técnica de cromatografía de gases asociada a espectroscopia de masas. 
Figura 1. 
FIGURA 1: PORCENTAJE DE REMOCIÓN DE ALCANOS 
 
La figura 1 muestra el porcentaje de remoción de los alcanos que se calculó utilizando la siguiente formula: % de remoción = [(alcanos 
control – alcanos tratamiento)/alcanos control]*100. 
Se calculó el porcentaje de remoción de los alcanos para cada una de las réplicas. El grafico 1 
muestra la eficiencia de remoción de cada una de las cepas a través del tiempo, la tabla tres muestra 
la varianza y la media de la cantidad de petróleo total (v/v) para cada cepa. 
TABLA 3: PROMEDIO Y VARIANZA DE LOS DATOS DE PETRÓLEO TOTAL (V/V). 
 Media Varianza Media Varianza Media Varianza 
Control 98 1 97,3333333 6,33333333 97,3333333 21,3333333 
M8A1 94,6666667 1,33333333 77,6666667 2,33333333 56,6666667 4,33333333 
M8A4 88 3 58 1 17 3 
PAO1 91,3333333 1,33333333 65 7 38 4 
 7 días 28 días 56 días 
 
Los cromatogramas (figura 1 a 3 del anexo) permiten observar como a lo largo del montaje la 
desaparición de los picos de alcanos es evidente en las muestras con bacterias frente a la muestra 
control. Sin embargo, la velocidad con la que desaparecen estos picos no es la misma para todas las 
bacterias. Para la semana 4 en los ensayos de M8A4 y PAO1 los únicos picos aun identificables son 
los picos de HC17 y HC18, mientras que para M8A1 en la semana 4 aún son identificables los picos 
de HC20 a HC31. 
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
7 2 8 5 6
%
 R
EM
O
C
IÓ
N
DIAS
Control P. aeruginosa M8A1 P. aeruginosa M8A4 P. aeruginosa PAO1
18 
 
Para la semana 8 el único pico identificable en PAO1 y M8A4 es HC17, mientras que para las 
muestras tomadas de M8A1 el pico HC18 también es identificable. HC17 es el pico de mayor 
abundancia en el petróleo que se probó, por lo que es lógico que sea también el pico que más 
demora en ser removido del medio. 
Para saber si la diferencia existente entre las medias de remoción de las diferentes cepas (tabla 3) 
eran o no significativas para cada uno de los puntos de medición (día 7, 28 y 56) se corrió un ANOVA 
para todos los grupos (Ho: µ1 = µ2 = µ3 = µ4; grados de libertad = 3, F = 662,0694444, P = 3,36115E-
23, valor critico F = 3,00878657) y pruebas T pareadas para las cepas en cada uno de los puntos de 
medición. La tabla 5 permite observar que las diferencias en remoción de hidrocarburos son 
significativas para el día 56. 
TABLA 4: VALORES P PARA PRUEBAS T PAREADAS DE LA REMOCIÓN DE HIDROCARBUROS DE 
LAS CEPAS PARA EL DIA 56. 
cepa P. aeruginosa M8A1 P. aeruginosa M8A4 P. aeruginosa PAO1 
P. aeruginosa M8A1 0 1,43326E-05 0,000361862 
P. aeruginosa M8A4 1,43326E-05 0 0,000162204 
P. aeruginosa PAO1 0,000361862 0,000162204 0 
 
2. Estandarización de la formación de biopelícula sobre gota de petróleo. 
 
Para poder comparar la respuesta de las poblaciones bacterianas en un medio tan complejo como 
lo es el petróleo crudo se vio la necesidad de tener un montaje que permitiese aislar material 
genético con el mínimo de contaminación por hidrocarburos y que biológicamente fuese fiel a lo 
que sucede en los proceso de degradación. 
Los montajes que usualmente permiten observar la formación de biopelícula sobre los 
hidrocarburos, no permiten que la biopelícula sea retirada sin arrastrar una gran cantidad del 
hidrocarburo consigo. Esto genera contaminación de la muestra cuando se realiza extracciones de 
material genético. La contaminación del material genético con alcanos o aromáticos limita los 
análisis que se pueden realizar sobre ese material. 
 
 
2.1. Perlas de alginato. 
 
La figura 2A muestra una visión macro de una perla de alginato con petróleo inmovilizado dentro 
de ella. 2B muestra un acercamiento de la superficie de la perla donde se observa que la distribución 
del petróleo al interior del alginato no es uniforme. La figura 2C muestra una vista alterna de la 
superficie de una perla, observándose que las zonas de rugosidad sobre la superficie corresponden 
a “bolsillos de petróleo”; o espacios donde microgotas de petróleo quedaron inmovilizadas muy 
cerca de la superficie de perla. 
 
