Salvador Salcedo

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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIAEN 
TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO,A.C. 
 
 
 
 
 
 ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS 
PRESENTES EN EL PROCESO DE 
ELABORACIÓN DE SIDRA MEXICANA 
 
 
 
 
 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL GRADO 
 
ACADEMICO DE 
 
 
 
 
 
MAESTRO EN CIENCIA 
Y TECNOLOGIA 
EN LA ESPECIALIDAD DE 
BIOTECNOLOGIA PRODUCTIVA 
 
 
 
PRESENTA 
 
 
 
I.B.Q. SALVADOR SALCEDO HERNÁNDEZ 
 
 
 
 
 
GUADALAJARA, JAL. AGOSTO, 2017. 
 
 
 
 
 
ÍNDICE DE CONTENIDOS 
CAPÍTULO 1: RESUMEN ----------------------------------------------------------------------------------------------- 1 
CAPÍTULO 2: ANTECEDENTES ------------------------------------------------------------------------------------- 3 
2.1-GENERALIDADES DE LA SIDRA ---------------------------------------------------------------------------------------- 4 
2.1.1- DEFINICIÓN Y CLASIFICACIÓN EN ESPAÑA ----------------------------------------------------------------------- 4 
2.1.2-DEFINICION Y CLASIFICACIÓN EN MÉXICO ----------------------------------------------------------------------- 4 
2.1.3-PROCESO DE PRODUCCIÓN DE SIDRA ------------------------------------------------------------------------------ 5 
2.2-PROCESOS FERMENTATIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------- 9 
2.2.1-Fermentación alcohólica ------------------------------------------------------------------------------------- 9 
2.2.1.3-Factores que afectan la fermentación alcohólica ----------------------------------------------------- 12 
2.2.1-FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA ----------------------------------------------------------------------------------- 15 
2.2.2.1-Introducción------------------------------------------------------------------------------------------------ 15 
2.2.3- Fermentaciones mixtas ------------------------------------------------------------------------------------- 19 
2.3-IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS EN PROCESOS FERMENTATIVOS ------------------------------------ 20 
2.3.1-Introduccion -------------------------------------------------------------------------------------------------- 20 
2.3.2-Técnicas de cultivo e identificación de microorganismos ---------------------------------------------- 20 
CAPÍTULO 3: JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ---------------------------------------------- 29 
3.1 JUSTIFICACIÓN ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 30 
3.2 HIPÓTESIS --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 30 
3.3 OBJETIVO GENERAL --------------------------------------------------------------------------------------------------- 30 
3.4 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ----------------------------------------------------------------------------------------------- 30 
CAPÍTULO 4: METODOLOGÍA ------------------------------------------------------------------------------------ 32 
4.1 MEDIOS DE CULTIVO --------------------------------------------------------------------------------------------------- 33 
4.1.1 Medio de cultivo MRS --------------------------------------------------------------------------------------- 33 
4.1.2 Medio de cultivo agar MRS en placa. --------------------------------------------------------------------- 33 
4.1.3 Medio de cultivo agar WL en placa. ---------------------------------------------------------------------- 33 
4.1.4 Medio de cultivo agar WL con cloranfenicol en placa. ------------------------------------------------- 34 
4.1.5 Medio YPD --------------------------------------------------------------------------------------------------- 34 
4.1.5 Medio de cultivo sintético de sidra (MSS). --------------------------------------------------------------- 34 
4.2 MUESTREO CONTEO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS. -------------------------------------------------------- 34 
4.2.1 Toma de muestras. ------------------------------------------------------------------------------------------- 34 
4.2.2 Conteo celular de microorganismos. ---------------------------------------------------------------------- 35 
4.2.3 Sembrado y conteo en placa de microorganismos. ------------------------------------------------------ 37 
4.2.4 Tinción de Gram --------------------------------------------------------------------------------------------- 39 
4.2.5 Técnica de PCR-COLONY --------------------------------------------------------------------------------- 40 
 
 
 
