Obtencion_y_caracterizacion_de_andamios

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UNIVERSIDAD MODELO
ESCUELA DE INGENIERÍA
“OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE
ANDAMIOS PARA INGENIERÍA TISULAR
ÓSEA A PARTIR DE ESPONJA MARINA
HALICHONDRIA SPP”
TESIS
PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
INGENIERO BIOMÉDICO
PRESENTADA POR:
JOSÉ ADRIÁN CORAL GÓNGORA
Mérida, Yucatán
05 de Diciembre 2018
© Derechos de autor
Por este medio declaro que este trabajo de titulación:
“Obtención y caracterización de andamios para Ingeniería tisular ósea a
partir de esponja marina Halichondria spp”
es de mi propia autoría, a excepción de las citas y referencias que he empleado para
fundamentar mis argumentos, a las cuales he dado crédito a sus autores relacionados
en la sección Bibliografía. Asimismo, afirmo que este trabajo no ha sido presentado
previamente con este nombre para la obtención de otro título profesional o grado
académico equivalente.
Firma
Nombre
Mérida, Yucatán, 05 de diciembre de 2018
Agradecimientos
Profundamente agradezco a mi alma máter, la Universidad Modelo, por mi formación
como Ingeniero y por su aportación en la compra del reactivo Tritón. Agradezco a
todos los profesores que alguna vez me dieron clases y de los que me llevo las mejores
experiencias. En especial al M.C. Edson Estrada López, por ser un profesor diferente,
que me motivó a ser mejor cada día y de esos que terminas extrañando.
Agradezo al M.C. Carlos Eliseo Sauri Quintal, director de la Escuela; y al Ing. David
Alberto Palomo Torres, coordinador del departamento de ingeniería biomédica, por
brindarme su apoyo en las aulas y pasillos de la Universidad y estar al pendiente de
mi crecimiento académico.
Quiero agradecer de manera especial a mis asesores, el M.C. Irving Fernández Cer-
vantes, por todo su apoyo para los fines de este proyecto, por los conocimientos trans-
mitidos, por los consejos académicos, laborales y de vida; así como a la Dra. Lorena
Violeta León Deniz, por su gran ayuda para la realización de todo el proyecto, por su
apoyo en la recolección y toma de muestra asi como en el asesoramiento y revisión del
trabajo.
Además agradezco a la Dra. Trinidad Cu Cañetas, por su valiosa aportación durante
los procesos experimentales realizados en el laboratorio de microbiologia; al Dr. Vic-
tor Castaño Meneses y a la Dra. Nayeli Rodríguez Fuentes, por su colaboración para
realizar las caracterizaciones fisicoquímicas.
No podía faltar un sincero agradecimiento a mis amigos (as), Mario Enrique, Alejan-
dra Hananí, Wilberth Gabriel, Gonzalo Daniel, Noemí Iraís, Cielo Guadalupe, Ricardo
Enrique, Mario Alberto, Ariana Marilyn, Ale y Diego, Jorge, Daniel, Carballo, David,
Tommy y a todos mis amigos y compañeros de la Universidad.
i
A mi Mamá, una gran mujer que me enseñó
que sólo con perseverancia, dedicación y entrega
se alcanzan las metas.
A mi Papá, un gran ejemplo de lo que significa
trabajar duro, con humildad, sacrificio y honestidad.
A mi familia y amigos.
Gracias por sus palabras de apoyo
y por darme fortaleza en cada momento decisivo de mi vida.
A la Universidad Modelo y compañeros,
por su apoyo incondicional durante esta carrera tan apasionante.
A mi hermano Claudio, mi tía Guadalupe, mi tío Martín,
mi abuela Mercedes, mi abuelo Felipe,
mis abuelos Juventino† y Selmira†, Tíos, Tías, Primos.
A mi bella Isla Cozumel, mi blanca Mérida, mi querido México,
para sí, para todos..
ii
Glosario
ATD Andamios tridimensionales
ATP Adenosín Trifosfato
ATR Reflectancia Total Atenuada
BM Biomateriales
BMU Unidad Multicelular Básica
BS Biosilica
CLG Colágena
DTGA Curvas de la primera derivada respecto a la temperatura, ∆m
∆T
FT-IR Espectroscopía infrarroja por Transformada de Fourier
HA Hidroxiapatita
IT Ingeniería tisular
MEC Matriz extracelular
MO Microscopía óptica
OPG Osteoprotegerina
PLA Ácido Poliláctico
RANKL Ligando del Receptor Activador de Factor Nuclear κβ
TO Tejido óseo
TGA Análisis termogavimétrico
Ca Calcio
H+ Ión positivo de Hidrógeno
NaCl Cloruro de sodio
SiO2 Dióxido de silicio
iii
Resumen
La pérdida, desgaste y fallas de tejido óseo constituyen uno de los problemas más
comunes, frecuentes y de alto costo para cualquier nación. En particular, poco se ha
estudiado sobre la estructura y composición de biomateriales obtenidos a partir de
organismos de origen marino del phylum Porifera, más aún, el aprovechamiento de
la especie Halichondria spp para esta aplicación es nula. En este trabajo se propo-
ne generar andamios a partir de compósitos naturales que forman parte de la matriz
extracelular (MEC) del modelo animal Halichondria spp, con potencial aplicación en
ingeniería tisular ósea, utilizando procesos de descelularización. El andamio fue carac-
terizado utilizando técnicas espectroscópicas, térmicas y de microscopía. Se identificó
por MO la microestructura de la esponja que resultó similar al tejido óseo trabecular.
Se encontraron bandas relacionadas al Colágeno tipo I en lás técnicas FT-IR y RA-
MAN así como una pérdida de masa asociada a la combustión del Colágeno mediante
TGA.
iv
Índice general
Glosario iii
Resumen iv
Índice de figuras vii
Índice de tablas viii
1. Introducción 1
1.1. Antecedentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2. Planteamiento del problema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.3. Justificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.4. Hipótesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.5. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.5.1. Objetivo General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.5.2. Objetivos Específicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2. Marco Teórico 8
2.1. Tejido óseo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.2. Remodelación del tejido óseo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.3. Andamios para ingeniería tisular ósea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.4. Colágena . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.5. Biosilica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.6. Biomateriales de origen marino . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.7. Procesos de descelularización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.8. Métodos de caracterización de biomateriales . . . . . . . . . . . . . . . 17
v
2.8.1. Microscopía óptica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.8.2. Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier . . . . . . 17
2.8.3. Espectroscopía RAMAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.8.4. Análisis termogavimétrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
3. Metodología 20
3.1. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.2. Impresión 3D del modelo de PLA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.3. Preparación y Lavado de Andamios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.4. Descelularización de Andamios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.5. Deshidratación de Andamios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.6. Obtención de espículas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.7. Aplicación de técnicas de caracterización . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4. Resultados 26
4.1. Microscopía óptica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.2. FT-IR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4.3. Espectroscopia RAMAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.4. Análisis termogavimétrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
5. Conclusiones 36
Bibliografía 38
vi
Índice de figuras
3.1. Mapa del Estado de Yucatán, ubicando al Municipio de Telchac Puerto
con el código 083. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.2. Diagrama de flujo del procesamiento de andamios óseos. . . . . . . . . 21
3.3.(a) Cortes de esponja empleando moldes de PLA, (b) Conservación de
andamios en alcohol, (c) Lavado de andamios con NaCl. . . . . . . . . 22
3.4. (a) Proceso de descelularización de andamios, (b) Andamios en peróxido
de hidrógeno, (c) Andamios descelularizados. . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.5. Proceso de deshidratación de andamios. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.6. Proceso de obtención de espículas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
4.1. Imágenes de microscopía óptica de andamios de Halichondria spp. . . . 26
4.2. Espectro FT-IR de andamios de Halichondria spp. . . . . . . . . . . . . 28
4.3. Espectro FT-IR de espículas de Halichondria spp en el rango de 1800-400
cm−1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.4. Espectros RAMAN Andamios. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.5. Espectros RAMAN Espículas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.6. Análisis TGA de andamios de Halichondria spp. . . . . . . . . . . . . . 34
4.7. Análisis TGA de espiculas de Halichondria spp. . . . . . . . . . . . . . 35
vii
Índice de tablas
4.1. Bandas FT-IR Andamios de Halichondria spp. . . . . . . . . . . . . . . 27
4.2. Bandas FT-IR Espículas de Halichondria spp. . . . . . . . . . . . . . . 29
4.3. Bandas espectroscopía RAMAN de Andamios de Halichondria spp. . . 30
4.4. Bandas espectroscopía RAMAN de Espículas de Halichondria spp. . . . 32
4.5. Análisis TGA Andamios de Halichondria spp. . . . . . . . . . . . . . . 35
viii
Capítulo 1
Introducción
La Ingeniería tisular (IT) –un área específica de la ingeniería biomédica– es un campo
multidisciplinario e interdisciplinario emergente que implica el desarrollo de implantes
bioartificiales, con el propósito de reparar o mejorar la función de los tejidos u órganos
(Hutmacher, 2000), basándose en la ciencia y la tecnología de células y Biomateriales
(BM), buscando proporcionar un microambiente adecuado para el crecimiento celular
y la producción de factores de crecimiento.