 
 
 
19 
 
FIGURA 2: PETRÓLEO INMOVILIZADO EN GOTAS DE ALGINATO 4% 
 
Figura 2: Petróleo inmovilizado engotas de alginato 4%. Se observa que el alginato fue efectivo en inmovilizar el petróleo en su interior. 
2A Visión macro de una perla de alginato con petróleo inmovilizado dentro de ella. 2B acercamiento de la superficie de la perla, se observa 
que la distribución del petróleo al interior del alginato no es uniforme. 2C vista alterna de la superficie de una perla, zonas de rugosidad 
sobre la superficie. 
FIGURA 3: BACTERIAS CRECIENDO SOBRE LA SUPERFICIE DE LAS PERLAS DE PETRÓLEO. 
 
Figura 3: Bacterias creciendo sobre la superficie de las perlas de petróleo. Las bacterias se ven creciendo sobre las gotas de alginato 
(manchas blancas) 
Una de las cosas que se observó en este ensayo es que las bacterias no crecían “sobre” la superficie 
de las perlas (figura 3) sino que de hecho las bacterias ingresaban en la red de alginato y colonizaban 
los bolsillos de petróleo (Figura 4). Así mismo se observó que el petróleo escapaba en cierto 
porcentaje de las perlas y quedaba en el medio, lo que otorgaba al medio, al final del ensayo, una 
coloración café. 
En el caso de estas perlas, el que las bacterias no crezcan sobre ellas sino que ingresen en la red de 
alginato y colonicen la arquitectura interna de las perlas ocasiona un problema extra para el 
aislamiento y purificación de RNA. Para aislar RNA en este ensayo tendríamos que macerar las perlas 
liberando el petróleo al medio y el petróleo más el alginato pasa a ser otra fuente de contaminación 
de la muestra lo que dificulta la extracción de RNA de las biopelículas que crecen sobre el petróleo. 
 
 
 
 
20 
 
FIGURA 4: BACTERIAS COLONIZANDO BOLSILLOS DE PETRÓLEO EN PERLAS DE ALGINATO. 
 
2.2. Láminas de agarosa. 
 
Al final de este ensayo se observó que las bacterias crecen sobre la agarosa (sustrato solido) y sobre 
el petróleo (sustrato aceitoso). En este ensayo para poder retirar las células debíamos rasparlas de 
la matriz de agarosa, y al rasparlas arrastrábamos una considerable cantidad de petróleo líquido a 
la muestra además de que las células que crecen sobre una matriz solida activan diferentes 
mecanismos a aquellas que crecen sobre una matriz aceitosa y en este ensayo era imposible realizar 
la diferenciación de los dos tipos de células. 
 
FIGURA 5: PETRÓLEO INMOVILIZADO EN AGAROSA 2% 
 
La figura 5 permite observar el petróleo inmovilizado con agarosa. En este ensayo el petróleo no queda inmovilizado al interior de la 
agarosa sino que queda sobre la agarosa que se ha solidificado. 
 
 
21 
 
2.3. Capilares de vidrio. 
FIGURA 6: MONTAJES UTILIZANDO CAPILARES DE VIDRIO 
 
Figura 6: montaje de capilares de vidrio. La gota de petróleo se sostiene ´por tención superficial en el capilar de vidrio, pero una vez 
empieza a ser degradado el petróleo la tención superficial de la gota se pierde y esta se despende del capilar arrastrando consigo la 
biopelícula. 
La figura 6 muestra el montaje realizado con capilares de vidrio. El problema que presentó este 
montaje fue que una vez formada la biopelícula sobre la gota de petróleo, el petróleo empezaba a 
ser degradado y perdía sus componentes ligeros, esto ocasionó que la gota de petróleo que se 
sostenía sobre el capilar por tensión superficial colapsara y se soltara del capilar. Es entonces 
imposible recuperar la biopelícula sin tomar toda la gota de petróleo pues en el mejor de los casos, 
en los que la biopelícula se soltaba intacta junto con la gota de petróleo, esta envolvía totalmente 
la gota. Por lo tanto, la contaminación con petróleo de las muestras era muy alta y dificultaba la 
obtención de material genético de las biopelículas. 
2.4. Biopelícula sobre gota de petróleo. 
FIGURA 7: MONTAJE DE GOTAS DE PETRÓLEO. 
 
 
22 
 
 
FIGURA 8: RECUPERACIÓN DE LA BIOPELÍCULA SOBRE Y ALREDEDOR DE LA GOTA DE 
PETRÓLEO 
 
En este montaje la biopelícula se desarrolló en la interface medio/petróleo y sobre la superficie de 
polipropileno de la tapa de la caja de petri mini. La biopelícula se sostuvo por tension supericial y es 
esta misma fuerza la que permite que al romper un punto de tension superficial sobre la superficie 
de polipropileno la pelicula sea halada en la direccion contraria y sea repelida de la superficie de la 
gota de petróleo permitiendo su recuperación relativamente limpia. 
La formación de biopelícula se iniciaba hacia el día siete y hacia el día quince se observaba que 
partes de la biopelícula se desprendían de la gota de petróleo. En promedio cada biopelícula tenía 
entre 108 y 109 ufc. Con M8A1 mostrando de forma continua los valores más bajos de ufc/ml (107-
108). La literatura indica que la formación de biopelícula se da cuando la densidad poblacional en P. 
aeruginosa alcanza 10-7 ufc/ml y que las biopelículas maduras presentan densidades poblacionales 
de 10-8ufc/ml o 10-9 ufc/ml. (Dötsch et al., 2012; Macedo et al., 2005) por lo que se considera que 
las biopelículas utilizadas en este estudio son maduras. 
Este montaje es el que finalmente se escogió para llevar a cabo el aislamiento y purificación de RNA 
y la evaluación de presencia ausencia de transcritos relacionados a QS, virulencia y degradación de 
alcanos. 
Todo el proceso es más fácilmente observable en el video del siguiente enlace: 
https://youtu.be/Drr5GnKWoSo. 
3. Morfologia de Biopelículas. 
 
