TFG_NortesMéndez,Rocío

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UNIVERSIDAD DE JAÉN 
Facultad de Ciencias Experimentales 
 
 
Trabajo Fin de Grado 
Alumna: Rocío Nortes Méndez 
 
 
 
 
 
Julio, 2014 
Estudio del metabolismo del 
ibuprofeno en orina humana 
mediante hplc-ms de alta 
resolución 
 
 
Estudio del metabolismo del ibuprofeno en 
orina humana mediante hplc-ms de alta 
resolución 
i 
ÍNDICE 
 Página
1. RESUMEN…………………………………………………………………………... 1 
2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………… 2 
2.1. Justificación……………………………………………………………….. 2 
2.2. Definición de farmacología……………………………………………… 3 
2.3. Fármacocinética y procesos farmacocinéticos………………………... 4 
2.3.1. Absorción………………………………………………………... 6 
2.3.2. Distribución……………………………………………………... 6 
2.3.3. Metabolismo………………………………………………......... 6 
2.3.3.1. Reacciones de fase I………………………………… 7 
2.3.3.2. Reacciones de fase II………………………………... 9 
2.3.4. Excreción……………………………………………………….. 11 
2.4. Antiinflamatorios no esteroideos (AINE)……………………………….. 11 
2.4.1. Definición…………………………………………………......... 11 
2.4.2. Clasificación………………………………………………......... 11 
2.4.3. Mecanismo general de acción………………………………… 12 
2.4.4. Acciones farmacológicas con interés terapéutico……......... 13 
2.4.5. Reacciones adversas comunes……………………………… 14 
2.4.6. Derivados del ácido propiónico………………………………. 14 
2.5. Antecedentes…………………………………………………………....... 14 
2.5.1. Metabolismo del ibuprofeno…………………………………... 14 
2.5.2. Métodos empleados para la determinación de los 
metabolitos……………………………………………………………… 
 
16 
2.6. Objetivos………………………………………………………………....... 22 
3. EXPERIMENTAL…………………………………………………………............... 22 
3.1. Materiales y reactivos……………………………………………………. 22 
3.2. Recogida de muestras…………………………………………………… 23 
3.3. Preparación de la muestra………………………………………………. 23 
3.4. Instrumentación…………………………………………………………... 24 
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………. 25 
4.1. Optimización del método………………………………………………… 25 
 
ii 
Página 
4.2. Validación del método………………………………………………........ 27 
4.3. Estudio de eliminación del ibuprofeno…………………………………. 28 
4.4. Identificación y confirmación de compuestos mediante 
cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a espectrometría 
de masas con analizador de tiempo de vuelo (LC-TOFMS)……………... 
 
 
28 
5. CONCLUSIONES…………………………………………………………………... 41 
6. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………... 41 
7. ANEXO ……………………………………………………………………………… 45 
 
1 
1. RESUMEN 
 
 
En esta memoria se describe el estudio de los metabolitos del ibuprofeno presentes 
en la orina humana tras su administración oral. La orina recogida se procesó 
mediante extracción en fase sólida y a continuación se analizó empleando una 
metodología basada en cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de 
masas con analizador de tiempo de vuelo (LC-TOFMS) equipado con una interfase 
de electrospray (ESI) operando en modo negativo. La estrategia empleada para la 
identificación de los metabolitos se basó en la determinación de la masa exacta de 
los compuestos y en el estudio de los fragmentos característicos de cada uno de 
ellos a partir de experimentos de fragmentación mediante disociación inducida por 
colisión (CID). El método descrito permitió la identificación de un total de 22 
metabolitos del ibuprofeno, los cuales son resultado de diferentes modificaciones, 
entre ellas, la glucuronidación (3 isómeros), la hidroxilación (3 isómeros) y la 
carboxilación (1 isómero) del propio ibuprofeno; además de la glucuronidación del 
hidroxiibuprofeno (10 isómeros) y del carboxiibuprofeno (5 isómeros). 
 
 
ABSTRACT 
 
 
In this memory, the excretion of metabolites of ibuprofen present in human urine 
following an oral administration is studied. Urine collected was processed with solid-
phase extraction, and then samples were analyzed using liquid chromatography 
time-of-fly mass spectrometry (LC-TOFMS) equipped with an electrospray interface 
(ESI) operating in negative ion mode. The strategy applied for the identification of 
metabolites was based on the exact mass determinations and on the studies of 
fragmentation patterns of each compound by experiments from in-source collision 
induced dissociation (CID) fragmentation. Using the proposed methodology a total of 
22 metabolites of ibuprofen were identified as a result of different modifications, such 
as glucuronidation (3 isomers), hydroxylation (3 isomers) and carboxylation (1 
isomer) of ibuprofen; also glucuronidation of hydroxyibuprofen (10 isomers) and 
carboxyibuprofen (5 isomers). 
2 
2. INTRODUCCIÓN 
 
 
2.1. Justificación 
 
La importancia del estudio del metabolismo de fármacos y xenobióticos se debe a la 
posibilidad de evaluar su eficacia y la dosis adecuada, para que así una vez que el 
fármaco llegue a su punto de acción no se prolongue su efecto durante más tiempo 
del deseado ni produzca un efecto tóxico. De ahí que estos estudios sean también 
esenciales para conocer la seguridad de los medicamentos, pues se deben conocer 
las características y concentraciones de cada uno de sus metabolitos para así poder 
evaluar su toxicidad. 
Además, como es posible identificar las rutas y la tasa de eliminación, así como los 
principales sitios de biotransformación, el metabolismo desempeña un papel decisivo 
en el desarrollo de fármacos, permitiendo diferenciar los posibles fármacos de 
aquellos con propiedades no deseadas, para llevar a cabo a continuación 
investigaciones más específicas. 
Por otro lado, los antiinflamatorios no esteroideos (AINE) forman un grupo 
farmacológico con propiedades antiinflamatorias, antitérmicas y analgésicas, el cual 
es uno de los más utilizados en terapéutica y presenta un mayor consumo en 
España, ya que las patologías que pueden ser tratadas con estos fármacos son muy 
frecuentes. En la Figura 1A se muestra el consumo de antiinflamatorios no 
esteroideos en el período comprendido entre el año 2000 y el 2012, durante el cual 
se han llevado a cabo modificaciones de las condiciones de uso y la retirada del 
mercado de algunos de sus componentes tras conocer nuevos datos sobre sus 
reacciones adversas. En términos generales, los derivados arilpropiónicos son los 
más utilizados, ya que suponen el 65,1% del consumo de antiinflamatorios no 
esteroideos en 2012. Entre ellos, el ibuprofeno fue el más consumido, representando 
el 43,9% del consumo total de antiinflamatorios no esteroideos en 2012 (Figura 1B). 
 
3 
 
Figura 1. A) Evolución del consumo de AINES en España. B) Evolución del consumo de derivados 
arilpropiónicos en España. (Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, 
Utilización de medicamentos antiinflamatorios no esteroides (AINE) en España durante el periodo 
2000-2012, 2014). 
 
 
2.2. Definición de farmacología 
 
Un fármaco es, en sentido amplio, toda sustancia química capaz de interactuar con 
un organismo vivo. En sentido más restringido, se define como toda sustancia 
química utilizada en el tratamiento, la curación, la prevención o el diagnóstico de una 
enfermedad, o para evitar la aparición de un proceso fisiológico no deseado. Los 
fármacos son los principios activos de los medicamentos, es decir, de las sustancias 
medicinales y sus asociaciones destinadas a ser utilizadas en personas o animales, 
*Otros: fenamatos, indolacéticos, pirazolonas, salicilatos.
A 
B 
4 
que presentan propiedades para prevenir, diagnosticar, tratar, aliviar o curar 
enfermedades, o para modificar funciones fisiológicas (Flores, J., Capítulo 1: 
Farmacología: concepto y objetivos en Farmacología Humana, 2008, Barcelona, 
Elsevier Masson). 
La farmacología es la ciencia biológica que estudia las acciones y propiedades de 
los fármacos en los organismos, abarcando, por tanto, todos los aspectos 
relacionados con la acción del fármaco: el origen, la síntesis, la preparación, las 
propiedades, las acciones desde elnivel molecular hasta el organismo completo, su 
manera de situarse y moverse en el organismo, las formas de administración, las 
indicaciones terapéuticas y las acciones tóxicas. En consecuencia, se convierte en 
un campo multidisciplinar que puede ser subdividido en varias áreas: 
farmacoquímica, farmacotecnia, farmacognosia, galénica, etnofarmacología, 
farmacodinamia, farmacocinética, farmacogenética, farmacometría, 
cronofarmacología, farmacología clínica, farmacología terapéutica y farmacotoxia 
(Flores, J., Capítulo 1: Farmacología: concepto y objetivos en Farmacología 
Humana, 2008, Barcelona, Elsevier Masson). 
 
 
2.3. Fármacocinética y procesos farmacocinéticos 
 
La farmacocinética es el área de la farmacología que se ocupa de los procesos y los 
factores que afectan a la cantidad de fármaco que en cada momento está presente 
en el lugar donde debe ejercer su efecto terapéutico, una vez que se le ha 
administrado al organismo una dosis determinada de fármaco. En consecuencia, es 
necesario el análisis de la cantidad de fármaco y de sus metabolitos en los fluidos 
biológicos en función del tiempo y de su efecto a la respuesta farmacológica. El 
conocimiento de estos datos y su interpretación permite obtener la información 
necesaria para valorar o predecir la acción terapéutica o tóxica de un fármaco 
(Flores, J., Capítulo 1: Farmacología: concepto y objetivos en Farmacología 
Humana, 2008, Barcelona, Elsevier Masson). 
Se distinguen cuatro procesos farmacocinéticos objeto de estudio (absorción, 
distribución, metabolismo y excreción) que se encuentran relacionados entre sí 
(Figura 2) y se detallarán más adelante. 
5 
D 
D·f 
f 
F 
Fex 
FP 
M 
Mex 
MP 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
- 
Dosis administrada 
Cantidad de fármaco absorbida 
Fracción de absorción 
Fármaco libre 
Fármaco excretado 
Fármaco unido a proteínas 
Metabolito activo libre 
Metabolito activo excretado 
Metabolito activo unido a proteínas 
Figura 2. Relación entre los procesos farmacocinéticos 
 
Como todos estos procesos se encuentran en equilibrio dinámico, la concentración 
de fármaco variará a lo largo del tiempo (Figura 3). Por este motivo, en el organismo 
humano, la concentración de fármaco activo disminuye a medida que aumenta la 
eliminación, siendo ésta un factor que afecta de manera importante al tiempo que 
tarda en alcanzarse y en desaparecer su efecto. El fármaco puede excretarse sin ser 
modificado o tras haber sido metabolizado. La mayoría de los fármacos se eliminan 
de las dos formas, aunque siempre es preferente uno u otro mecanismo, en función 
de las características del fármaco. La variación de la cantidad de metabolitos en el 
tiempo depende de los procesos de formación y de eliminación de los mismos. 
 