En general, el Tejido óseo (TO) tiene la capacidad de regenerarse (Venkatesan et al.,
2015), sin embargo, en condiciones críticas específicas –como en defectos óseos extensos
y fracturas con vascularización inadecuada o interrumpida–, la respuesta del cuerpo es
insuficiente, dando como resultado la síntesis de tejido cicatricial de Colágena (CLG)
con propiedades estructurales y funcionales limitadas al original, siendo en estos casos
donde existe la necesidad de utilizar BM. Estos pueden usarse para fabricar Andamios
tridimensionales (ATD) con tamaños de poro apropiados que permiten el crecimien-
to, unión, migración, proliferación, o incluso promueven la diferenciación de células
para fomentar la regeneración y/o formación de tejidos. Las construcciones de ATD
mantienen la función de Matriz extracelular (MEC), siendo clave propiedades como la
microarquitectura, interconexión de poro, distribución de tamaños de cavidad, entre
otras, definen la función del tejido en formación (Loi et al., 2016).
Otra característica de un andamio adecuado es una biodegradabilidad apropiada,
que permite reemplazar dicho sustituto por el nuevo tejido. En tanto que, éstos de-
ben promover interacción celular, desarrollar los tejidos y mostrar propiedades físicas
y mecánicas compatibles con los requerimientos del tejido que será regenerado. Ade-
más, los productos de degradación del andamio deben tener baja inmunogenicidad y
citotoxicidad (Yang et al., 2005). Por lo tanto, los andamios deben ser biocompatibles
y no deben inducir ninguna respuesta adversa.
1
Los andamios sintéticos pueden ser alterados para ajustar la porosidad, la microes-
tructura, la tasa de degradación y la mecánica. Sin embargo, existen algunas limita-
ciones para su uso, especialmente los altos costos de fabricación. Para superar estos
problemas, los materiales naturales han demostrado ser una alternativa prometedora.
Una característica especial es que, debido a su componente orgánico, los materiales
naturales son a menudo más biocompatibles, ya que ofrecen una mejor superficie in-
teractiva para la unión celular y el crecimiento (Lin et al., 2011).
En este contexto, la vida marina y su rica biodiversidad proporcionan un abundante
recurso de nuevos productos para la sociedad. Sorprendentemente, el potencial de los
organismos de origen marino para las aplicaciones biotecnológicas sigue siendo una gran
área de estudio sin explotar al máximo. Mas aún, este tipo de materiales tienen propie-
dades estructurales y químicas interesantes que podrían explotarse para el desarrollo
de nuevos productos orientados a la ingeniería tisular (Silva et al., 2014). Entre estos
organismos, las esponjas marinas presentan un enorme potencial terapéutico en una
amplia gama de aplicaciones debido a su acción antitumoral, antiviral, antiinflamato-
ria y antibiótica (Sipkema et al., 2005). Algunos estudios mostraron que los productos
químicos naturales de las esponjas pueden actuar como inhibidores de los factores de
transcripción y pueden ser eficaces contra los neoplasmas malignos y las enfermedades
virales (Blunt et al., 2016). Una de las propiedades que hacen interesantes a las esponjas
como sustitutos óseos son sus características estructurales. La mayoría de las especies
tienen una eficiente arquitectura porosa interconectada, que les permite procesar una
cantidad significativa de agua y facilita el flujo de fluidos, imitando un andamio óseo
ideal (Leonetti et al., 2000). Las propiedades osteogénicas de las esponjas marinas tam-
bién se destacan por su contenido mineral, como la Biosilica (BS) y otros compuestos,
que son capaces de soportar el crecimiento celular y estimular la formación ósea y la
mineralización.
En este trabajo se propone generar un andamio monocapa poroso, extraído del mo-
delo animal Halichodria Spp, constituido por una matriz cerámica de óxido de silicio
que emule las propiedades y distribución estructural del TO, para su posible aplicación
en ingeniería tisular.
2
1.1. Antecedentes
Históricamente, la necesidad de investigación sobre BM implantables inició cuando
los médicos intentaron colocar materiales sintéticos incrustados en el cuerpo después de
la cirugía. Numerosos hallazgos arqueológicos muestran intentos de reemplazar dien-
tes perdidos utilizando materiales como corales, marfil, metales, huesos humanos y de
animales e incluso madera, los cuales datan de las primeras etapas de la humanidad.
Más tarde, se diseñaron y desarrollaron BM con propiedades deseables, como biocom-
patibilidad, biodegradabilidad y osteoconductividad, para fungir como injertos óseos.
Los injertos óseos utilizados clínicamente también se pueden clasificar en función de su
origen en materiales biológicos o sintéticos (Nukavarapu y Amini, 2011).
En la década de 1960, la primera generación de BM se desarrolló con el objetivo de
lograr una combinación adecuada de propiedades físicas para que coincida con las del
tejido reemplazado con una respuesta tóxica mínima para el huésped (Ratner et al.,
2013). Generalmente se les denominó como "bioinerte", es decir, biológicamente inertes.
En general, los BM de primera generación pueden clasificarse en los siguientes tipos:
metales (por ejemplo: titanio o aleaciones de titanio, acero inoxidable, aleaciones de
cobalto y cromo), polímeros sintéticos (por ejemplo: metacrilato de metilo de poliéster,
tipo teflón) y cerámicas (por ejemplo: alúmina, zirconia, carbono) (Hench, 2015).
La primera prótesis sustitutiva exitosa fue desarrollada por Charnley a fines de la
década de 1950, la cual se encuentra constituida en su totalidad de acero inoxidable.
El acero inoxidable es resistente a la corrosión debido al alto contenido de cromo. Sin
embargo, la poca resistencia al desgaste del acero inoxidable condujo a la introducción
de aleaciones de cobalto–cromo. Estos materiales exhibieron una excelente resistencia
a la corrosión y al desgaste. El titanio y susaleaciones, originalmente utilizados en
aeronáutica, generaron gran interés en la ortopedia debido a su excelente resistencia a
la corrosión, su módulo elástico moderado y su baja densidad. Branemark introdujo
el concepto de osteointegración para implantes en la década de 1940, que es la unión
directa entre un implante y el TO del huésped sin formación de tejido blando. Esta
se convirtió gradualmente en uno de los requisitos más importantes para los implantes
óseos.
Los BM de segunda generación incluyen polímeros biodegradables sintéticos y de-
rivados naturalmente (CLG, poliésteres), fosfatos de calcio (sintéticos o derivados de
materiales naturales como corales, algas, esponjas, huesos bovinos), carbonato de cal-
cio (natural o sintético), sulfatos de calcio y vidrios bioactivos (basados en sílice o
no silícicos) (Laurencin et al., 2006). Muchos BM derivados de la naturaleza poseen
excelente biocompatibilidad y biodegradabilidad ya que son componentes esenciales
de los tejidos (Venkatesan et al., 2011). El Bioglass, inventado por Larry Hench, fue
3
el primer material osteointegrativo artificial diseñado para formar un enlace químico
directo con el hueso. El concepto comenzó a extenderse a mediados de la década de
1980 cuando se implementó el uso de "materiales bioactivos.en una serie de aplicaciones
dentales y ortopédicas con el objetivo de producir componentes bioactivos que pudie-
ran provocar una respuesta biológica favorable en el entorno fisiológico. Además, la
demanda de materiales con propiedades físicas, químicas, biológicas, biomecánicas y
de degradación específicas condujo al uso de materiales "biodegradables". El concepto
de materiales biorreabsorbibles / bioabsorbibles / biodegradables fue introducido por
Kulkarni y colaboradores en los años 60’s. Los materiales biorreabsorbibles exhibieron
relevancia clínica a través de la descomposición química controlada, por lo tanto, fueron
ampliamente utilizados como BM más adelante.
Los BM de tercera generación están diseñados para incorporar señales instructivas
en los materiales para inducir una respuesta celular favorable, como la mejora de la
supervivencia celular, la diferenciación celular dirigida y el compromiso de linaje espe-
cífico (Yu et al., 2015). Algunos de estos enfoques implican el uso de factores solubles
(factores de crecimiento, citocinas, hormonas y productos químicos), factores insolubles
(moléculas de MEC, BM con propiedades mecánicas y estructurales específicas) o el
uso de estímulos externos.
El desarrollo de materiales para activar genes específicos y la adaptación molecu-
lar de BM para obtener respuestas celulares deseadas son algunas de las estrategias
utilizadas para el desarrollo de materiales de tercera generación. Los materiales con ca-
racterísticas físicas apropiadas, como alta porosidad e interconectividad, se diseñaron
para facilitar las interacciones entre materiales y células, la infiltración de nutrientes,
oxígeno y la vascularización. Por ejemplo, Nukavarapu y colaboradores, desarrollaron
andamios ópticamente porosos y mecánicamente compatibles para la ingeniería de re-
generación ósea. En un estudio posterior, se demostró que estas matrices controlan la
tensión de oxígeno dentro de la estructura de poro para que la matriz pueda soportar la
supervivencia celular osteogénica y vasculogénica incluso en el interior de la estructura
de poros de la MEC, lo que produce una gran área de regeneración ósea (Nukavarapu
y Amini, 2011).
Los productos terapéuticos innovadores basados en biosilica y fibras de esponja pue-
den surgir como una opción efectiva para los productos sustitutos ya presentes en el
mercado. Se sabe que la mayoría de los elementos bioactivos naturales y los recur-
sos disponibles para tratar padecimientos musculoesqueléticos y cartilaginosos tienen
principalmente orígenes bovinos y porcinos, que han sido motivo de preocupación en
los últimos años. Los materiales sintéticos que se han utilizado con el mismo fin te-
rapéutico, presentan de manera similar algunas limitaciones para la práctica clínica,
especialmente sus altos costos de fabricación y producción. Además, entre los diversos
4
productos alternativos presentes en el mercado, pocos pueden igualar el rendimien-
to clínico y muchos carecen de propiedades apropiadas de citoxicidad y el potencial
osteoinductivo. En este sentido, el uso de compuestos bioactivos de origen marino se
considera altamente atractivo para la industria, ya que son fuentes alternativas impor-
tantes para el desarrollo de productos médicos con interés comercial.