3.1. Fotografías arquitectura macro. 
 
Durante la separación de las biopelículas para extracción de RNA se observó que la biopelícula de 
M8A1 era muy débil y no se separaba como una sola unidad sino que al romper la tensión superficial 
https://youtu.be/Drr5GnKWoSo
23 
 
9 de 10 veces se deshacía en pedacitos, mientras que las biopelículas de M8A4 y PAO1 se separaban 
siempre en una sola unidad. 
Estas diferencias en resistencia de la biopelícula hacen surgir preguntas sobre las posibles 
diferencias que había entre ellas. A saber, ¿es la biopelícula de M8A1 diferente a las biopelículas 
producidas por PAO1 y M8A4? 
Para responder a esta pregunta se realizó fotografía al estereoscopio de las biopelículas creciendo 
sobre las gotas de petróleo. La figura 8 muestra las diferentes morfologías de la biopelícula que 
exhiben las tres cepas. 
FIGURA 9: DIFERENCIAS DE MORFOLOGÍA DE LA BIOPELÍCULA DE HIDROCARBUROS DE LAS 
TRES CEPAS 
 
Figura 9: Diferencias de morfología de la biopelícula de hidrocarburos de las tres cepas. La biopelícula que se observa para las cepas 
PAO1 y M8A4 es morfológicamente similar, mientras que la biopelícula que se observa para M8A1 es diferente con respecto a la de 
PAO1 
Se observó que M8A1 presenta una arquitectura diferente a la de las otras cepas, con una 
biopelícula aparentemente menos uniforme y compacta sobre la gota de petróleo. 
3.2. Fotografías de fluorescencia. 
Para intentar entender si las diferencias observadas en la arquitectura de las biopelículas eran 
producto de diferencias micro (posición de células vivas) al interior de las mismas, se realizó 
microscopia de fluorescencia utilizando Sito9 como marcador del DNA. 
Los resultados se observan en la figura nueve que muestra las proyecciones XY y YZ para el único 
montaje que permitía ver algo (PAO1). 
En la figura 9 podemos observar como el petróleo posee una señal muy fuerte y absorbió el 
fluorocromo (Syto9) lo que hizo que fuese difícil el ver la señal de las bacterias en la biopelícula. 
 
 
 
24 
 
 
FIGURA 10: FOTOGRAFÍA UTILIZANDO SYTO9 DE LA BIOPELÍCULA DE PSEUDOMONAS 
AERUGINOSA PAO1 CRECIENDO SOBRE UNA GOTA DE PETRÓLEO. 
 
Figura 10: Fotografía utilizando syto9 de la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa PAO1 creciendo sobre una gota de petróleo. A 
muestra la proyección XY de la fotografía. Aquí se observa la gota de petróleo en verde fluorescente continuo y la biopelícula en puntos 
verdes sobre fondo negro. En B se observa la proyección YZ o de profundidad, donde la gota de petróleo está en la parte superior de la 
imagen y la biopelícula en la parte inferior. 
La figura 10A se observa que la gota de petróleoadsorbe la mayor parte del reactivo Syto9 (mancha 
verde fluorescente) y las células de la biopelícula (puntitos verdes fluorescentes sobre fondo negro). 
La figura 10B permite observar las células de PAO1 en la parte de abajo y la señal del petróleo en la 
parte de arriba. 
Utilizando las imágenes del confocal de fluorescencia se realizó un modelo 3D de las biopelículas. 
La figura 11 muestra un fotograma del modelo 3D. 
FIGURA 11: FOTOGRAMA DEL MODELO 3D DE LAS BACTERIAS (PAO1) SOBRE EL PETRÓLEO 
MOSTRANDO BACTERIAS AL INTERIOR DE LA GOTA DE PETRÓLEO. 
 