 
Figura 3. Curvas de absorción y eliminación
 
 
 
Fijación a tejidos inactivos (Reservorio) 
Excreción 
Absorción  Distribución  
 
FP  F  M MP
F
M M
F
F M 
FP 
Df D 
MF
Fexc Mex
Metabolismo 
Tejidos activos 
(Receptores) 
6 
2.3.1. Absorción 
 
La absorción es el proceso que comprende la liberación del fármaco de su forma 
farmacéutica, su disolución y su entrada en el organismo. Depende de 
características fisicoquímicas del fármaco, de la preparación farmacéutica y de la vía 
de administración. Durante este proceso puede producirse, en aquellos casos en los 
que el fármaco se administra por una vía diferente a la intravenosa, un fenómeno 
conocido como eliminación presistémica que consiste en la degradación parcial del 
fármaco antes de que sea distribuido en el organismo originando que su absorción 
sea incompleta. Asimismo, antes de la distribución, el fármaco puede ser absorbido 
en el tracto gastrointestinal y ser metabolizado en el hígado, lo que se conoce como 
primer paso hepático. 
 
2.3.2. Distribución 
 
La distribución es el proceso por el cual el fármaco es transportado desde el lugar de 
absorción hasta el de acción, permitiendo así que llegue a los órganos en los que 
debe actuar o en los que se va a metabolizar. El transporte tiene lugar a través de la 
circulación sistémica y puede producirse de diferentes formas como pueden ser la 
disolución en el plasma, la fijación a proteínas plasmáticas o la unión a las células 
sanguíneas. De este proceso depende la concentración de fármaco que se alcanza 
en cada tejido. 
Para acceder al interior de las células y a las estructuras intracelulares los fármacos 
deben atravesar las membranas orgánicas, de ahí que los fármacos liposolubles 
penetren más fácilmente y se distribuyan con mayor rapidez. 
 
2.3.3. Metabolismo 
 
El metabolismo es el proceso de biotransformación de los fármacos que, debido a 
una serie de reacciones químicas, produce otros compuestos que se pueden 
eliminar con mayor facilidad, denominados metabolitos. Estas reacciones son 
causadas por la actividad de determinadas enzimas, las cuales se hallan 
principalmente en el hígado, aunque también están presentes en otros órganos 
como en el riñón, el pulmón o el intestino, de forma menos significativa. Los 
7 
fármacos liposolubles son susceptibles de ser transformados en el organismo 
humano, ya sea total o parcialmente, mientras que los hidrosolubles suelen ser 
excretados sin modificar. 
Múltiples reacciones son responsables del metabolismo, de forma que un compuesto 
puede ser modificado en varios sitios de forma simultánea o transformado mediante 
reacciones sucesivas. Como resultado, se obtiene un gran número de metabolitos 
que pueden ser clasificados en función de su actividad biológica. Se distinguen 
cuatro grupos: los metabolitos menos activos biológicamente, debido a la pérdida de 
su actividad farmacológica; los metabolitos activos desde un punto de vista 
terapéutico, en cuyo caso el compuesto inicial es denominado profármaco y carece 
de actividad biológica; los metabolitos activos aunque con una actividad terapéutica 
diferente a la del fármaco de partida; y los metabolitos activos desde un punto de 
vista tóxico. 
Las reacciones responsables del metabolismo se clasifican en reacciones de fase I y 
reacciones de fase II. 
 
2.3.3.1. Reacciones de fase I 
 
Las reacciones de fase I tienen como fin la funcionalización de la molécula de 
manera que se produzca un aumento de su polaridad. El resultado de estas 
reacciones puede ser la inactivación de la misma y su posterior excreción, o bien su 
transformación en otra más activa. 
En la Tabla 1 se recogen algunas de las reacciones de fase I que se pueden 
producir. Los grupos funcionales que se incorporan a la molécula, como los grupos 
hidroxilo, los grupos amino o los grupos ácido carboxílico, son, todos ellos, 
susceptibles de sufrir posteriores reacciones de fase II. 
Las oxidaciones, al ser muy variadas, son la vía de transformación más frecuente y, 
como consecuencia puede producirse la pérdida de parte de la molécula o la 
incorporación de oxígeno a la misma. Se diferencian dos tipos de oxidaciones, las 
oxidaciones microsómicas y las oxidaciones no microsómicas, que son catalizadas 
por distintas enzimas. Las oxidaciones microsómicas son las más comunes en el 
metabolismo de fármacos, tanto por la variedad de reacciones como por la cantidad 
de fármacos que las utilizan. Las enzimas responsables de las oxidaciones 
8 
microsómicas son el complejo citocromo P450 (CYP450) y la flavin monooxigenasa 
(FMO), que se encuentran fundamentalmente en el microsoma hepático. 
Otras reacciones de fase I de menor importancia son las reducciones, que pueden 
sufrirlas moléculas que contengan oxígeno o nitrógeno, y las reacciones de hidrólisis 
debidas a la actuación de enzimas hidrolasas presentes en el plasma y los tejidos. 
 
Tabla 1. Reacciones de fase I (Del Arco, C., Capitulo 5: Metabolismo de los fármacos en
Farmacología Humana, 2008, Barcelona, Elsevier Masson) 
Oxidaciones 
Oxidaciones microsómicas 
Hidroxilación alifática o aromáticaFormación de alcoholes o fenoles 
R1 R2 R1 R2
OH
R R
OH
Desalquilación 
Pérdida de grupos alquilo en aminas sustituidas, éteres o tioles
NH
R2R1 NH2R1 R2 CHO+ N-desalquilación
O
R2R1 OHR1 R2 CHO+
S
R2R1 SHR1 R2 CHO+
O-desalquilación
S-desalquilación
Desaminación oxidativa 
Formación de una cetona o aldehído a partir de una amina. 
R2R1
NH2
+
R2R1
O
NH3
Sulfoxidación 
Formación de sulfóxidos a partir de un tioéter 
S
R2R1
S
R2R1
O
Desulfuración de tioéteres 
S
R2R1
O
R2R1
N-Oxidación (aminas 3ª) y 
N-hidroxilación (aminas 1ª y 2ª) 
R1 NH
R2
R1 N
R2
OH
Epoxidación de dobles enlaces CH2 CH2
O
Oxidaciones extramicrosómicas 
Oxidación de alcoholes y aldehídos 
R OH R COOH
CHOCH3 R COOH
Alcoholdeshidrogenasa
Aldehídodeshidrogenasa
 
Oxidación de purinas metiladas 
Desaminación oxidativa,debidas a monoaminooxidasas (MAO) 
Deshalogenación 
 
   
9 
Tabla 1. Reacciones de fase I (Del Arco, C., Capitulo 5: Metabolismo de los fármacos en
Farmacología Humana, 2008, Barcelona, Elsevier Masson) (Continuación) 
Reducciones 
Nitrorreducción 
NO2 NH2
Azorreducción 
Ar N
N Ar
Ar NH22
 
Reducción de aldehídos a alcoholes 
R OHCHOCH3
Alcoholdeshidrogenasa
 
Hidrólisis 
Hidrólisis de ésteres y amidas, producida por esterasa y amidasas. 
Hidrólisis de enlaces peptídicos, producida por peptidasas. 
 
2.3.3.2. Reacciones de fase II 
 
Las reacciones de fase II se producen sobre las moléculas del fármaco o sobre los 
productos de las reacciones de fase I. Tienen como finalidad aumentar el tamaño de 
la molécula mediante el acoplamiento a un sustrato endógeno, provocando su 
inactivación en la mayoría de los casos. Las transferasas son las enzimas que 
catalizan estas reacciones de conjugación cuyos productos se caracterizan por 
presentar, de forma general, mayor polaridad y, por tanto, ser más fáciles de 
eliminar. Sin embargo, existen casos en los que las reacciones de conjugación 
activan la molécula. 
En función del sustrato con el que se produzca la reacción, se distinguen varios tipos 
de conjugación: 
 La glucuronidación consiste en la conjugación del ácido glucurónico con 
alcoholes, fenoles, ácidos carboxílicos, aminas aromáticas y tioles. Se considera 
una de las vías metabólicas más importantes en el caso de los fármacos. Los 
productos de esta reacción se conocen como glucurónidos y se caracterizan por 
ser más solubles en agua que el compuesto de partida y, por tanto, pueden ser 
excretados con mayor facilidad. El mecanismo por el cual se produce la 
conjugación consiste en la sucesión de varias reacciones catalizadas por 
enzimas que se encuentran principalmente en el hígado. En primer lugar, se 
produce la síntesis del ácido uridindifosfato glucurónico (UDPGA) a partir de la 
glucosa y uridintrifosfato (UTP). A continuación, el UDPGA, que es un compuesto 
fosfato de alta energía, actúa como donador del ácido glucurónico mediante el 
10 
ataque de un átomo rico en electrones (oxígeno, nitrógeno o azufre) sobre el C-1 
del ácido glucurónico del UDPGA (Figura 4). 
 
O
OH
OH
OH
OH
O
PO3H2
O
O
OH
OH
OH OH
O
P
OH
O
O P
O
OH
O
N NH
OH
OH
O
O
UTP Pirofosfato
Glucosa-1-P UDPG
O
O
OH
OH OH
O
P
OH
O
O P
O
OH
O
N NH
OH
OH
O
O
O
OH
UDPGA
2 NAD+ + H2O 2 NADH
 
UPGA R-COOH UGPGT UDP++
O
OH
OH
OH
O
OH
O
R
O
 
Figura 4. Reacción de glucuronidación (Williams, D.A. Chapter 4: Drug Metabolism en Foye’s Principles 
of Medicinal Chemistry, 2013, Baltimore, Lippincott Williams & Wilkins; Voet, D., Voet, J. G., Capítulo 18: 
Metabolismo del glucógeno en Bioquímica, 2006, Buenos Aires, Editorial Médica Panamericana) 
 
 La acilación consiste en la adición de un sustituyente acilo a sustancias que 
contienen grupos amino o ácidos carboxílicos. Requiere la participación de 
derivados de la coenzima A (CoA-SH) y enzimas aciltransferasas. La reacción 
más común es la acetilación, en la cual la acetilcoenzima A actúa como donador 
de acetilos. 
 La conjugación con glutatión consiste en la reacción, por mediación de las 
glutatión-transferasas (GST), entre fármacos electrófilos y el tripéptido glutamil-
cisteinil-glicina, que se encuentra preferentemente en la forma tiol (GSH) lo que 
lo hace ser un fuerte nucleófilo. 
 La conjugación con grupos sulfato, reacción catalizada por las enzimas 
sulfotransferasas, se produce en hormonas sexuales y en compuestos que 
contienen grupos fenólicos en su estructura, siendo ésta una vía importante para 
su metabolismo. Los grupos sulfato deben ser previamente activados por medio 
de la reacción con ATP. 
 La metilación consiste en la incorporación de un sustituyente metilo, por acción 
de las enzimas O-, N-, S- y C-metiltransferasas. 
11 
 La conjugación de ribósidos y ribósido-fosfatos con fármacos análogos de las 
purinas y pirimidinas, da lugar a ribonucleósidos y ribonucleótidos. Como 
resultado de esta reacción el compuesto adquiere actividad biológica. 
 