Tanto la biosílica como el colágeno son compuestos con propiedades interesantes para
establecer tratamientos y nuevos productos médicos, lo que abre nuevas posibilidades
para las industrias biomédica y farmacéutica. Evidencias científicas sólidas demostraron
los efectos estimulantes de las esponjas marinas sobre la osteogénesis, su alta afinidad
por el mineral óseo y su importante papel en la estimulación de la actividad de los
osteoblastos. Además, las fibras de esponjas que tienen una composición y estructura
similares al colágeno vertebrado, son una excelente alternativa como fuente de proteínas
de colágeno, con un bajo riesgo de transmisión de agentes causantes de infección y buena
biocompatibilidad (Hench, 2015).
De esta forma, las esponjas marinas y sus compuestos bioactivos son una "mina
de oroçon respecto a la diversidad de sus metabolitos secundarios y la posibilidad
de generar nuevos productos en beneficio de la sociedad a través de la biotecnología
marina, contribuyendo tanto a la calidad de vida del paciente como a la competitividad
de varios sectores económicos (Lin et al., 2011).
La literatura muestra que los compuestos de esponjas marinas tienen propiedades
osteogénicas, que apoyan el crecimiento celular in vitro, estimulan la formación de
hueso y la mineralización in vivo. En este contexto, las esponjas marinas son un recurso
alternativo y prometedor para la ingeniería de tejidos óseos y para el desarrollo de
productos biomédicos con interés comercial. Sin embargo, se deben superar algunas
limitaciones y desafíos para su uso. Se debe realizar una extensa serie de pruebas que
investiguen la biocompatibilidad, la citotoxicidad, el rendimiento biológico (in vitro e
in vivo) y el potencial osteogénico utilizando diferentes especies de esponjas, ya que
sus características y composición son muy variables.
Si la intención es aprovechar la estructura de la esponja como una matriz natural para
la sustitución ósea, otra limitación que debe tenerse en cuenta es la reproducibilidad
de estos BM. A pesar de que los andamios naturales son a menudo más biocompatibles
debido a su superficie biointeractiva para la colonización celular, los BM sintéticos
pueden tener su microestructura y propiedades fisicoquímicas en blanco o pueden ser
alteradas para ajustar la porosidad y la tasa de degradación (Wang et al., 2014).
5
1.2. Planteamiento del problema
En la actualidad, los trastornos relacionados con el tejido óseo (TO) son un desa-
fío clínico significativo en todo el mundo, representando la mitad de padecimientos en
personas mayores de 50 años (Brinker y O’Connor, 2004), principalmente causados por
trauma, fracturas, cáncer, deformidades e infecciones. En México según datos de la Se-
cretaria de Salud, para el año 2020 habrá un aumento considerable de adultos mayores
(Nerem y Sambanis, 1995), por lo tanto, existirán más pacientes que demanden nuevas
alternativas para el tratamiento de sus padecimientos. Gran parte de las complicaciones
se deben a que los materiales desarrollados como implantes y sustitutos en odontolo-
gía y ortopedia sólo ofrecen una solución temporal y constantemente no satisfacen la
funcionalidad requerida, es decir, no son totalmente compatibles con el TO, careciendo
de propiedades como la funcionalidad mecánica, estabilidad estructural, entre otras
(Laurencin et al., 2006).
1.3. JustificaciónEsta investigación tendrá como resultado aplicar una metodología para el procesa-
miento de materiales a base de óxido de silicio y colágena con propiedades estructurales
macrométricas y micrométricas presentes en la MEC, obtenidas a partir de esponjas
marinas de la familia Halichondriidae específicamente del modelo animal Halichondria
spp, utilizando técnicas de descelularización. Este andamio se constituye, tomando co-
mo base la formación de la MEC generada por la esponja, cuya constitución morfológica
en cuanto a su anatomía es muy similar a la constitución del TO. El desarrollo de este
tipo de metodologías representa un aporte importante en los intereses científicos del
país, con el fin de generar andamios que tengan como principal objetivo emular las pro-
piedades estructurales del TO, aprovechando la gran abundancia existente de recursos
marinos presentes en la Península de Yucatán.
Este estudio representa una gran contribución a la ciencia biomédica y al desarrollo
de nuevos procedimientos para la generación de BM y su aplicación para fines médicos,
permitiendo la integración de diversas áreas de conocimiento, como la biomedicina,
ingeniería de los materiales, IT y BM, biología marina, etc. Se espera que, a largo
plazo, la aplicación de este tipo de tecnologías sea una realidad para el tratamiento de
padecimientos óseos en clínicas de especialización y con esto contribuir a la mejora en
la calidad de vida de los pacientes.
6
1.4. Hipótesis
El andamio de matriz cerámica y colágena obtenido a partir del proceso de desce-
lularización de la MEC del modelo animal Halichondria spp, presentará propiedades
estructurales y de biocompatibilidad viables para su aplicación en Ingeniería tisular
ósea.
1.5. Objetivos
1.5.1. Objetivo General
Obtener y caracterizar un andamio compósito, diseñado para emular las propiedades
estructurales del TO, cuya aplicación sea la regeneración de este tejido.
1.5.2. Objetivos Específicos
i) Obtener andamios a partir de la descelularización de la MEC presente en el
modelo animal Halichondria spp.
ii) Generar espículas a partir de la descelularización de la MEC presente en el modelo
animal Halichondria spp.
iii) Emplear Microscopía óptica (MO) para la caracterización morfológica del anda-
mio.
iv) Realizar la caracterización fisicoquímica del andamio utilizando las técnicas de
Espectroscopia Infrarroja por Transformada de Fourier (FT-IR), Espectroscopia
RAMAN y Análisis Termogravimétrico (TGA).
7
Capítulo 2
Marco Teórico
2.1. Tejido óseo
El tejido óseo es un tejido conectivo mineralizado que forma el esqueleto. Este ejerce
funciones importantes en el cuerpo, entre ellos, de soporte, otorgándole una estructura
rígida a los músculos; de locomoción, permitiendo los movimientos corporales; de pro-
tección, pues forma cavidades que protegen tejidos blandos y órganos internos y el de
homeostasis mineral, pues sirve como depósito de Calcio (Ca) y fosfato.
El tejido óseo está formado por diversas células y por una matriz extracelular, cuyos
principales componentes son Colágena tipo I, Hidroxiapatita (HA) y agua. El com-
ponente inorgánico presente en el TO está compuesto en un 95% de Hidroxiapatita,
deficiente en calcio e hidróxido, conteniendo además un 5% de impurezas como sodio,
potasio, estroncio, fluoruros, carbonatos, entre otros. El mayor de los componentes or-
gánicos del TO es el colágeno tipo I, sintetizado por los osteoblastos, esta proteína
le confiere al hueso resistencia a la tracción, elasticidad y flexibilidad. Además, ofrece
un sitio adecuado para la nucleación y el crecimiento de los cristales de HA. Si bien
existen varios tipos de colágeno, un 95% de colágeno óseo es tipo I, mientras que el 5%
restante es tipo V. Las moléculas de colágeno están compuestas por una triple hélice
de aproximadamente 1.5 nm de diámetro con giro hacia la derecha, integrada con tres
cadenas polipeptídicas llamadas cadenas a. Cada cadena a esta compuesta por una
estructura característica repetitiva a lo largo de la cadena de tres aminoácidos, glicina
X-Y, donde X e Y son mayormente prolina e hidroxiprolina, respectivamente.
Además de la colágena tipo I y de HA, otras proteínas forman la MEC ósea como
proteoglicanos, osteocalcina, osteonectina, osteopontina, sialoproteinas, fibronectina,
trombospondina, vitronectina y factores de crecimiento. Las células implicadas en el
metabolismo óseo son células mesenquimales, diferenciándose a osteoblastos, osteocitos
8
y osteoclastos. Los osteoblastos tienen la función de formar TO y luego calcificarlo.
Tienen un tamaño promedio de 25 µm de diámetro y una forma poliédrica, poseen
un citoplasma altamente basófilo debido a la alta producción de ARN, un retículo
endoplasmático extenso y un aparato de Golgi muy desarrollado como evidencia de
su gran actividad sintética. Los osteocitos son las células más abundantes del TO, su
población puede llegar al 90% del total de los constituyentes celulares; estos pueden
censar cambios mecánicos y traducirlos en señales bioquímicas que actúan sobre el
hueso. Los osteoclastos son las únicas células conocidas capaces de degradar el hueso,
estas disuelven los cristales de HA y digieren la matriz orgánica a parir de la secreción de
diversas enzimas, entre las cuales, las más importantes son las proteasas, cuya función
es degradar y absorber el hueso.
Según su estructura, el TO se puede clasificar en esponjoso (o trabecular) y com-
pacto (o cortical). El hueso trabecular posee una estructura altamente porosa con una
porosidad variable entre 50 y 90 % con sus poros interconectados, consiste en una serie
de trabéculas formadas por placas y varillas entre las cuales queda contenida la médula
ósea. El hueso cortical es más denso que el trabecular, con una porosidad promedio de
5% y se encuentra en la superficie de los huesos, está compuesto por una disposición
paralela al eje mayor del hueso de estructuras cilíndricas llamadas osteonas o Sistema
de Havers.
2.2. Remodelación del tejido óseo
El remodelado óseo es un proceso que se lleva a cabo en todos los huesos del orga-
nismo a lo largo de toda la vida, demostrando que el tejido está muy lejos de ser un
tejido estático. Los principales objetivos del proceso son mantener la fortaleza ósea y
la homeostasis mineral. En el remodelado óseo se absorben pequeñas porciones óseas
debido a la actividad osteoclástica, luego se deposita MEC, que posteriormente se
mineraliza debido a la actividad osteoblastica. En el proceso final, durante la remode-
lación se reabsorbe tejido viejo y luego se forma tejido nuevo. El proceso puede reparar
microfracturas, evitando su acumulación.