Figura 11: Fotograma del modelo 3D de las bacterias (PAO1) sobre el petróleo mostrando bacterias al interior de la gota de petróleo. 
Fotograma tomado de la reconstrucción 3D del stack de imágenes del microscopio de fluorescencia. Cada punto rojo en la imagen 
corresponde a una partícula de 0.5um por 1.5um que son las dimensiones reportadas para una célula de Pseudomonas aeruginosa. Se 
obseva que algunos de estos puntos fueron identificados por el software al interior de la gota de petróleo (mancha negra en la imagen). 
25 
 
 
El modelamiento 3D es mas facilmente observable en el video del siguiente link: 
https://youtu.be/SRAIjnyQc1o 
El modelo nos permite observar que las bacterias están en contacto directo con la gota de petróleo, 
algunas de ellas incluso fueron reconocidas hacia los bordes pero dentro de la gota de petróleo, lo 
que nos permite pensar que el modelo de horizontes fluidos propuesto por Rühs et al., 2014 para 
biopelículas aceite-agua es adecuado para describir lo que sucede en las biopelículas de 
Pseudomonas aeruginosa sobre petróleo. 
Debido a las diferencias que observamos en las biopelículas que crecen sobre las gotas de petróleo 
y a las diferencias en remoción de hidrocarburos, se cuestionó si estas diferencias estaban asociadas 
a movilidades diferentes en las cepas (siendo movilidad un determinante morfológico y funcional 
de formación de biopelículas) o si estaban asociadas a diferencias en el perfil transcripcional. 
4. Determinación de características morfológicas y funcionales. 
 
4.1. Morfología de colonia. 
 
FIGURA 12: DEFINICIÓN DE VARIABLES DE MORFOLOGIA DE COLONIA Y MOVILIDAD. 
 
Figura 12: Definición de variables de morfología de colonia y movilidad. Para poder realizar la descripción de los cambios en morfología 
de colonia se definieron caracteres como la opacidad del medio y la cantidad de anillos de crecimiento observados. La figura permite ver 
como se definieron los estados del carácter para opacidad del medio, anillos de crecimiento y halo de movilidad 
 
 
 
https://youtu.be/SRAIjnyQc1o
26 
 
 
TABLA 5: CAMBIOS EN LA MORFOLOGIA DE COLONIA Y MOVILIDAD DE LAS CEPAS DESPUES DE 
ESTAR 7 DIAS EN PETRÓLEO. 
 Colonia Swarming Swimming Twitching 
 
Redonda, bordes 
definidos, 3 anillos de 
crecimiento definidos, 
anillo externo muy 
delgado. 
Redonda, bordes difusos, 3 
anillos de crecimiento 
definidos, halo de movilidad 
muy delgado 
Redonda, A=8,25cm2, 
no hay anillos de 
crecimiento definidos, 
opacidad del medio 
baja. 
Redonda, bordes poco 
definidos, 4 anillos de 
crecimiento definidos, 
halo de movimiento muy 
delgado 
PAO1 
Control 
Redonda, bordes 
definidos, 3 anillos de 
crecimiento definidos, 
anillo externo muy 
grueso. 
Redonda, bordes difusos, 3 
anillos de crecimiento 
definidos, halo de movilidad 
muy grueso 
Redonda, A=10,66cm2, 
no hay anillos de 
crecimiento definidos, 
opacidad del medio 
baja. 
Redonda, bordes poco 
definidos, 4 anillos de 
crecimiento definidos, 
halo de movimiento muy 
delgado 
M8A4 
 
No es redonda, bordes 
definidos, no hay 
evidencia de anillos de 
crecimiento. 
No es redonda, bordes 
definidos, 2 zonas de 
crecimiento definidas, no se 
diferencia halo de movilidad 
Redonda, A=6,13cm2, 
no hay anillos de 
crecimiento definidos, 
opacidad del medio alta. 
Redonda, bordes poco 
definidos, 4 anillos de 
crecimiento definidos, 
halo de movimiento muy 
delgado 
M8A1 
 
 
Redonda, bordes 
definidos, densidad 
central no uniforme, 
anillos de crecimiento 
definidos. 
Redonda, bordes difusos, 2 
anillos de crecimiento 
definidos, halo de movilidad 
muy delgado 
Redonda, A=0,48cm2, 2 
anillos de crecimiento 
definidos, opacidad del 
medio baja. 
Redonda, bordes 
definidos, sin anillos de 
crecimiento definidos, 
halo de movimiento muy 
grueso 
PAO1 
7 días 
petróleo 
Redonda, bordes 
definidos, densidad 
central no uniforme, 
anillos de crecimiento 
definidos. 
Redonda, bordes difusos, 3 
anillos de crecimiento 
definidos, halo de movilidad 
delgado 
Redonda, A=0,64cm2, 2 
anillos de crecimiento 
definidos, opacidad del 
medio baja. 
Redonda, bordes 
definidos, 4 anillos de 
crecimiento definidos, 
halo de movimiento muy 
grueso 
M8A4 
 
No es redonda, bordes 
poco definidos, un anillo 
de crecimiento definido. 
No es redonda, bordes no 
definidos, 1 zona de 
crecimiento definida, no se 
diferencia halo de movilidad 
Redonda, A=0,92cm2, 
no hay anillos de 
crecimiento definidos, 
opacidad del medio 
baja. 
Redonda, bordes 
definidos, 2 anillos de 
crecimiento definidos, 
halo de movimiento muy 
delgado 
M8A1 
 
