Reporte_de_investigacion_Analisis_de_la

Vista previa del material en texto

Universidad De Guanajuato 
División de ciencias naturales y exactas 
 
 
 
Centro De Investigaciones Avanzadas Del Instituto 
Politécnico Nacional (CINVESTAV) Unidad Irapuato 
Departamento de biotecnología y bioquímica 
 
Proyecto de Investigación 
 
17 ENERO de 2023 
 
“Caracterización Bioquímica por espectroscopía 
de infrarrojo de la mezcla de suelo limo arena 
y análisis de la composición microbiana 
presente” 
 
Asesor organizacional: Dr. Víctor Olalde Portugal 
 
Por: Carlos Daniel Sierra Álvarez 
 
 
 
2 
 
 
RESUMEN 
 
El presente proyecto de investigación ha sido desarrollado en las instalaciones del 
Centro de Investigaciones Avanzadas del Instituto Politécnico Nacional 
(CINVESTAV) Unidad Irapuato, en el Departamento de Biotecnología y Bioquímica. 
Con la finalidad de analizar las poblaciones bacterianas presentes en el suelo 
utilizado en el sector agrícola, se analizó la mezcla de suelo Limo Arena a través de 
Espectrometría de Infrarrojo (FTIR) inoculado con bacterias presentes en suelo, 
para conocer las cualidades orgánicas del suelo para su uso en el sector agrícola. 
Para comenzar, se realizó una dilución de suelo en agua destilada en relación 1:10, 
luego, por medio de la técnica de diluciones consecutivas, se sembraron placas a 
distintos factores de dilución, tomando una alícuota de 50 µL se inocularon en 
Placas Petri con los medios de cultivo; PDA, medio Extracto de Suelo, Martin y 
Czapek, y también en tubos de NFB semisólido, se dejaron incubar por 48 horas a 
28°C. Después se seleccionan colonias bacterianas crecidas en los diferentes 
medios de cultivo, las bacterias son elegidas dependiendo de su morfología colonial. 
Por medio de estría cruzada se resembraron estas bacterias en cajas Petri en medio 
de PDA bajo las mismas condiciones de incubación. Haciendo elección de dos 
colonias bacterianas desconocidas llamadas X1 y X2. También se cultivan en medio 
Hugh & Leifson, BDK y D1M, por 24 horas a 28°C, esto con la finalidad de conocer 
el género taxonómico de bacterias. Posteriormente se observaron bajo el 
microscopio en búsqueda de sus características microscópicas morfológicas. 
 
 
 
3 
 
 
ÍNDICE 
 
RESUMEN .............................................................................................................. 2 
INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 5 
FACTORES ABIÓTICOS ........................................................................................ 8 
SUELO................................................................................................................. 8 
PH DE SUELOS ................................................................................................ 12 
FACTORES BIÓTICOS ......................................................................................... 14 
NICHO ECOLÓGICO ........................................................................................ 14 
RIZOSFERA ...................................................................................................... 15 
CONSORCIOS MICROBIANOS ........................................................................ 16 
PROBLEMÁTICA .................................................................................................. 18 
JUSTIFICACIÓN ................................................................................................... 19 
HIPÓTESIS ........................................................................................................... 19 
OBJETIVO GENERAL .......................................................................................... 19 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 19 
MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 20 
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ....................................................... 20 
ESPECTROMETRÍA DE INFRARROJO (FTIR) ................................................ 22 
METODOLOGÍA .................................................................................................... 25 
OBTENCIÓN DE MICROORGANISMOS DEL SUELO ..................................... 26 
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA ESPECTROMETRÍA ......................... 27 
ANÁLISIS DE COLONIAS BACTERIANAS SELECCIONADAS ........................ 28 
RESULTADOS ...................................................................................................... 31 
MICROORGANISMOS PRESENTES EN EL LIMO ARENA ............................. 31 
SELECCIÓN DE COLONIAS BACTERIAS ....................................................... 34 
ESPECTROSCOPÍA FTIR ................................................................................. 36 
ANALISIS DE COLONIAS BACTERIANAS SELECCIONADAS ........................ 42 
DISCUSIÓN DE RESULTADOS ........................................................................... 52 
CONCLUSIONES .................................................................................................. 53 
ANEXOS ............................................................................................................... 54 
 
 
4 
 
REFERENCIAS ..................................................................................................... 55 
 
 
 
 
 
5 
 
 
INTRODUCCIÓN 
 
Actualmente es necesario el estudio de suelos agrícolas, enfocando los 
análisis a los factores bióticos y abióticos asociados al óptimo desarrollo de las 
plantas. La importancia de esto radica en la obtención de recursos agrícolas sanos 
utilizando una cantidad optima de nutrientes como el agua, carbono orgánico 
disponible y compuestos nitrogenados. 
Existe un reconocimiento generalizado de que el planeta Tierra ha entrado 
en una nueva época geológica, el Antropoceno, debido al significativo impacto 
global que las actividades humanas han tenido sobre los ecosistemas terrestres 
como la extinción masiva de especies del Holoceno. (Crutzen, 2006) El Antropoceno 
está marcado por los efectos sin precedentes de una sola especie, el Homo sapiens, 
en la composición física, química y biológica de nuestro planeta. El alcance global 
de las empresas humanas extiende estos efectos a todos los ecosistemas, desde 
la atmósfera superior hasta las profundidades del mar. Se sugiere que las redes 
alimentarias proporcionan un medio conceptual útil en el que se pueden mapear las 
consecuencias ecológicas de tales cambios ambientales, identificar las lagunas de 
conocimiento y generar predicciones. Además, la teoría de la red alimentaria ofrece 
una comprensión de las cadenas de interacción potencialmente complejas que 
podrían generar las intervenciones humanas. (Worm B. &., 2016). 
El concepto clave de la teoría de la red alimentaria es que una sola especie 
puede tener en la dinámica de la red alimentaria, la biodiversidad y el 
funcionamiento del ecosistema. También ha revelado los efectos de las acciones 
mecanicistas sobre las cadenas de interacción que se transmiten a otras especies. 
Cabe mencionar que una especie clave de define como una especie que produce 
un efecto desproporcionado sobre su medio ambiente en relación con su 
abundancia poblacional. (Paine, 1995) Las especies clave se pueden comparar con 
los nodos de una red eléctrica: cuando se elimina un solo nodo, las luces se apagan 
en diferentes distritos; este argumento también se ha utilizado en la conservación 
para motivar la protección especial de las especies clave del medio ambiente. 
(Worm B. &., 2016) 
En los últimos años, muchos ecologistas han cambiado su enfoque hacia los 
patrones agregados de la estructura de la comunidad ambiental, como la biomasa 
y la diversidad, así como su relación con funciones como la productividad y el ciclo 
de nutrientes. La macroecología ha surgido como un subcampo dominante 
orientado al estudio de las relaciones con el objetivo de comprenderpatrones 
generales del paisaje aparentemente caótico de la diversidad biológica local. (Worm 
B. &., 2016) 
 
 
6 
 
Un aspecto particular de las cadenas de interacción es el rol hiperclave del 
ser humano, caracterizado por impactar de forma trascendente múltiples especies 
clave en diferentes hábitats. Este es solo uno de los limitados roles ecológicos que 
desempeñan los humanos en el Antropoceno, que debe complementarse con otras 
perspectivas. Sin embargo, estamos convencidos de que el concepto clave de la 
teoría de la red alimentaria, aplicada a los impactos humanos en diversas redes 
alimentarias, producirá importantes avances en los conocimientos sobre nuestra 
ecología y lugar colectivo en la naturaleza. (Worm B. &., 2016) 
Actualmente, la agricultura convencional y sus prácticas se presentan como 
una gran amenaza para la viabilidad del suelo, provocando la alteración de la 
diversidad funcional microbiana, y con ello la degradación del suelo a nivel mundial, 
amenazando la cadena alimentaria y la inocuidad. La intensificación de la agricultura 
es producto del uso excesivo y, en ocasiones, inapropiado de plaguicidas químicos 
ha provocado la vitalidad de la tierra y la contaminación ambiental en varios 
agroecosistemas como cuerpos de agua, provocando la pérdida de biodiversidad al 
evitar el desarrollo de plantas, animales, insectos, ecosistemas acuáticos y otros 
tipos de vida silvestre, e inclusive llegando a afectar la salud de trabajadores 
agrícolas y consumidores. (Aguilar-Paredes, 2020) 
La agricultura intensiva bajo cubiertas plásticas afecta profundamente la 
calidad del suelo ya que altera profundamente el ciclo del agua, así como el 
contenido de carbono orgánico disponible (C) y otros nutrientes indispensables. Por 
un lado, la precipitación natural se restringe bajo túneles de plástico, aumentando 
la salinidad del suelo en las capas superiores. Asimismo, la acidificación del suelo 
provocada por la aplicación excesiva de minerales y nutrientes, frecuentemente 
utilizados bajo dichos cobertores plásticos, aumenta el efecto negativo sobre la 
calidad del suelo a lo largo del tiempo, repercutiendo el rendimiento de los cultivos. 
Además, la labranza intensiva cambia la relación carbono-nitrógeno (C/N) debido a 
la pérdida de materia orgánica del suelo por erosión y lixiviación, lo que provoca la 
degradación del suelo. Sin embargo, aún existe un gran potencial en los suelos, lo 
que requiere adoptar estrategias sostenibles que los protejan de prácticas agrícolas 
nocivas. (Aguilar-Paredes, 2020) 
Existen múltiples estrategias para abordar la agricultura sostenible y la 
alimentación de las personas mediante la reducción de los impactos ambientales, 
se ha informado ampliamente que la promoción de prácticas agrícolas que 
aumentan la biodiversidad microbiana del suelo, como la agricultura orgánica o 
agroecológica que representan una importante alternativa para la obtención de 
alimentos de buena calidad y mejoras en los aspectos ambientales, económicos y 
sociales. (Aguilar-Paredes, 2020) El aumento de la biodiversidad microbiana 
estabiliza el funcionamiento de los agroecosistemas y aumenta la resiliencia al 
cambio climático. Desde la antigüedad, los microorganismos han estado presentes 
en asociación con plantas y animales, otorgándoles múltiples beneficios en un 
equilibrio dinámico, lo que ha sido atribuido a múltiples sistemas de comunicación, 
 