 
4.2.6 Técnica RFLP. ----------------------------------------------------------------------------------------------- 40 
4.3 TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS. -------------------------------------------------------------------------------------- 41 
4.3.1 Determinación de carbohidratos y ácidos orgánicos con la técnica HPLC. ------------------------- 41 
4.3 MUESTRO DEL PROCESO DE ELABORACIÓN DE SIDRA. ------------------------------------------------------------ 42 
4.4 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS POR LA TÉCNICA DE SEMBRADO EN PLACA.-------------------------- 42 
4.5 CLASIFICACIÓN MORFOLÓGICA DE LOS MICROORGANISMOS NATIVOS DE SIDRA NATURAL. --------------- 43 
4.6 CLASIFICACIÓN COLONIAS DE LEVADURAS POR LA TÉCNICA RFLP ------------------------------------------- 43 
4.7 IDENTIFICACIÓN DE COLONIAS DE LEVADURAS POR SECUENCIACIÓN. ----------------------------------------- 43 
4.8 CLASIFICACIÓN DE BACTERIAS SIDRA NATURAL POR LA TÉCNICA DE TINCIÓN DE GRAM. ------------------ 44 
4.9 PRESERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS NATIVOS DE SIDRA NATURAL. ---------------------------------- 44 
4.10 SELECCIÓN DE CEPAS DE BACTERIAS PARA LA ELABORACIÓN DE SIDRA. ------------------------------------ 44 
4.12 PRUEBAS PRELIMINARES DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA DE DIFERENTES JUGOS DE MANZANA. -- 44 
CAPÍTULO 5: RESULTADOS --------------------------------------------------------------------------------------- 46 
5.1 AISLAMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS NATIVOS DE SIDRA NATURAL POR SEMBRADO EN PLACA. ---- 48 
5.2 CLASIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR MACROCOLONIA. ------------------------------------------------- 52 
5.3 CLASIFICACIÓN DE COLONIAS DE LEVADURAS POR LA TÉCNICA DE PCR-RFLP. ---------------------------- 57 
5. 5 IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS POR SECUENCIACIÓN Y CONSERVACIÓN ------------------------------------ 58 
5.6 CLASIFICACIÓN DE BACTERIAS SIDRA NATURAL POR LA TÉCNICA DE TINCIÓN DE GRAM. ------------------ 61 
5.7 SELECCIÓN DE CEPAS DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS (BAL) PARA LA ELABORACIÓN DE SIDRA. -------- 62 
5.8 FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA SOBRE DIFERENTES JUGOS DE MANZANA. ------------------------------------- 67 
CAPÍTULO 6: CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS --------------------------------------------------------- 71 
6.1 CONCLUSIONES --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 72 
6.2 PERSPECTIVAS ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 72 
CAPÍTULO 7: BIBLIOGRAFÍA ------------------------------------------------------------------------------------- 73 
ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 85 
ANEXO A-1: MEMORIAS EN EXTENSO DEL XXXVI ENCUENTRO NACIONAL DE LA AMIDIQ 2015. ---------- 86 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ÍNDICE DE FIGURAS 
FIGURA 1: ESQUEMA GENERAL DE PRODUCCIÓN DE SIDRA, TOMANDO COMO REFERENCIA EL PROCESO 
TRADICIONAL DE LA REGIÓN DE ASTURIAS, ESPAÑA. -------------------------------------------------------------- 5 
FIGURA 2: SELECCIÓN Y LIMPIEZA DE MANZANAS EMPLEADAS EN LA ELABORACIÓN DE SIDRA -------------------- 6 
FIGURA 3: PRENSAS EMPLEADAS EN LA CLARIFICACIÓN DEL MOSTO PARA SIDRA: A) PRESAN MECÁNICA O 
LLAGAR, B) PRENSA HIDRÁULICA HORIZONTAL DE PISTÓN. ------------------------------------------------------- 6 
FIGURA 4: DIAGRAMA DEL PROCESO DE CLARIFICACIÓN DELMOSTO, EMPLEANDO TÉCNICAS FÍSICAS, QUÍMICAS 
Y BIOQUÍMICAS. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 7 
FIGURA 5: REPRESENTACIÓN DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA ------------------------------------------------------ 9 
FIGURA 6: ESQUEMA DEL PROCESO DE LA GLUCOLISIS EN LAS LEVADURAS. ----------------------------------------- 10 
FIGURA 7:DESTINOS DEL PIRUVATO EN EL METABOLISMO DE LAS HEXOSAS EN LAS LEVADURAS. ---------------- 11 
FIGURA 8: INTEGRACIÓN DE METABOLISMO DE S. CEREVISIAE DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL MOSTO DE UVA 
EN LA ELABORACIÓN DE VINOS. -------------------------------------------------------------------------------------- 13 
FIGURA 9: BIOSÍNTESIS GENERAL DE ÉSTERES ----------------------------------------------------------------------------- 14 
FIGURA 10: FERMENTACIÓN DE LAS HEXOSAS Y PENTOSAS POR LA RUTA DE LA FOSFOCETOLASA EN O. OENI. - 16 
FIGURA 11:RUTAS Y ACARREADORES PARA LA FERMENTACIÓN DEL MALATO Y CITRATO POR O. OENI Y L. 
MESENTEROIDES --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 17 
FIGURA 12: DEL ÁCIDO MÁLICO POR UNA RUTA ALTERNA EN BAL DEL GENERO LACTOBACILLUS. -------------- 18 
FIGURA 13: ESTRUCTURA GENERAL DE LA PARED CELULAR EN LOS TIPOS DE BACTERIAS. A) PARED CELULAR 
DE BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS, ESTÁ CONSTITUIDA POR UNA DOBLE CAPA FOSFOLIPÍDICA. B) PARED 
CELULAR DE BACTERIAS GRAM-POSITIVAS, CONSTA DE VARIAS CAPAS INTERCONECTADAS DE 
PEPTIDOGLICANOS Y ÁCIDO TEICOICO. -------------------------------------------------------------------------------- 22 
FIGURA 14: ESQUEMATIZACIÓN DEL PROCESO DE LA TINCIÓN DE GRAM. CONSTA DE 5 ETAPAS, LA FIJACIÓN DE 
LA MUESTRA EN UN PORTAOBJETOS, TINCIÓN CON CRISTAL VIOLETA, ADICIÓN DE SOLUCIÓN DE LUGOL-
YODO, DECOLORACIÓN CON SOLUCIÓN DE ALCOHOL-ACETONA Y POR ÚLTIMO TINCIÓN CON SAFRANINA - 23 
FIGURA 15: MORFOLOGÍAS MÁS COMUNES QUE PRESENTAN LAS BACTERIAS. A) LA FORMA ESFÉRICA ES 
CONOCIDA COMO COCOS, PRESENTADO VARIANTES SEGÚN LA FORMA QUE ESTÁN AGRUPADOS, COMO 
DIPLOCOCO (DOS COCOS), ESTREPTOCOCO (CADENAS DE COCOS), ESTAFILOCOCO (FORMACIÓN DE 
RACIMOS), SARCINA (AGRUPACIÓN EN FORMA DE CUBO) Y TÉTRADA (CUATRO COCOS). B) LA FORMA 
ALARGADA CON PUNTAS REDONDEADAS ES LLAMADA BACILO, PRESENTADO VARIANTES SEGÚN LA FORMA QUE 
ESTÁN AGRUPADOS, COMO DIPLOBACILO (DOS BACILOS), ESTREPTOBACILO (CADENAS DE BACILOS).C) 
EXISTEN OTRAS MORFOLOGÍAS ALGUNAS SON LA VIBRIO () Y EL ESPIRILO (BASTÓN LARGO EN FORMA DE 
ESPIRAL) ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 24 
FIGURA 16: ESTRUCTURA ADN RIBOSOMAL NUCLEAR. ----------------------------------------------------------------- 25 
FIGURA 17: MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE LEVADURAS BASADO EN LA AMPLIFICACIÓN 
POR PCR Y LA POSTERIOR SECUENCIACIÓN DE LAS REGIONES RIBOSOMAL. ----------------------------------- 26 
 
