Practica_6_de_bioquimica

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Universidad Juárez Autónoma de Tabasco.
División Académica de Ciencias Básicas.
Licenciatura en Químico Farmacéutico Biólogo.
Laboratorio de Bioquímica.
Grupo C.
Práctica:
Práctica #6. Cuantificación de Proteínas por el método de Lowry.
Nombre del Profesor:
Dra. Cecilia Sánchez Trinidad.
Nombre del Alumno:
Ángel Jaret Zúñiga Quen.
152A20033
Fecha:
 27 de Octubre de 2017.
 
Práctica #6.
Cuantificación de Proteínas por el método de Lowry.
Objetivo.
Cuantificar proteínas en el huevo por el método de Lowry, aplicando técnicas espectrofotométricas.
Introducción.
El método de Lowry es una técnica colorimétrica que permite calcular la concentración de proteínas totales presentes en una disolución o extracto biológico. El método se basa en el empleo de dos reactivos. 
El componente fundamental del Reactivo A es el CuSO4, que aporta iones Cu2+. En medio alcalino, estos iones reaccionan con aquellas moléculas que tengan varios enlaces peptídicos consecutivos, es decir, péptidos y proteínas, dando lugar a complejos solubles que presentan un color azul pálido. 
El Reactivo B, también conocido como reactivo de Folin-Ciocalteau o reactivo de fenoles, reacciona con aquellos aminoácidos de la proteína que lleven en su cadena lateral grupos fenólicos (la tirosina, la fenilalanina y el triptófano), dando lugar a un color azul intenso.
La intensidad del color producido en el tubo de ensayo, que se mide con un espectrofotómetro, es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la disolución, lo que permite cuantificar ésta si se compara con tubos preparados de forma similar con cantidades conocidas de una proteína de referencia, con los que se hace una recta de calibrado.
Es recomendable elaborar una curva de calibración con proteínas del mismo tipo a cuantificar, ya que en este método están involucrados los aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano.
Diagrama de flujo.
1) Preparación de reactivos.
2) Solución A.
3) Mezclar A y B (50:1). Solución C.
4) Reactivo de F-C 1:1 con agua. Solución D.
5) Enumerar 12 tubos e ir administrando las cantidades que se piden en la tabla.
Para determinar proteínas en la leche.
	Tubo (mL)
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	9
	10
	11
	12
	Albumina sb 100ug/mL.
	0
	0.1
	0.2
	0.4
	0.8
	1.0
	
	
	
	
	
	
	Caseína obtenida.
	
	
	
	
	
	
	0.25
	0.50
	
	
	
	
	Caseína pura.
	
	
	
	
	
	
	
	
	0.25
	0.50
	
	
	Leche diluida.
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	0.25
	0.50
	H2O.
	1.0
	0.9
	0.8
	0.6
	0.2
	2.0
	0.75
	0.50
	0.75
	0.50
	0.75
	0.50
	C.
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
7-12 (Muestras problema).
6) Sobrenadante dilución 1:100; Leche pura dilución 1:1000
7) Después de agregar la solución C dejar reposar 10 minutos
8) Leer al espectrofotómetro a 750nm.
Resultados.
Los valores de absorbancia obtenidos con el espectrofotómetro a 750 nm para cada una de las 12 soluciones se muestran a continuación:
Tabla 1: Valores de absorbancia de cada una de las muestras.
	Tubo No.
	Solución *
	