2.3.4. Excreción 
 
La excreción es el proceso por el que se expulsan del organismo los fármacos 
inalterados y sus metabolitos. Se distinguen diferentes vías de excreción, siendo las 
más destacadas la vía renal y la vía biliar. La vía renal es la más importante y resulta 
especialmente útil cuando la excreción tiene lugar preferentemente o de forma 
exclusiva a través de ella. La excreción biliar es relevante cuando los compuestos 
presentan unas determinadas características, como un elevado peso molecular, 
estructuras que contienen grupos polares (sales de amonio cuaternarias, 
glucuronatos o sulfatos), compuestos no ionizables o compuestos organometálicos. 
 
 
2.4. Antiinflamatorios no esteroideos (AINE) 
 
2.4.1. Definición 
 
Los antiinflamatorios no esteroideos (AINE) constituyen un grupo de fármacos que 
se caracteriza por ser extenso, variado y químicamente heterogéneo. Puede 
dividirse en familias de compuestos cuyos componentes presentan, en general, 
propiedades antiinflamatorias, analgésicas y antipiréticas, es decir, reducen los 
síntomas de la inflamación, el dolor y la fiebre, respectivamente; aunque su eficacia 
relativa puede ser diferente para cada acción. Asimismo, su toxicidad también varía 
entre unos componentes y otros, de ahí que su aplicación clínica dependa tanto de 
su eficacia como de su toxicidad relativas. 
 
2.4.2. Clasificación 
 
La Tabla 2 muestra una clasificación de los diferentes antiinflamatorios no 
esteroideos en grupos farmacológicos, incluyendo el nombre del fármaco prototipo 
12 
de cada grupo. Aunque se ha incluido el paracetamol, éste carece de acción 
antiinflamatoria. 
 
Tabla 2. Clasificación de los AINE (Feria, M., Capítulo 22: Fármacos analgésicos-antitérmicos y 
antiinflamatorios no esteroideos. Antiartríticos en Farmacología Humana, 2008, Barcelona, Elsevier 
Masson; Leza, J.C. y Lizasoain, I., Capítulo 31: Fármacos antiinflamatorios no esteroideos y otros 
analgésicos-antipiréticos en Farmacología básica y clínica, 2008, Madrid, Editorial Médica 
Panamericana) 
Grupo farmacológico Fármaco prototipo Grupo farmacológico Fármaco prototipo 
ÁCIDOS NO ÁCIDOS 
Salicílico Ácido acetilsalicílico Sulfoanilidas Nimesulida 
Enólico Alcanonas Nabumetona 
 
Pirazolonas Metamizol Paraaminofenoles Paracetamol 
Pirazolidindionas Fenilbutazona COXIB (Inhibidores selectivos de la 
ciclooxigenasa 2) Oxicams Piroxicam y meloxicam
Acético Metilsulfonilfenilo Etoricoxib 
 
Indolacético Indometacina Sulfonamida Celecoxib 
Pirrolacético Ketorolaco Sulfonilpropanamida Parecoxib 
Fenilacético Diclofenaco 
Piranoindolacético Etodolaco 
Propiónico Ibuprofeno, naproxeno 
Antranílico Ácido mefenámico 
Nicotínico Clonixina 
 
2.4.3. Mecanismo general de acción 
 
Los antiinflamatorios no esteroideos actúan inhibiendo la acción de la ciclooxigenasa 
(COX), que es la enzima que cataliza la síntesis de prostaglandinas (PG) y 
tromboxanos (TX) (Figura 5). 
 
 
Figura 5. Representaciónesquemática de la acción de los AINE y los glucocorticoides e 
sobre la expresión de las isoformas de la ciclooxigenasa (COX-1 y COX-2). 
Fosfolípidos de la membrana
Ácido araquidónico
Leucotrienos
PG fisiológicas y TX
PG patológicas y 
prostaciclinas Inflamación 
Fosfolipasa A2 
COX-1 
(constitutiva)
COX-2 
(inducible) 
Lipooxigenasa 
Glucocorticoides 
AINE 
-
- -
Glucocorticoides
Estómago, intestino, riñón y plaquetas 
-
13 
 
Se han encontrado al menos dos isoenzimas de la ciclooxigenasa, ambas con el 
mismo peso molecular y una estructura muy similar, aunque con funciones distintas. 
Por un lado, la ciclooxigenasa 1 (COX-1), que está siempre presente en los tejidos, 
es la responsable de la síntesis de las prostaglandinas y tromboxanos que participan 
en el control de funciones fisiológicas. Por otro lado, la ciclooxigenasa 2 (COX-2) 
cataliza la síntesis de compuestos que participan en el proceso de la inflamación, el 
dolor y la fiebre, de ahí que la inhibición de la COX-2 justifique la actividad 
terapéutica de estos fármacos. Sin embargo, los antiinflamatorios no esteroideos 
inhiben de forma no selectiva las dos isoformas de la ciclooxigenasa, en 
consecuencia la inhibición de la COX-1 da lugar a la aparición de reacciones 
adversas. 
 
2.4.4. Acciones farmacológicas con interés terapéutico 
 
a) Acción analgésica 
Los antiinflamatorios no esteroideos se utilizan para tratar dolores de intensidad 
moderada, con la ventaja de que, a diferencia de los antiinflamatorios opioides, no 
alteran la percepción. La acción analgésica se basa en la inhibición de la síntesis de 
prostaglandinas que sensibilizan las terminaciones nerviosas nociceptivas. 
 
b) Acción antitérmica 
Los antiinflamatorios no esteroideos disminuyen la temperatura corporal en casos de 
fiebre, que es un proceso que pertenece al mecanismo de la respuesta inmunitaria. 
La acción antitérmica se debe a la inhibición de la síntesis de prostaglandinas 
hipotalámicas que actúan como mediadoras en este proceso. 
 
c) Acción antiinflamatoria. 
La inflamación es una respuesta fundamental frente a agresiones producidas por 
una gran variedad de estímulos. La acción antiinflamatoria se debe a la inhibición de 
la síntesis de prostaglandinas y otros compuestos relacionados con la 
vasodilatación. 
 
14 
2.4.5. Reacciones adversas comunes 
 
Algunas de las reacciones adversas que caracterizan a los antiinflamatorios no 
esteroideos son las alteraciones y lesiones gastrointestinales. Además, estos 
fármacos son responsables de reacciones adversas renales, de hipersensibilidad 
(alergias) y hematológicas (hemorragias o fenómenos trombóticos). 
 
2.4.6. Derivados del ácido propiónico 
 
Los derivados de ácido propiónico constituyen un grupo de compuestos con 
características farmacológicas y reacciones adversas similares, aunque la estructura 
química entre unos componentes del grupo y otros pueda ser relativamente distinta. 
Forman parte de este grupo el ibuprofeno, el naproxeno, el fenoprofeno, el 
ketoprofeno, el flurbiprofeno, la oxaprozina y otros derivados de menor uso clínico. 
Estos compuestos son quirales y generalmente se administran como mezclas 
racémicas de los enantiómeros R (–) y S (+). La forma farmacológicamente activa es 
la S (+), por este motivo, en el organismo el enantiómero R (–) es transformado en el 
enantiómero S (+). 
En general sus características farmacocinéticas son las siguientes: se absorben casi 
completamente por vía oral; se distribuyen por el organismo mediante la fijación a 
proteínas plasmáticas, preferentemente a la albúmina; se metabolizan intensamente, 
por lo que la cantidad expulsada de forma libre es mínima (< 1 %); y se excretan 
fundamentalmente por vía renal. Las reacciones metabólicas son variadas, entre 
ellas, destacan la hidroxilación, la desmetilación y la conjugación, principalmente con 
el ácido glucurónico. 
 
 
2.5. Antecedentes 
 
2.5.1. Metabolismo del ibuprofeno 
 
El ibuprofeno es un fármaco antiinflamatorio no esteroideo frecuentemente utilizado 
en el ámbito farmacéutico. Entre los procesos de biotransformación que, en el 
organismo, puede sufrir este fármaco destacan dos: la inversión enantiomérica y el 
15 
metabolismo oxidativo (Kepp, D.R. et al, 1997; Moraes de Oliveira, A. R. et al, 2005; 
Magiera, S., Gülmez, S., 2014). 
La inversión enantiomérica es necesaria para que se produzca la conversión de la 
forma del ibuprofeno R (-), que es inactiva, al enantiómero S (+), que es 
farmacológicamente activo (Rudy, A. C. et al, 1990; Moraes de Oliveira, A. R. et al, 
2005; Magiera, S., Gülmez, S., 2014; Rainsford, K. D. Chapter 2: Biodisposition in 
Relation to Actions en Ibuprofen: Pharmacology, Therapeutics and side effects, 
2012, Basel, Springer). 
En cuanto al metabolismo oxidativo, éste origina varios metabolitos que serán 
excretados en distintas concentraciones y por diversas vías. De forma que 
aproximadamente el 66% del fármaco se excreta por vía renal; mientras que el 34% 
por vía biliar. Además, se ha encontrado que el 60% de la dosis se excreta en las 
primeras 24 horas, porcentaje que aumenta al 80 o 100% en los siguientes 5 días 
(Kepp, D.R. et al, 1997). 
Como resultado de las reacciones de oxidación de fase I, se obtienen cuatro 
metabolitos: el 1-hidroxiibuprofeno, el 2-hidroxiibuprofeno y el 3-hidroxiibuprofeno, 
que son productos de la hidroxilación alifática del ibuprofeno; y el carboxiibuprofeno, 
que es el producto de la oxidación del 3-hidroxiibuprofeno hasta ácido carboxílico. 
Como consecuencia del carácter quiral de la molécula de ibuprofeno, sus 
metabolitos también presentarán centros quirales, dando lugar a la aparición de 
enantiómeros y estereoisómeros, como por ejemplo los dos enantiómeros del 2-
hidroxiibuprofeno y los cuatro estereoisómeros del carboxiibuprofeno. La 
glucuronidación es la reacción de fase II más importante en el metabolismo del 
ibuprofeno en humanos, en consecuencia, se obtienen cinco posibles metabolitos: 
tres glucurónidos de los derivados hidroxilados del ibuprofeno, un glucurónido del 
carboxiibuprofeno y otro glucurónido del propio ibuprofeno sin modificar. 
Normalmente los metabolitos presentan más de un sitio en la molécula susceptible 
de sufrir glucuronidación, sin embargo, de forma general se produce en el ácido 
carboxílico de la cadena lateral de ácido propiónico, y da lugar a lo que se conoce 
como acilglucurónidos. La estructura del ibuprofeno y de sus distintos metabolitos se 
muestra en la Figura 6. (Rudy, A. C. et al, 1990; Kepp, D.R. et al, 1997; Moraes de 
Oliveira, A. R. et al, 2005; Plumb, R. S. et al, 2007; Magiera, S., Gülmez, S., 2014). 
 