 
7 
 
entre ellos se encuentran las interacciones químicas a nivel de la rizosfera. Estos 
sistemas de comunicación son fundamentales en el ecosistema agrícola, ya que 
regulan todos los procesos biogeoquímicos en el suelo, manteniendo su fertilidad y 
salud. Estos procesos incluyen la descomposición, el ciclo de nutrientes, el 
mantenimiento de la materia orgánica, el control de patógenos, la degradación de 
contaminantes y la reducción de gases de efecto invernadero (GEI), que afectan 
directamente tanto la productividad de los cultivos como la calidad ambiental. 
(Aguilar-Paredes, 2020) 
Para poder beneficiarse del enorme potencial del microbioma del suelo, es 
necesario conocer la distribución y composición de las comunidades microbianas 
en diferentes territorios y escalas temporales, como las variaciones estacionales. 
Esta información también permite prevenir los cambios que se pueden generar en 
un escenario de cambio climático global debido a que existen comunidades 
microbianas presentes en el suelo que fijan carbono atmosférico variando así la 
concentración de Carbono orgánico disponible. Además, el desconocer los efectos 
de la pérdida de diversidad en lugares y tiempos específicos, puede generar un gran 
impacto en la sustentabilidad de los ecosistemas y por ende en el bienestar humano. 
Cuanto mayor sea la diversidad de microorganismos en el suelo, mayor será la 
funcionalidad de ese suelo, lo que a su vez se traduce en alimentos con una mayor 
calidad nutricional y salud del suelo. (Aguilar-Paredes, 2020) 
Las PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria) son un grupo diverso de 
bacterias que colonizan la rizosfera vegetal, mostrando un impacto positivo en el 
medio ambiente. Las especies bacterianas más ampliamente reportadas son de los 
géneros Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus, Acetobacter, Azospirillum, 
Paenibacillus, Serratia, Burkholderia, Herbaspirillum y Rhodococcus. Las 
interacciones entre la planta y PGPR son sinérgicas, lo que genera beneficios 
relevantes tanto para los cultivos de plantas como para el microbioma de la planta. 
Por un lado, la planta promueve el establecimiento de PGPR a través de la 
producción de sustancias de almacenamiento, como carbohidratos, ácidos 
orgánicos y minerales, así como la producción de exudados de raíces, que son 
utilizados por la PGPR para la nutrición o como una herramienta para establecer 
interacciones simbióticas, como la nodulación de micorrizas o fijadora de nitrógeno. 
El establecimiento puede ser endófito, dando lugar a la colonización de las 
estructuras internas de la planta, incluidas las semillas, la colonización de los 
espacios intercelulares de la planta; el establecimiento puede involucrar también a 
las células bacterianas de vida libre en la rizosfera. (Aguilar-Paredes, 2020) 
Los factores del ambiente que inciden sobre la vida de los organismos 
pueden dividirse en abióticos y bióticos, pero también pueden clasificarse como 
recursos y reguladores. Los recursos son aquellos factores del ambiente que son 
consumidos o utilizados directamente por los organismos, que al así hacerlo 
disminuyen su disponibilidad para el resto. Los reguladores son aquellos factores 
que regulan la forma en que son utilizados los recursos. Los límites de tolerancia de 
 
 
8 
 
un organismo a estos factores ambientales abarcan un rango dentro de los que el 
organismo puede vivir y reproducirse. (Fernández, 2005) 
 
FACTORES ABIÓTICOS 
 
En biología y ecología, los factores o componentes abióticos son los 
componentes químicos y físicos sin vida del medio ambiente que afectan a los 
organismos vivos y al funcionamiento de los ecosistemas. Son los factores inertes: 
climático y geológico presentes en el medioambiente. (Chapin, III, F. Stuart, 2011., 
Dolores M., 2003) 
Entre los factores abióticos más importantes podemos encontrar se dividen 
en factores físicos y químicos (Calixto, F. et al, 2008, Hogan, C. Benito, 2010): 
Factores Físicos: luz, radiación solar, presión atmosférica, ondas sonoras, 
temperatura y relieve. (Chapin, III, F. Stuart, 2011., Dolores M., 2003) 
Factores Químicos: composición del aire, calidad del agua, el pH del suelo, 
la humedad del suelo y aire, y los diferentes nutrientes orgánicos e inorgánicos. 
(Chapin, III, F. Stuart, 2011., Dolores M., 2003) 
 
SUELO 
 
El suelo está constituido por una matriz sólida de materiales orgánicos e 
inorgánicos que ocupa alrededor de la mitad de su volumen total, la otra mitad está 
ocupada por espacios llamados poros que, a su vez, pueden contener agua y aire 
endistintas proporciones. Una característica de la matriz sólida que determina 
muchas de las propiedades físicas de los suelos es su distribución de tamaños de 
partículas, también llamada granulometría o textura. Informalmente, a los suelos en 
los que predominan las partículas pequeñas se les conoce como suelos de textura 
fina, y aquellos de textura más gruesa que poseen las partículas de mayor tamaño. 
Las partículas sólidas que generalmente presentan una gradación de tamaños 
desde unos pocos nanómetros (nm; 10-9 m) hasta varios milímetros, se clasifican 
en uno de los sistemas más usados en tres tipos: arena (0,05 a 2 mm de diámetro), 
limo (2 a 50 µm), y arcilla (menos de 2 µm). Los suelos, a su vez, se clasifican en 
clases texturales de acuerdo con qué proporción contengan de cada una de las tres 
fracciones mencionadas (por ejemplo: suelo limo-arcilloso). (Fernández, 2005) 
La distribución de tamaño de partículas es tan importante como su tamaño 
promedio, una de las razones para esto, y la más importante desde el punto de vista 
de la oferta de agua, es que el tamaño de las partículas determina el tamaño de los 
espacios entre ellas, y por lo tanto la textura determina la distribución de tamaños 
 
 
9 
 
de los poros. Una aproximación simplificada a esa distribución, con resultados 
empíricos adecuados, es la usada por CAMPBELL (1985), quien desarrolló un 
análisis completo de las relaciones hídricas basado en el supuesto de que el tamaño 
de las partículas del suelo sigue una distribución logarítmica normal. (Fernández, 
2005) 
 
Textura de suelo agrícola 
 
Resultan particularmente importantes los factores de tipo abiótico 
relacionados con la oferta de recursos del sustrato, de los cuales el agua juega un 
papel central. El balance de agua de una parcela depende de cuánta agua de las 
precipitaciones se filtra, cómo se redistribuye dentro del perfil, cuánta se pierde por 
drenaje profundo, y cuánta se evapora a la atmósfera directamente desde la 
superficie del suelo o a través de la transpiración de las plantas. El tamaño de 
partículas del suelo (su “textura”) influye fuerte y directamente sobre todos estos 
factores. A través de una combinación de efectos estáticos y dinámicos, impone 
restricciones físicas al almacenaje y movimiento del agua en el suelo y, por lo tanto, 
a la oferta para la vegetación. (Fernández, 2005) 
 
Figura 1. Fotografías de la mezcla de suela Limo Arena. 
 
La textura tiene influencia directa e indirecta sobre muchos aspectos 
importantes para la vegetación, siendo un factor de selección en todos los 
 
 
10 
 
ambientes, y no sólo en aquellos en que es extremo y crónico, como las zonas 
áridas. (Fernández, 2005) 
Macro y Micronutrientes 
El contenido en nutrientes de los suelos de cultivo depende tanto del material 
de partida, como de los aportes de fertilizantes, sin olvidar la posible acción de la 
contaminación atmosférica, que puede fomentar incrementos significativos de la 
concentración de determinados elementos en zonas con cantidades importantes de 
deposición por vía húmeda y/o seca. Las raíces de las plantas absorben nutrientes 
de la solución del suelo y, como consecuencia, para mantener el equilibrio entre la 
fase sólida y líquida se produce la desorción o disolución desde la fase sólida, pero 
no toda la cantidad de un elemento existente en la fase sólida del suelo puede ser 
transferido a la solución. Esencialmente, los factores que afectan a la disponibilidad 
de nutrientes son el pH, el contenido en materia orgánica, textura y potencial redox. 
(Ulloa Guitián, 2001) 
Los nutrientes del suelo se pueden encontrar en 5 fracciones o estados: 
soluble, intercambiable, asociados a la materia orgánica, asociados a óxidos, 
asociados a minerales primarios y secundarios. También, la fracción más lábil, en 
la que se encuentra la porción de un elemento asimilable, a corto y mediano plazo 
está formada por los tres primeros estados: soluble, intercambiable y asociada a la 
materia orgánica. Por tanto, el contenido total de un nutriente en un suelo no 
equivale a la cantidad que está disponible para la planta. (Ulloa Guitián, 2001) 
El nitrógeno representa el 78% de los gases que componen la atmósfera; sin 
embargo, esta fuente no se encuentra disponible para las plantas La principal fuente 
de este elemento para las plantas la constituye la materia orgánica del suelo (MOS), 
la cual es oxidada por los microorganismos del suelo para liberar el nitrógeno. Sin 
embargo, en suelos con poca cantidad de MOS, este proceso no proporciona a los 
cultivos cantidades suficientes de nitrógeno inorgánico, por lo que la fijación de 
nitrógeno adquiere una gran importancia como fuente de nitrógeno adicional. 
(Philippot & Germon 2005). 
La fijación biológica de nitrógeno provee la mayor fuente externa de nitrógeno 
para los diferentes ecosistemas. Este proceso es responsable del 65% de la fijación 
anual, mientras que los procesos industriales solamente representan el 25%. La 
fijación biológica de nitrógeno se lleva a cabo exclusivamente por procariontes que 
tienen la capacidad de reducir el nitrógeno atmosférico N2, a amonio (NH4), que 
puede ser utilizado por las plantas, contribuyendo a la mejora y productividad de los 
cultivos. Por tanto, cualquier deficiencia en los compuestos nitrogenados orgánicos 
e inorgánicos del suelo estimula la fijación microbiana de N2. (Dilly O. et al. 2004, 
Kuiper I. et al. 2004, Mantilla P. et al. 2009, Philippot & Germon. 2005) 
 
 
 
11 
 
 
 