 
 
 
FIGURA 18: MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES BASADO EN LA AMPLIFICACIÓN POR PCR Y 
ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN POSTERIOR DE LAS REGIONES RIBOSOMAL ------------------------------------------ 27 
FIGURA 19: DIVISIONES DE UN TANQUE DE FERMENTACIÓN PARA REALIZAR EL MUESTREO SIGNIFICATIVO DEL 
PROCESO DE ELABORACIÓN DE SIDRA. ------------------------------------------------------------------------------ 35 
FIGURA 20: METODOLOGÍA PARA REALIZAR CONTEO DE CÉLULAS EN MEDIO LIQUIDO CON CÁMARA DE 
NEUBAUER (ADAPTADO DE GAB SISTEMÁTICA ANALÍTICA S.L.). --------------------------------------------- 36 
FIGURA 21: MÉTODO PARA DILUCIONES SERIALES, SEMBRADO Y CONTEO EN PLACA. ADAPTADO DE LA DE LAS 
NOM-110-SSA1-1994 Y NOM-092-SSA1-1994. ---------------------------------------------------------------- 37 
FIGURA 22: DESCRIPCIÓN GRAFICA DE LA DIVISIÓN IMAGINARA DE UNA PLACA EN CUADRANTES PARA EL 
CONTEO CON BASE EN LA NORMA NOM-092-SSA1-1994. ------------------------------------------------------- 39 
FIGURA 23: METODOLOGÍA DE LA TINCIÓN DE GRAM. DESCRIPTO POR EL PROVEEDOR HYCELMR. ------------ 39 
FIGURA 24: ETAPAS DEL MUESTREO EN EL PROCESO DE ELABORACIÓN DE SIDRA. A-JUGO DE MANZANA 
NATURAL (JMN), B-JUGO CENTRIFUGADO (JC), C-JUGO DE MANZANA CONCENTRADO (JMC), D-JUGO DE 
MANZANA FERMENTADO ESPONTÁNEAMENTE, E Y F- TINAS DE FERMENTACIÓN DIRIGIDA EN DIFERENTES
 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 42 
FIGURA 25: MORFOLOGÍAS DE LAS COLONIAS AISLADAS DEL JUGO NATURAL DE LA MANZANA EN PLACAS CON 
MEDIOS AGAR-MRS, AGAR-WL Y AGAR-WLC, USANDO DILUCIONES DE 106 Y 107, ORGANIZADAS EN 12 
GRUPOS DEFERENTES DE ACUERDO A SUS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS (FORMA DE LA COLONIA, 
PATRÓN DE COLORACIÓN, TAMAÑO Y TEXTURA APARENTE ). -------------------------------------------------------- 48 
FIGURA 26: MORFOLOGÍAS DE LAS COLONIAS AISLADAS DEL JUGO NATURAL DE LA MANZANA CENTRIFUGADO 
EN MEDIOS AGAR-MRS, AGAR-WL Y AGAR-WLC, USANDO DILUCIONES DE 106 Y 107, ORGANIZADAS EN 
9 GRUPOS DEFERENTES DE ACUERDO A SUS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS (FORMA DE LA COLON 
COLONIA, PATRÓN DE COLORACIÓN, TAMAÑO Y TEXTURA APARENTE ). -------------------------------------------- 49 
FIGURA 27: COLONIAS AISLADAS DEL JUGO MANZANA CON FERMENTACIÓN ESPONTANEA EN PLACAS EN 
MEDIOS AGAR-MRS, AGAR-WL Y AGAR-WLC, USANDO DILUCIONES DE 106 Y 107, ORGANIZADAS EN 6 
GRUPOS DEFERENTES DE ACUERDO A SUS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS (FORMA DE LA COLONIA, 
PATRÓN DE COLORACIÓN, TAMAÑO Y TEXTURA APARENTE). -------------------------------------------------------- 50 
FIGURA 28: COLONIAS AISLADAS DEL JUGO DE MANZANA CONCENTRADO (80°BRIX) EN PACAS CON MEDIOS 
AGAR-MRS, AGAR-WL Y AGAR-WLC, USANDO DILUCIONES DE 106 Y 107, ORGANIZADAS EN 2 GRUPOS 
DE ACUERDO A SUS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS (FORMA DE LA COLONIA, PATRÓN DE 
COLORACIÓN, TAMAÑO Y TEXTURA APARENTE ). --------------------------------------------------------------------- 50 
FIGURA 29: COLONIAS AISLADAS TINAS EN DIFERENTES TIEMPOS DE FERMENTACIÓN, EN PLACAS CON MEDIOS 
AGAR-MRS, AGAR-WL Y AGAR-WLC, USANDO DILUCIONES DE 106 Y 107, ORGANIZADAS EN 6 GRUPOS 
DE ACUERDO A SUS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS (FORMA DE LA COLONIA, PATRÓN DE 
COLORACIÓN, TAMAÑO Y TEXTURA APARENTE ). --------------------------------------------------------------------- 51 
FIGURA 30: CLASIFICACIÓN PRELIMINAR DE LAS COLONIAS AISLADAS DEL PROCESO DE ELABORACIÓN DE 
SIDRA, TOMANDO EN CUENTA EN PRIMERA INSTANCIA LA ETAPA DE AISLAMIENTO Y EN SEGUNDA ES LAS 
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LA COLONIA. -------------------------------------------------------------- 51 
 