16 
Figura 6. Estructura del ibuprofeno y de sus metabolitos del ibuprofeno 
 
Los metabolitos mayoritarios son el 2-hidroxiibuprofeno y el carboxiibuprofeno, junto 
con sus derivados conjugados con el ácido glucurónico, pues se encuentran en la 
orina en concentraciones significativas y suponen aproximadamente el 58% de la 
dosis administrada; en cambio, el 3-hidroxiibuprofeno y el 1-hidroxiibuprofeno son 
metabolitos minoritarios, así como sus productos de conjugación, ya que se 
encuentran en pequeñas concentraciones (Kepp, D.R. et al, 1997). 
 
2.5.2. Métodos empleados para la determinación de los metabolitos. 
 
Previamente a la realización de este estudio, se llevó a cabo una búsqueda 
bibliográfica con el objetivo de conocer los metabolitos encontrados con anterioridad 
en diferentes matrices de diversas especies, así como las metodologías analíticas 
desarrolladas para este fin. Existen diversas referencias en la bibliografía sobre la 
determinación de metabolitos del ibuprofeno, en las cuales se describen diferentes 
métodos analíticos. Algunos ejemplos se recogen en la Tabla 3. 
 
 
17 
Tabla 3. Métodos para el estudio del metabolismo del ibuprofeno en distintas matrices y especies. 
Analitos 
Matriz/Especie 
Técnica analítica 
Pretratamiento de 
muestra 
Tratamiento de muestra Condiciones de análisis Referencia 
1-hidroxiibuprofeno 
2-hidroxiibuprofeno 
Carboxiibuprofeno 
Conjugados del ibuprofeno 
Conjugados de los 3 
metabolitos. 
Orina/ 
Humano 
HPLC-UV 
Detección a 220 nm 
Toma de muestra: 
entre las 0- 8h tras la 
ingestión, cada 2 horas. 
Ajuste de pH a 2: 5 ml 
de ácido clorhídrico 2M 
por cada 100 ml de 
orina. 
 
 
SPE: cartuchos de C18 con 100 mg 
de adsorbente Bond Elut Varian. 
i) Acondicionamiento: 2x1 ml de 
acetonitrilo, después, 2x1ml de 
ácido acético 1%. 
ii) Carga de la muestra: 1 ml de 
orina. 
iii) Lavado: 500 μl de acetonitrilo-
1%ácido acético (10:90). 
 iv) Elución de analitos: 500μL de 
acetonitrilo. 
v) Evaporación a sequedad, con 
nitrógeno. 
vi) Reconstitución: 500 μl de fase 
móvil. Si es necesario, el eluato 
reconstituido puede ser diluído 1:10 
en agua para ajustarlo al rango de la 
curva de calibración. 
 
Columna Knauer (40 x 4.6 mm 
I.D.) con relleno Hypersil (3 μm). 
Temperatura: 40ºC. 
Fase móvil isocrática (18:15:67, 
v/v) 
A: acetonitrilo 
B: fosfato potásico 0,2M (pH 
7.4) 
C:agua 
Kepp, D.R. et 
al, 1997 
 (S)-2-hidroxiibuprofeno 
 (R)-2-hidroxiibuprofeno 
(2’S, 2S)-carboxiibuprofeno 
 (2’R, 2S)- carboxiibuprofeno 
 (2’S, 2R)- carboxiibuprofeno 
 (2’R, 2R)- carboxiibuprofeno 
 
Orina/ 
Humano 
HPLC-UV 
Detección a 230 nm 
Toma de muestra: 
entre las 0 - 24 h tras la 
ingestión, en intervalos 
de 0-2, 2-4, 4-6, 6-8, 8-
12 y 12-24 h. 
Almacenamiento: 
alícuotas de 3 ml 
congeladas a -20 ◦ C. 
 
 
 
Hidrólisis alcalina: 0,5 ml orina + 
100μL NaOH 1 M. Incubación 1.5 h 
a temperatura ambiente. 
Neutralización: adición de 100 μL 
HCl 1M. 
SPME: Adición de 1 ml de tampón 
de fosfato 1M (pH 3.8) + 20% de 
NaCl (w / v). 
i) Inmersión de la fibra: 30 min, 
agitación magnética, temperatura 
ambiente. 
ii) Desorción: 3 min en vial con 
metanol. 
iii) Evaporación a sequedad. 
Corriente de aire comprimido, 
temperatura ambiente. 
iv) Redisolución en 100 μL de fase 
móvil. 
Columna quiral Chiralpak AS 
(250mm × 4.6 mm, 10μm). 
Fase móvil isocrática (95:5, v/v): 
A: hexano 
B: isopropanol 
 
Moraes de 
Oliveira, A. R. 
et al, 2005 
18 
 
 
 
Tabla 3. Métodos para el estudio del metabolismo del ibuprofeno en distintas matrices y especies. (Continuación) 
Analitos 
Matriz/ 
Especie 
Técnica analítica 
Pretratamiento de 
muestra 
Tratamiento de muestra Condiciones de análisis Referencia 
Glucurónidos de los 
compuestos: 
1-hidroxiibuprofeno 
2-hidroxiibuprofeno 
3-hidroxiibuprofeno 
Carboxiibuprofeno 
Ibuprofeno 
(4 isómeros) 
Orina/ 
Humano 
UPLC/TOF 
Modo negativo. 
Alterna baja y alta 
energía de colisión 
Sin especificar Sin especificar 
 
Columna ACQUITY C18 (2.1 x 
150 mm, 1.7 μm BEH) ultra-
performance liquid 
chromatography (UPLC). 
Temperatura: 65ºC 
Gradiente de elución. Fase móvil: 
A: acetonitrilo 
B: acetato de amonio acuoso 
(pH 5). 
Plumb, R. S. et 
al, 2007 
2-hidroxiibuprofeno 
Carboxiibuprofeno 
Ibuprofeno 
 
Orina/ 
Humano 
HPLC-RMN (300 MHz) 
 
Toma de muestra: a las 
4 h de la ingestión. 
Adición de 
estabilizante: azida 
sódica (0.1%, w/v). 
Centrifugación: 
Alícuota de 15 ml, 3000 
rpm durante 30 min. Se 
recoge el sobrenadante. 
Almacenamiento: 
congelada a -80 ◦ C. 
 
 
Hidrólisis alcalina: 10 ml orina + 1 
ml de KOH. Calentamiento a 60ºC 
durante 15 min. 
Enfriar a temperatura ambiente. 
Ajuste a pH 2: ácido fosfórico. 
Dilución con agua (50/50). 
SPE: cartuchos Oasis Max (6 
cm3/150 mg). 
i) Acondicionamiento: 3ml t-
butiletiléter + 3 ml metanol + 3 ml de 
agua. 
ii) Carga de la muestra:10 ml. 
iii) Lavado: 3 ml de NaOAc 50 mM + 
4 ml de MeOH. 
 iv) Elución de analitos: 4 ml 
disolución MTBE/MeOH/TFA 
(89:10:1) 
v) Evaporación a sequedad, con 
nitrógeno. 
vi) Reconstitución con 0,4 ml 
acetonitrilo/ agua (30:70). 
 
Columna Hypersil GOLD C18 (150 
mm × 2,1 mm). 
Gradiente de elución. Fase móvil: 
A: Agua (pH 3 con ácido 
acético) 
B: Acetonitrilo (pH 3 con ácido 
acético) 
 
Columna de preconcentración 
previa al RMN: Aquasil C18 (50 
mm x 1.0 mm). 
 
Djukovic, D. et 
al, 2007 
19 
 
 
 
 
 
Tabla 3. Métodos para el estudio del metabolismo del ibuprofeno en distintas matrices y especies. (Continuación) 
Analitos 
Matriz/ 
Especie 
Técnica analítica 
Pretratamiento de 
muestra 
Tratamiento de muestra Condiciones de análisis Referencia 
Ibuprofeno 
2-hidroxiibuprofeno 
3-hidroxiibuprofeno 
Éter glucurónido del 
hidroxiibuprofeno 
Acil glucurónido del 2-
hidroxiibuprofeno 
Acil glucurónido del 
ibuprofeno 
Taurina conjugada del 
ibuprofeno 
Taurina del éter glucurónido 
de los hidroxiibuprofenos 
Bilis/ 
Trucha 
LC-ESI(-) -Q-TOF-MS 
 
LC- ESI(-)-IT-MS 
 
 
Toma de muestra: Tras 
la exposición diaria. 
Almacenamiento: 
congelada a -80 ◦ C. 
 
 
Hidrólisis enzimática: Disolución 
de la enzima en 200μl de tampón de 
acetato 1M (pH 5) + 250 ng de 
patrón interno (D3-IBF) + alícuota de 
60-100 μL de muestra. 
Incubación 4h a 37ºC. Dilución con 
1 ml de agua desionizada (pH 2). 
SPE: Cartuchos Oasis HLB 3 cm2 60 
mg. 
i) Acondicionamiento: 3 ml de 
metanol y 3 ml de agua (pH2). 
 ii) Carga de la muestra. 
iii) Lavado: 1 ml de agua (pH 2) y 1 
ml de metanol 20%. 
iv) Elución: 1 ml de metanol al 80% 
en NH4OH 2%. 
v) Evaporación del extracto. 
vi) Redisolución con 300μl de 
acetonitrilo 2% en hidróxido amónico 
0.01M. 
 
Columna XBridge C18 (2.1 x 50 
mm, 3.5 μm). 
Precolumna de la la misma marca 
(2.1 x 10mm, 3.5 μm). 
Temperatura 30ºC 
Fase móvil: 
A: acetato de amonio 0.01M. 
B: acetonitrilo 90% en acetato 
de amonio 0.01M. 
C: hidróxido de amonio 0.01M. 
D: acetonitrilo 90% en 
hidróxido amónico. 
Elución con gradiente de 
concentración A+B o C+D. 
Brozinski, J. M. 
et al, 2013 
1-β-O-acilglucurónido del 
ibuprofeno 
Orina/ 
humano 
UHPLC-FAIMS-ESI-TOF 
UHPLC-FISCID-MS 
Sin especificar 
 
Filtración (filtro de 45 μm). 
Dilución (2x) con una disolución 
del metabolito IAG de 
concentraciones dentro del rango 
0.028 – 22 μg/ml (0.055 -44 μg/ml 
de IAG en fase movil). 
Columna Zorbax C18 (2.1 mm × 
50 mm, 1.8 μm). 
Elución isocrática 50:50. Fase 
móvil: 
A: acetonitrilo 
B: acetato de amonio acuoso 
10 mM, pH 3. 
Smith, R. W. et 
al, 2013 
20 
 
 
Tabla 3. Métodos para el estudio del metabolismo del ibuprofeno en distintas matrices y especies. (Continuación) 
Analitos 
Matriz/ 
Especie 
Técnica analítica 
Pretratamiento de 
muestra 
Tratamiento de muestra Condiciones de análisis Referencia 
Ibuprofeno 
1-hidroxiibuprofeno 
2-hidroxiibuprofeno 
3-hidroxiibuprofeno 
carboxiibuprofeno 
 