 
12 
 
 
PH DE SUELOS 
 
El análisis del suelo es una herramienta bastante eficaz para evaluar el nivel 
de fertilidad de este, permitiendo efectuar pronósticos las necesidades de abono y 
siendo uno de los principales criterios para diagnosticar la acidez del suelo. (Ulloa 
Guitián, 2001) 
Para entender la acidez del suelo se tiene que comprender que los ácidos 
son sustancias químicas que en solución acuosa liberan iones de hidrógeno [H+], 
los cationes de hidrogeno nunca se encuentran de manera individual en la 
naturaleza, estos usualmente se combinan con el agua formando el ion Hidronio 
(H3O+). (Scheid A., 2005) 
El ácido de Brønsted-Lowry HA, se puede describir según la siguiente 
reacción en solución acuosa: [𝐻𝐴] 𝑆𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑎𝑐𝑢𝑜𝑠𝑎→ [𝐻+] + [𝐴−] 
Se disocia en el catión [H+] y el anión [A-]. Los ácidos fuertes se disocian 
completamente. Existen ácidos débiles, que se asemejan más a los problemas de 
acidez presentes en los suelos, se disocian muy poco en condiciones normales de 
temperatura y presión, y debido a la baja disociación de estos ácidos débiles, se 
presentan concentraciones bajas de H+ en soluciones acuosas. Por lo que, en la 
naturaleza, usualmente se encontrarán problemas con este tipo de ácidos y sus 
respectivas disociaciones. (Scheid A., 2005) 
El concepto de pH representa la concentración de iones de hidrogeno [H+] y 
es expresada por la siguiente equivalencia: 𝑝𝐻 = −log ([𝐻+]) 
Los suelos pueden ser ácidos por naturaleza debido a la propia pobreza del 
material base (roca), o a procesos de formación que favorecen la disminución de 
elementos básicos como K, Ca, Mg, Na, etc., como ocurre con la sobreexplotación 
de suelos agrícolas. Además, la acidez de los suelos puede aumentar debido a 
cultivos y/o fertilizantes químicos que conducen a dicho proceso. (Scheid A., 2005) 
En cualquier caso, la acidificación comienza, o aumenta, debido a la eliminación de 
bases de la superficie de los coloides del suelo. Hay dos formas principales de 
acidificación del suelo: 
El primero se produce de forma natural por la disociación del dióxido de 
carbono en presencia de agua y a pH mayor a 5,2: 𝐶𝑂2(𝑔) + 𝐻2𝑂 𝑝𝐻>5,2→ 𝐻+ + 𝐻𝐶𝑂3− 
 
 
13 
 
Lo que produce iones de hidrogeno H+ que se transfiere a la fase sólida del 
suelo y se libera un catión intercambiable como el Ca+ o Mg+, que se lixiviará con 
el bicarbonato. Este fenómeno se ve favorecido a valores de pH elevados (básico),siendo menos favorecido a pH ácido (inexpresivo a pH < 5,2). Por lo tanto, en suelos 
muy ácidos no es tan probable la acidificación por bicarbonato. (Scheid A., 2005) 
La segunda causa de acidificación la provocan algunos fertilizantes, 
especialmente los que contienen amoníaco y urea, que durante su transformación 
en el suelo (por las redes metabólicas de microorganismos), dan como resultado un 
aumento en la concentración de protones [H+] en el sustrato: 
Amoniaco: 2(NH4 +) + 3 O2 → 2(NO2 −) + 2H2O + 4H+ 
Urea: (CO−) (NH4 +)2 + 2H2O → (NH4 +)2 (CO3 −) 
El H+ producido libera un catión intercambiable en la disolución del suelo, 
que se lixiviará con el anión que lo acompaña, intensificando la acidificación del 
suelo. (Scheid A., 2005) 
La hidrólisis del aluminio es la tercera causa de acidificación, que produce 
iones H+, según la reacción: Al+3 + 3H2O → Al+3(OH−)3 + 3H+ 
La acidez intercambiable se refiere a los iones de H+ y Al3+ que son retenidos 
en la superficie de los coloides por fuerzas electrostáticas (iónicas). La acidez no 
intercambiable está representada por hidrógeno enlazado covalentemente con otros 
compuestos coloides con carga negativa variable y compuestos de aluminio (como 
los hidróxidos o amoniaco). La acidez potencial corresponde a la suma de la acidez 
intercambiable y la acidez no intercambiable del suelo. (Scheid A., 2005) 
Los carbonatos reaccionan con el hidrógeno en el suelo, liberando agua y 
dióxido de carbono. El hidróxido de aluminio es insoluble en agua por lo que se 
precipita. (Scheid A., 2005) 
El aluminio en estado iónico es capaz de atravesar la membrana plasmática 
a través de los poros hidrófilos o por los canales de proteínas alcanzando el interior 
de la célula. El ápice radicular es importante en cuanto a la respuesta a la toxicidad 
por Al+3, pues es aquí donde se acumula en gran parte, además de ser el principal 
punto donde se tiene la exudación de ácidos orgánicos como mecanismo de 
tolerancia y el lugar donde se forma calosa como respuesta de la sensibilidad al 
aluminio. El apoplasto (espacio libre entre células) es el primer compartimento de la 
raíz que está en contacto con el aluminio, además de ser la zona de mayor 
acumulación, sobre todo en la matriz de pectina. El aluminio dentro de la raíz tiene 
afinidad por componentes de la pared celular, lo cual altera sus propiedades 
mecánicas, y por ende afecta la elongación de las células. (Horst, Wang, & Eticha, 
2010) 
 
 
14 
 
En el caso de correctores de la acidez del suelo distintos a las obtenidas de 
rocas calizas como la cal viva (CaO) y la cal hidratada Ca(OH)2, que son bases 
químicamente fuertes, el mecanismo de neutralización de la acidez del suelo se 
basa en la reacción de compuestos hidroxilo (OH-) con los iones de (H+). (Scheid 
A., 2005) El encalado es una técnica de preparación del suelo para cultivos 
agrícolas en la cual se aplica piedra caliza molida (CaCO3, MgCO3 y otros 
carbonatos) con el objetivo de aumentar los niveles de calcio y magnesio, neutralizar 
el aluminio trivalente y corregir el pH del suelo, para un desarrollo satisfactorio de 
los cultivos. (Scheid A., 2005) 
 
 
FACTORES BIÓTICOS 
 
Los factores bióticos son los organismos vivos que influyen en la forma de un 
ecosistema, se pueden referir a la flora, y la fauna de un lugar y las interacciones 
entre cada organismo vivo. Los individuos deben tener comportamiento y 
características fisiológicas específicas que permitan su supervivencia y su 
reproducción en un ambiente definido. La condición de compartir un ambiente 
generando competencia u otros tipos de interacciones entre las especies y dentro 
de cada especie, esto provocado por el alimento, el espacio o territorio, 
reproducción, etc. Como consecuencia se modifican las poblaciones de las 
especies. (Dolores M., 2003) 
Los miembros de la cadena trófica son factores bióticos que incluyen: 
1. Productores o autótrofos, organismos capaces de fabricar o sintetizar sus 
propios alimentos a partir de sustancias inorgánicas como dióxido de 
carbono, agua y sales minerales. Las plantas son seres autótrofos. 
2. Consumidores o heterótrofos, organismos incapaces de producir su alimento, 
por ello lo ingieren ya sintetizado. Los animales son seres consumidores. 
3. Descomponedores, organismos que se alimentan de materia orgánica en 
descomposición. Entre ellos están los hongos y las bacterias. 
 
NICHO ECOLÓGICO 
 
En Ecología se desarrolló un concepto que integra los límites de tolerancia y 
la multi-factorialidad del ambiente: el nicho ecológico. Una población determinada 
puede mantenerse en el tiempo o crecer sólo dentro de una combinación finita de 
rangos de muchos parámetros ambientales. El nicho ecológico de una población 
comprende todas las combinaciones de factores ambientales dentro de las cuales 
 
 
15 
 
la población puede perpetuarse. El nicho ecológico no es un lugar ni un grupo de 
lugares concretos. Distintas localidades (hábitats) presentarán determinadas 
condiciones ambientales que pueden estar o no incluidas en el nicho de una 
población dada. Es posible que ciertos individuos de la población sean incapaces 
de reproducirse bajo una determinada combinación de factores ambientales; pero 
si pueden hacerlo otros miembros de la misma población, esta combinación de 
factores estará dentro del nicho. (Fernández, 2005) 
El concepto de nicho es útil para entender las interacciones entre 
organismos. Por ejemplo, cuanto mayor sea la superposición de nichos de dos 
especies, potencialmente mayor será la intensidad de la competencia entre ellas. 
(Fernández, 2005) 
 
RIZOSFERA 
 
La rizosfera comprende la región del suelo ocupada por las raíces de las 
plantas, donde crece una comunidad microbiológica diversa y dinámica, cuya 
actividad se vincula con distintos procesos relacionados con el agua, nutrición 
mineral, intercambio de cationes y producción de exudados, entre muchos otros, 
que la hacen diferente del resto del suelo en sus propiedades físicas, químicas y 
biológicas. Un ejemplo de ello es el pH o potencial de iones hidrógeno, que en la 
rizosfera es más ácido por el intercambio catiónico y por la producción de ácidos 
orgánicos, el potencial de agua también cambia y es menor, así como la presión 
parcial de oxígeno, la actividad respiratoria permite acumular más di óxido de 
carbono y de carbohidratos solubles procedentes de exudados de las raíces. 
(Jaramillo, 2011) 
Estas condiciones favorecen el crecimiento de microorganismos por gramo 
de suelo, que es dos o tres veces mayor que en el suelo que no es parte de la 
rizosfera. La disponibilidad de nutrimentos se ve influenciada por las raíces y en 
consecuencia la microflora compuesta principalmente por bacterias, actinomicetos, 
hongos y algas que es dinámica y cambia cualitativa y cuantitativamente, 
repercutiendo de diferente forma en el crecimiento de las plantas y de otros 
microorganismos del suelo, entre ellos la microfauna (protozoarios y nematodos) y 
la mesofauna, donde los ácaros juegan un papel importante. (Jaramillo, 2011) 
En general, los microorganismos del suelo influyen en la rizosfera alterando 
el ciclo y la disponibilidad de nutrientes, pero estos mecanismos también podrían 
influir en la disponibilidad de elementos traza que no son nutrientes. (Alford, 2010) 
Las bacterias de la rizosfera que mejoran el crecimiento de las plantas se 
conocen como rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (por sus 
siglas en ingles PGPR). Las PGPR puede aumentar el crecimiento de las raíces al 
 
 
16 
 
restringir la acumulación de etileno en la rizosfera, lo que inhibe el crecimiento de 
las plantas; el mecanismo bacteriano involucra la actividad de la ACC desaminasa. 
Además, algunas bacterias producen reguladores del crecimiento de las plantas que 
provocan el alargamiento de las células de la raíz, como el ácido indol-3-acético 
(IAA, una auxina). (Alford, 2010) 
Otra interacción PGPR altamente especializadaocurre donde el crecimiento 
de leguminosas es incrementado por bacterias simbióticas de nódulos de raíz. 
Aunque estas bacterias tienen el mayor efecto sobre las leguminosas cuando las 
bacterias infectan las plantas y viven dentro del nódulo de la planta, los rizobios 
también viven en la rizosfera. (Alford, 2010) 
Los microorganismos tienen la capacidad de mejorar la solubilidad de los 
elementos traza en la rizosfera y, por lo tanto, pueden afectar la hiperacumulación. 
De hecho, se describió una mayor producción de ácido y solubilidad de metales en 
presencia de bacterias de la rizosfera de plantas hiperacumuladoras. Además de 
los ácidos, las bacterias pueden producir otros exudados que solubilizan los 
metales. (Alford, 2010) 
 