La tabla 5 muestra la descripción de la morfología de colonia y las diferencias en movimientos de las 
bacterias antes y después de estar 7 días en medio con 1% de petróleo. (Figuras 5, 6 y 7 del anexo 
muestran fotografías). Llama la atención que la morfología de colonia de M8A1 para iniciar es poco 
definida. 
Dietrich y colaboradores, 2008; Rashid y Kornberg, 2000 mencionan la importancia de los tipos de 
movimientos celulares para la formación de las biopelículas. Durante la formación de las biopelículas 
se espera que el movimiento swimming (fliA) disminuya y los movimientos Twitching y swarming 
aumenten (pilB). Esto facilita el asentamiento de la biopelícula y el aumento de la densidad 
poblacional local para la activación de los mecanismos de quorum sensing. 
 
La figura 4 del anexo muestra a que corresponde cada una de las características evaluadas para la 
morfología de colonia y movilidad, resultados que se presentan en la tabla 5. 
 
 
27 
 
 
5. Expresión de Genes de degradación y virulencia en biopelículas. 
 
5.1. Extracciones de RNA. 
 
La metodología escogida para realizar las extracciones de RNA fue la de biopelículas sobre gotas de 
petróleo. 
 
Los resultados de dichas extracciones fueron medidos en Quibit y se presentan en la tabla 1 del 
anexo. En general, las extracciones producen alrededor de 0,0100ug/ul a 0,0300ug/ul de RNA. La 
calidad del RNA fue evaluada utilizando el Bioanalyzer y los RIN son altamente variables, entre RIN 
2 y Rin 7 con las muestras de M8A1 mostrando las menores calidades. 
5.2. Determinación de la expresión de genes. 
 
El análisis de la trascripción de genes mostró diferencias de expresión entre las biopelículas de 
hidrocarburos y las biopelículas de aceite de girasol. En general las biopelículas de hidrocarburos 
están expresando de forma diferencial a las biopelículas de aceites los genes de degradación de 
alcanos y los genes de respuesta a estrés orgánico. Como es de esperarse los genes de movilidad y 
asociados a la formación de biopelícula y producción de ramnolípidos se expresaron en los dos 
ensayos (FIGURA 13) 
 
FIGURA 13: EXPRESIÓN DE GENES DE VIRULENCIA Y DEGRADACIÓN PARA RNA 
PROVENIENTE DE BIOPELÍCULAS DE PETRÓLEO Y ACEITE DE GIRASOL. 
 
Figura 13: Expresión de genes de virulencia y degradación para rna proveniente de biopelículas de petróleo y aceite de girasol. Se observa 
que la expresión (cuadros a color) no es diferencial para las bacterias al interior de los dos medios de cultivo (petróleo y aceite de girasol), 
pero si se da una diferencia de expresión entre los dos medios de cultivo. 
Las diferencias en el comportamiento en los agares de movilidad hacen pensar que las diferencias 
en remoción de los hidrocarburos podrían estar asociadas a las diferencias en lacreación de las 
biopelículas. Diferentes estudios han probado que la adhesión de las células al sustrato y la creación 
eficiente de biopelículas afectan las tasas de degradación de derivados del petróleo y otros 
compuestos (Dohnt et al., 2011; Grimaud, 2010; Macedo et al., 2005; Taylor & Buckling, 2011) 
Evaluamos si la secuencia de los genes PilB, FliA (los únicos asociados a movilidad evaluados) AlkB1 
y AlkB2 era diferentes o similares en las cepas. Las secuencias de los genes fueron extraídas 
utilizando Blast2sequence sobre datos de secuenciación de las cepas y datos de NCBI. 
28 
 
Se encontró que las secuencias para los genes FliA, AlkB1 y AlkB2 son idénticas en el contenido de 
aminoácidos entre las cepas, sin embargo la secuencia de aminoácidos para el gen PilB presenta 
múltiples cambios en la cepa M8A1 con respecto a la secuencia de PAO1 y M8A4 (FIGURA 14). 
Se observó entonces que PilB en M8A1 posee una secuencia de aminoacidos poco conservada con 
respecto a PAO1 en los primeros 200 AA del marco de lectura del gen, sin embargo la región de 400 
a 600 aminoácidos que le sigue está mucho mejor conservada. 
FIGURA 14: CAMBIOS EN LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE PILB PARA M8A1 FRENTE A 
PAO1 Y M8A4 
Figura15: Alineamiento de aminoácidos de las secuencias de PilB para las cepas M8A1, M8A4 y PAO1. El alineamiento permite ver donde 
difieren las secuencias de las tres cepas 
Dado que el sitio activo de la proteína PilB (motivo GPTGSGKT, 326-333) se encuentra en las tres 
secuencias, se evaluó si el modelo predicho para la estructura de PilB difería en M8A1 y M8A4. 
(FIGURA 15). 
FIGURA 15: PREDICCIÓN ESTRUCTURAL DE PILB PARA M8A4 Y M8A1 BASADO EN 
SECUENCIA DE AMINOACIDOS 
 