Orina/ 
Humano 
UHPLC-ESI (-)-MS/MS 
 
QTRAP Triple 
cuadrupolo 
 
Sin especificar 
 
Hidrólisis: 2 ml orina + 20.0 ng/ml 
IS + 400μl de NaOH 1M (Tª 
ambiente, 30 min). 
Neutralización: 400μl de HCl 1M. 
USAEME: i) 2 ml muestra NaCl 15% 
(w/v), pH 2 . ii) 100μL de 1-octanol. 
iii) Agitación manual 10 s. iv) Baño 
de ultrasonidos 10 min. v) Agitación 
manual 10 s. vi) Centrifugación 6500 
rpm, 5 min. vii) Recoger 50μL de 
sobrenadante. viii) Disolución de 
10μL 90μL de metanol. ix) Inyección 
de 5μl. 
Columna Zorbax Rapid Resolution 
High Definition (RRHD) SB-C18 
(50 × 2.1 mm, 1.8 μm de diámetro 
de partícula, Agilent Technologies, 
Waldbronn,Germany). 
Temperatura 35ºC. 
Gradiente de elución. Fase móvil: 
‐ A: 0.1% ácido fórmico en 
agua (pH 3.0) 
‐ B: acetonitrilo. 
Magiera, S., 
Gülmez, S., 
2014 
21 
En los métodos encontrados, las combinaciones entre las técnicas de tratamiento y 
preparación de muestra y las técnicas de detección son numerosas. 
En la mayor parte de la bibliografía revisada, la recogida de las muestras de orina se 
ha realizado de forma periódica dentro de las primeras 24 o 32 horas tras la 
administración de la dosis y, en general, es posible almacenarlas a -20ºC sin que 
sufra alteraciones (Moraes de Oliveira, A. R. et al, 2005; Magiera, S., Gülmez, S., 
2014), aunque ciertos autores aseguran la integridadde las muestras 
conservándolas a una temperatura más baja (–80 ºC) (Djukovic, D. et al, 2007; 
Brozinski, J. M. et al, 2013). Además se han descrito operaciones previas al 
almacenamiento como pueden ser el ajuste del pH, la adición de sustancias 
estabilizantes, como la azida sódica, y la eliminación de partículas en suspensión 
mediante centrifugación, así se garantiza su adecuada conservación (Kepp, D.R. et 
al, 1997; Djukovic, D. et al, 2007). 
En los métodos mencionados, el tratamiento de muestra tiene como finalidad el 
aislamiento y la preconcentración de los analitos mediante el uso de diferentes 
técnicas, entre ellas, la extracción en fase sólida (SPE) (Kepp, D.R. et al, 1997; 
Djukovic, D. et al, 2007; Brozinski, J. M. et al, 2013), la microextracción en fase 
sólida (SPME) (Moraes de Oliveira, A. R. et al, 2005) o la microextracción-
emulsificación asistida por ultrasonidos (USAEME) (Magiera, S., Gülmez, S., 2014). 
En ciertas ocasiones estas técnicas de separación van acompañadas de otras 
operaciones que adecuen la muestra a los requisitos de la técnica de separación o 
de análisis que se va a emplear: ajuste de pH, hidrólisis, dilución o adición de patrón 
interno. 
En cuanto al análisis instrumental, la cromatografía líquida es la técnica analítica 
más utilizada en este tipo de estudios, ya que sirve para la detección de analitos no 
volátiles, polares y/o inestables térmicamente, características que pueden presentar 
los metabolitos del ibuprofeno. Los primeros métodos desarrollados para este fin 
utilizaban la cromatografía de alta resolución (HPLC) con detección UV. Con esta 
técnica de análisis ha sido posible desarrollar métodos cuantitativos para la 
determinación simultánea de los metabolitos de fase I y de fase II del ibuprofeno 
(Kepp, D.R. et al, 1997). Algunos años después, se describió la determinación 
conjunta de los dos enantiómeros del 2-hidroxiibuprofeno y los cuatro 
estereoisómeros del carboxiibuprofeno, mediante HPLC-UV usando una columna 
quiral (Moraes de Oliveira, A. R. et al, 2005). Posteriormente, también se han 
22 
utilizado otras técnicas para obtener información estructural de los metabolitos como 
por ejemplo RMN (Djukovic, D. et al, 2007). También se han descrito metodologías 
de análisis más sensibles que permiten cuantificar bajas concentraciones de algunos 
metabolitos. Este es el caso de la cromatografía líquida acoplada con detectores de 
masas, por ejemplo, las metodologías que utilizan la cromatografía líquida de 
ultraresolución acoplada a un detector de masas de alta resolución con analizador 
de tiempo de vuelo (UPLC-TOFMS) (Plumb, R. S. et al, 2007). Recientemente se ha 
utilizado cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-
MS/MS) (Brozinski, J. M. et al, 2013; Magiera, S., Gülmez, S., 2014) o se ha 
incorporado en estos sistemas un dispositivo de espectrometría de movilidad de 
iones (FAIMS) que mejora drásticamente la selectividad del análisis (Smith, R. W. et 
al, 2013). 
 
 
2.6. Objetivos 
 
Los objetivos principales de este trabajo son los siguientes: 
1) Desarrollar y validar un método analítico para el análisis del metabolismo del 
ibuprofeno en orina humana mediante HPLC-MS de alta resolución. 
2) Realizar un estudio de la eliminación urinaria del ibuprofeno, mediante la 
aplicación del método desarrollado. 
3) Identificar los metabolitos del ibuprofeno presentes en la orina humana tras la 
administración oral de una dosis determinada, a partir de la determinación de la 
masa exacta de los compuestos y del estudio de los fragmentos característicos de 
cada uno de ellos. 
 
 
3. EXPERIMENTAL 
 
 
3.1. Materiales y reactivos 
 
El patrón de ibuprofeno de calidad analítica se adquirió a través de Sigma Aldrich 
(Madrid, España). Se prepararon disoluciones concentradas (500 mg/L) de 
23 
ibuprofeno en metanol. La disolución completa del compuesto se conseguía usando 
como disolvente metanol, de grado HPLC adquirido de Sigma Aldrich (Madrid, 
España). La disolución patrón de ibuprofeno en metanol que se almacenó en el 
congelador a una temperatura de -20ºC, se empleó para preparar disoluciones de 
menor concentración (50, 10, 1 y 0.1 mg/L). El agua de grado HPLC para los análisis 
se obtuvo de un sistema de agua Mili-Q-Plus ultra pura de Millipore (Milford, EEUU). 
Para la extracción en fase sólida se usaron cartuchos de tipo polimérico (Varian 
Bond Elut Plexa, 200 mg, 6 ml). Los filtros de jeringa utilizados eran de 0.45 µm 
(Millipore Milford, EEUU). 
 
 
3.2. Recogida de muestras 
 
Para el estudio del metabolismo urinario del ibuprofeno en humanos, se siguieron las 
Directrices del Comisión de Ética de la Universidad de Jaén utilizando el material de 
seguridad y tomando las precauciones adecuadas (Anexo). Se administraron 900 
mg de ibuprofeno por vía oral y las muestras de orina se recogieron durante las 48 
horas posteriores (16 muestras). La muestra de orina recogida con anterioridad a la 
ingestión de ibuprofeno se utilizó como blanco. 
 
 
3.3. Preparación de la muestra 
 
Las etapas de la extracción en fase sólida realizadas fueron las siguientes: 
1) Acondicionamiento: Se acondiciona el cartucho dos veces con 3 mL de metanol, 
seguido de dos veces 3 mL de agua ultrapura, en ambos casos con un flujo de 3 
mL/min. 
2) Carga de muestra: Se hacen pasar 3 mL de muestra de orina a la que 
previamente se le han añadido 3 mL de disolución tampón de ácido acético/acetato 
amónico (100 mM, pH 2.85). Se emplea un flujo de 1 mL/min. 
3) Lavado: Se emplean 3 mL de agua ultrapura. 
24 
4) Elución: Los analitos retenidos en el cartucho se eluyen dos veces con un 
volumen de 3 mL de metanol, a un flujo de 1 mL/min. El eluato se recoge en un tubo 
de ensayo de 15 mL. 
5) Evaporación del extracto: Se utiliza un baño de agua a 35ºC y una corriente de 
nitrógeno, de forma que se consigue la evaporación del extracto hasta casi 
sequedad. 
6) Reconstitución del extracto: Se añaden 100 μL de metanol y se agita en un Vortex 
con el fin de conseguir la completa disolución de los analitos. Después se añade 
agua ultrapura hasta alcanzar un volumen final de 600 μL. De esta forma se 
consigue un factor de preconcentración 5 (volumen inicial de muestra: 3 mL en orina; 
volumen final de muestra: 0.6 mL en un 16% de metanol). 
7) Filtración: Se filtran los 0.6 mL de muestra con un filtro de HPLC de 0.45 μm de 
tamaño de poro y se trasvasan a un vial. Si el análisis no se realiza de forma 
inmediata, las muestras se conservan en el congelador a -20ºC. 
Debido a la complejidad de la muestra y a las elevadas concentraciones de los 
metabolitos del ibuprofeno, se realizó también un segundo análisis en el que se 
utilizaron diluciones de los extractos anteriores. Se tomaron 100 μL de extracto y se 
diluyeron con 900 μL de agua ultrapura, obteniéndose así una dilución 1:2 de la 
muestra. 
 
 
3.4. Instrumentación 
 
La separación de los analitos en los extractos de orina se llevó a cabo usando un 
sistema de cromatografía de líquidos, HPLC (Agilent Series 1290 INFINITY, Agilent 
Technologies, Santa Clara, EEUU) equipado con una columna analítica de fase 
reversa C18 de 4.6 mm x 100 mm y 1.8 μm de tamaño de partícula (Zorbax). Se 
inyectaron 20 μL de extracto en cada análisis. Se empleó un gradiente de elución en 
el que las fases móviles A y B eran agua milli-Q con 0.1% de ácido fórmico y 
acetonitrilo, respectivamente. La composición inicial de la fase móvil (10% 
acetonitrilo) se mantuvo constante durante 3 minutos y, a continuación, ésta cambió 
conforme a un gradiente lineal hasta alcanzar una composición correspondiente al 
25 
100% de acetonitrilo, la cual se mantuvo durante los tres últimos minutos de análisis 
(Tabla 4). El flujo fue de 0.5 mL/min. 
 
Tabla 4. Gradientes de elución empleados. 
Método 1 Método 2 
Tiempo (min) %B Tiempo (min) %B 
0 10 0 10 
3 10 3 10 
5 255 25 
20 70 30 50 
22 100 33 100 
25 100 38 100 
 
El sistema HPLC estaba conectado a un espectrómetro de masas con analizador de 
tiempo de vuelo (Agilent 6220 TOF, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 
equipado con una interfase de electrospray (ESI) operando en modo de ionización 
negativo. Las condiciones de la fuente ESI se detallan a continuación: 
‐ Voltaje del capilar, 4000 V. 
‐ Presión del gas de nebulización, 40 psi. 
‐ Caudal del gas de secado, 9 L/min. 
‐ Temperatura del gas de secado, 325ºC. 
‐ Voltaje del octapolo, 250 V. 
‐ Voltaje de fragmentación, 190 V, para obtener información estructural de 
fragmentos debido a disociación inducida por colisiones de las especies de 
interés en la región de transporte de iones (in-source CID), que se ha usado para 
estudiar la fragmentación). 
El rango de masas en el que se trabaja estaba comprendido m/z 50 y 1000. 
 