CONSORCIOS MICROBIANOS 
 
Un consorcio o comunidad microbianos son dos o más grupos bacterianos o 
microbianos que viven simbióticamente. Los consorcios pueden ser 
endosimbióticos o ectosimbióticos, o en ocasiones pueden ser ambos. (Madigan, 
Bender, Buckley, Sattley, & Stahl, 2019) Dado el papel fundamental de las 
comunidades microbianas en el ciclo biogeoquímico, las respuestas al cambio 
climático podrían tener repercusiones en la estructura del ecosistema y 
retroalimentaciones al sistema climático. Con tiempos de generación relativamente 
cortos y un crecimiento rápido en condiciones favorables, las comunidades 
microbianas podrían estar entre los componentes más rápidos de un ecosistema 
para responder a las condiciones ambientales cambiantes. (Cruz-Martínez, 2009) 
Hasta la fecha, la enorme diversidad de comunidades microbianas del suelo 
ha impedido su caracterización integral y ha limitado nuestra comprensión de los 
efectos climáticos a amplias agrupaciones funcionales o taxonómicas en una 
comunidad o subconjuntos específicos dentro de una comunidad. Las comunidades 
de plantas y microbios son impulsores mutuos potencialmente poderosos en la 
respuesta de los ecosistemas terrestres al cambio global, aunque las asociaciones 
entre ellos no se comprenden bien. Con un enfoque combinado sobre el suelo y 
bajo tierra, basado en el campo, examinamos la magnitud de la respuesta en cada 
uno a un cambio compartido en las condiciones ambientales. (Cruz-Martínez, 2009) 
 
 
17 
 
Los microbios del suelo son proveedores clave de servicios ecosistémicos e 
impulsan procesos multifuncionales, que abarcan la interacción de diferentes 
comunidades microbianas y la interacción de estas con los demás componentes de 
la biota del suelo, es decir, la microfauna y la mesofauna. Dentro de esta compleja 
red interconectada, los microorganismos son los encargados de mantener los flujos 
de energía que sustentan todo el ecosistema, a través de la recirculación de los 
recursos disponibles. Sin embargo, otros organismos forman grupos ecológicos en 
el mismo ambiente y comparten una alta multifuncionalidad en el ecosistema. La 
microfauna del suelo es fundamental para la funcionalidad del ecosistema y 
cualquier cambio en estos organismos clave puede producir cambios a nivel vegetal, 
de bioma y microbiano. (Aguilar-Paredes, 2020) 
Los grupos de microorganismos más relevantes en el suelo son los hongos 
micorrízicos arbusculares y las bacterias promotoras del crecimiento vegetal. Estos 
microorganismos juntos aumentan la fijación y absorción de N2, solubilizan P, 
convierten el amonio (que puede unirse químicamente a las partículas de arcilla) en 
nitrato soluble y fácilmente asimilable, protegen de otros microorganismos 
patógenos e incluso remedian los suelos contaminados. (Aguilar-Paredes, 2020) 
Los consorcios (hongos y bacterias) tienen múltiples aplicaciones a la 
agricultura sustentable que han sido reportadas para permitir una mayor absorción 
de nutrientes y biocontrol de patógenos, dependiendo de prácticas agrícolas que 
permitan su mantenimiento, como prácticas como la labranza nula o escasa; uso de 
coberturas de cultivos diversos e idealmente nativos; uso de enmiendas orgánicas 
como compost; reducción o eliminación de insumos externos, como fertilizantes, 
herbicidas y control de plagas y enfermedades; prácticas que promuevan la 
agroecología; agricultura orgánica y agricultura inteligente para desarrollar una 
regeneración de consorcios microbianos del suelo; y una intensificación ecológica 
de los cultivos. Asimismo, se han detectado diferentes comunidades de hongos del 
suelo que afectan la formación o estabilización del suelo a escala de macro y 
microagregados a través de diferentes mecanismos metabólicos dentro de los 
procesos físicos, bioquímicos y biológicos que llevan a cabo. (Aguilar-Paredes, 
2020) 
Para un mejor desempeño de los agentes de biocontrol de fitopatógenos se 
pueden manejar microbios en consorcio en más de dos especies o cepas de una 
misma especie. Así se ha reportado para el control de patógenos causantes de la 
pudrición de la papaya en donde se probó con éxito un consorcio de cuatro especies 
de bacterias de los géneros Serratia, Enterobacter y Rahnella, o en mijo perla 
Pennisetum glaucum para el combate de hongos patógenos de la raíz mediante 
consorcio de tres cepas de Bacillus spp. De manera similar, se ha demostrado que, 
en maíz, la aplicación de bacterias benéficas de los géneros Bacillus y 
Pseudomonas en consorcio de dos y de tres cepas, se incrementa el efecto positivo 
sobre la promoción del crecimiento de la planta (Mayorga, 2020) 
 
 
18 
 
 
PROBLEMÁTICA 
 
La obtención de suelos agrícolas es fundamental para el desarrollo de las 
civilizaciones humanas, se busca que los suelos agrícolas sean óptimos para 
diversos cultivos, este análisis es posible gracias al análisis sistemático de los 
factores bióticos y abióticos del suelo. 
La presencia de deficiencias de nutrientes en cultivos y sobre diferentes tipos 
de suelos, ha potenciado el análisis de la disponibilidad de micronutrientes. Los 
problemas de la falta de micronutrientes tienden a agravarse debido, entre otros, a 
los siguientes factores; (a) Existencia de suelos con cantidades bajas de 
micronutrientes presentes debido principalmente a la composición química de las 
rocas que componen al sustrato; (b) Agotamiento de micronutrientes en suelos 
fértiles por el aumento desmedido de la productividad y sobreexplotación del suelo; 
(d) Práctica de encalado mal aplicada, que puede a alterar drásticamente el pH del 
suelo y reduce la disponibilidad de algunos microelementos a excepción de Calcio, 
Magnesio, Fósforo y Molibdeno; (d) Agotamiento de microorganismos esenciales de 
la rizosfera debido al uso desmedido de la labranza del suelo, aplicación de 
fertilizantes químicos y uso incorrecto de agrocultivos que desequilibran las 
condiciones adecuadas para una rizosfera saludable. (Ulloa Guitián, 2001) 
Tras la crisis financiera del 2008, los datos sugieren que los hogares más 
vulnerables antes de la crisis financiera sufrieron un efecto mayor en términos de 
inseguridad alimentaria, lo que puede llevar a profundizar las disparidades sociales 
y de salud. Por lo tanto, las medidas para mitigar el impacto de la crisis entre los 
grupos vulnerables deben abordarse con cuidado en México. (Vilar-Compte, 2015). 
Por esto, es necesario actuar en la presente recesión económica que azota al 
mundo tras la crisis de la pandemia de COVID-19, del año 2019, por lo que sus 
consecuencias en el sector agropecuario se deben de afrontar para evitar 
precisamente que hogares con menos recursos económicos en México sufran de 
inseguridad alimentaria. 
En pleno siglo XXI se debe de pensar en estrategias ecológicas para la 
obtención sostenible de suelos agrícolas fértiles, con un nicho ecológico óptimo para 
el cultivo de diversas plantas del sector agrícola, y se deben de estudiar tanto los 
factores bióticos y como los abióticos del nicho ecológico para el correcto desarrollo 
de la actividad agrícola. 
 
 
 
19 
 
 
JUSTIFICACIÓN 
 
Debido a la necesidad conocer la composición biótica (microorganismos, 
nutrientes y metabolitos) y abiótica (texturadel suelo agrícola). Se deben de estudiar 
las bacterias presentes en el suelo que se pretende utilizar para la agricultura. 
Existiendo una gran variedad de bacterias que se puede encontrar en los suelos, 
algunas bacterias son: benéficas para diversas plantas, patógenas de plantas 
agrícolas, patógenas de animales y patógenas de humanos. A su vez, se buscan 
macronutrientes, micronutrientes y metabolitos secundarios (moléculas orgánicas) 
a través de espectroscopia infrarroja por su facilidad de uso con las muestras y 
como instrumento de análisis cualitativo del sustrato. 
 
HIPÓTESIS 
 
La mezcla de suelo Limo Arena contiene comunidades microbianas 
que afectan la composición bioquímica del suelo. 
 
OBJETIVO GENERAL 
 
Analizar a través de espectrometría de infrarrojo (FTIR) el suelo Limo 
Arena inoculado con bacterias presentes para conocer la composición 
bioquímica. 
 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
Obtener y seleccionar colonias bacterianas que están presentes en la mezcla 
de suelo Limo Arena. 
 
Analizar espectros de infrarrojo del sustrato seco, estéril e inoculado con las 
colonias bacterianas seleccionadas. 
 
Analizar mediante microscopía las colonias bacterianas seleccionadas para 
la identificación del género taxonómico. 
 
 
 
20 
 
 
MARCO TEÓRICO 
 
 
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS 
 
Los microorganismos son organismos ubicuos y en los ambientes naturales 
se encuentran usualmente como poblaciones mixtas, por lo que es necesario 
tenerlos como cultivos puros por medio de aislamientos, para así poder identificarlos 
y caracterizarlos. La preparación de un cultivo puro implica no solo el aislamiento 
de un determinado microorganismo, sino su mantenimiento y el de su descendencia. 
Es importante determinar los diferentes medios de cultivo y condiciones de 
incubación óptimas para cada uno de ellos y así lograr la formación de colonias 
visibles aisladas. (Álvarez, 2017) 
Es posible utilizar diferentes estrategias para el aislamiento e identificación 
de microorganismos: Separación física mediante diluciones seriadas y siembra en; 
utilización de medios de cultivos selectivos y diferenciales y aprovechamiento de 
características particulares de los microorganismos. Para facilitar y mejorar el 
proceso generalmente se combinan estas estrategias. (Álvarez, 2017) 
 
Microorganismos de suelo o tierra 
 
El suelo está constituido por minerales de varios tamaños, formas y 
características químicas, raíces de plantas, población de organismos vivos 
(microorganismos) y materia orgánica en varias etapas de descomposición. Cada 
factor físico y químico del suelo influye en el crecimiento o actividad de los 
microorganismos. (Álvarez, 2017) 
 
Medios de Cultivo 
 
Un medio de crecimiento o medio de cultivo es un sólido, líquido o semisólido 
diseñado para soportar el crecimiento de una población de microorganismos o 
células a través del proceso de proliferación celular o plantas pequeñas. Se utilizan 
diferentes tipos de medios para cultivar diferentes tipos de células. (Ryan KJ, Ray 
CG, 2004) 
 