 
29 
 
Figura 14: Modelos predichos utilizando homología de secuencia de AA para PilB de las cepas M8A1 y M8A4. Valores P de los modelos 
predichos son: p-value M8A1 = 6.65e-14 M8A4 y p-value M8A4 = 5.63e-14 por lo que se considera que la escogencia del templado y los 
modelo predichos son acertados. Las flechas rojas indican donde se observa diferencias de plegamiento entre los dos modelos. La estrella 
indica el sitio activo de reconocimiento de ATP de esta proteína. 
A futuro se podría evaluar la relación estadística entre la eficiencia de remoción de hidrocarburos y 
la eficiente formación de biopelículas alrededor de las gotas de petróleo. Se realizó un análisis de 
independencia utilizando Ji-cuadrado y la codificación de la tabla 6. 
TABLA 6: CODIFICACIÓN DE VARIABLES PARA Ji-cuadrado 
 
Tabla 6: Resumen de los resultados utilizando como punto de comparación los resultados de PAO1. Si el resultado es similar al obtenido 
por PAO1 se codifica como 1, si el resultado es diferente se codifica como 0. 
% Remoción = % remoción de hidrocarburos. 
Morfología = Morfología de biopelículas. 
Integridad = Integridad de la biopelícula durante el proceso de aislamiento. 
Perfil Transcripción = Resultados globales de presencia/ausencia de transcritos para los genes evaluados a partir de RNA de biopelículas 
sobre petróleo. 
Secuencia PilB = Secuencia de AA para el gen PilB 
 
Al evaluar la independencia del porcentaje de remoción frente a las demás variables encontramos 
que es independiente para todas (Ji-cuadrado=3; P=0,226) excepto para la variable perfil de 
transcripción pues al ser igual en todas las cepas se convierte en un carácter no informativo. Tabla 
7. 
TABLA 7: TABLA DE CONTINGENCIA PARA JI-CUADRADO 
Carácter B Integridad 
Carácter A: Remoción 
82 57 42 total 
igual PAO1 1 1 0 2 
diferente PAO1 0 0 1 1 
total 1 1 1 3 
 
 
Cepa % Remoción Morfología Integridad Swimming Swarmming Twitching
perfil 
transcripción
Secuencia 
PilB
PAO1 57 1 1 1 1 1 1 1
M8A1 42 0 0 0 0 0 1 0
M8A4 82 1 1 1 1 1 1 1
30 
 
 
DISCUSIÓN 
 
En el presente estudio se observa que existen diferencias en remoción de hidrocarburos para las 
cepas de P. aeruginosa PAO1, M8A1 y M8A4, que la morfología de las biopelícula es diferente para 
la cepa M8A1 y que esta cepa también posee diferencias en características morfológicas y 
funcionales de colonia y movilidad cuando se compara con M8A4 y PAO1. La expresión de los genes 
evaluados es la misma para todas las cepas, pero la secuencia del gen PilB difiere en M8A1 cuando 
se compara con la secuencia de M8A4 y PAO1. 
Es posible que si se hacen análisis cuantitativos de expresión de estos genes, los resultados de 
independencia cambien, pero para el alcance de este estudio la expresión no diferencial por parte 
de todas las cepas de los genes evaluados en el ambiente con petróleo es no informativo con 
respecto a la remoción de alcanos. 
Taylor and Buckling (2011), Rashid et al. (2000) y Eric Deziel et al. (2001) relacionan la formación de 
la biopelícula con disminución de los morfotipos swimming – asociados a bajas en la producción de 
flagelo (FliA) y aumento en los morfotipos twitching y swarming – asociados a aumentos en la 
producción de pili (PilB). Biopelículas fragmentadas, como la que se observa en M8A1, son para ellos 
indicadores de deficiencias en los mecanismos de transformación de los morfotipos de vida libre a 
biopelícula. Esta trasformación de morfotipos esta mediada por la activación y sobreexpresión de 
genes asociados a movilidad twitching y swarming (FliA, RhlA), así como por la regulación negativa 
de genes asociados a swimming (PilB). 
En el presente estudio podemos ver esta diferencia de regulación de los morfotipos en los 
comportamientos de las diferentes cepas en los agares de movilidad. 
Para las tres cepas, el movimiento de swimming pasó a tener menos área después de que las cerpas 
estuvieron creciendo en petróleo. El área del halo de movimiento disminuyó un 85% (M8A1) y 94% 
(M8A4) y un 95% para PAO1. 
Twitching aumentó para PAO1 en presencia de petróleo un 58%, mientras que para M8A4 aumentó 
un 76%. En los tres casos se observó que la colonia principal se hizo más pequeña después de estar 
en petróleo. En el caso de M8A1 además el halo de movimiento desapareció. 
Swarming para PAO1 no mostró aumento o disminución antes y después de estar en petróleo, 
mientras que para M8A4 disminuyó un 2% después de estar en petróleo. M8A1 por su parte inicio 
con una morfología poco definida para swarming y después de estar en petróleo esta morfología se 
hizo aún menos definida. Esta “malformación” de la colonia de swarming de M8A1 puede ser 
indicativo de una mutación en el gen PPK (que cataliza la transferencia reversible de los fosfatos 
terminales del ATP). Ya que en sus estudios Rashid et al. (2000) muestran que las cepas que tienen 
mutaciones en el gen PPK expresan formas de swarming diferentes a las de la cepa control (PAO1) 
y dificultades para formar biopelículas estables. 
 