 
 
 
FIGURA 31: MACROCOLONIAS DESARROLLADAS EN PLACAS DE MEDIO WL. LOS 8 GRUPOS DE COLONIAS 
FORMADOS DE ACUERDO A SUS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS (FORMA DE LA COLONIA, PATRÓN DE 
COLORACIÓN, TAMAÑO Y TEXTURA APARENTE). ------------------------------------------------------------------- 52 
FIGURA 32: CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS PRESENTADAS POR EL GRUPO DE COLONIAS A: A) CONTORNO 
DE LA COLONIA, B)PATRÓN DE BANDAS DE COLOR Y C) FORMA ELEVADA DE LA COLONIA ---------------- 53 
FIGURA 33: CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS PRESENTADAS POR EL GRUPO DE COLONIAS B: A) CONTORNO 
DE LA COLONIA, B)PATRÓN DE BANDAS DE COLOR Y C) FORMA ELEVADA DE LA COLONIA. ---------------- 53 
FIGURA 34: CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS PRESENTADAS POR EL GRUPO DE COLONIAS C: A) CONTORNO 
DE LA COLONIA, B)PATRÓN DE BANDAS DE COLOR Y C) FORMA ELEVADA DE LA COLONIA. ---------------- 54 
FIGURA 35: CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS PRESENTADAS POR EL GRUPO DE COLONIAS D: A) CONTORNO 
DE LA COLONIA, B) PATRÓN DE BANDAS DE COLOR Y C) FORMA ELEVADA DE LA COLONIA. --------------- 54 
FIGURA 36: CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS PRESENTADAS POR EL GRUPO DE COLONIAS E: A) CONTORNO DE 
LA COLONIA, B)PATRÓN DE BANDAS DE COLOR Y C) FORMA ELEVADA DE LA COLONIA. ------------------- 55 
FIGURA 37: CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICASPRESENTADAS POR EL GRUPO DE COLONIAS F: A) CONTORNO DE 
LA COLONIA, B) PATRÓN DE BANDAS DE COLOR Y C) FORMA ELEVADA DE LA COLONIA. ------------------- 55 
FIGURA 38: CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS PRESENTADAS POR EL GRUPO DE COLONIAS G: A) CONTORNO 
DE LA COLONIA, B)PATRÓN DE BANDAS DE COLOR Y C) FORMA ELEVADA DE LA COLONIA. ---------------- 56 
FIGURA 39: CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS PRESENTADAS POR EL GRUPO DE COLONIAS H: A) CONTORNO 
DE LA COLONIA, B)PATRÓN DE BANDAS DE COLOR Y C) FORMA ELEVADA DE LA COLONIA. ---------------- 56 
FIGURA 40: VISUALIZACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE LA AMPLIFICACIÓN POR LA TÉCNICA DE PCR EN UN GEL DE 
AGAROSA ULTRAPURA AL 3% Y UN MARCADO DE 1KPB CON GEL-RED COMO MARCADOR FLUORESCENTE. 
1) PRODUCTO DE AMPLIFICA DEL GRUPO A, 2) PRODUCTO DE AMPLIFICA DEL GRUPO B, 3) PR3) 
PRODUCTO DE AMPLIFICA DEL GRUPO C, 4) PRODUCTO DE AMPLIFICA DEL GRUPO D, 5) PRODUCTO DE 
AMPLIFICA DEL GRUPO E, 6) PRODUCTO DE AMPLIFICA DEL GRUPO F Y 7) PRODUCTO DE AMPLIFICA DEL 
GRUPO G Y H. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 57 
FIGURA 41: LOCALIZACIÓN DE LAS ESPECIES AISLADAS EN EL PRESENTE TRABAJO, DE ACUERDO A LA ETAPA 
DEL PROCESO DE ELABORACIÓN DE SIDRA -------------------------------------------------------------------------- 61 
FIGURA 42: TINCIÓN DE GRAM DE BACTERIAS AISLADAS DE PROCESO DE ELABORACIÓN DE SIDRA MEXICANA. 
A) MUESTRA 10:GRAM NEGATIVA, B) MUESTRA 24:GRAM NEGATIVA, C)MUESTRA 33:GRAM NEGATIVA 
Y D) MUESTRA 50:GRAM NEGATIVA. -------------------------------------------------------------------------------- 62 
FIGURA 43: CRECIMIENTO (DENSIDAD ÓPTICA A 600 NM) DE O. SPP EN MEDIO SINTÉTICO DE SIDRA, SIN 
AGITACIÓN Y 20°C POR 240 H. --------------------------------------------------------------------------------------- 63 
FIGURA 44: CRECIMIENTO (DENSIDAD ÓPTICA A 600 NM) DE BACTERIAS ACIDOLÁCTICA, DURANTE LA 
FOMENTACIÓN MALOLÁCTICA EN MEDIO SINTÉTICO DE SIDRA, SIN AGITACIÓN Y 20°C POR 240 H. P. 
ACIDILACTICI A , P. ACIDILACTICI B Y O. OENI . --------------------------------------------------- 64 
FIGURA 45: MONITOREO DEL CONSUMO DE ÁCIDO MÁLICO (MG/L) Y PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO (MG/L) 
DURANTE LA FERMENTACIÓN DURANTE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA, MUESTREADO CADA 24 H, EN 
 