 
21 
 
Medio Martin: Para el aislamiento selectivo de Neisseria patógena. (J.D. 
Thayer et al., 1966) 
Medio PDA: El agar papa dextrosa y el caldo papa dextrosa son medios de 
cultivo microbiológicos comunes hechos de infusión de papa y dextrosa. El agar 
papa dextrosa (abreviado "PDA") es el medio más utilizado para el cultivo de hongos 
y bacterias. (Harold Eddleman, Ph. D, 1998) 
Medio Czapek: es utilizado para la propagación de hongos y otros 
organismos en un laboratorio. Fue desarrollado para el cultivo de Aspergillus niger 
y Penicillium camemberti. Funciona bien para muchos hongos saprofitos y bacterias 
del suelo, como especies de Aspergillus, Candida, Penicillium y Paecilomyces. 
(Hardy Diagnostics, 2017) 
Medio extracto de suelo: se prepara especialmente con una cantidad 
considerable de la muestra de suelo buscando obtener los micronutrientes 
presentes en el sustrato. (Díaz Ortíz, A. P., 2018) 
Medio D1M: se utiliza para el crecimiento semiselectivo de bacterias del 
género Agrobacterium. (Alippi. et al., 2011) 
Medio BDK: es usado para distinguir pseudomonas fluorescentes de 
pseudomonas no fluorescentes. Este medio es el mejor medio de aislamiento 
general para bacteria las pseudomonas, las fluorescentes producen un pigmento 
amarillo que emite fluorescencia bajo la luz ultravioleta de onda larga (366 nm). 
Algunos aislamientos del grupo P. syringae no emiten fluorescencia. (King, E.O. et 
al, 1954) 
Hugh & Leifson: es un medio al que se pueden añadir varios hidratos de 
carbono para el estudio del metabolismo oxidativo o fermentativo de los 
microorganismos. El medio está destinado a la diferenciación de bacilos 
gramnegativos aislados de muestras clínicas y otros materiales. Las bacterias 
utilizan la glucosa y otros carbohidratos a través de varias vías metabólicas; algunas 
son rutas oxidativas, pero otras involucran reacciones de fermentación. Durante el 
proceso anaeróbico de fermentación, el piruvato se convierte en una variedad de 
ácidos mixtos en alta concentración, según el tipo de fermentación. Ciertas bacterias 
Gram negativas no fermentadoras metabolizan la glucosa mediante la respiración 
aeróbica y, por lo tanto, solo producen una pequeña cantidad de ácidos débiles 
durante la glucólisis y el ciclo de Krebs. El medio completo contendrá una alta 
concentración de carbohidrato con un bajo contenido de peptona para evitar la 
utilización de peptona por un organismo aeróbico y la producción resultante de una 
reacción alcalina que neutralizaría la ligera acidez producida por un organismo 
oxidativo. (Hugh, R., & Leifson, E., 1953) 
 
 
 
22 
 
 
ESPECTROMETRÍA DE INFRARROJO (FTIR) 
 
El interés de la espectroscopia NIR radica en sus ventajas frente a técnicas 
instrumentales alternativas. Por lo tanto, puede registrar espectros para muestras 
sólidas y líquidas sin pretratamiento, implementar metodologías continuas, 
proporcionar espectros rápidamente y predecir parámetros físicos y químicos a 
partir de un solo espectro. Estos atributos lo hacen especialmente atractivo para la 
caracterización directa y rápida de muestras. (Blanco & Villarroya., 2002) 
La región NIR abarca el rango de longitud de onda de 780 a 2500 nm, en el 
que las bandas de absorción corresponden principalmente a sobretonos y 
combinaciones de vibraciones fundamentales. (Blanco & Villarroya., 2002) 
La vibración de las moléculas se puede describir utilizando el modelo del 
oscilador armónico, mediante el cual se puede calcular la energía de los diferentes 
niveles equidistantes a partir de 
𝐸𝑣𝑖𝑏 = (𝜐 + 12) ℎ2𝜋√𝑘µ 
Donde 𝜐 es el número cuántico vibracional, h la constante de Planck, k la 
constante de fuerza y m la masa reducida de los átomos enlazados. Solo son 
posibles aquellas transiciones entre niveles de energía consecutivos (∆𝜐 =±1) que 
provocan un cambio en el momento dipolar, ∆𝐸𝑣𝑖𝑏 = ∆𝐸𝑟𝑎𝑑 = ℎ𝑣 
Donde v es la frecuencia vibratoria fundamental del enlace que produce una 
banda de absorción en la región IR media. Sin embargo, el modelo del oscilador 
armónico no puede explicar el comportamiento de las moléculas reales, ya que no 
tiene en cuenta la repulsión coulombiana entre los átomos ni la disociación de los 
enlaces. Como resultado, el comportamiento de las moléculas se parece más al 
modelo de un oscilador anarmónico, en el que los niveles de energía no están 
igualmente espaciados. Por lo tanto, la diferencia de energía disminuye al aumentar 
la frecuencia v: ∆𝐸𝑣𝑖𝑏 = ℎ𝑣[1 − (2𝑣 + ∆𝑣 + 1)𝑦] 
Donde y es el factor de anarmonía. La anarmonicidad puede resultar en 
transiciones entre estados de energía vibracional donde ∆v=±2, ±3. . .. Estas 
transiciones entre estados vibratorios no contiguos producen bandas de absorción 
conocidas como sobretonos (primer y segundo sobretono, respectivamente) en, 
aproximadamente, múltiplos de la frecuencia vibratoria fundamental. Además, son 
mucho menos probables que las transicionesfundamentales, por lo que las bandas 
 
 
23 
 
son mucho más débiles (la banda del primer sobretono es de 10 - 100 veces más 
débil que la de la frecuencia fundamental, dependiendo del enlace particular). Estas 
bandas aparecen entre 780 nm y 2000 nm, según el orden armónico y la naturaleza 
y fuerza del enlace. (Blanco & Villarroya., 2002) 
En las moléculas poliatómicas, dos o más modos de vibración pueden 
interactuar de tal manera que causen cambios de energía simultáneos y den lugar 
a bandas de absorción denominadas bandas de combinación, cuyas frecuencias 
son las sumas de múltiplos de cada frecuencia de interacción. (Blanco & Villarroya., 
2002) 
La intensidad de las bandas NIR depende del cambio en el momento dipolar 
y la anarmonicidad del enlace. Debido a que el átomo de hidrógeno es el más liviano 
y, por lo tanto, exhibe las vibraciones más grandes y las mayores desviaciones del 
comportamiento armónico, las bandas principales típicamente observadas en la 
región NIR corresponden a enlaces que contienen este y otros átomos livianos (a 
saber, C–H, N–H, O–H y S–H); por el contrario, las bandas para enlaces como C=O, 
C–C y C–Cl son mucho más débiles o incluso están ausentes. (Blanco & Villarroya., 
2002) 
Las interacciones entre los átomos en diferentes moléculas (por ejemplo, los 
enlaces de hidrógeno y las interacciones dipolares) alteran los estados de energía 
vibratoria, cambiando así las bandas de absorción existentes y dando lugar a otras 
nuevas, a través de diferencias en la estructura cristalina. Esto permite distinguir las 
formas de los cristales y determinar las propiedades físicas (como la densidad, la 
viscosidad y el tamaño de las partículas en los sólidos pulverulentos). En otras 
palabras, el espectro NIR contiene no solo información química útil para determinar 
las composiciones, sino también información física que se puede emplear para 
determinar las propiedades físicas de las muestras. (Blanco & Villarroya., 2002) 
 
INSTRUMENTACIÓN DE LA ESPECTROSCOPIA IR 
 
La instrumentación de espectroscopia NIR ha evolucionado dramáticamente 
en respuesta a la necesidad de velocidad en los análisis y flexibilidad para adaptarse 
a diferentes estados de muestra. Los espectrofotómetros utilizados para registrar 
espectros NIR son esencialmente idénticos a los empleados en otras regiones del 
espectro electromagnético. Pero el equipo NIR puede incorporar una variedad de 
dispositivos como lo muestra la figura 1, según las características de la muestra y 
las condiciones y necesidades analíticas particulares (como la velocidad, la 
complejidad de la muestra y las condiciones ambientales), por lo que la técnica es 
muy flexible. (Blanco & Villarroya., 2002) 
 
 
24 
 
 
Figura 2. Principales características de los equipos de espectroscopia NIR. 
Los espectrofotómetros NIR pueden ser de dos tipos con respecto a la 
selección de longitud de onda, a saber, longitud de onda discreta y espectro 
completo. Los primeros son más simples, ya que irradian muestras con solo unas 
pocas longitudes de onda. Como resultado, pueden usarse solo en aplicaciones con 
analitos que absorben en zonas espectrales específicas. (Blanco & Villarroya., 
2002) 
Los instrumentos NIR de espectro completo suelen incluir una rejilla de 
difracción, aunque pueden ser del tipo transformada de Fourier (FT)-NIR. Son 
mucho más flexibles que los instrumentos de longitud de onda discreta, por lo que 
se pueden utilizar en una variedad más amplia de situaciones. (Blanco & Villarroya., 
2002) 
 
 
25 
 
 
METODOLOGÍA 
 
Se comienza con la obtención de la mezcla de suelo Limo Arena que es utilizado 
como sustrato para el crecimiento de plantas, el Limo Arena es solicitado al personal 
del CINVESTAV Unidad Irapuato. Del suelo son pesadas distintas cantidades para 
cada muestra de Limo Arena a trabajar. Todo el material y medios de cultivo 
necesarios para el manejo del Limo Arena y de microorganismos se esterilizaron 
previamente. 
 
Figura 3. Diagrama de flujo que muestra el orden de los eventos del proyecto de 
Análisis de la mezcla de suelo Limo Arena. 
 
La figura 3 muestra el flujograma seguido, partiendo de la mezcla de Limo 
Arena proporcionada por el personal del CINVESTAV unidad Irapuato, se toman y 
se pesan las muestras, por una parte, se separa para esterilizar, otra parte se seca 
y otra es utilizada para diluciones y obtención de microorganismos presentes. Las 
bacterias aisladas son seleccionadas según su morfología colonial para ser 
 
 
26 
 
inoculadas en limo arena estéril. Las bacterias son crecidas en medio de cultivo 
selectivo. 
 
OBTENCIÓN DE MICROORGANISMOS DEL SUELO 
Medios de cultivo 
 
Para el crecimiento de microorganismos presentes en el Limo Arena se 
usaron los siguientes medios de cultivo: PDA (Potato Dextrosa Agar), Martin, NFB, 
Czapek y Medio extracto de suelo. 
 