Para las tres cepas, el movimiento de swimming, que en principio ocupa toda la caja de Petri pasó a 
tener menos área. El área del halo de movimiento disminuyó entre un 85% (M8A1) y 94% (M8A4). 
Este cambio en el área de movimiento durante el ensayo deja ver que la maquinaria para producir 
movimiento swimming, asociada a la producción de flagelo, disminuye su actividad después de que 
las bacterias han estado creciendo en petróleo. Sin embargo, vale la pena reafirmar que no es que 
31 
 
las bacterias cambien totalmente del morfotipo swimming a morfotipos de menos movimiento, sino 
que un porcentaje de la población bastante considerable lo hace. La presencia de bacterias 
flageladas en la biopelícula liquido/liquido es lo que permite que se dé la difusión Eddy, pues son 
los flagelos de las bacterias los que crean los vórtices de mezcla y permiten la difusión entre los dos 
fluidos (Rühs et al., 2014) y en nuestro estudio podemos ver que este horizonte fluido (FIGURA 10) 
se presenta en las biopelÍculas de PAO1. 
Twitching aumentó entre un 58% (PAO1) y un 76% (M8A4), esto permite ver de forma fisiológica 
como la maquinaria asociada a movilidad Twitching (PilB, RhlA) aumenta en la población de 
bacterias después de estaren petróleo. En otros estudios de movilidad asociada a biopelículas, se 
ve que un incremento en movilidad Twitching y una disminución en movilidad swimming es 
necesaria para la formación de la biopelícula (Dötsch et al., 2012; GA O'Toole & Kolter, 1998) 
El gen Ppk cataliza la transferencia reversible de los fosfatos terminales del ATP para formar largas 
cadenas de polifosfatos y está asociado principalmente a la producción de alginato. La producción 
de alginato es vital para la motilidad swarming sobre superficies solidas pues permite al grupo de 
bacterias permaneces en una unidad cohesiva. No existen estudios de este gen en biopelículas 
liquido/liquido. Rashid et al. (2000) encontraron que malformaciones de la colonia en agares de 
swarming suelen ser indicativo de una mutación en el gen Ppk, por lo que se realizó un análisis de 
la secuencia de este gen para todas las cepas y no encontramos diferencia alguna en la secuencia 
de nucleótidos, por lo que en este momento no podemos explicar por qué la morfología swarming 
de M8A1 es diferente a la de las otras cepas. 
 
El análisis de la presencia/ausencia de trascritos mostró diferencias de expresión entre las 
biopelículas de hidrocarburos y las biopelículas de aceite de girasol. En general las biopelículas de 
hidrocarburos están expresando de forma diferencial a las biopelículas de aceites los genes de 
degradación de alcanos y los genes de respuesta a estrés orgánico. Los genes de movilidad y 
asociados a la formación de biopelícula y producción de ramnolípidos se expresaron en los dos 
ensayos. 
 
Estos resultados son diferentes a los resultados obtenidos por Rojas, 2008 donde en petróleo no se 
observó expresión de los genes mexC y OprJ. Sin embargo, al comparar los estudios hay que tener 
en cuenta un par de cosas: 1. En el estudio de Rojas 2008 evaluó un consorcio de cepas de 
Pseudomonas aeruginosa de los cuales M8A1 y M8A4 son 2 de las 4 cepas que se tenían en el 
consorcio. 2. El petróleo utilizado por Rojas 2008 no es un petróleo estéril, y de hecho reportan en 
el estudio el crecimiento de un hongo asociado. 3. La extracción de RNA se realizó de células 
planctónicas, mientras que en este estudio realizamos extracción de RNA de células en biopelículas 
directamente asociadas a las gotas de petróleo. 
 
Se puede crear paralelos entre el presente estudio y el estudio de Rojas, 2008 al observar que la 
producción de autoinductores y la activación del sistema QS están activos en los dos. Rojas, 2008 
confiere la presencia de transcritos de los genes ExoS y ExoT a la presencia del hongo en el medio, 
principalmente debido a que el sistema de secreción tipo 3, del cual ExoS es el efector, esta descrito 
para cepas clínicas, en experimentos de virulencia. Rojas también concluye que la presencia de los 
trascritos MexX y MexY es producto de la presencia del hongo en el medio. Nuevamente, la 
información que se tiene de las bombas de excreción MexXY-oprM está asociada solo a la 
importancia que estas bombas tienen en la resistencia a antibióticos. 
 