Absorbancia
a 750 nm
	Blanco
	Agua.
	0.17
	1
	1 ml Agua.
	0.27
	2
	0.1 ml Albumina sb 100ug/mL y 0.9 ml Agua.
	0.030
	3
	0.2 ml Albumina sb 100ug/mL y 0.8 ml Agua.
	0.027
	4
	0.4 ml Albumina sb 100ug/mL y 0.6 ml Agua.
	0.029
	5
	0.8 ml Albumina sb 100ug/mL y 0.2 ml Agua.
	0.028
	6
	1 ml Albumina sb 100ug/mL y 2 ml Agua.
	0.026
	7
	0.25 ml caseína obtenida y 0.75 ml Agua.
	0.059
	8
	0.5 ml caseína obtenida y 0.5 ml Agua.
	0.087
	9
	0.25 ml caseína pura y 0.75 ml Agua.
	0.028
	10
	0.5 ml caseína pura y 0.5 ml Agua.
	0.024
	11
	0.25 ml leche diluida y 0.75 ml Agua.
	0.029
	12
	0.5 ml leche diluida y 0.5 ml Agua.
	0.031
	TE
	Leche pura 1:1000.
	0.204
*A todas las soluciones se agregaron 5 ml del reactivo C.
Del tubo 2-6 (Albumina). 
 (
ABSORBANCIAS A 75
0nm
) (
Albumina 
sb
 (
ug
/
mL
).
)
Del tubo 7-12 (Caseína).
Tabla 2: determinación de la cantidad de proteína utilizando la ecuación de recta.
	Tubo No.
	Absorbancia (y) a 750 nm
	Proteína (ug/mL)
	7
	0.059
	11(-)
	8
	0.087
	21.37(-)
	9
	0.028
	0.48
	10
	0.024
	1.96
	11
	0.029
	0.11
	12
	0.031
	0.62 (-)
 (
Proteína (mg).
)
 (
Caseína.
) (
ABSORBANCIAS A 540nm.
)
Actividades finales y/o análisis.
1. ¿El método utilizado es adecuado?
R= Si, aunque es un procedimiento bastante largo.
2. Señale la relevancia o importancia del método.
R= Su alta sensibilidad a los detergentes y ciertos aminoácidos hacen a este método el menos indicado para cuantificar proteínas, siendo el de preferencia el método de Biuret.
3. ¿Qué proteínas son adecuadas para emplear este método? Describa el por qué.
R= a) inmunoglobulinas. Mal funcionamiento inmunológico
b) hemoglobina. Una concentración baja produce anemia.
c) insulina. Una concentración baja produce diabetes.
d) fibrilinas. La falta de esta produce deformación en los huesos.
e) seroalbúmina. Su falta produce deformaciones.
4. ¿Los resultados son los esperados para las muestras problemas?
R= Si, aunque con algunas variaciones inusuales en las absorbancias.
Conclusiones.
El método de Lowry es poco preciso de acuerdo a las determinaciones realizadas. Existen interferencias en la cuantificación de proteínas por el método de Lowry, las principales se basan en la similitud estructuralmente la sustancia que interfiere y los aminoácidos que son detectados por este método; compuestos con grupos aromáticos, otras interferencias pueden serlos agentes que desnaturalizan o que precipitan proteínas.
Pese a que muchas proteínas tienen aminoácidos con grupos aromáticos, la abundancia de estos en la proteína puede crear resultados poco confiables para este ensayo.
Bibliografía:
1. Nel Berg, J.M.; John, L.T.; Lubert, S. (2008) Bioquímica. 2ª ed. Reverté, Barcelona.
2. Segal, C. (2005) Manual de prácticas de biología molecular de la célula. Editorial publidisia. 
3. Cambell, P.N.; Smith, A.d.; Peters, T.J. (2006) Bioquímica ilustrada: bioquímica y biología molecular en la era posgenómica. Masson, España.
4. Harris, D.C. (2003). Quantitative chemical analysis. San Francisco: W.H. Freeman.
Preparar las 3 soluciones que componen el reactivo de A.
0.4g de NaOH.
2g de Na2CO3.
0.04g de tartrato de sodio y potasio.
Disolver los tres en un vaso p.p con 100mL de agua.
Preparación de reactivos.
100ug/mL de albumina sb.
Solución B: 0.05g de CuSO4 en 10mL de H2O.
NaOH al 10% en agua.
Albumina.
Y(Absorbancia a 750nm)	0.1	0.2	0.4	0.8	1	0.03	2.7E-2	2.9000000000000001E-2	2.8000000000000001E-2	2.5999999999999999E-2	Caseina.
Y(Absorbancia a 750nm)	-11	-21.37	0.48	1.96	0.11	-0.62	5.8999999999999997E-2	8.6999999999999994E-2	2.8000000000000001E-2	2.4E-2	2.9000000000000001E-2	3.1E-2