Dilución de Limo Arena 
Se pesaron 10 g de suelo y se diluyen en 90 mL de agua destilada estéril y 
en frascos previamente esterilizados (Frasco LA). Posteriormente se diluyeron en 
tubos con 9 mL de agua destilada previamente esterilizados y se mezclaron por 
agitación a 3000 rpm por 10 minutos. Luego se tomó 1 mL del frasco LA, después 
se realizaron las diluciones 10 -1, 10 -2 y 10 -3. Luego se inocularon con el instrumento 
Spiral Autoplate 4000 con 50 µL placas Petri con medios PDA, Martín, Czapek y 
Medio extracto de suelo. Se dejó en incubadora a 28 °C por 48 hrs. 
Se realizó la dilución de la mezcla de suelo de Limo Arena Estéril (LAE), se 
pesaron 10 g de suelo estéril y se diluyeron en 100 mL de agua destilada estéril y 
en frascos previamente esterilizados. Se tomó 1 mL del frasco LAE, después se 
realizaron las diluciones 10 -1, 10 -2 y 10 -3. Luego se inocularon con el instrumento 
Spiral Autoplate 4000 con 50 µL las placas Petri con medios PDA, Martín, Czapek 
y Medio extracto de suelo. Se dejó en incubadora a 28 °C por 72 hrs. 
 
Selección de colonias bacterianas en diferentes medios 
 
Se tomaron las colonias de bacterias de significativa morfología colonial, 
figura 4, de los siguientes medios: 
Placa de PDA: Colonia bacteriana de gran tamaño (>3 mm) de color blanco 
crema, brillosa, con bordes irregulares, plana. Colonia bacteriana de tamaño medio 
(<3 mm) de color blanco crema, brillosa, con borde circular, plana. 
Placa con medio Czapek: 2 colonias bacterianas de ~1 mm de tamaño, de 
borde circular, color blanco traslucidas brillosas. 
 
 
27 
 
También se inocularon tubos de medio semisólido de NFB a través una gota 
de 20 µL del frasco de LA, cayendo sobre la superficie del tubo de NFB semisólido, 
figura 4. Se dejó en incubadora a 33 °C por 72 horas. Tubos A y B, figura 10. Luego 
se tomaron las colonias bacterianas de morfología significativa, del tubo de medio 
NFB semisólido, y se toma una asada de las colonias de ~1 mm de tamaño, forma 
circular, color blanco traslucido, creciendo a 20 mm por debajo de la superficie, a 
continuación, se inocularon por medio de estría cruzada en placas Petri de PDA por 
48 horas a 31°C. Caja Petri A de la figura 5. 
Luego estas bacterias se resembraron en placas Petri con medio PDA 
utilizando estría cruzada para obtener colonias bacterianas más diferenciadas, se 
incubaron por 48 hrs a 31°C. De estas cajas de son seleccionadas las colonias de 
bacteria color blanco provenientes de la caja B, con posteriores asilamientos se 
obtienen las bacterias de la caja D, llamada X2, figura 5. 
 
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA ESPECTROMETRÍA 
Muestras de Limo Arena 
 
El Limo Arena se analizará de 3 maneras; Limo Arena Seco (LAS), Limo 
Arena Estéril (LAE) y Limo Arena Inoculado (LAI). 
Muestra Limo Arena Estéril. Se pesan 500 g del suelo. Se esteriliza por 1 
hora a 15 lb en autoclave, tres veces en distintos días. Se pesan 50 g y se colocan 
en una caja Petri. 
Muestra Limo Arena Seco. Se pesan 500 g del suelo. Se seca por 4 horas a 
60°C. Luego se pesan 50 g y se colocan en una placa Petri. 
Muestra Limo ArenaInoculado. Se pesan 1000 g del suelo. Se esteriliza por 
1 hora a 15 lb en autoclave, tres veces en distintos días. Luego se inocula con 50 
mL de las colonias bacterianas crecidas en medio liquido infusión de papa, se deja 
en incubación por 15 días a 28°C.Despues se pesan 50 g y se colocan en una caja 
Petri respectivamente. Obteniendo 2 muestras del Limo arena inoculado: LAIX1 y 
LAIX2. 
 
Preparación de muestras Limo Arena para espectrometría FTIR 
Se utilizan 2 tipos de disolventes para diluir las muestras, se usa como 
disolvente polar Etanol al 99.9% (grado de biología molecular), y como disolvente 
no polar se utiliza Hexano al 98.9%, utilizando una relación 1:1. A partir de las 4 
muestras elaboradas: LAE, LAE y LAIX1 y X2, se toma 1 g de cada muestra, se 
colocan en tubos de ensaye estériles de 10 mL y se diluyen en 1 mL de cada tipo 
 
 
28 
 
disolvente por separado. Obteniendo en total 8 muestras: LAENP (Limo Arena 
Estéril No Polar), LAEP (Limo Arena Estéril Polar), LASNP (Limo Arena Seco No 
Polar), LASP (Limo Arena Seco Polar), LAIX1NP (Limo Arena Inoculado con 
bacterias X1 No Polar), LAIX1P (Limo Arena Inoculado con bacterias X1 Polar), 
LAIX2NP (Limo Arena Inoculado con bacterias X2 No polar) y LAIX2P (Limo Arena 
Inoculado con bacterias X2 Polar). Después se zonificaron las muestras por 20 
minutos a 24 °C de temperatura, a continuación, se transfieren las muestras a tubos 
estériles Eppendorf de 1.5 mL. Posteriormente se centrifugan las muestras a 12000 
rpm por 10 min y se toma el sobrenadante de cada muestra, transfiriéndolas a tubos 
estériles Eppendorf de 1.5 mL. 
 
Espectrometría de Infrarrojo 
 
Las diferentes muestras de Limo Arena se escanean en el Instrumento Cary 
600 Series FTIR Spectrometer de Agilent Technologies, en modo de Transmitancia 
en el rango de 4000 - 500 cm-1. Se miden 32 escaneos de cada muestra y se 
promedian. Tiempo bajo medición del espectrómetro 1 minuto aproximadamente. 
Resolución de 4 cm-1. Las correcciones del ruido de fondo se hacen antes de cada 
escaneo por cada muestra. 
 
ANÁLISIS DE COLONIAS BACTERIANAS SELECCIONADAS 
 
Crecimiento en NFB 
 
Las colonias bacterianas seleccionadas se inocularon por picadura en tubos 
de NFB semisólido (tubos A y B), se incubaron a 31°C. Luego, a través de picadura 
se inocularon en tubos de NFB semisólido las cepas bacterianas X1 y X2, figura 10. 
Después de 14 días de crecimiento a 33°C, las bacterias presentes en el tubo 
de NFB semisólido (tubo A) se inocularon en frascos con 40 mL con NFB líquido. 
Se tomó con un asada de las bacterias que se encontraban formando una campana 
a 20 mm por debajo de la superficie de dicho tubo, colocando 3 réplicas de frascos 
de estas bacterias. Se tomó como control positivo bacterias presentes en parcelas 
agrícolas de la comunidad de San Agustín de los Tordos, del municipio de Irapuato, 
Guanajuato, y que son fijadoras de nitrógeno. Se dejan en incubación a 31°C 
registrando el tiempo cuando ocurrió cambio de color en el medio liquido de NFB. 
Figura 11. 
 
 
 
29 
 
Crecimiento en medios Hugh & Leifson, BDK y D1M 
 
Para el crecimiento de las bacterias seleccionadas se utilizan los medios 
Hugh & Leifson, BDK y D1M. 
Se inocularon por medio de estría cruzada las colonias X1 y X2 en Cajas Petri 
en los medios BDK y D1M, incubados por 72 hrs a 31°C. Posteriormente se analizan 
las cajas de BDK bajo luz ultravioleta. Figura 12. 
Se prepara el medio Hugh & Leifson para la prueba bioquímica, es preparado 
y vaciado en tubos de ensaye estériles de 10 mL. Se inoculan con las cepas 
bacterianas X1 y X2, se incuban por 72 horas a 33°C. Figura 13. 
 
Conteo de Unidades Formadoras de Colonias 
 
Se preparó medio líquido de infusión de papa en matraces de 250 mL, se 
colocaron 50 mL del medio líquido para cada cepa bacteriana seleccionada. Luego 
se inocularon con una asada de cada colonia bacteriana, se dejó incubar por 24 
horas a 31°C en agitación a 1200 rpm. Después se tomó 1 mL de esta solución 
madre y se pasó a otro matraz de 250 mL con 50 mL de infusión de papa, dejándose 
en las mismas condiciones de crecimiento. A continuación, se procedió a hacer 
diluciones consecutivas en tubos con 9 mL de agua destilada estéril, tomando 1 mL 
del caldo de cultivo preparado en el paso anterior, se realizaron las diluciones 
consecutivas de las concentraciones 10 -1, 10 -2 y 10 -3. Se plaquearon con el 
instrumento Spiral Autoplate 4000, inoculando 50 µL de las diluciones 10 -2 y 10 -3, 
en placas Petri con medio de PDA, crecidos por 24 horas a 31 °C. Para finalizar, se 
realizó conteo de UFC/mL de cada colonia bacteriana seleccionada. Tabla 3. 
 
Microscopia de las bacterias 
 
Se prepararon frotis para las colonias X1 y X2, se utilizó medio liquido de 
PDA incubado por 24 horas a 28°C a 1200 rpm, se dispensaron 200 µL del inoculo 
sobre un portaobjetos, luego se frota con la superficie de otro portaobjetos para 
dispersar el inoculo líquido sobre toda la superficie del portaobjetos inferior, y se fija 
con el mechero. Después se deja secar y se coloca en el microscopio para su 
observación, se utilizan los objetivos 40x y 100x (con aceite de inmersión). 
Se preparan los colorantes para Tinción Gram, en este caso se prepara Azul 
de Metileno y Cristal Violeta como primer colorante de la tinción Gram. 
 
 
30 
 
Con la misma técnica con la que se prepararon los frotis anteriores, se 
preparan frotis para Tinción Gram, se realiza la tinción con Azul de Metileno como 
primer colorante, y en el otro par se utiliza Cristal Violeta. Estos colorantes se aplican 
por 1 minuto, luego se aplica el Lugol por 1 minuto, después se lava con solución 
alcohol cetona hasta no dejar rastro de colorante, al final se aplica Safranina por 1 
minuto lavando posteriormente con agua y dejando secar por 15 min a 28°C de 
temperatura. Se colocan en el microscopio utilizando los objetivos 40x y100x (con 
aceite de inmersión). Figuras 14 y 15. Se hace una recopilación de características 
morfológicas a nivel microscópico de las colonias mencionadas, tabla 4. 
 
 
 
 
31 
 
RESULTADOS 
 
MICROORGANISMOS PRESENTES EN EL LIMO ARENA 
 
Figura 4. Microorganismos presentes en el suelo Limo Arena en los distintos medios de cultivo. 
Placas Petri de medios PDA, Extracto de suelo, Martín y Czapek, 48 horas de incubación a 32 °C. 
 