 
 
 
MEDIO SINTÉTICO DE SIDRA, SIN AGITACIÓN Y 20°C POR 240 H POR P. ACIDILACTICI ÁCIDO MÁLICO 
 Y ÁCIDO LÁCTICO . ---------------------------------------------------------------------------------- 65 
FIGURA 46: MONITOREO DEL CONSUMO DE ÁCIDO MÁLICO (MG/L) Y PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO (MG/L) 
DURANTE LA FERMENTACIÓN DURANTE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA, MUESTREADO CADA 24 H, EN 
MEDIO SINTÉTICO DE SIDRA, SIN AGITACIÓN Y 20°C POR 240 H POR O. OENI. ÁCIDO MÁLICO Y 
ÁCIDO LÁCTICO . ----------------------------------------------------------------------------------------------- 65 
FIGURA 47: CONSUMO DE AZÚCARES TOTALES Y PRODUCCIÓN DE ETANOL, DURANTE LA FERMENTACIÓN 
ALCOHÓLICA DE S. CEREVISIAE EN JUGO DE MANZANA (JM1), DURANTE 240 H, SIN AGITACIÓN, A 20°C Y 
MUESTREADO CADA 24 H. CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES TOTALES (G/L), 
CONCENTRACIÓN DE ETANOL (G/L) ---------------------------------------------------------------------------------- 68 
FIGURA 48: CONSUMO DE AZÚCARES TOTALES Y PRODUCCIÓN DE ETANOL, DURANTE LA FERMENTACIÓN 
ALCOHÓLICA DE S.CEREVISIAE EN JUGO DE MANZANA (JM2), DURANTE 240 H, SIN AGITACIÓN, A 20°C Y 
MUESTREADO CADA 24 H. . CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES TOTALES (G/L), 
CONCENTRACIÓN DE ETANOL (G/L). --------------------------------------------------------------------------------- 68 
FIGURA 49: CONSUMO DE AZÚCARES TOTALES Y PRODUCCIÓN DE ETANOL, DURANTE LA FERMENTACIÓN 
ALCOHÓLICA DE S. CEREVISIAE EN JUGO DE MANZANA (JM3), DURANTE 240 H, SIN AGITACIÓN, A 20°C Y 
MUESTREADO CADA 24 H . CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES TOTALES (G/L), 
CONCENTRACIÓN DE ETANOL (G/L). --------------------------------------------------------------------------------- 69 
 
 ÍNDICE DE TABLAS 
TABLA 1:TAMAÑO (EN PARES DE BASES “PB”) DE LOS PRODUCTOS DE AMPLIFICACIÓN DE PCR Y DIGESTIÓN DE 
RFLP, OBTENIDOS DE CADA GRUPOS LEVADURAS PARA SU CLASIFICACIÓN. --------------------------------- 58 
TABLA 2: ESPECIE IDENTIFICADA CORRESPONDIENTE A CADA GRUPO DE LEVADURA ESTUDIADO, PRESENTANDO 
EL PORCENTAJE DE COBERTURA Y SIMILITUD DE LA SECUENCIACIÓN DEL GEN 5.8S Y LOS ESPACIADORES 
INTERNOS ITS 1 Y ITS 2. ----------------------------------------------------------------------------------------------- 59 
TABLA 3: PARÁMETROS DETERMINADOS DURANTE LA CONVERSIÓN DE ÁCIDO MÁLICO EN ÁCIDO LÁCTICO EN 
MEDIO SINTÉTICO DE SIDRA, POR O. OENI, P. ACIDILACTICI Y LA COMPARACIÓN DE LOS RESULTADOS CON 
O. OENI (SCOTT LABORATORIES INC.) CON UNA BAL COMERCIAL EMPLEADA PARA REDUCIR LA 
CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO MÁLICO EN JUGOS DE MANZANA COMERCIALES. --------------------------------- 66 
 