32 
 
En los estudios de los mecanismos de expresión de las bombas de excreción MexXY-Opr se ha 
encontrado que la expresión de las mismas es altamente específica para ciertos antibióticos (Evans 
et al., 1998; Hocquet et al., 2003; Li, Nikaido, & Poole, 1995; Masuda et al., 2000). Sin embargo, 
también se ha visto que estas bombas de excreción se encuentran sobre reguladas para proteger a 
las bacterias de estrés orgánico (Muller, Stevens, Craig, & Love, 2007). 
 
En nuestro ensayo la expresión de estas bombas puede hacer parte de la respuesta a estrés 
orgánico. OprM y OprJ son los canales de estas bombas (Masuda et al., 2000), y se ha encontrado 
que OprM y OprJ no son los precursores de la especificidad de sustrato de las bombas. De hecho, la 
especificad de sustrato de estas bombas cada vez está más en entredicho ya que a medida que se 
realizan estudios más amplios se encuentra que estas bombas facilitan el paso por membrana de 
una gran cantidad de compuestos (biosidas, tintes, detergentes, inhibidores metabólicos, solventes 
orgánicos, y moléculas asociadas a comunicación bacteriana) (Tegos & Hamblin, 2006) con 
estructuras similares a los antibióticos estudiados en un principio. Esto indica que las bombas 
realizan un reconocimiento estructural de su sustrato y cualquier cosa que estructuralmente sea 
parecido habrá de pasar por la bomba. Este reconocimiento estructural fue recientemente probado 
por Dreier and Ruggerone (2015). Teniendo todo esto en cuenta, es muy posible que la activación 
de estas bombas en nuestro ensayo se deba a que el petróleo posee compuestos que 
estructuralmente son similares a los sustratos comúnmente estudiados para estas bombas (FIGURA 
15). 
 
La expresión de genes de virulencia como LasA y LasB está asociada a la degradación de elastina y 
la proteína surfactante-D (SP-D) en los pulmones (Bleves et al., 2010). Su función en degradación de 
petróleo no se ha estudiado, pero teniendo en cuenta que en las infecciones pulmonares rompe los 
enlaces que forman la SP-D es posible que en degradación de petróleo su función sea la de regular 
la cantidad de ramnolipidos o biosurfactantes en el medio alrededor de las bacterias. 
FIGURA 16: SIMILITUD ESTRUCTURAL DE LAS QUINOLONAS CON HIDROCARBUROS DE 
PETRÓLEO. 
 
 
Figura 15: Similitud estructural de las quinolonas con hidrocarburos de petróleo. Estructuralmente, las quinolonas, no son más que anillos 
aromáticos. Esta misma estructura es posible encontrarla en hidrocarburos de petróleo como los tioles y los asfaltenos. 
 
ToxA inhibe la formación de proteínas en células eucariotas, es dependiente del sistema QS y no se 
ha estudiado su función en ambientes de degradación de petróleo. Dado que en nuestro ensayo se 
33 
 
expresa en presencia de petróleo sería muy interesante estudiar que otra función puede llegar a 
tener esta toxina además de la que ya se conoce en ambientes de infección. 
La evaluación de las secuencias de los genes de movilidad y degradación de alcanos evaluados 
mostro que solo hay diferencias en las secuencias de aminoácidos del gen PilB para la cepa M8A1. 
Estas diferencias no afectan la secuencia del sitio de unión de la proteína producida por el gen, sin 
embargo el modelo estructural producido para M8A1 es diferente de aquel producido para M8A4, 
por lo que podemos sugerir que las diferencias observadas en movilidad entre las dos cepas podrían 
estar asociadas a un plegamiento diferente de PilB para M8A1. 
Considerando datos de bibliografía, la formación de biopelícula en Pseudomonas aeruginosa parece 
estar regulada a nivel de traducción más que a nivel de transcripción. Esto se ve principalmente al 
comparar los resultados obtenidos por microarreglos con resultados obtenidos por proteomica. Los 
análisis de trascriptoma llevan a concluir que alrededor del 1% de los genes de P. aeruginosa están 
diferenciados entre biopelículas y células planctónicas (diferencias de 2-fold) (Whiteley et al., 2001) 
y que el trascriptoma de biopelícula es poco diferenciado del trascriptoma de las células en fase 
estacionaria, mientras que los resultados de proteomica muestran que alrededor del 50% del 
proteoma reportado se diferencia entre planctónicas y biopelículas (diferencias de hasta 6-fold) (R. 
D. Waite, Papakonstantinopoulou, Littler, & Curtis, 2005) y que además P. aeruginosa muestra al 
menos tres fenotipos durante el ciclo de vida de una biopelícula: (a) planctónica, (b) biopelícula 
madura, y (c) dispersión. Estos fenotipos muestran patrones de traducción tan diferentes entre 
ellos, que son comparables a las diferencias que muestran especies diferentes del género 
Pseudomonas en estadios similares de crecimiento. (Drenkard & Ausubel, 2002; Sauer et al., 2002; 
Stoodley et al., 2002) 
Adicional y más recientemente, algunos investigadores se han concentrado en la identificación de 
determinantes relacionados con la formación y maduración de las biopelículas.