 
 
 
1.- Medio PDA 2.- Medio Extracto de suelo 
3.- Medio Martín 4.- Medio Czapek 
 
 
32 
 
 
 
1.- Medio PDA; mostraron crecimiento de colonias de hongos y bacterias. Los 
hongos crecidos muestran textura algodonosa y filamentosa, 1.1 de color verde 
oscuro alrededor y blanco en el centro, tienen forma circular, elevación de domo y 
borde circular filamentoso, su tamaño es mediano aproximadamente de 3 mm, 1. 2 
la otra colonia de hongos presente aquí es de color marrón oscuro en el centro, 
marrón más claro en el centro y de borde color blanco, tiene una textura algodonosa 
filamentosa, de forma circular, elevación de domo, bordes filamentosos, tamaño >3 
mm. Las colonias bacterianas crecidas son: 1.3 color blanco traslucido, de forma 
Tabla 1. Descripción macroscópica de la morfología colonial de las diferentes colonias microbianas 
crecidas en los medios PDA, Extracto de suelo, Martin y Czapek. Incubados por 48 horas a 32°C. 
No. 
Coloni
a 
Color Forma Textura Brillo Elevación Borde Tamañ
o (mm) 
1.1 Centro blanco, 
medio verde 
oscuro y borde 
blanco 
Circular Algodonosa 
y 
filamentosa 
en bordes 
Opaco Domo Entero, circular y 
filamentoso 
3 
1.2 Centro marrón 
oscuro, medio 
marrón claro, 
borde blanco 
Circular Algodonosa 
y 
filamentosa 
en bordes 
Opaco Domo Entero, circular y 
filamentoso 
>3 
1.3 Blanco 
traslucido 
Circular 
irregular 
Mocosa Brillosa Plana Ondulado/Curvo >3 
1.4 Amarillo oscuro Circular Mocosa Brillosa Convexa Entero >3 
1.5 Amarillo Rizoide Mocosa Brillosa Ligera Irregular curvo 20 
1.6 Blanco pálido Rizoide Mocosa Brillosa Plana Ondulado >3 
2.1 Verde oscuro Puntiforme 
Algodonoso 
y 
filamentoso 
Sin brillo Domo Filamentoso >3 
2.2 Blanco Circular Mocosa Sin brillo Domo Entero y circular 1 
2.3 Verde del 
centro, blanco a 
los bordes 
Circular Algodonoso 
y 
filamentoso 
Sin brillo Domo Filamentoso <3 
3.1 Verde del 
centro, blanco a 
los bordes 
Circular 
irregular 
Algodonoso 
y 
filamentoso 
Sin brillo Domo Filamentoso 20 
3.2 Blanco pálido Circular 
irregular 
Algodonoso Opaco Domo Filamentoso 30 
3.3 Amarillento Circular 
irregular 
Algodonoso Sin brillo Domo Filamentoso 25 
4.1 Verde del 
centro, blanco a 
los bordes 
Circular Algodonoso 
y 
filamentoso 
Sin brillo Domo Filamentoso 3 
4.2 Blanco 
traslucido 
Circular Mocosa Brillosa Plana Ondulado <3 
4.3 Blanco pálido Circular Mocosa Brillosa Plana Irregular ondulado <3 
 
 
33 
 
rizoide e irregular, textura mocosa, brillosa, elevación plana y borde ondulado/curvo, 
tamaño >3 mm. 1.4 la colonia de color amarillo oscuro, de forma circular, textura 
mocosa, brillo ante la luz, elevación convexa, borde entero, tamaño>3 mm. 1.5 es 
la colonia color amarillo, forma rizoide, textura mocosa, brillosa, ligera elevación, 
borde irregular curvo, tamaño 20 mm, 1.6 es la colonia bacteriana blanco pálido 
tiene una forma irregular, textura mocosa, brillante, es plana y de borde ondulado, 
de tamaño >3 mm. Se observa que en el medio de PDA crecen 2 colonias diferentes 
de hongos que, por su morfología macroscópica, puede referirse a dos tipos de 
hongos distintos. Por otro lado, destaca la colonia bacteriana 1.4 que forma 
ramificaciones irregulares sin crear una lisis celular que crecen dentro de la colonia 
bacteriana 1.5, lo que ayuda a deducir que no existe un antagonismo entre estas 
colonias bacterianas. 
2.- Medio Extracto de suelo; en este medio crecieron 2 tipos de hongos, 2.1 
es la colonia de hongos color verde oscuro es filamentoso, con forma circular, con 
elevación de domo y de borde circular filamentoso, de tamaño >3 mm. 2.2 es una 
colonia bacteriana color blanco que posee textura mocosa y es brillosa, forma 
circular, elevación de domo, borde circular y entero, de 1 mm aproximadamente. 2.3 
es la colonia de hongo de color verde del centro y blanco de los bordes, de textura 
algodonosa/filamentosa, forma circular, elevación de domo, de borde filamentoso, 
con un tamaño <3 mm. En este medio crecieron 2 tipos de hongos; el hongo 2.1 
posee el mayor tamaño de colonial y creciendo 10 colonias, 2.3 tiene 10 unidades 
de colonia, y 2.2 posee 25 unidades de colonias bacterianas visibles. 
3.- Medio Martín; se encuentra crecimiento de solamente hongos, 3.1 es la 
colonia de hongos color verde oscuro del centro y blanco de los bordes, de forma 
irregular, elevación de domo, borde filamentoso e irregular, de tamaño >20 mm, y 
solo presenta una colonia en la placa. 3.2 la colonia siguiente de hongo es de color 
blanco pálido, textura algodonosa, forma irregular, elevación de domo, bordes 
irregulares y filamentosos, con un tamaño aproximado de 30 mm, y tiene 4 colonias 
formadas. 3.3 La última colonia de hongo presente es color amarillento, de textura 
algodonosa, forma irregular, elevación de domo, borde filamentoso, con un tamaño 
aproximado de 25 mm, y solo posee una colonia presente en la placa. 
4.- Medio Czapek; 4.1 muestra crecimiento de 1 tipo de hongo, color verde 
oscuro del centro y borde blanco, de textura algodonosa y filamentosa, forma 
circular, elevación de domo, borde filamentoso, de tamaño de 3 mm 
aproximadamente, y tiene 3 colonias visibles en la placa. 4.2 muestra crecimiento 
de colonias bacterianas color blanco traslucido, brillosa, forma circular, elevación 
plana, de borde ondulado, con un tamaño <3 mm, y presenta 9 colonias bacterianas. 
4.3 es la otra colonia bacteriana encontrada es color blanco pálido, brillosa, de forma 
irregular, sin elevación, de borde irregular ondulado, con un tamaño <3 mm, y solo 
posee 1 colonia bacteriana. 
 
 
34 
 
SELECCIÓN DE COLONIAS BACTERIAS 
 
Aislamiento por estría cruzada de colonias bacterianas seleccionadas. 
 
Figura 5. Placas Petri con medio PDA inoculadas por estría cruzada de las 
colonias bacterianas seleccionadas, 24 horas de incubación a 32°C. Las cajas C 
y D son las colonias bacterianas seleccionadas y llamadas X1 y X2, 
respectivamente. 
 
 
 
Son seleccionadas las colonias 1.3 y 4.2 (figura 4), luego se resembraron en 
cajas Petri de PDA por estría cruzada para purificar las colonias seleccionadas, tal 
y como muestra la figura 5 (cajas A y B), específicamente en la caja B se tomaron 
Caja B 
Caja D 
Caja A 
Caja C 
 
 
35 
 
unas pequeñas colonias circulares brillosas y de color blanco. Luego, a través de 
posteriores aislamientos y resiembras, se obtuvieron las cepas bacterianas de las 
cajas C y D, que son X1 y X2 respectivamente. Estas bacterias se seleccionaron 
por su parecido colonial a bacterias de interés que poseen la capacidad de fijar 
nitrógeno en el suelo, como lo podría ser Bacillus subtilis o algunas especies de 
Azospirillum. 
 
Tabla 2. Descripción macroscópica de la morfología colonial de las bacterias aisladas. 
Caja Color Forma Textura Brillo Elevación Borde Tamaño 
(mm) 
A Blanco opaco Irregular Mocosa Brillosa Plana Dentado <3 
B Blanco hueso Circular Mocosa Brillosa Ligera Entero >3 
C Blanco opaco Irregular Mocosa Brillosa Plana Dentado ~5 
D Blanco opaco 
traslucido 
Irregular Mocosa Brillosa Plana Dentado <1 
 
La caja A muestra las colonias bacterianas de color blanco opaco, brillosa a 
la luz, con forma irregular, elevación plana, borde dentado, las colonias aisladas son 
de tamaño <3 mm. La caja B muestra colonias bacterianas color amarillo 
fluorescente, brillosa, de forma circular, leve elevación, borde entero, de tamaño 
aproximado de 2 mm. La caja C muestra colonias bacterianas color blanco opaco, 
brillosa, de forma irregular, leve elevación, borde dentado, tamaño 5 mm. La caja D 
muestra colonias color blanco opaco traslucido, forma irregular, textura mocosa, 
brillosa, elevación plana, borde dentado, tamaño 2 mm. 
 
 
 
36 
 
ESPECTROSCOPÍA FTIR 
 
Las señales que aparecen ~2350 cm-1 pertenecen al dióxido de carbono 
atmosférico (CO2). En el rango de 4000-3500 cm-1 se observan múltiples señales 
que no pertenecen directamente a ningún compuesto con enlaces N-H de 
estiramiento, por lo que se descartan para la interpretación final del contenido 
orgánico que contenga dicho tipo de enlace. 
 
Figura 6. Espectros de infrarrojo de Limo Arena Estéril con disolventes No Polar 
y Polar respectivamente. Rango 500 a 4000 cm-1. Modo Transmitancia. Las 
series son las réplicas del análisis por muestra FTIR. 
93
94
95
96
97
98
99
100
101
5
0
0
1
0
0
0
1
5
0
0
2
0
0
0
2
5
0
0
3
0
0
0
3
5
0
0
4
0
0
0
T
r
a
n
s
m
it
ta
n
c
e
 %
Wavenumber cm-1
LAENP
Serie 1 Serie 2 Serie 3 Blanco
 
 
37 
 
 
En la figura 6, las señales en multiplete a destacar son las cuales están en el 
rango de 3750-3500 cm-1 (Espectro LAENP), pero al estar demasiado desplazado 
de la región que comúnmente se presentan los enlaces de N-H, se podría deber a 
ruido del background, por lo que también podría ser descartada como perteneciente 
a algún tipo de compuesto nitrogenado. El resto de las señales tanto en LAENP y 
LAEP, corresponden a señales de los disolventes utilizados. 
 