 
 
1 
 
 
Capítulo 1: Resumen 
 
 
 
 
2 
 
 
El presente trabajo tuvo como objetivo el aislamiento, identificación y conservación de los 
microorganismo presentes en el proceso fermentativo de la elaboración de sidra mexicana. 
En la primera etapa se realizo el muestreo de las diferentes etapas del proceso de 
elaboración de sidra. 
En la segunda etapa se realizó el aislamiento de colonias de microorganismos mediante 
diluciones seriadas y sembrado en placa con medios selectivos. Las colonias aisladas 
fueron clasificadas y agrupadas de manera preliminar, con base a las características 
morfológicas de la colonia y tinción de Gram (para el caso de bacterias). 
En la tercera etapa se realizó una verificación de cómo se agruparon las colonias con base a 
la morfología, para esto se empleó técnicas moleculares con base en el estudio del ADN 
ribosomal. 
En la cuarta etapa se realizó la identificación de las colonias mediante la secuenciación del 
ADN ribosomal y se crioconservaron para ser agregadas a la colección de CIATEJ. 
En la quinta etapa se realizó una selección de una bacteria acidoláctica para realizar la 
fermentación maloláctica en el proceso de elaboración de sidra, considerando dos cepas de 
la colección de CIATEJ y una cepa comercial. 
Por último se realizó la selección de un jugo de manzana para la elaboración de sidra, se 
emplearon cuatro jugos de manzana (2 concentrados y 2 naturales). Con los que se realizo 
los estudios preliminares para conocer y estandarizar el proceso de fermentación de sidras 
mexicanas, 
 
 
 
3 
 
 
 
 
 
Capítulo 2: 
Antecedentes 
 
 
 
 
4 
 
2.1-Generalidades de la sidra 
Los principales productores de sidra a nivel mundial son Inglaterra, Irlanda, Francia y 
España, según datos de la AICV2015 (L'Association des Industries des Cidres et Vins de 
fruits). Sobre sale una región en especial, llamada Asturias, en la costa norte del atlántico 
en España, debido a la calidad de sus sidras, contando con un proceso estandarizado y 
denominación de origen. 
2.1.1- Definición y clasificación en España 
Con base en el ministerio de agricultura de España, los mostos de manzana son clasificados 
y definidos en cuatro tipos. El primer tipo denominado “mosto de manzana”, es el jugo 
obtenido de la manzana fresca por medios físicos, en tanto no haya comenzado su 
fermentación. El segundo tipo es denominado “mosto natural”, es el monto de manzana que 
no ha sido objeto de tratamiento. El tercer tipo “mosto conservado”, es el mosto de 
manzana cuya fermentación alcohólica ha sido evitada por tratamientos autorizados a dicho 
fin. El cuarto tipo “mosto concentrado” es el producto obtenido por deshidratación parcial 
de los mostos de manzana hasta que el grado de concentración impida la fermentación 
espontánea. 
En la normatividad española consideran dos tipos de sidra, sidra estándar y natural. Se 
denomina como sidra, a la bebida resultante de la fermentación alcohólica total o parcial de 
la manzana frescao de sus mostos, con una graduación alcohólica adquirida superior a 4 
grados. Se denomina como sidra natural a la sidra elaborada siguiendo las prácticas 
tradicionales, sin adición de azúcares, que contiene gas carbónico de origen endógeno 
exclusivamente con una graduación alcohólica adquirida superior a 4,5 grados. 
La sidra también se clasifica con base en el contenido de azúcares en tres tipos: seca, la 
sidra que contiene menos de 30 g/l. de azúcares; semiseca o semidulce, entre 30 y 50 g/l., y 
dulce cuando contiene más de 50 g/l. En la normatividad vigente no consideran a la sidra 
rosada. 
2.1.2-Definicion y clasificación en México 
Se denomina sidra por la norma NMX-V-011-1992 como una bebida alcohólica que resulta 
de la fermentación de los mostos de manzana, con un porcentaje de etanol entre 3-6 en la 
escala de Gay Lussac. Los mostos de manzana son clasificados como, mosto de manzana 
 
 
 