Cada proceso puntual de remodelado se lleva a cabo por ciclos secuenciales de activa-
ción osteoclástica-osteoblástica, formando una Unidad Multicelular Básica (BMU). La
primera fase consta de reclutamiento y activación de los precursores mononucleares de
la circulación para formar osteoclastos. Estos llegan a la superficie del hueso, uniéndose
mediante los receptores de integrina a proteínas de la matriz extracelular que contienen
la secuencia RGD (arginina, glicina, ácido aspártico) formando una zona sellada entre
el hueso y el osteoclasto. Esta etapa dura alrededor de tres semanas en cada ciclo de
remodelado. Como se ve en la fig. varios factores regulan la actividad de los osteo-
9
clastos, tomando un rol central, el Ligando del Receptor Activador de Factor Nuclear
κβ (RANKL) y la Osteoprotegerina (OPG), ambos producidas por los osteoblastos
Una vez unido el osteoclasto al hueso comienza la erosión del tejido, para ello el
osteoclasto libera un Ión positivo de Hidrógeno (H+) mediante bombas de protones
de Adenosín Trifosfato (ATP) -dependientes con el fin de bajar el pH a 4.5- en el
compartimiento de reabsorción para facilitar la remoción de HA. Además, el osteoclasto
libera una serie de enzimas que degradan la MEC. Una vez finalizada la reabsorción, los
osteoclastos son eliminados medianteapoptosis celular. Luego de la fase de reabsorción,
el remodelado entra en una fase de formación, en la cual los osteoblastos se diferencian
a partir de sus precursores. Si bien, el acoplamiento entre el final de la reabsorción y
el comienzo de la formación no está aclarado, se cree que el mismo involucra diversos
factores de crecimiento. La formación de hueso dura entre 4 a 5 meses. En este tiempo,
las células osteoblásticas secretan MEC y vesículas, conteniendo altas concentraciones
de Ca y fosfatos para lograr la mineralización del colágeno producido. Al finalizar el
proceso de formación, un 50-60 % de los osteoblastos entran en apoptosis, y el resto se
convierte en osteocitos o en células que recubren el hueso. El proceso de remodelación
es básicamente el mismo tanto en el tejido óseo cortical como en el trabecular.
2.3. Andamios para ingeniería tisular ósea
El uso de injertos óseos es el estándar para tratar fracturas esqueléticas, o para
reemplazar y regenerar huesos perdidos, como lo demuestra la gran cantidad de proce-
dimientos de injertos
óseos realizados en todo el mundo. El más común de estos es el autoinjerto, sin embar-
go, su uso puede llevar a complicaciones tales como dolor, infección, cicatrices, pérdida
de sangre y morbilidad en el sitio del donante. La alternativa son los aloinjertos, pero
carecen de la capacidad osteoconductiva de los autoinjertos y conllevan el riesgo de por-
tar agentes infecciosos o rechazo inmunitario (Saha et al., 2014). Un andamio o injerto
óseo ideal debe estar hecho de biomateriales que imiten la estructura y las propiedades
de la matriz extracelular ósea, que incluyan células osteoprogenitoras y proporcionen
todas las señales ambientales necesarias que se encuentran en el tejido óseo. El área de
la ingeniería tisular es muy amplia y es la combinación de bioingeniería, biología y bio-
química. En la última década ha avanzado mucho y ha propuesto soluciones mediante
la sustitución de los tejidos de nuestro cuerpo dañados de forma permanente. El campo
se ha expandido a la regeneración tisular de cartílago, hueso, vasos sanguíneos, piel,
etc. Involucra el desarrollo de implantes bioartificiales y / o el fomento de la remode-
lación tisular con el objetivo de reparar o mejorar la función de los tejidos u órganos
(Mallick et al., 2015). Los constructos bioartificiales generalmente consisten en células,
10
biomateriales y factores de crecimiento, por lo que la ingeniería tisular se basa tanto
en la ciencia como en la tecnología de células y biomateriales. Un aspecto clave de la
ingeniería tisular basada en células para la reparación y regeneración de tejidos es el
uso de andamios adecuados. Idealmente, los materiales de los andamios deberían ser
biomiméticos, funcional y estructuralmente de la matriz extracelular nativa del tejido
y ser capaces de experimentar degradación cuando se forma el tejido funcional. Aunque
se dispone de una amplia variedad de materiales de andamios, es importante en el cam-
po de la medicina regenerativa seleccionar un material que corresponda estrechamente
con las propiedades del tejido que busca reemplazar (Yu et al., 2015). Cada tipo de
material se asocia con una respuesta específica y única del huésped cuando se implanta,
por lo que también se debe considerar la biocompatibilidad del material del andamio.
2.4. Colágena
La CLG pertenece a una familia de proteínas fibrosas presentes en organismos mul-
ticelulares y representa aproximadamente el 25 % del peso seco total de los mamíferos
(Alberts, 2002). Proporciona textura, resistencia y forma, y se encuentra en la mayoría
de los tejidos conectivos de los animales: dermis, huesos, tendones, cartílago, ligamentos
y vasos sanguíneos, dientes, córnea, discos intervertebrales, cuerpos vítreos y placenta
(Pallela et al., 2013). La presencia de colágeno en todo el tejido conectivo lo convierte
en una de las biomoléculas más estudiadas de la MEC.
Hasta el día de hoy, se han caracterizado 29 tipos distintos de CLG y todos presentan
una estructura típica de triple hélice. Se sabe que existen los tipos de CLG I, II, III,
V y XI que forman fibras de CLG. Las moléculas de CLG están compuestas por tres
cadenas α que se ensamblan juntas debido a su estructura molecular. Cada cadena α
está compuesta por más de mil aminoácidos basados en la secuencia [Gly−X−Y ]. La
presencia de glicina es esencial en cada tercera posición de aminoácidos para permitir
un empaquetamiento ajustado de las tres cadenas α en la molécula de tropocolágeno
y las posiciones X e Y están en su mayoría llenas de prolina y 4-hidroxiprolina, respec-
tivamente (van der Rest y Garrone, 1991).
La CLG tipo I [α1(I)]2 α2(I)] es el principal componente de hueso, piel, tendones,
ligamentos, córnea y órganos internos, cuyo porcentaje representa el 90 % de la CLG
corporal; la CLG tipo II [α1(II)]3 comprende la composición fibrilar del cartílago, disco
intervertebral, notocorda y humor vítreo del ojo; la CLG tipo III [α1(III)]3, compone
las fibrillas secundarias presentes en piel, vasos sanguíneos y órganos internos; la CLG
tipo V, comprende tejidos similares a los que se componen de CLG tipo I; y la CLG
tipo XI, comprende tejidos similares a los que se componen de CLG tipo II (Parenteau-
Bareil et al., 2010).
11
Hay aproximadamente veinticinco conformaciones de cadena α diferentes, cada una
producida por su gen único. La combinación de estas cadenas, en grupos de tres, se
ensambla para formar los 29 tipos diferentes de colágeno que se conocen actualmente.
Aunque se han descrito muchos tipos de colágeno, solo se usan unos pocos para producir
biomateriales. El colágeno tipo I es actualmente el estándar fundamental en el campo
de la IT (Parenteau-Bareil et al., 2010).
La CLG es un candidato ideal para el diseño de ATD, pues es biocompatible y
biodegradable y estimula la proliferación y diferenciación de células pertenecientes a
la matriz extracelular (Polo-Corrales et al., 2014). Además, con una combinación de
materiales biomiméticos óseos como la Hidroxiapatita (HA) y el quitosano, se pueden
mejorar las condiciones en los andamios para aplicaciones específicas en IT ósea (Pallela
et al., 2013).
La CLG se encuentra presente en muchos organismos marinos, como son: esponjas,
medusas, pulpos, calamares y peces. Las especies de esponjas que pertenecen a la
clase Demospongiae (Porífera) consisten estructuralmente en un esqueleto formado por
espículas silíceas o fibras de colágeno o ambas. En este último caso, las fibras de colágeno
proporcionan una matriz en la que están incrustadas las espículas. La abundancia de
sílice, así como los iones de calcio y carbonato en los antiguos ambientes marinos, por
un lado, y la existencia de andamios primarios de quitina y colágeno, por otro lado, los
hace adecuados para varias aplicaciones biomiméticas (Ehrlich, 2010).
Una alternativa es aprovechar la materia prima proveniente del modelo animal Hali-
chondria spp (Porífera, Demospongiae), que se encuentra en la península de Yucatán.
De esta forma, es posible generar andamios con potencial aplicación clínica a través
de técnicas de procesamiento y síntesis accesibles a base de biomateriales de origen
marino.
2.5. Biosilica
El silicio representa el segundo elemento más abundante en la corteza, después del
oxígeno. Constituye el 26 % de la corteza terrestre, y en forma de compuesto como
Dióxido de silicio (SiO2), es el mineral más común. A partir de sales de silicato, el
ácido silícico se forma por acidificación en solución acuosa (Wang et al., 2010). La
sílice cristalina más abundante es la arena, que se caracteriza por su extrema dureza y
fragilidad.