80
85
90
95
100
105
5
0
0
1
0
0
0
1
5
0
0
2
0
0
0
2
5
0
0
3
0
0
0
3
5
0
0
4
0
0
0
T
r
a
n
s
m
it
ta
n
c
e
 %
Wavenumber cm-1
LAEP
Serie 1 Serie 2 Serie 3 Blanco
 
 
38 
 
 
Figura 7. Espectros de infrarrojo de Limo Arena Seco con disolventes No Polar y 
Polar respectivamente. Rango 500 a 4000 cm-1. Las series son las réplicas del 
análisis por muestra FTIR. 
 
La figura 7 muestra que en los espectros LASNP y LASP solo existen señales 
de los disolventes utilizados para el análisis FTIR. Lo cual significa que no existen 
componentes orgánicos que superen el 1% de la composición del suelo seco. 
88
90
92
9496
98
100
102
5
0
0
1
0
0
0
1
5
0
0
2
0
0
0
2
5
0
0
3
0
0
0
3
5
0
0
4
0
0
0
T
r
a
n
s
m
it
ta
n
c
e
 %
Wavenumber cm-1
LASNP
Serie 1 Serie 2 Serie 3 Blanco
83
85
87
89
91
93
95
97
99
101
5
0
0
1
0
0
0
1
5
0
0
2
0
0
0
2
5
0
0
3
0
0
0
3
5
0
0
4
0
0
0
T
r
a
n
s
m
it
ta
n
c
e
Wavenumber cm-1
LASP
Series1 Series3 Series4 Blanco
 
 
39 
 
Figura 8. Espectros de infrarrojo de Limo Arena Inoculado con colonias 
bacterianas X1 con disolventes No Polar y Polar respectivamente. Rango 500 a 
4000 cm-1. Las series son las réplicas del análisis por muestra FTIR. 
 
En la figura 8, en el espectro LAIX1NP las únicas señales a destacar son las 
del disolvente puesto que no hay más señales con magnitud significativa. Por otro 
lado, el espectro LAIX1P muestra más señales pertenecientes al disolvente de 
84
86
88
90
92
94
96
98
100
102
5
0
0
1
0
0
0
1
5
0
0
2
0
0
0
2
5
0
0
3
0
0
0
3
5
0
0
4
0
0
0
T
r
a
n
s
m
it
ta
n
c
e
 %
Wavenumber cm-1
LAIX1NP
Serie 1 Serie 2 Serie 3 Blanco
84
86
88
90
92
94
96
98
100
102
5
0
0
1
0
0
0
1
5
0
0
2
0
0
0
2
5
0
0
3
0
0
0
3
5
0
0
4
0
0
0
T
r
a
n
s
m
it
ta
n
c
e
 %
Wavenumber cm-1
LAIX1P
Serie 1 Serie 2 Serie 3 Blanco
 
 
40 
 
etanol únicamente, lo que significa que no se detectaron la presencia otros 
compuestos orgánicos. 
 
Figura 9. Espectros de infrarrojo de Limo Arena Inoculado con colonias 
bacterianas X2 con disolventes No Polar y Polar respectivamente. Rango 500 a 
4000 cm-1. Las series son las réplicas del análisis por muestra FTIR. 
 
83
85
87
89
91
93
95
97
99
101
5
0
0
1
0
0
0
1
5
0
0
2
0
0
0
2
5
0
0
3
0
0
0
3
5
0
0
4
0
0
0
T
r
a
n
s
m
it
ta
n
c
e
 %
Wavenumber cm-1
LAIX2NP
Serie 1 Serie 2 Serie 3 Blanco
80
85
90
95
100
105
5
0
0
1
0
0
0
1
5
0
0
2
0
0
0
2
5
0
0
3
0
0
0
3
5
0
0
4
0
0
0
T
r
a
n
s
m
it
ta
n
c
e
 %
Wavenumber cm-1
LAIX2P
Serie 1 Serie 2 Serie 3 Serie 4 Blanco
 
 
41 
 
La figura 9 muestra que las señales aparecidas en ambos espectros 
corresponden a las señales de los grupos funcionales de los disolventes utilizados. 
Los cual indica que, si existen compuestos orgánicos en el suelo limo arena 
inoculado con las colonias bacterianas X2, no superaran el 1% de la composición 
del suelo. 
 
Tabla 2.1. Recopilación de señales presentes en los espectros de infrarrojo 
obtenidos de las figuras 6, 7, 8 y 9. 
Enlaces Tipo de vibración Rango de señal (cm-1) 
O-H alargamiento 3500-3000 
-CH3 (Metilo) alargamiento 2960, 2870 
-CH2 (Metileno) alargamiento 2930, 2850 
-C-H (Metino alifático) alargamiento 3000-2800 
C=O alargamiento 1550-1870 
H-C-H (metilo, metileno) doblamiento 1490-1150 
C=C-H (Insaturación 
alifática) 
Deformación fuera del 
plano 
1000-780 
 
La tabla 2.1 recopila las señales más visibles en los espectros obtenidos, 
todas las señales descritas en esta tabla tienen su origen en el disolvente utilizado. 
Las señales que podrían destacar, y que tiene en común todos los espectros 
obtenidos con el disolvente polar, es que presentan señales que pertenecen a 
compuestos con grupos funcionales como carbonilo (C=O) e insaturaciones 
alifáticas (C=C-H), esto se puede deber al equilibrio acido base que se genera por 
el uso del disolvente de etanol, justamente debido al grupo hidroxilo. 
Las bandas sospechosas entre 3600-3700 pueden deberse a pequeñas 
trazas de humedad en un solvente orgánico, como el etanol, dan lugar a bandas 
debido a las vibraciones O-H en esta región. También se puede observar una banda 
ancha y débil cerca de 1650 cm-1 (6,06 µm). Tales bandas son particularmente 
notables cuando se usan celdas de muestra gruesas de largo camino óptico. 
(Socrates, G., 2004) También las señales en ~665 pueden deberse a los 
instrumentos de doble haz más antiguos y mal equilibrados pueden presentar 
bandas debidas al dióxido de carbono atmosférico, también una banda que se 
presenta a 2350 cm-1 (4,26 µm). (Socrates, G., 2004) 
 
 
 
42 
 
 
ANALISIS DE COLONIAS BACTERIANAS SELECCIONADAS 
 
Crecimiento en tubos de medio NFB semisólido 
 
Figura 10. Crecimiento en tubos con medio de NFB semisólido inoculados con las 
bacterias seleccionadas: A y B, incubados por 72 horas a 33°C. Colonias 
bacterianas seleccionadas inoculadas por picadura: X1 y X2, incubados por 6 días 
a 31°C. 
Control A B X1 X2 
 
 
En la figura 10, se observa que tras el tiempo de incubación la cepa 
bacteriana X1 existe un cambio en la coloración del medio NFB semisólido, se 
puede interpretar como que existen bacterias fijadoras de Nitrógeno atmosférico 
(N2) como parte de sus procesos metabólicos, siendo compuestos como NH3 u 
óxidos nitrogenados los metabolitos secundarios de estas, lo cual basifica el pH del 
medio NFB cambiando el color de azul claro a azul oscuro. 
 
 
 
43 
 
Crecimiento de bacterias en medio NF líquido 
 
Figura 11. Frascos con medio NFB líquido incubados en distintos tiempos a 
31°C de temperatura a 3000 rpm. 
 Control Control 
Positivo 
Inoculado 
con 10-3 
Repetición 1 
Inoculado 
con 10-3 
Repetición 2 
Inoculado 
con 10-3 
Repetición 3 
 
 
Tiempo de 
incubación 
0 días 
 
 
 
Tiempo de 
incubación 
6 días 
 
 
 
Tiempo de 
incubación 
13 días 
 
 
Figura 11. Frascos con medio NFB líquido. Se divide en 3 grupos de 
fotografías; la primera fila corresponde a los medios recién inoculados, la segunda 
fila es después de 6 días de incubación y la tercera fila representa el crecimiento 
luego de 13 días de incubación. Se utilizó un control, una cepa de bacterias fijadoras 
de nitrógeno (control positivo), y 3 réplicas de las bacterias seleccionadas. El control 
no tuvo ningún cambio a través de los 13 días, el control positivo tuvo cambio 
positivo a los 6 días, y el resto de los frascos tuvieron cambio de color a azul añil. 
 
 
44 
 
Lo que nos indica que las colonias bacterianas que se encuentran presentes en la 
mezcla de suelo limo arena tienen la capacidad de cambiar el pH del medio NFb 
volviéndolo más alcalino en un tiempo de 13 días de incubación. 
 
Crecimiento en medios D1M y BDKing 
 
Figura 12. Fotografías de cajas Petri de los medios D1M y BDKing. Estría cruzada. Tiempo de 
incubación 72 horas a 31°C. 
 D1M BDKing BDKing bajo UV 
 
Consorcio 
Bacteriano 
X1 
 
 
 
Consorcio 
Bacteriano 
X2 
 
 
Se observa en la figura 12que el medio D1M muestra un resultado negativo 
de crecimiento de bacterias Agrobacterium para las colonias X1 y X2, aunque es 
visible que existe muy poco crecimiento al inicio de la primera parte de la estría 
cruzada en ambas cajas. Por otra parte, el medio BDK muestra un crecimiento en 
ambas cajas, aplicando luz ultravioleta se observa que las bacterias X1 y X2 no 
presenta fluorescencia, lo cual podría indicar que no son Pseudomonas 
fluorescentes. 
 
 
 
45 
 
Prueba Hugh & Leifson 
 
Figura 13. Tubos con medio Hugh & Leifson, incubados por 72 horas a 33°C de 
temperatura. 
Tubos testigo Tubos incubados de las 
bacterias X1 y X2 
Tubos incubados de las 
bacterias X1 y X2 con 
aceite mineral 
 
 
 
Figura 13 muestra el tubo testigo A que no posee aceite mineral, el tubo 
testigo B contiene aceite mineral y no muestran crecimiento bacteriano. Los tubos 
AX1 y AX2 fueron inoculados por picadura con asa por 72 horas y muestran 
crecimiento a lo largo del tubo de ensaye, lo que significa que pueden crecer en 
presencia de oxígeno. Los tubos BX1 y BX2 contienen aceite mineral, inoculados 
por picadura, a las 72 horas de incubación muestran crecimiento a lo largo de ambos 
tubos, indicando que pueden crecer sin la presencia de oxígeno. Esto indica que 
ambas colonias bacterianas son anaerobias facultativas, utilizan glucosa en 
presencia y ausencia de oxígeno, por lo que son fermentativas. 
 
Unidades Formadoras de Colonias 
 
Tabla 3. Muestra las UFC/mL de las colonias bacterianas seleccionadas. 
UFC/mL 
 
X1 
 
X2 
 
1.9508x104