resultante de la extracción del jugo de las manzanas, mosto concentrado de manzana 
obtenido por concentración del mosto de manzana
habiendo iniciado la fermentación alcohólica, se le detiene
alcohol. 
La sidra es clasificada con base en
azúcares como dulce (>40.1 g/L), semidulce (10 
color como, es clasificada como
mezcla de ellos; rosada, que resulta de la fermentación de los mostos de manzana o mezcla 
de ellos, adicionada de mosto de uva (concentrado o no), no más del 15% de vin
antocianina, hasta obtener una transmitancia no menor de 20% a la longitud de onda de 
520nm o su equivalente en absorbancia de 0.7%.
2.1.3-Proceso de producción de sidra
En la figura 1 se presenta el proceso 
tradicional de Asturias(Mangas Alonso, 1996)
Figura 1: Esquema general de producción de sidra, tomando como referencia el proceso tradicional de la 
región de Asturias, España. 
5 
resultante de la extracción del jugo de las manzanas, mosto concentrado de manzana 
obtenido por concentración del mosto de manzana, mosto de manzana apagado
o la fermentación alcohólica, se le detiene, prohibiéndose la adición del 
a sidra es clasificada con base en diversos parámetros. Con base a su 
azúcares como dulce (>40.1 g/L), semidulce (10 - 40 g/L) y seca (<10 g/L). Con
, es clasificada como ámbar, que resulta de la fermentación de los mostos
que resulta de la fermentación de los mostos de manzana o mezcla 
de ellos, adicionada de mosto de uva (concentrado o no), no más del 15% de vin
, hasta obtener una transmitancia no menor de 20% a la longitud de onda de 
520nm o su equivalente en absorbancia de 0.7%. 
producción de sidra 
proceso general de producción de sidra, basado en el proceso 
(Mangas Alonso, 1996). 
: Esquema general de producción de sidra, tomando como referencia el proceso tradicional de la 
resultante de la extracción del jugo de las manzanas, mosto concentrado de manzana 
mosto de manzana apagado es aquel que 
prohibiéndose la adición del 
a su contenido en 
Con base en su 
que resulta de la fermentación de los mostos o 
que resulta de la fermentación de los mostos de manzana o mezcla 
de ellos, adicionada de mosto de uva (concentrado o no), no más del 15% de vino tinto, o 
, hasta obtener una transmitancia no menor de 20% a la longitud de onda de 
o en el proceso 
 
: Esquema general de producción de sidra, tomando como referencia el proceso tradicional de la 
 
 
 
La primera etapa consiste en la selección y limpieza de la 
inspeccionada para que cumpla con los parámetro de calidad
contenido de azúcar o almidón y firmeza), 
y reducir la población microbiana, es permitido emple
sodio (peso/volumen) para eliminar suciedad incrustada en la fruta, junto con un cepillado. 
Procede la etapa de trituración, aquí el objetivo es reducir el tamaño de la manzana por 
acción de cuchillas o martillos con ro
esto facilita el prensado en etapas posteriores
Figura 2: Selección y limpieza de manzanas empleadas en la elaboración de sidra
Procede la etapa de maceración
importancia ya que promueve la síntesis de aromas, ayuda a clarificar el mosto y facilita el 
prensado (Flanzy, 2003; Mangas Alonso, 1996)
de presando a utilizar, prensado lento necesita una macer
rápido de 6 a 8 horas(Mangas Alonso, 1996)
a)
Figura 3: Prensas empleadas en la clarificación del mosto para sidra: a) presan mecánica o llagar, b) prensa 
hidráulica horizontal de pistón. 
6 
La primera etapa consiste en la selección y limpieza de la manzana (figura 2)
cumpla con los parámetro de calidad necesarios
contenido de azúcar o almidón y firmeza), le sigue un proceso de lavado para eliminar lodo 
y reducir la población microbiana, es permitido emplear un solución al 5% de 
) para eliminar suciedad incrustada en la fruta, junto con un cepillado. 
Procede la etapa de trituración, aquí el objetivo es reducir el tamaño de la manzana por 
acción de cuchillas o martillos con rodillos para obtener un tamaño ideal de la pulpa, ya que 
esto facilita el prensado en etapas posteriores(Mangas Alonso, 1996). 
 
Selección y limpieza de manzanas empleadas en la elaboración de sidra 
maceración, consiste en reposar el jugo y la pulpa, esta etapa es 
ya que promueve la síntesis de aromas, ayuda a clarificar el mosto y facilita el 
(Flanzy, 2003; Mangas Alonso, 1996). El tiempo de maceración depende del tipo 
de presando a utilizar, prensado lento necesita una maceración de 2 a 4 días y un prensad
(Mangas Alonso, 1996). 
 b)
Prensas empleadas en la clarificación del mosto para sidra: a) presan mecánica o llagar, b) prensa 
(figura 2), la fruta es 
necesarios (madurez, 
sigue un proceso de lavado para eliminar lodo 
ar un solución al 5% de hidróxido de 
) para eliminar suciedad incrustada en la fruta, junto con un cepillado. 
Procede la etapa de trituración, aquí el objetivo es reducir el tamaño de la manzana por 
dillos para obtener un tamaño ideal de la pulpa, ya que 
 
, esta etapa es de vital 
ya que promueve la síntesis de aromas, ayuda a clarificar el mosto y facilita el 
. El tiempo de maceración depende del tipo 
ación de 2 a 4 días y un prensado 
 
Prensas empleadas en la clarificación del mosto para sidra: a) presan mecánica o llagar, b) prensa 
 
 
7 
 
Procede la etapa de prensado, esta operación consiste en extraer la mayor cantidad de jugo, 
para sidras artesanales se usan prensas mecánicas (figura 3a) y la operación tarda 
aproximadamente de 2 a 4 días, donde se realizan varios cortes y se alcanza un rendimiento 
del 65 al 75%, en cambio para la producción industrial de sidra, se utilizan presas 
hidráulicas o neumáticas (figura 3b) que realizan la operación en cuestión de horas con un 
rendimiento del 70-75%. 
 Una vez obtenido el mosto sigue la etapa de clarificación pre-fermentativa (figura 4), son 
empleadas diversas técnicas, físicas (sedimentación y centrifugación), bioquímicas 
(defecación enzimática y clarificación enzimática) y químicas (agentes clarificantes como 
albumina, caseína, etc.) en combinación con las técnicas bioquímicas(Mangas Alonso, 
1996). 
 