La BS es un nutriente esencial para el ecosistema natural en general, y para los
humanos y otros vertebrados en particular, donde la falta de silicio da como resultado
malformaciones esqueléticas graves (Carlisle, 1972). Los primeros intentos para evaluar
12
la aplicación biomédica de biosilica para eltratamiento de defectos de los huesos y
dientes son prometedores. Así, durante una reacción de silicatein con el sustrato de
metasilicato de sodio, se formaron capas de biosilica a nanoescala (50–150 nm) en
Hidroxiapatita dental y ósea, con la intención de reducir el riesgo de caries o regenerar
el tejido óseo a través de la actividad estimulada por BS de las células mineralizantes.
La sílice es utilizada por una serie de organismos marinos, por ejemplo, algas uni-
celulares, foraminíferos y esponjas, como un esqueleto de cuerpo duro. Los elementos
esqueléticos (espículas) de las esponjas silíceas, Hexactinellida y Demospongiae, están
compuestas de ópalo amorfo, cuya fórmula química es SiO2−nH2O. Los tamaños y las
morfologías de las espículas son muy diversos, como se revisa en el trabajo de Uriz, los
animales secretan las espículas minerales siguiendo distintos patrones arquitectónicos
(Uriz, 2006). La mayoría de las Demospongiae y Hexactinellida producen elementos
esqueléticos individuales compuestos de sílice, las espículas que varían en tamaño pos-
teriormente pueden fusionarse o interconectarse entre sí. Las dos clases difieren desde
el punto de vista esquelético. En Demospongiae, el número de ejes simétricos de sus
megascleras es monaxonial o tetraxonal. Por el contrario, en espículas de hexactinélidos
la estructura del eje es monaxonial o triaxonial.
Se ha descrito una forma especial de mineralización controlada biológicamente (es
decir, controlada enzimáticamente) para el proceso de biosilicificación en esponjas silí-
ceas. En estos animales (Demospongiae y Hexactinellida), la enzima silicatein participa
catalíticamente en la formación de biosilica, y sirve simultáneamente como andamio
orgánico para el producto mineral inorgánico de poli-silicato. Por lo tanto, actúa como
Bio-semilla y matriz orgánica (Wang et al., 2010).
2.6. Biomateriales de origen marino
Los biomateriales son uno de los campos más interesantes de la ciencia moderna, tra-
ta con materiales o sustancias de derivados biológicos que se usan dentro de un sistema
biológico (Saha et al., 2014). El colágeno es la proteína más abundante de alto peso mo-
lecular en los organismos invertebrados y vertebrados, incluidos los mamíferos; brindan
estructura a los tejidos, existiendo diferentes tipos de acuerdo con su organización es-
pecífica. A partir de esto, ha sido elegido como uno de los materiales biológicos clave en
los enfoques de regeneración tisular. Además, la industria está en constante búsqueda
de nuevas fuentes naturales de colágeno y metodologías mejoradas para su producción.
Se han propuesto y explorado diferentes organismos para la extracción de colágeno, lo
que permite la producción sostenible de diferentes tipos de ésta, con propiedades que
dependen del tipo de organismo (y su entorno natural) y la metodología de extracción
(Silva et al., 2014). El uso de biomateriales basados en colágeno en el campo de las
13
aplicaciones de ingeniería de tejidos ha estado creciendo intensamente en las últimas
décadas. El colágeno posee ventaja en ser biodegradable, biocompatible, fácilmente dis-
ponible y altamente versátil. Sin embargo, dado que el colágeno es una proteína, sigue
siendo difícil de esterilizar sin alteraciones en su estructura (Parenteau-Bareil et al.,
2010).
Entre las fuentes naturales, la más nueva y también la más potente identificada es
el medio marino. Los organismos marinos están estructurados y constituidos por ma-
teriales con una amplia gama de propiedades y características que pueden justificar su
posible aplicación dentro del campo biomédico (Kim, 2015). Además, asegurar la ex-
plotación sostenible de los recursos marinos naturales constituye una plataforma muy
interesante para el desarrollo de nuevos biomateriales, con beneficios tanto económicos
como ambientales. En esta perspectiva, se está aislando un número creciente de dife-
rentes tipos de compuestos de organismos marinos y se los transforma en productos
rentables para aplicaciones clínicas, incluida la administración controlada de fárma-
cos y dispositivos de ingeniería tisular. De acuerdo a Saha y Yadav, se han reportado
los usos de algunos biomateriales obtenidos a partir de diversos organismos marinos
como esponjas, ascidias, crustáceos, organismos sésiles, corales, actinobacterias, algas
marinas y hongos. Las esponjas son excelentes sujetos de investigación debido a sus
esqueletos fibrosos y espículas mineralizadas, que contienen sílice amorfa o carbonato
de calcio.
Las esponjas que constituyen el phylum Porífera son los organismos acuáticos multi-
celulares más primitivos y simples que se conocen y es un grupo clave para entender la
evolución de los metazoarios (Erpenbeck y Wörheide, 2007). El número total de espe-
cies es desconocido, ya que aún se siguen descubriendo nuevas especies para la ciencia.
El grupo está integrado por tres clases: Calcárea, Hexactinellida y Demospongiae, sien-
do ésta la de mayor dominancia y diversidad en las costas de Yucatán (Gómez y Solis,
2010).
Se caracterizan por la presencia de poros y canales a través de su cuerpo por los
que circula una corriente de agua. Son invertebrados coloniales sésiles que viven en los
cuerpos de agua. En esencia, una esponja es una agrupación de células que funcionan
juntas, pero con poca integración y control de sus actividades celulares. Una de las
células típicas de las esponjas son los coanocitos, células flageladas que se encargan
de crear el flujo interno del agua, de atrapar y digerir las partículas de alimento, de
absorber el oxígeno y de expulsar sustancias de desecho. No obstante, su gran éxito
se debe probablemente a que poseen un tipo de células llamadas arqueocitos, con una
habilidad única en el reino animal ya que tienen la capacidad de transformarse en
cualquier otro tipo de célula que la esponja necesite, además de servir como un sistema
único de reparación celular. Este diseño estructural, aunque aparentemente simple, les
14
ha permitido sobrevivir a muchas crisis y extinciones durante los últimos 600 millones
de años (Carballo et al., 2014).
Una de las características más importantes de las esponjas desde el punto de vista
biotecnológico se debe a la gran variedad de productos naturales que producen, ya que
seguramente es el grupo marino más importante en cuanto a la producción de compues-
tos bioactivos (Cowden, 1995). De hecho, uno de los pocos fármacos de origen marino
que se comercializan en la actualidad se encontró en 1950, en la esponja del Caribe
Tethya crypta (actualmente Cryptotethya crypta). Posteriormente por síntesis, se ob-
tuvieron los análogos Ara-A (Vidarabin, Vidarabin Thilo®), antivirales muy efectivos
sobre todo contra diversos herpes y los Ara-C (Cytarabin, Alexan®, Udicil®, Lara-
cit), actualmente uno de los pocos compuestos efectivos contra leucemias. y linfomas
en adultos y niños (McConnell et al., 1994).
Más recientemente, a finales de 2010, se aprobó el uso de otro compuesto derivado
de una esponja marina, el Halaven (mesilato de eribulina), análogo sintético de la
halicondrina B, un producto natural aislado de la esponja marina Halichondria okadai,
indicado para el tratamiento del cáncer de mama (Cortes et al., 2011).
Otro campo interesante donde las esponjas están incursionando es el de los bioma-
teriales, los cuales son el resultado de un largo proceso evolutivo y nos muestran lo
que ha conseguido la naturaleza después de millones de años de evolución, creando
no sólo materiales con propiedades extraordinarias, sino también técnicas sofisticadas
de fabricación, más allá de lo que es capaz la tecnología actual. En este campo, las
esponjas marinas también constituyen un recurso increíble, ya que el esqueleto de al-
gunas especies, principalmente las del género Aplysina, tienen una estructura tal que
funciona como andamiaje para el cultivo de células en la regeneración de tejidos como
el cartílago (Ehrlich et al., 2010). Las esponjastambién han adquirido un gran interés
debido a que son capaces de construir nanoestructuras de silicio (espículas) a tempera-
tura ambiente que pudieran tener una aplicación importante en la industria del silicio
(Bond y McAuliffe, 2003).
15
2.7. Procesos de descelularización
La descelularización es el proceso de remover los antígenos celulares alogénicos o xe-
nogénicos del tejido los cuales podrían iniciar una respuesta inmune, mientras se deja
una matriz extracelular (MEC) viable la cual se compone de una mezcla de moléculas
estructurales y funcionales. Los procesos de descelularización aprovechan la MEC pre-
sente en los propios tejidos de origen animal o humano, para la generación de andamios
biocompatibles para el crecimiento celular Las estrategias de descelularización varían
de acuerdo a la naturaleza del tejido e involucran procesos químicos, físicos y enzimá-
ticos que idealmente remueven los componentes celulares, preservando la estructura,
composición, actividad biológica e integridad mecánica de la MEC nativa. La efectivi-
dad del proceso de descelularización depende tanto de la metodología utilizada como
de la naturaleza del tejido (Crapo et al., 2011).
Los agentes más efectivos para la descelularización de cada tejido y órgano dependen
de muchos factores, como grosor, densidad o la aplicación clínica prevista. Debe enten-
derse que cada agente y método de eliminación de células alterará la composición de la
MEC y causará cierto grado de interrupción de la estructura. Antes de aplicar agentes
de descelularización, el exceso de tejido no deseado puede eliminarse para simplificar
el proceso de eliminación de células (Yang et al., 2010).