 
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
4.1. Optimización del método 
 
Los primeros experimentos realizados en este estudio se centraron en la 
optimización de la separación cromatográfica de los compuestos estudiados, el 
ibuprofeno y sus metabolitos. Para ello, en estas primeras pruebas se inyectaron 
26 
patrones de ibuprofeno de 10 mg/L y se estableció el método más adecuado para la 
separación de los analitos. En él, el ibuprofeno debía salir a un tiempo de retención 
lo suficientemente alto como para que los metabolitos, de carácter más polar, 
pudiesen quedar bien separados en el cromatograma a tiempos de retención 
inferiores. Se probaron dos métodos con las condiciones cromatográficas descritas 
en el apartado 3.4. El primero de ellos fue un método de 25 minutos, cuyo TIC se 
ilustra en la Figura 7A. La Figura 7B corresponde al TIC para un análisis de 38 
minutos. Mientras que en el primer método todos los compuestos eluyen en los 
primeros 17 minutos de análisis (tiempo de retención del ibuprofeno, tR = 16.658 
minutos), en el segundo son eluídos en un período de tiempo más amplio (tiempo de 
retención del ibuprofeno, tR = 28.511 minutos), de forma que quedan mejor 
separados. 
 
 
Figura 7. Comparación de los TIC obtenidos para la muestra de orina recogida 
aproximadamente 2 horas después de la ingestión. A) Método de análisis de 25 minutos. B) 
Método de análisis de 38 minutos. 
 
Se escogió el segundo método para la identificación de los analitos en extractos de 
orina diluidos 1:2 para que no se saturase el detector a causa de las elevadas 
concentraciones de metabolitos. Sin embargo, como la cantidad de ibuprofeno 
excretado sin metabolizar es mínima, para realizar la curva de eliminación del 
ibuprofeno se utilizaron extractos de orina preconcentrados 5:1 y se analizaron con 
el método más corto. 
A 
B 
27 
4.2. Validación del método 
 
Para la validación del método analítico los parámetros que se han estudiado han 
sido los límites de detección y cuantificación, el efecto matriz y los valores del 
coeficiente de correlación, que se muestran en la Tabla 5. 
 
Tabla 5. Parámetros estudiados para la validación del método analítico 
 m/z teórica tR(min) 
LOD 
(mg/L) 
LOQ (mg/L) 
Intervalo 0.2 – 10 mg/L 
Efecto matriz R2 
Ibuprofeno 205.1234 28.5 0.22 0.83 1.08 (+ 8%) 0.9834
 
El límite de detección se define como la mínima concentración de analito que 
proporciona una señal que puede distinguirse del ruido de fondo, pero sin especificar 
la precisión. El límite de cuantificación es la menor concentración de analito que se 
puede determinar con la precisión requerida. Para su determinación se sigue el 
criterio 10σ y 3σ: En cuanto al límite de cuantificación, se admite que corresponde a 
la concentración de analito en matriz de orina cuyo cromatograma extraído de un ion 
da una señal-ruido de 10; y en cuanto al límite de detección, se admite que 
corresponde a la concentración de analito en matriz de orina cuyo cromatograma 
extraído de un ion da una señal-ruido de 3. Estos límites fueron estimados a partir 
de la señal-ruido de los patrones preparados en matriz para la recta de calibrado. 
El efecto matriz fue estudiado preparando dos rectas de calibrado. En la primera de 
ellas, se prepararon patrones de ibuprofeno de distintas concentraciones (10, 5, 2, 1, 
0.5, 0.1 mg/L) en metanol:agua, con la finalidad de que la disolución que se 
inyectase tuviese una composición similar a la de la fase móvil. En la segunda, se 
prepararon patrones en orina (exenta de analito) de las mismas concentraciones que 
las utilizadas para la recta de calibrado anterior. La orina que se empleó había sido 
previamente pretratada siguiendo el procedimiento de preparación de muestra 
descrito en el apartado 3.3. El efecto matriz corresponde al cociente entre las dos 
pendientes obtenidas para cada una de las rectas de calibrado, en matriz y en 
disolvente. En la Tabla 5 se muestra que la ratio de las pendientes no era 
significativamente distinta. Por último, la linealidad del método es buena, tal y como 
demuestra el valor del coeficiente de correlación. 
 
28 
 
4.3. Estudio de eliminación del ibuprofeno 
 
El estudio de la excreción del ibuprofeno por vía renal se realizó mediante el 
seguimiento de la cantidad de ibuprofeno excretada en la orina en función del tiempo 
(Figura 8). La cuantificación se llevó a cabo utilizando las áreas obtenidas en el 
cromatograma extraído (con una ventana de error de masa de 20 ppm) de la 
molécula desprotonada del ibuprofeno en cada una de las muestras. La curva 
alcanza un máximo en las primeras horas y, a continuación, a partir de la muestra 
que se recogió 14 horas después de la ingesta de ibuprofeno, disminuye la 
concentración excretada hasta que se hace nula. Como resultado del estudio 
cuantitativo, se obtuvo que menos del 1% de la dosis administrada fue excretada por 
vía renal de forma inalterada, ya que la mayoría se excreta como conjugado. Este 
resultado es consistente con lo descrito por otros autores (Kepp et al., 1997). 
 
 
 
Figura 8. Curva de eliminación del ibuprofeno 
 
 
4.4. Identificación y confirmación de compuestos mediante cromatografía 
de líquidos de alta resolución acoplada a espectrometría de masas con 
analizador de tiempo de vuelo (LC-TOFMS) 
 
Para la identificación de los compuestos en cada una de las muestras se ha 
procedido del modo que se describe a continuación: 
1) Análisis de las muestras y obtención del cromatograma total de iones (TIC). 
2) Cálculo de la m/z teórica del ion [M-H]-: Se calcula la masa exacta del analito a 
partir de su fórmula molecular y después a este valor se le resta la masa del protón. 
‐0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 5 10 15 20 25 30 35
Ib
u
p
ro
fe
n
o
 (
m
g)
Tiempo (h)
29 
3) Obtención del cromatograma extraído de iones (EIC) para la m/z de [M-H]-. 
4) Obtención del espectro de masas correspondiente al pico cromatográfico del 
analito, con el fin de estudiar la fragmentación del compuesto. 
5) Comprobación del error en la medida de la masa exacta, pues debe ser inferior a 
±5 ppm. 
6) Confirmación de los fragmentos: Para confirmar que, efectivamente, los iones 
identificados como fragmentos de los analitos son resultado de la fragmentación del 
mismo, se comprueba que coincidan los perfiles de los EIC del ion [M-H]- y de los 
iones de los fragmentos. 
En la Figura 8, se ilustra la aplicación de este procedimiento a la identificación del 
ibuprofeno excretado sin modificar. 
 
30 
Figura 8. Diagrama de la identificación del ibuprofeno en una muestra de orina recogida 
aproximadamente 3 horas después de la ingesta. 
 
1) Obtención del TIC 
3) Obtención del EIC 
2) Cálculo de la m/z teórica de [M-H]- 
4) Obtención del MS 
5) Comprobación del error 
6) Coincidencia de los 
perfiles de los EIC
m/z teórica(C13H17O2
-) = 205.1234 
205.1231 
 
161.1334 
Error, C13H17O2
- (ppm) = 1.02 
Error, C12H17
- (ppm) = 1.69 
Fragmento de m/z 
161.1334 
[M-H]- 
31 
Enla Tabla 4 se recogen todos los datos necesarios para la identificación y 
confirmación del ibuprofeno y sus metabolitos en orina humana. 
Para la mayoría de los compuestos identificados el error en la medida de la masa 
exacta es inferior a ±5 ppm, excepto ciertos casos en los que los picos tenían muy 
baja intensidad. Una composición elemental se da por confirmada una vez que se 
encuentren al menos dos iones con un error inferior a ±5 ppm. El error calculado es 
un error relativo que se expresa en tanto por millón: 
Error	 ppm 	
m z	 M H⁄ experimental 	m z	 M H⁄ teórica	
m z	 M H⁄ teórica
	x	10 
Ninguno de estos compuestos se detectaron en la muestra de orina utilizada como 
blanco (muestra recogida previamente a la ingesta de ibuprofeno). Ni la 
estereoquímica del ibuprofeno o de sus metabolitos, ni la inversión quiral de la forma 
R(-) a la S(+), pudieron ser determinadas pues es una limitación inherente a la 
espectrometría de masas. 
Los resultados obtenidos están de acuerdo con los que aparecen en la bibliografía 
disponible sobre el metabolismo urinario del ibuprofeno (Plumb, R. S. et al, 2007). 
 
   
32 
Tabla 4. Recopilación de datos espectrométricos sobre el ibuprofeno y los metabolitos detectados 
Compuesto tR (min) 
Composición 
elemental 
Ion 
detectado 
m/z 
teórica 
m/z 
experimental 
Error 
(ppm) 
Ibuprofeno 28.511 
C13H18O2 C13H17O2
- 205.1234 205.1231 1.69 
C12H18 C12H17
- 161.1336 161.1334 1.02 
Derivados 
glucurónidos del 
ibuprofeno 
1 17.505 C19H26O8 C19H25O8
- 381.1555 381.1569 -3.72 
2 17.731 
C19H26O8 C19H25O8
- 381.1555 381.1571 -4.16 
C13H18O2 C13H17O2
- 205.1234 205.1238 -2.06 
C6H10O7 C6H9O7
- 193.0354 193.0356 -1.19 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0250 -0.94 
C12H18 C12H17
- 161.1336 161.1330 3.72 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0242 1.94 
3 17.863 
C19H26O8 C19H25O8
- 381.1555 381.1572 -4.49 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0253 -2.87 
Derivados 
glucurónidos del 
hidroxiibuprofeno 
4 6.609 
C19H26O9 C19H25O9
- 397.1504 397.1520 -4.07 
C13H18O3 C13H17O3
- 221.1183 221.1187 -1.73 
C12H18O C12H17O
- 177.1285 177.1292 -4.00 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0252 -2.08 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0244 0.34 
5 6.760 
C19H26O9 C19H25O9
- 397.1504 397.1523 -4.82 
C13H18O3 C13H17O3
- 221.1183 221.1190 -3.29 
C12H18O C12H17O
- 177.1285 177.1288 -1.98 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0249 -0.26 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0247 -2.40 
6 6.827 
C19H26O9 C19H25O9
- 397.1504 397.1521 -4.25 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0250 -0.80 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0245 -0.59 
7 6.978 
C19H26O9 C19H25O9
- 397.1504 397.1528 -5.92 
C13H18O3 C13H17O3
- 221.1183 221.1186 -1.14 
C6H10O7 C6H9O7
- 193.0354 193.0356 -1.30 
C12H18O C12H17O
- 177.1285 177.1283 0.85 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0249 -0.40 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0240 3.38 
8 7.044 
C19H26O9 C19H25O9
- 397.1504 397.1524 -4.88 
C13H18O3 C13H17O3
- 221.1183 221.1188 -2.21 
C6H10O7 C6H9O7
- 193.0354 193.0367 -6.63 
C12H18O C12H17O
- 177.1285 177.15289 -2.16 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0247 0.87 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0240 3.30 
9 7.308 
C19H26O9 C19H25O9
- 397.1504 397.1524 -5.02 
C13H18O3 C13H17O3
- 221.1183 221.1186 -1.31 
C6H10O7 C6H9O7
- 193.0354 193.0360 -3.13 
C12H18O C12H17O
- 177.1285 177.1280 2.72 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0247 0.45 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0236 7.42 
10 7.639 
C19H26O9 C19H25O9
- 397.1504 397.1522 -4.44 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0250 -1.23 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0242 2.10 
11 7.941 
C19H26O9 C19H25O9
- 397.1504 397.1522 -4.42 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0251 -1.47 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0239 4.23 
12 8.026 
C19H26O9 C19H25O9
- 397.1504 397.1523 -4.72 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0252 -2.25 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0243 1.14 
13 8.338 
C19H26O9 C19H25O9
- 397.1504 397.1523 -4.85 
C13H18O3 C13H17O3
- 221.1183 221.1185 0.71 
C6H10O7 C6H9O7
- 193.0354 193.0354 0.00 
C12H18O C12H17O
- 177.1285 177.1279 3.51 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0248 0.29 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0244 0.14 
Derivados 
hidroxilados del 
ibuprofeno 
 