Los ácidos y bases catalizan la degradación hidrolítica de las moléculas. El ácido
peracético es un agente de desinfección común que se duplica como un agente de des-
celularización al eliminar los ácidos nucleicos residuales con un efecto mínimo en la
composición y estructura de la MEC. El ácido acético daña y elimina el colágeno con
una reducción de la MEC. Las bases (por ejemplo, hidróxido de calcio, sulfuro de sodio
e hidróxido de sodio) se usan para eliminar el vello de las muestras de dermis durante
las primeras etapas de la descelularización (Brown et al., 2011). Sin embargo, las bases
pueden eliminar completamente los factores de crecimiento de la matriz y disminuir las
propiedades mecánicas de la MEC de manera más significativa que los agentes químicos
y enzimáticos
Los alcoholes, como el glicerol, ayudan a descelularizar los tejidos deshidratando las
células (Prasertsung et al., 2008). De hecho, los alcoholes como el isopropanol, el etanol
y el metanol son más efectivos que la lipasa para eliminar los lípidos del tejido y son
capaces de dejar el tejido adiposo libre de lípidos en un período relativamente breve
(Crapo et al., 2011).
16
2.8. Métodos de caracterización de biomateriales
De manera general, en IT existen tres formas de caracterizar andamios, una es la
caracterización morfológica o estructural, otra es la caracterización fisicoquímica y fi-
nalmente la caracterización funcional o fisiológica. En la caracterización estructural, se
evalúan la organización espacial y la morfológica empleando técnicas de microscopia
óptica y microscopía electrónica de barrido La caracterización fisicoquímica tiene que
ver con la evaluación cuantitativa de la distribución de los componentes químicos es-
pecíficos del andamio, determinados mediante análisis espectroscópicos, de difracción,
químicos, entre otros. Finalmente, en la caracterización funcional se determina la viabi-
lidad celular del andamio y citotoxicidad, se evalúan las propiedades mecánicas, como
el módulo elástico a tensión, a compresión y a esfuerzo, entre otras. Estos métodos
permiten entender las propiedades de los andamios generados de una manera objetiva
y cuantificable para una aplicación específica. Para los fines de ésta investigación, se
hace una revisión de las técnicas empleadas, siendo estas: Microscopía óptica, FT-IR,
RAMAN y Análisis termogravimétrico.
2.8.1. Microscopía óptica
La microscopía óptica (MO) es el método más utilizado para examinar la microestruc-
tura de un biomaterial de tipo metálico, cerámico y polimérico. En su nivel más básico,
MO proporciona una imagen visual de la superficie de un material y permite medir las
características de la superficie dentro de los límites de la resolución proporcionada por
la longitud de onda de la luz visible (Leng, 2013).
Hay muchas variaciones de MO con modificaciones y mejoras en el diseño, con el
propósito de aumentar la resolución, la ampliación y el contraste, así como la reducción
de aberraciones y artefactos. La mejor resolución teórica posible es de alrededor de
0.2 µm a una longitud de onda de 400 nm (luz violeta). De igual importancia para
la ampliación es el contraste y el brillo de la imagen. El brillo disminuye a medida
que aumenta la ampliación y debe ajustarse cuidadosamente para permitir la mejor
visibilidad posible de la muestra (Zhang, 2014).
2.8.2. Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier
La Espectroscopía infrarroja por Transformada de Fourier (FT-IR) es una técnica
ampliamente utilizada para la caracterización de biomateriales. Es una forma de es-
pectroscopia vibracional basada en la interacción de la radiación IR y las vibraciones
naturales de los enlaces químicos entre los átomos que componen el material. En la
espectroscopia FT-IR, la muestra se irradia con radiación IR y se miden los cambios en
la absorción de esta radiación por parte de la muestra. La muestra absorbe radiación
17
en la región IR solo cuando hay una coincidencia (resonancia) entre las frecuencias de
la radiación IR con la vibración molecular y la vibración natural provoca un cambio
en el momento dipolar durante la vibración. Las vibraciones moleculares son dos ti-
pos: estiramiento (que cambia la longitud del enlace) y flexión (que cambia el ángulo
del enlace). La aplicación del algoritmo de transformada rápida de Fourier, permite la
detección simultánea de toda la energía transmitida (Kumar, 2013).
Estos cambios en el movimiento vibratorio dan lugar a bandas de absorción en el
espectro vibratorio. Para la región IR, la posición de las bandas de absorción en el
espectro no se presenta como longitud de onda sino como número de onda, utilizando
el centímetro recíproco como su unidad (cm−1). La región IR se subdivide en tres
regiones espectrales, es decir, la IR cercana (de 4000 a aproximadamente 14,000 cm−1),
la IR media (de 400 a 4000 cm−1) y la IR lejana (de aproximadamente 25 a 400 cm−1)
(Bandyopadhyay y Bose, 2013).
2.8.3. Espectroscopía RAMAN
Cuando una luz cuántica impacta una superficie, se produce un proceso de dispersión
elástica denominado dispersión de Rayleigh, un proceso inelástico denominado disper-
sión Raman y una energía. Cuando la radiación incidente es absorbida por un estado
electrónico virtual de la molécula, seguida de la emisión al estado vibratorio excitado,
las líneas Raman correspondientes se denominan líneas de Stokes. Alternativamente,
cuando la vibración molecular ya está en el estado excitado y, al volver a emitirse al
estado fundamental, las líneas Raman se denominan líneas anti-Stokes (Wang y Chu,
2013).
La espectroscopia Raman es una herramienta poderosa para investigar la química
de la superficie de los materiales. Similar a la espectroscopia IR, la espectroscopia Ra-
man es una de las espectroscopias de vibración molecular. IR y Raman son altamente
complementarios, ya que la espectroscopia Raman se basa en la polarizabilidad y la
espectroscopia IR se ocupa de los momentos dipolares. A veces, la espectroscopia Ra-
man es sensible a esos modos de vibración, que no son observados por IR o solo dan
lugar a bandas de absorción de IR débiles. En la espectroscopia Raman, la longitud de
onda de la fuente de excitación puede ser ultravioleta, visible, cercana a IR e incluso
IR. Su sensibilidada la superficie no solo está relacionada con la longitud de onda de
excitación, sino que también se relaciona con las propiedades de los materiales (Wang
y Chu, 2013).
18
2.8.4. Análisis termogavimétrico
El Análisis termogavimétrico (TGA) es una técnica para medir el cambio de masa de
una muestra con la temperatura. Una muestra que se va a medir se coloca en un horno
y su cambio de masa se controla mediante una termobalanza. La aplicación principal
de TGA es analizar la descomposición del material y la estabilidad térmica mediante
el cambio de masa en función de la temperatura en modo de escaneo o en función del
tiempo en modo isotérmico. Las curvas TGA se representan como el cambio de masa
expresado en porcentaje frente a la temperatura. La técnica TGA es simple pero efectiva
para evaluar la estabilidad térmica y las reacciones químicas al monitorear el cambio
de masa en los materiales. Varias reacciones involucran cambios de masa, incluyendo
deshidratación, desorción, descomposición y oxidación. A menudo es deseable trazar
Curvas de la primera derivada respecto a la temperatura, ∆m
∆T
(DTGA), con curvas
TGA para revelar las temperaturas de descomposición de los polímeros. Sólo las curvas
DTGA podrían indicar claramente la temperatura de descomposición de un material.
(Leng, 2013)
19
Capítulo 3
Metodología
La elaboración de este trabajo se llevó a cabo en siete etapas; la primera etapa consis-
tió en la obtención de los andamios generados a partir de modelo animal Halichondria
spp, que fue recolectado en la Ciénega del municipio de Telchac Puerto, el cual se en-
cuentra ubicado a 62 kilómetros al noreste de la ciudad de Mérida, capital del estado
de Yucatán y a 30 minutos del puerto Progreso (N21°20’28.36", O89°15’47.99"). Ver
Figura 3.1
Figura 3.1: Mapa del Estado de Yucatán, ubicando al Municipio de Telchac Puerto con el
código 083.
20
3.1. Materiales y métodos
Los materiales utilizados fueron los siguientes: vaso de precipitado de 100 mL, báscula
granataria digital, matraz aforado de 100 mL, parrilla de agitación, estufa bacterioló-
gica, cajas de Petri, Cloruro de sodio (NaCl), agua destilada, alcohol etílico al 70 %,
alcohol isopropilico al 100 %, peróxido de hidrogeno; estos materiales y reactivos se
emplearon para el proceso de lavado, descelularización y deshidratación de andamios.
Se propuso generar un andamio monocapa poroso, extraído del modelo animal Hali-
chondria spp, constituido por una matriz cerámica de óxido de silicio con refuerzo de
un biopolímero de CLG que emule las propiedades y distribución estructural del TO,
para su posible aplicación en ingeniería de tejidos óseos. Además se extrajeron las es-
pículas de esta esponja para recibir una evaluación similar. Tanto el andamio como las
espículas fueron caracterizados utilizando técnicas fisicoquímicas y morfológicas, estas
son microscopia óptica (MO), termogravimetría (TGA), espectroscopia infrarroja por
transformada de Fourier (FT-IR) y espectroscopia Raman (RAMAN). Éstas técnicas
permiten observar la morfología microestructural presente en cada una de las capas del
andamio, así como conocer las temperaturas de transición y las temperaturas donde
la CLG pierde masa. Los métodos de espectroscopia permiten conocer las bandas de
absorción y/o transmisiones específicas de los componentes químicos del andamio.
El desarrollo implementado para ésta investigación se desglosa en el siguiente diagra-
ma de flujo de la Figura 3.2
Figura 3.2: Diagrama de flujo del procesamiento de andamios óseos.
21
3.2. Impresión 3D del modelo de PLA
Se diseñó una base circular de dimensiones 12mm x 5mm, que servirá de molde para
hacer los cortes adecuados del modelo animal. El material empleado para el molde fue
Ácido Poliláctico (PLA).
3.3. Preparación y Lavado de Andamios
Una vez obtenido este organismo, se extrajeron de ellos las secciones más prominentes
del tallo, haciendo disecciones de las caras superficiales. Posteriormente, se realizaron
los cortes circulares, apoyándose con los bordes del molde impreso en 3D, según lo
requerido para realizar las pruebas de caracterización. Posteriormente se realizaron
unos lavados utilizando una solución 1M de NaCl en 100 mL de agua destilada durante
intervalos de 1 hora (ver Figura 3.3).
(a) (b) (c)
Figura 3.3: (a) Cortes de esponja empleando moldes de PLA, (b) Conservación de andamios
en alcohol, (c) Lavado de andamios con NaCl.
3.4. Descelularización de Andamios
Una vez lavados los andamios, se iniciará el proceso de descelularización, donde éstos
son expuestos en 100mL de etanol al 70 %, 100 mL de alcohol isopropílico al 100 %,
dejando en agitación por periodos de 1 hora. Posteriormente los andamios se ponen en
contacto con metanol durante 24 horas.
Concluido este periodo, los andamios fueron sumergidos en 100 mL de agua oxige-
nada en agitación durante 1 hora. Después de este lapso, los andamios fueron puestos
en contacto con una solución 2M de bicarbonato de sodio en 100mL de agua desti-
lada durante 1 hora. El proceso continúa hasta observar cambios considerables en la
coloración de los andamios (ver Figura 3.4).
22
(a) (b) (c)
Figura 3.4: (a) Proceso de descelularización de andamios, (b) Andamios en peróxido de
hidrógeno, (c) Andamios descelularizados.
3.5. Deshidratación de Andamios
Finalizado este proceso, los andamios se secaron en un horno a 50 ºC, para ello fueron
colocados en cajas de Petri; se tuvo el cuidado de estar vigilando frecuentemente para
evitar que se dañaran por la exposición prolongada al calor (ver Figura 3.5).
Figura 3.5: Proceso de deshidratación de andamios.
3.6. Obtención de espículas
Una vez obtenido este organismo y realizados los cortes de las secciones más promi-
nentes del tallo, se cortó la estructura esponjosa hasta obtener una consistencia más
fina y pequeña de la muestra para facilitar el proceso de destrucción orgánica. Después
fueron depositados 100 gr de esta muestra en 200 mL de ácido hipocloroso con hidróxi-
do de sodio (Cloralex®) y se dejó reposar por 1 hora hasta observar cambios. Pasado
el tiempo, se decantó la solución con cuidado de no desperdiciar el material inorgáni-
co asentado –ya que este material son las espículas–, y se agregaron nuevamente 200
23
mL de Cloralex®, dejando en reposo 30 min. Concluido el tiempo se retiró el agente
químico y se agregó 200 mL de agua destilada, dejando reposar 30 min.
Este proceso de lavados con ácido y agua se repite las veces necesarias hasta obtener
un material inorgánico limpio y libre de otras sustancias o residuos. Se recomienda
tres veces (ver Figura 3.6). Concluido este proceso, en la última decantación de agua
destilada, las espículas que se encuentran asentadas se dejan secar por un tiempo que
va desde 1 hr. hasta 24 hrs.
(a) Cortes de la sección del tallo de la esponja (b) Descelularización con Cloralex®
(c) Después de lavado con agua destilada y pre-
vio a un nuevo lavado con Cloralex®
(d) Espículas
Figura 3.6: Proceso de obtención de espículas.
24
3.7. Aplicación de técnicas de caracterización
El andamio fue caracterizado utilizando la técnica de Microscopía Óptica (MO),
donde se observa la morfología microestructural presente entre cada una de las capas
y la interfaz entre ellos. Para determinar las temperaturas a la que la CLG comienza
a desnaturalizarse o a perder masa, se utiliza la técnica de análisis termogravimétrico
(TGA). Finalmente, como apoyo a la información extraída, se analizará el andamio por
medio de la técnica de espectroscopia infrarroja por Transformada de Fourier (FT-IR)
y por Espectroscopia RAMAN, con el fin de conocer las bandas de absorción específicas
de los constituyentes químicos del andamio.
25
Capítulo 4
Resultados
4.1. Microscopía óptica
Los andamios basados en el esqueleto de la esponja Halichondria spp fueron anali-
zados por microscopía óptica, empleando objetivos de 4x y 10x. En la Figura 4.1 se
muestran las tomas realizadas a un andamio,en donde se observa la microestructura
propia de la esponja, en esta destacan la porosidad y una interconexción de poro en
secciones que asemejan al tejido óseo trabecular, de acuerdo a la caracterizaciones rea-
lizadas por Gibson, donde empleo técnicas de microscopía para evaluar la resistencia
mecánica de la cabeza del fémur (Gibson, 1985).
Figura 4.1: Imágenes de microscopía óptica de andamios de Halichondria spp.
26
4.2. FT-IR
Los andamios basados en la esponja Halichondria spp fueron analizadas mediante la
técnica de Espectroscopia Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR). El espectro
obtenido a través del Software Orgin8® se presenta en la Figura 4.2 que muestra
las bandas principales encontradas. El espectro tiene una longitud que va desde los
4000 cm−1 hasta los 500 cm−1 . Los datos detallados de las bandas de absorbancia más
importantes presentes en el espectro FT-IR se presentan en la Tabla 4.1. Se confirma
la presencia de grupos amida I, II y III relacionadas a CLG tipo I.
Tabla 4.1: Bandas FT-IR Andamios de Halichondria spp.
Bandas de intensidad Asignación vibratoria
3278 cm−1 -OH estiramiento
1636 cm−1 -NH deformación (Amida I)
1541 cm−1 -NH estiramiento (Amida II)
1451 cm−1 -CH2 estiramiento
1397 cm−1 -CH3 estiramiento
1232 cm−1 -C −N estiramiento (Amida III)
1027 cm−1 -CO estiramiento
783 cm−1 -NH2 deformación
El espectro FT-IR del andamio estudiado contiene señales características pertene-
cientes a los grupos funcionales amida. Los picos observados pertenecen a los números
de onda 1636, 1541 y 1232 cm−1, relacionados respectivamente a las vibraciones de los
grupos amida I, II y III (Zdarta et al., 2017).
27
60080010001200140016001800
No. de onda (cm-1 )
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
A
b
s
o
rb
a
n
c
ia
 (
%
)
FT-IR de Andamios de Halichondria spp.
Andamios
Amida I
Amida II
-CH
2
 ESTIRAMIENTO
-CH
3
 ESTIRAMIENTO
C-O ESTIRAMIENTO
-NH
2
 DEFORMACION
Amida III
Figura 4.2: Espectro FT-IR de andamios de Halichondria spp.
Además se observan picos en los numeros de onda 3278 cm−1, 1451 cm−1, 1397 cm−1,
1027 cm−1, 783 cm−1, pertenecientes a las vibraciones de grupo hidroxilo (-OH), del
estiramiento de etilo (CH2), del estiramiento de metilo (CH3), del estiramiento del
grupo –CO y la presencia del grupo -NH2, respectivamente. Estas bandas se ubican
entre los rangos propuestos en el trabajo realizado por Belbachir y colaboradores, donde
se caracterizaron por FT-IR los 5 tipos de CLG existentes y se encontraron los picos
característicos para cada uno (Belbachir et al., 2009).
Se realizó espectroscopia FT-IR a una muestra de espiculas de Halichondria spp
descelularizadas. En la Figura 4.3 se muestra una sección del mismo, que va de 1800
a 500 cm−1, en donde se observan las bandas caracteristicas con presencia de SiO2,
de acuerdo a los estudios realizados por Arasuna y colaboradores con otra esponja de
la familia Demospongiae, donde analizó el SiO2 presente en las espículas a traves de
espectroscopía FT-IR (Arasuna et al., 2018).
28
40060080010001200140016001800
No. de onda (cm-1 )
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
A
b
s
o
rb
a
n
c
ia
 (
%
)
FT-IR de Espiculas de Halichondria spp.
Espiculas
H-O-H ENLACE
Si-O ENLACE
Silanol GRUPO
Si-O-Si ENLACE
Figura 4.3: Espectro FT-IR de espículas de Halichondria spp en el rango de 1800-400 cm−1.
Se observan picos en los numeros de onda 1630 cm−1, 1032 cm−1, 939 cm−1, 789
cm−1, pertenecientes a las vibraciones de la molecula de agua (H −O−H), del enlace
Si−O, del enlace Si−O− Si, y del grupo silanol, respectivamente. En 3624 cm−1 se
reporta también la presencia de grupos silanol. (Ver Tabla 4.2).
Tabla 4.2: Bandas FT-IR Espículas de Halichondria spp.
Bandas de intensidad Asignación vibratoria
1630 cm−1 Vibración H −O −H
1032 cm−1 Si−O enlace
939 cm−1 Si−O − Si enlace
3624 cm−1, 789 cm−1 Grupo Silanol
29
4.3. Espectroscopia RAMAN
Empleando la técnica de espectroscopia RAMAN, se analizaron los andamios basados
en la esponja Halichondria spp. Todas las muestras se corrieron utilizando Reflectancia
Total Atenuada (ATR) con cristal de diamante, a 32 barridos, una potencia de 100
mW y 4 cm−1 de resolución. Los espectros obtenidos a través del Software Orgin8®
se presentan en la Figura 4.4, que muestra las bandas principales.