14 9.698 
C13H18O3 C13H17O3
- 221.1183 221.1189 -2.83 
C12H18O C12H17O
- 177.1285 177.1289 -2.46 
C9H10O C9H9O
- 133.0659 133.0658 0.37 
15 10.557 
C13H18O3 C13H17O3
- 221.1183 221.1191 3.35 
C12H18O C12H17O
- 177.1285 177.1287 -1.40 
16 12.455 
C13H18O3 C13H17O3
- 221.1183 221.1189 -2.53 
C12H18O C12H17O
- 177.1285 177.1288 -1.98 
 
   
33 
Tabla 4. Recopilación de datos espectrométricos sobre el ibuprofeno y los metabolitos detectados 
(Continuación) 
Compuesto tR (min) 
Composición 
elemental 
Ion 
detectado 
m/z 
teórica 
m/z 
experimental 
Error 
(ppm) 
Derivados 
glucurónidos del 
carboxiibuprofeno 
17 7.088 
C19H24O10 [M-H]
- 411.1297 411.1311 -3.46 
C6H10O7 C6H9O7
- 193.0354 193.0360 -2.97 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0255 -3.36 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0246 -1.35 
18 7.248 
C19H24O10 [M-H]
- 411.1297 411.1315 -4.50 
C13H16O4 C13H15O4
- 235.0976 235.0982 -2.67 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0251 -1.87 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0241 2.44 
19 7.343 
C19H24O10 [M-H]
- 411.1297 411.1315 -4.46 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0252 -2.27 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0240 3.98 
20 7.503 
C19H24O10 [M-H]
- 411.1297 411.1316 -4.64 
C13H16O4 C13H15O4
- 235.0976 235.0980 -1.76 
C6H10O7 C6H9O7
- 193.0354 193.0361 -3.82 
C12H16O2 C12H15O2
- 191.1078 191.1079 -0.74 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0251 -1.78 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0245 -0.97 
21 7.579 
C19H24O10 [M-H]
- 411.1297 411.1310 -3.16 
C6H8O6 C6H7O6
- 175.0248 175.0242 3.43 
C5H6O3 C5H5O3
- 113.0244 113.0239 4.3 
Derivado carboxilado 
del ibuprofeno 
22 10.591 
C13H16O4 C13H15O4
- 235.0976 235.0982 -2.64 
C12H16O2 C12H15O2
- 191.1078 191.1083 -2.80 
 
El primer compuesto identificado fue el ibuprofeno. Como se disponía de patrones, 
se pudo utilizar el tiempo de retención (tR), que se conoció inyectando una disolución 
patrón de 10 mg/L de ibuprofeno y extrayendo el EIC para la m/z 205.1234 (Figura 
9A), en el cual aparece un pico cuyo tiempo de retención es el del ibuprofeno. A 
continuación, a partir del TIC de uno de los extractos de orina se extrajo el EIC para 
la m/z 205.1234 y, de él, su espectro de masas (Figura 9B) que se utilizó para 
confirmar la identificación usando el valor de la m/z experimental de [M-H]- y el 
fragmento de m/z 161.1334, así como el error de ambos. 
34 
Figura 9. A) EIC para la m/z 205.1234 del patrón de ibuprofeno (10 mg/L). B) EIC para la 
m/z 205.1234 de la muestra recogida aproximadamente 3 horas después de la ingestión. 
 
Los metabolitos 1, 2 y 3, detectados a 17.505, 17.731 y 17.863 minutos, 
corresponden a glucurónidos del ibuprofeno. Esta biotransformación está asociada a 
una variación en la masa de +176.0321 Da, debida a la adición de C6H8O6, lo cual 
genera derivados con m/z 381.1555. Aunque la conjugación con el ácido glucurónico 
sólo puede producirse en un único sitio de la molécula, el grupo funcional ácido 
carboxílico, es posible justificar la presencia de estos tres metabolitos si tenemos en 
cuenta que pueden generarse isómeros: por un lado, el compuesto puede ser 
excretado como una mezcla de glucurónidos del R-ibuprofeno y del S-ibuprofeno, ya 
que éste ha sido administrado como racémico; por otro lado, la unión tipo éster del 
glucurónido puede experimentar reacciones de transacilación y provocar la 
presencia de hasta cuatro isómeros diferentes, es decir, los correspondientes a los 
compuestos 1-, 2-, 3- y 4-β- acilglucurónidos (Bailey, M. J., Dickinson, R. G., 2003). 
Sin embargo, con la técnica empleada no podemos conocer a cuáles de las 
posibilidades anteriores corresponden los tres metabolitos detectados. 
En la Figura 10 se muestra el EIC para el ion de m/z 381.1555 y los espectros de 
masas de cada uno de los tres picos identificados como glucurónidos del ibuprofeno. 
En los espectros de masas se detectaron, aunque no en todos loscasos, los 
fragmentos de m/z 205.1234 (pérdida del ácido glucurónico) y m/z 161.1336 
A 
161.1334 
B 
205.1231 
[M‐H]‐ 
28.511 
 
35 
(descarboxilación), así como de la parte correspondiente al ácido glucurónico con 
m/z 193.0354, m/z 175.0248 (pérdida de agua) y m/z 113.0242. 
 
 
Figura 10. EIC para la m/z 381.1555 de la muestra recogida 14 horas después de la ingestión y 
espectros de masas para cada pico. 
 
La adición de un grupo hidroxilo al ibuprofeno da lugar a un aumento de masa de 
+15.9949 Da, en consecuencia se forman iones de m/z 221.1183. El cromatograma 
extraído para este ion se muestra en la Figura 11A, en el cual se ponen de 
manifiesto numerosos picos (6.5 – 18.5 minutos) que pueden corresponder a 
metabolitos hidroxilados tanto de fase I como de fase II, y donde los picos de menor 
tiempo de retención corresponderán a los metabolitos de fase II por ser más polares. 
Los metabolitos de fase II tendrán m/z 397.1504, que corresponde a la masa del 
glucurónido de un hidroxiibuprofeno (variación de masa de +176.0321 Da, respecto 
al hidroxiibuprofeno). Cuando se obtuvo el EIC para m/z 397.1504 (Figura 11B), se 
confirmó que los picos con tiempo de retención entre 6.5 y 8.5 minutos corresponden 
a los glucurónidos de los derivados hidroxilados del ibuprofeno. Se han identificado 
diez de estos metabolitos (metabolitos 4 - 13). Este número tan elevado es 
consecuencia de la formación de diferentes isómeros, entre ellos, los de posición de 
los diferentes derivados hidroxilados, los debidos a la estereoquímica de los 
1 
175.0253 381.1572 
[M‐H]‐ 
[M‐H]‐ 
2 
3 
[M‐H]‐ 
381.1571 
113.0242 205.1238
193.0356 
175.0250 
161.1330
36 
compuestos y los que son productos de reacciones de transacilación, como en el 
caso anterior. 
 
 
Figura 11. A) EIC para la m/z 221.1183 de la muestra recogida 4 horas después aproximadamente. 
B) EIC para m/z 397.1504 de la muestra recogida 12 horas después aproximadamente. 
 
En los espectros de masas que se muestran en la Figura 12 se han detectado los 
siguientes fragmentos cuando han presentado suficiente intensidad: aquellos 
pertenecientes al hidroxiibuprofeno de m/z 221.1183 (pérdida del ácido glucurónico) 
y m/z 177.1285 (descarboxilación); y los debidos al ácido glucurónico con m/z 
193.0354, m/z 175.0248 (pérdida de agua) y m/z 113.0244. 
 
4 5 
6 7 
8 
9 
10 11
12
13
A 
B 
37 
 
Figura 12. Espectros de masas para los picos correspondientes a los glucurónidos del 
hidroxiibuprofeno (metabolitos 4 – 13). 
 
397.1520
221.1187 
177.1292 
113.0244 
175.0252 
[M‐H]‐ 
221.1190 
177.1288175.0249
113.0247
[M‐H]‐ 
* 397.1570
175.0250 
[M‐H]‐ 
* 397.1574
221.1186 
193.0356
113.0240
175.0249
177.1283
4 
397.1524
[M‐H]‐ 
113.0245 
113.0240 
175.0247
177.1285 
193.0367 
221.1188 
397.1524 
[M‐H]‐ 
411.1319
221.1186
193.0360
175.0247
113.0236
397.1522
[M‐H]‐ 
175.0250
113.0242 
397.1522 
[M‐H]‐ 
411.1314175.0251
113.0236
397.1523
[M‐H]‐ 
175.0252
113.0243 
397.1523
[M‐H]‐ 
221.1185 
193.0354
177.1289
175.0248
113.0244
5
6 7
8 9
10 11
12 13
[M‐H]‐ 
397.1523
38 
En cuanto al hidroxiibuprofeno, en la Figura 13 se recogen el cromatograma 
extraído para m/z 221.1183 y los espectros de masas para los tres metabolitos 
identificados como derivados hidroxilados del ibuprofeno (metabolitos 14, 15 y 16). 
De acuerdo con la bibliografía consultada, la hidroxilación puede ocurrir en tres sitios 
diferentes de la cadena alquílica unida al anillo aromático del ibuprofeno, de tal 
manera que es posible la formación de tres metabolitos distintos: 2-hidroxiibuprofeno 
(mayoritario), 3-hidroxiibuprofeno y 1-hidroxiibuprofeno (minoritarios). El metabolito 
14 corresponde al 2-hidroxiibuprofeno, en primer lugar debido a la mayor intensidad 
del pico y en segundo lugar debido a la presencia de un fragmento de m/z 133.0658 
intenso; entre los dos picos de menor intensidad podemos distinguir el 3-
hidroxiibuprofeno (metabolito 15) del 1-hidroxiibuprofeno (metabolito 16) ya que el 
espectro de masas de este último presenta una señal de gran intensidad 
correspondiente a un fragmento característico de m/z 159.1182 (Neunzig, I. et al, 
2011; Magiera, S., Gülmez, S., 2014). 
 