El espectro tiene una longitud que va desde los 100 cm−1 hasta los 3500 cm−1. Los
datos detallados de las bandas de intensidad más importantes presentes en el espectro
RAMAN se presentan en la Tabla 4.3. Con ésta técnica se confirma la presencia de
grupos amida I, II y III relacionadas a CLG tipo I, pues se localizaron las bandas
que caracterizan los enlaces –NH en rangos de números de onda cercanos, mismos que
fueron encontrados en los resultados de los trabajos de Gullekson y Borowicz (Gullekson
et al., 2011, Borowicz, 2016).
Tabla 4.3: Bandas espectroscopía RAMAN de Andamios de Halichondria spp.
Bandas de intensidad Asignación vibratoria
3301 cm−1 -NH estiramiento
2932 cm−1 -CH3 estiramiento
1671 cm−1 Amida I
1545 cm−1 Amida II
1451 cm−1 -CH2 estiramiento
1245 cm−1 Amida III
El espectro RAMAN del andamio estudiado en la Figura 4.4a contiene señales
características pertenecientes a los grupos funcionales amida. Los picos observados
pertenecen a los números de onda 1671, 1545 y 1245 cm-1, relacionados respectivamente
a las vibraciones de los grupos amida I, II y III (Gullekson et al., 2011).
Además se observan picos en los numeros de onda 3301 cm-1, 2932 cm-1, 1451 cm−1,
pertenecientes a las vibraciones del radical –NH, del estiramiento de metilo (CH3) y del
estiramiento de etilo (CH2), respectivamente. Estas bandas se ubican entre los rangos
propuestos en el trabajo realizado por Gulleckson, donde caracterizó por RAMAN
fibras de CLG tipo I (ver Figura 4.4b).
30
2500 2600 2700 2800 2900 3000 3100 3200 3300 3400 3500
No. de onda (cm-1 )
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
In
te
n
s
id
a
d
Espectro RAMAN de Andamios de Halichondria spp.
Andamios
-NH ESTIRAMIENTO
-CH
3
 ESTIRAMIENTO
(a) Espectro RAMAN de Andamios Zona 2500-3500 cm−1.
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000
No. de onda (cm-1 )
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
In
te
n
s
id
a
d
Espectro RAMAN de Andamios de Halichondria spp.
Andamios
Amida I
Amida II
Amida III
-CH
2
 ESTIRAMIENTO
(b) Espectro RAMAN de Andamios Zona 1000-2000 cm−1
Figura 4.4: Espectros RAMAN Andamios.
31
Se realizó ésta misma técnica a una muestra de espiculas de Halichondria spp desce-
lularizadas. En la Figura 4.5 se muestra dos secciones del mismo, la primera que va
de 2500 a 3800 cm−1, en donde se observan las bandas caracteristicas de grupos silanol;
y la segunda, que va de 200 a 1400 cm−1, en dode se obervan bandas relacionadas al
enlace oxigeno y silicio. Esto se confirma con los estudios realizados por Arasuna con
otra esponja de la familia Demospongiae, donde analizó el SiO2 presente en las espícu-
las a traves de espectroscopía RAMAN. Se observan picos en 3267 cm−1, 1087 cm−1,
962 cm−1 y 489 cm−1, pertenecientes a los grupos silanol, al estiramiento asimétrico del
enlace Si−O, al Q3 silanol y al estiramiento del enlace Si−O − Si, respectivamente
(Arasuna et al., 2018) (ver Tabla 4.4).
Tabla 4.4: Bandas espectroscopía RAMAN de Espículas de Halichondria spp.
Bandas de intensidad Asignación vibratoria
3267 cm−1 Grupo Silanol.
1087 cm−1 Si−O estiramiento asimétrico.
962 cm−1 Q3 Silanol.
489 cm−1 Si−O − Si estiramiento.
32
2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800
No. de onda (cm-1 )
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
In
te
n
s
id
a
d
10
4 Espectro RAMAN de Espiculas de Halichondria spp.
Espiculas
Silanol GRUPO
(a) Espectro RAMAN de Espículas Zona 2500-3800 cm−1.
200 400 600 800 1000 1200 1400
No. de onda (cm-1 )
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
In
te
n
s
id
a
d
Espectro RAMAN de Espiculas de Halichondria spp.
Espiculas
Si-O-SiENLACE
SI-O ENLACE
Q3 SILANOL
(b) Espectro RAMAN de Espículas Zona 200-1400 cm−1
Figura 4.5: Espectros RAMAN Espículas.
33
4.4. Análisis termogavimétrico
El TGA proporciona información sobre el cambio de masa en función del aumento
de temperatura a la que se somete el andamio, estos cambios se deben principalmente
a procesos de deshidratación, descomposición y oxidación. Las pérdidas principales de
temperatura se presentan en cuatro diferentes rangos, dados por la Zona A (0-150 ºC),
la Zona B (150-250 ºC), la Zona C (250-500 ºC) y la Zona D (500-650 ºC), como
se muestra en la Figura 4.6. La curva en A corresponde a la pérdida de agua del
material, que representó el 2 % en masa de la matriz, que ocurrió en 75 ºC. La zona B
no presentó pérdida. La siguiente pérdida se produjo en la Zona C en el termograma,
se observó en 290 ºC, correspondiente a un 30 % de masa perdida. Esto se relaciona con
la combustión del colágeno. Finalmente, la Zona D presentó una pérdida equivalente
al 10 % de masa a los 530 ºC, que representan la combustión de remanentes presentes
en la matriz (León-Mancilla et al., 2016) (ver Tabla 4.5).
0 100 200 300 400 500 600
Temperatura (°C)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
P
e
rd
id
a
 d
e
 m
a
s
a
 (
%
)
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
P
ri
m
e
ra
 d
e
ri
v
a
d
a
TGA de Andamios de Halichondria spp.
Zona A Zona B Zona C Zona D
Andamio
Primera derivada
Figura 4.6: Análisis TGA de andamios de Halichondria spp.
34
Tabla 4.5: Análisis TGA Andamios de Halichondria spp.
Zonas Descripción
Zona A (0-150 ºC)
Pérdida de agua del material, que representó el
2 % en masa de la matriz, que ocurrió a los 75 ºC.
Zona B (150-250 ºC) No presentó pérdida.
Zona C (250-500 ºC) 30 % de pérdida de masa a los 290 ºC.
Zona D (500-650 ºC) Pérdida equivalente al 10 % de masa a los 530 ºC.
El TGA presentado en la Figura 4.7 muestra el cambio de masa en función del
aumento de temperatura a la que se someten las espículas. Las pérdidas principales de
temperatura se presentan en cuatro diferentes rangos, dados por la Zona A (0-150 ºC),
la Zona B (150-250 ºC), la Zona C (250-500 ºC) y la Zona D (500-650 ºC). La curva
en A corresponde a la pérdida de agua del material, que representó el 10 % en masa de
la matriz, que ocurrió en 80 ºC. La zona B, zona C y zona D no presentaron pérdida
(Croce et al., 2004).
0 100 200 300 400 500 600
Temperatura (°C)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
-0.7
-0.6
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0
P
ri
m
e
ra
 d
e
ri
v
a
d
a
TGA de Espiculas de Halichondria spp.
Zona A Zona B Zona C Zona D
Espicula
Primera derivada
Figura 4.7: Análisis TGA de espiculas de Halichondria spp.
35
Capítulo 5
Conclusiones
Se ha logrado obtener andamios a partir de polímeros naturales de Halichondria spp
a través de la descelularización de la sección prominente de tallo del organismo. Los
andamios generados se diseñaron para aprovechar la arquitectuta porosa de la esponja
y de esta forma emular las propiedades estructurales del tejido óseo trabecular. La
metodología desarrollada permitió estandarizar un proceso de descelularización para
esta especie, de la cual se obtuvieron los andamios adecuados en tamaño de poro y
en forma para ser evaluados por las diferentes técnicas de caracterización ya mencio-
nadas. Además, aprovechando el material recolectado, se obtuvieron espículas de este
organimo, que están constituidas principalmente por dióxido de silicio (biosilica).
Se determinó a través de FT-IR y RAMAN que las espículas del modelo animal se
encuentran constituidos de biosilica (dióxido de silicio), pues son evidentes las bandas
de vibración que se atribuyen a los enlaces de oxígeno y silicio, así como de grupos
silanol. Los andamios obtenidos muestran una ausencia de organismos simbiontes y
células en todo el tejido, lo cual se corroboró utilizando microscopía óptica, además
con ésta técnica se identificó una similitud con la microestructura del tejido óseo trabe-
cular. Se determinó a través de FT-IR y RAMAN que los andamios del modelo animal
se encuentran constituidos principalmente de CLG tipo I, cuyas bandas de vibración
pertenecientes a los grupos funcionales Amida I, II y III asi como la vibración de otras
moléculas se señalan con claridad en los espectros. Más aún se confirma este hecho al
obtener las temperaturas típicas de degradación de la CLG utilizando los termogramas
TGA.
36
Con base en los resultados obtenidos, los andamios de Halichondria spp conservan
la morfología del hueso trabecular, los poros están abiertos e interconectados, y los
tamaños de los poros son adecuados para uso como soportes celulares. Este bioma-
terial se propone para su uso como un prototipo de andamio en la regeneración de
tejidos óseos, debido a que mimetiza sus propiedades estructurales y fisicoquímicas.
Aunque los resultados de las catacterizaciones son prometedores, se pretende explotar
las propiedades de biocompatiblidad de estos andamios con la proliferación celular de
osteoblastos y una revisión estadísitica de los ensayos.
En los océanos no solo hay agua, ya se ha demostrado que son una fuente abundante
de diversos materiales. Es por ello que existe la necesidad de desarrollar más biomate-
riales a partir de organismos marinos, sin embargo, los procedimientos in vitro deben
desarrollarse para obtener materiales de grado médico que sirvan para fines clínicos.
37
Bibliografía
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