Figura 13. EIC para m/z 221.1183 de la muestra recogida 4 horas después aproximadamente y 
espectros de masas para cada pico correspondiente a un hidroxiibuprofeno. 
[M‐H]‐ 
221.1189177.1288 
*221.1217 
133.0658
*177.1304  [M‐H]‐ 
[M‐H]‐ 
221.1191
177.1287 
14 
15 
16
159.1182
39 
El metabolismo urinario del ibuprofeno conduce a los derivados hidroxilados hasta 
su completa oxidación, generando un compuesto carboxilado, el cual puede 
posteriormente conjugarse con el ácido glucurónico. De acuerdo con la bibliografía 
revisada, el intermedio en la formación del derivado carboxilado es el 3-
hidroxiibuprofeno (Moraes de Oliveira, A. R. et al, 2005). La oxidación del alcohol a 
ácido carboxílico provoca un aumento de masa de +13.9792 Da, en consecuencia se 
forman iones de m/z 235.0976. El EIC para [M-H]- es el que aparece en la Figura 
14A, en él se ponen de manifiesto varios picos, uno de ellos más intenso y a mayor 
tiempo de retención que los otros. El metabolito 22, con tiempo de retención de 
10.591 minutos corresponde al carboxiibuprofeno. En su espectro de masas se pudo 
identificar un fragmento de m/z 191.1083 (pérdida de CO2 neutro). Los metabolitos 
17, 18, 19, 20 y 21, son los que tienen tiempos de retención más bajos (7.088, 
7.248, 7.343, 7.503 y 7.579 minutos, respectivamente) y corresponden a 
glucurónidos del carboxiibuprofeno, como podemos comprobar cuando se extrae el 
EIC para m/z 411.1297 (Figura 14B). La identificación de cinco isómeros se debe a 
la estereoquímica del compuesto y a productos de transacilación. En los espectros 
de masas observamos que, cuando la intensidad es lo suficientemente alta, la 
fragmentación genera los siguientes iones: aquellos característicos del 
carboxiibuprofeno con m/z 235.0976 (pérdida del ácido glucurónico), m/z 191.1078 
(descarboxilación); y los debidos al ácido glucurónico con m/z 193.0354, m/z 
175.0248 (pérdida de agua) y m/z 113.0244. 
 
40 
Figura 14. A) EIC para la m/z 235.0976 de la muestra recogida 14 horas después y espectros de 
masas. B) EIC para la m/z 411.1297 de la muestra recogida 14 horas después de la administración y 
espectros de masas para cada pico. 
 
 
 
*397.1536
[M‐H]‐ 
411.1311113.0246 
175.0255 
193.0360 
[M‐H]‐ 
411.1315
235.0982 
175.0251
113.0241 
*411.1335
[M‐H]‐ 
175.0251 113.0240
*411.1341
[M‐H]‐ 
235.0980 
193.0361 
191.1079 
175.0251
113.0245
[M‐H]‐ 
411.1310175.0242
113.0239
17 
18 
19 
20
21
Glucurónidos del 
carboxiibuprofeno 
*411.1341
191.1083 
235.0982 
[M‐H]‐ 
22
B 
A 
41 
5. CONCLUSIONES 
 
En esta memoria se ha propuesto un método para el estudio del metabolismo 
urinario del ibuprofeno en humanos mediante HPLC-TOFMS. A partir de los 
resultados obtenidos se pueden extraer las siguientes conclusiones: 
1) Se ha desarrollado un método eficaz para cuantificar ibuprofeno, estudiar su 
eliminación y la formación de los principales metabolitos. 
2) Se han identificado 22 metabolitos empleando LC-TOFMS y medidas de 
masas exactas de iones y fragmentos característicos. Los resultados obtenidos 
son consistentes con la bibliografía descrita anteriormente (Plumb et al, 2007), e 
incluso el número de especies diferentes identificadas es superior a la de los 
estudios previos (22 frente a 14). 
3) Aunque no se puede elucidar la posición de las sustituciones ni el orden de 
elución de los isómeros, la información que se extrae para estudiar el 
metabolismo es muy completa. Sería necesario el uso de experimentos MS/MS y 
MSn, por ejemplo mediante el uso de un LC-QTOFMS, para poder profundizar en 
esta información. 
 
 
6. BIBLIOGRAFÍA 
 
 Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios,Utilización de 
medicamentos antiinflamatorios no esteroides (AINE) en España durante el 
periodo 2000-2012, 2014. 
 
 Aleixandre, A., Puerro, M., Capítulo 2: Metabolismo y excreción de los fármacos 
en Farmacología básica y clínica, 2008, Madrid, Editorial Médica Panamericana. 
 
 Bailey, M. J., Dickinson, R. G. Acyl glucuronide reactivity in perspective: biological 
consequences. Chemico-Biological Interactions, 145 (2003), 117-137. 
 
42 
 Brozinski, J. M., Lahti, M., Oikari, A., Kronberg, L. Identification and dose 
dependency of ibuprofen biliary metabolites in rainbow trout. Chemosphere, 93 
(2013), 1789-1795. 
 
 Del Arco, C., Capitulo 5: Metabolismo de los fármacos en Farmacología Humana, 
2008, Barcelona, Elsevier Masson. 
 
 Djukovic, D., Appiah-Amponsah, E., Shanaiah, N., Gowda, G. A. N., Henry, I., 
Everly, M., Tobias, B., Raftery, D. Ibuprofen metabolite profiling using a 
combination of SPE/column-trapping and HPLC–micro-coil NMR. Journal of 
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 47 (2008), 328-334. 
 
 Domínguez-Romero, J. C., García-Reyes, J. F., Martínez-Romero, R., Berton, P., 
Martínez-Lara, E., Del Moral-Leal, M. L., Molina-Díaz, A. Combined data mining 
strategy for the systematic identification of sport metabolites in urine by liquid 
chromatography time-of-flight mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 761 
(2013), 1-10. 
 
 Domínguez-Romero, J. C., García-Reyes, J. F., Martínez-Romero, R., Martínez-
Lara, E., Del Moral-Leal, M. L., Molina-Díaz, A. Detection of main urinary 
metabolites of β2-agonist clenbuterol, salbutamol and terbutaline by liquid 
chromatography high resolution mass spectrometry. Journal of Chromatography 
B, 923-924 (2013), 128-135. 
 
 Feria, M., Capítulo 22: Fármacos analgésicos-antitérmicos y antiinflamatorios no 
esteroideos. Antiartríticos en Farmacología Humana, 2008, Barcelona, Elsevier 
Masson. 
 
 Fernández-Peralbo, M. A., Luque de Castro, M. D. Preparation of urine samples 
prior to targeted or untargeted metabolomics mass-spectrometry analysis. Trends 
in Analytical Chemistry, 41 (2012), 75-85. 
 
43 
 Ferrer, I.,, Thurman, E. M. Measuring the Mass of an Electron by LC/TOF-MS: A 
Study of “Twin Ions”. Analytical Chemistry, 77 (2005), 3394-3400. 
 
 Flores, J., Capítulo 1: Farmacología: concepto y objetivos en Farmacología 
Humana, 2008, Barcelona, Elsevier Masson. 
 
 Kepp, D. R., Sidelmann, U. G., Tjørnelund, J., Hansen, S. H. Simultaneous 
quantitative determination of the major phase I and II metabolites of ibuprofen in 
biological fluids by high-performance liquid chromatography on dynamically 
modified silica. Journal of Chromatography B, 696 (1997), 235-241. 
 
 Leza, J.C. y Lizasoain, I., Capítulo 31: Fármacos antiinflamatorios no esteroideos 
y otros analgésicos-antipiréticos en Farmacología básica y clínica, 2008, 
Madrid, Editorial Médica Panamericana. 
 
 Magiera, S., Gülmez, S. Ultrasound-assisted emulsification microextraction 
combined withultra-high performance liquid chromatography–tandem 
massspectrometry for the analysis of ibuprofen and its metabolites inhuman urine. 
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 92 (2014), 193–202. 
 
 Moraes de Oliveira, A. R., Malagueño de Santana, F. J., Bonato, P. S. 
Stereoselective determination of the major ibuprofen metabolites in human urine 
by off-line coupling solid-phase microextraction and high-performance liquid 
chromatography. Analytica Chimica Acta, 538 (2005), 25-34. 
 
 Neunzig, I., Göhringa, A., Drăgana, C. A., Zappb, J., Petersc, F. T., Maurerd, H. 
H., Bureika, M. Production and NMR analysis of the human ibuprofen metabolite 
3-hydroxyibuprofen. Journal of Biotechnology, 157 (2012), 417-420. 
 
 Plumb, R. S., Rainville, P. D., Potts, W. B., Castro-Perez, J. M., Johnson, K. A., 
Wilson, I. D. High-temperature ultra-performance liquid chromatography coupled 
to hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry applied to ibuprofen 
44 
metabolites in human urine. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 21 
(2007), 4079-4085. 
 
 Rainsford, K. D. Chapter 2: Biodisposition in Relation to Actions en Ibuprofen: 
Pharmacology, Therapeutics and side effects, 2012, Basel, Springer. 
 
 Rudy, A. C., Anliker, K. S., Hall, S. D. High-performance liquid chromatographic 
determination of the stereoisomeric metabolites of ibuprofen. Journal of 
Chromatography, 528 (1990), 395-405. 
 
 Smith, P.C., Phase II metabolism, 2012, University of North of California at 
Chapel Hill. 
 
 Smith, R. W., Toutoungi, D. E., Reynolds, J. C., Bristow, A. W. T., Ray, A., Sage, 
A., Wilson, I. D., Daniel J. Weston, Boyle, B., Colin S. Creaser, C. S. Enhanced 
performance in the determination of ibuprofen 1-β-O-acyl glucuronide in urine by 
combining high field asymmetric waveform ion mobility spectrometry with liquid 
chromatography-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 
1278 (2013), 76-81. 
 
 Voet, D., Voet, J. G., Capítulo 18: Metabolismo del glucógeno en Bioquímica, 
2006, Buenos Aires, Editorial Médica Panamericana. 
 
 Williams, D.A. Chapter 4: Drug Metabolism en Foye’s Principles of Medicinal 
Chemistry, 2013, Baltimore, Lippincott Williams & Wilkins. 
 
 
 
 
 
 
 
45 
7. ANEXO