Figura 4: Diagrama del proceso de clarificación del mosto, empleando técnicas físicas, químicas y 
bioquímicas. 
 
 
8 
 
Prosigue la etapa de fermentación, parte primordial de la fermentación de la sidra es que se 
lleva a cabo por un consorcio de microorganismos en donde están presentes tanto levaduras 
como bacterias, esta es llamada fermentación mixta, es decir, una fermentación alcohólica y 
maloláctica consecutivas. La fermentación alcohólica es realizada por levaduras (nativas o 
comerciales) que producen etanol y gran variedad de compuestos aromáticos, sean 
reportado gran variedad de especies de levaduras asociadas a la fermentación de sidra 
(Suárez y col.; 2007).El mosto fermentado es vaciado en toneles (barriles) de roble y se 
procede con la fermentación maloláctica espontanea. 
En la fermentación maloláctica las bacterias lácticas (nativas) realizan la descarboxilación 
del ácido málico en ácido láctico y la producciónde diversos compuestos aromáticos 
(Sánchez y col.; 2010). Un parámetro importante durante la fermentación es mantener a 
temperatura del proceso en un rango de 12-14°C y la ausencia de aire (Mangas 1996). 
El trasiego es la etapa que procede al término de la fermentación, en donde se cambia 
periódicamente de toneles (depósitos), con la finalidad de separar borras (impurezas) de la 
sidra, durante este proceso se obtiene estabilidad de las características fisicoquímicas y de 
la población microbiana, debe estar a temperaturas adecuadas (frías) y poco contacto con el 
aire. Cuando la sidra en el tonel obtenga una densidad inferior a 1 g/ml, una estabilidad 
microbiológica, cualidades organolépticas y turbidez del producto adecuada se procede al 
envasado, donde se debe tener la mismas condiciones que en el trasiego para evitar 
alteraciones, se pude adicionar ácido ascórbico para evitar el obscurecimiento de la sidra, se 
debe evaluar la estabilidad de la sidra en anaerobiosis a 25-30°C en la botella y así asegurar 
la calidad del producto(Mangas Alonso, 1996). 
Existen diversos defectos en la sidra como picado láctico, frambuoisé, el filado, amargor, 
entre otras alteraciones, que son causadas principalmente por alteraciones microbiologías 
y/o malas fermentaciones (Buron y col.; 2011; Coton y col.;. 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
2.2-Procesos fermentativos 
2.2.1-Fermentación alcohólica
2.2.1.1-Introducción 
La fermentación alcohólica es un proceso bioquímico, en el cual, los 
(principalmente glucosa y fructosa) son transformados a etanol 
anaeróbicas. Este proceso es realizado por levaduras y algunas bacterias como 
mobilis y puede ser resumido por la siguiente reacción (
 
Figura 5: Representación de la fermentación alcohólica
La fermentación alcohólica es un proceso mucho más complejo al representado en 
lafigura6, que conlleva reacciones
otras rutas metabólicas que realizadas a la par que sintetizan una gran variedad de 
compuestos secundarios, como los alcoholes superiores, ácidos, grasos esteres, cetonas, 
ácidos orgánicos, entre otros. Los compuestos secundarios producidos, influyen
determinante sobre características organolépticas de productos fermentados como el vino, 
cidra, cerveza, tequila, mezcal, etc.
1.2.1.2-Bioquimica de la fermentación alcohólica
El metabolismo de las hexosas (glucosa y fructosa) consta de varias etapas
primera etapa es la glicolisis, 
de reacciones (Barnett 2003).
específico en la membrana plasmática, para
fosfato, por la hexoquinasa empleando ATP como portador 
(Gancedo 1988). La glucosa
isomerasa, para luego ser nuevamente fosforilada a fructosa
fosfofructoquinasa y con ATP. 
gliceraldehido-3-fosfato (4%) y dihidroxicetona fosfato (96%), la cual es 
rápidamente a gliceraldehido
(Heinischand Rodicio 1996). 
la capacidad de aceptar electrones por parte del NAD
9 
 
Fermentación alcohólica 
ca es un proceso bioquímico, en el cual, los 
(principalmente glucosa y fructosa) son transformados a etanol y CO2en condiciones 
Este proceso es realizado por levaduras y algunas bacterias como 
y puede ser resumido por la siguiente reacción (Figura 5). 
: Representación de la fermentación alcohólica 
a fermentación alcohólica es un proceso mucho más complejo al representado en 
, que conlleva reacciones bioquímicas, químicas y fisicoquímicas. Además existen 
otras rutas metabólicas que realizadas a la par que sintetizan una gran variedad de 
, como los alcoholes superiores, ácidos, grasos esteres, cetonas, 
s. Los compuestos secundarios producidos, influyen
sobre características organolépticas de productos fermentados como el vino, 
cidra, cerveza, tequila, mezcal, etc. 
Bioquimica de la fermentación alcohólica 
las hexosas (glucosa y fructosa) consta de varias etapas 
etapa es la glicolisis, consiste en transformar las hexosas en piruvato por una serie 
. La glucosa es introducida a la célula por un transportador 
en la membrana plasmática, para ser transformada en el citoplasma 
empleando ATP como portador y donador del grupo fosfato
. La glucosa-6-fosfato es transformada a fructosa-6-fosfato por una 
somerasa, para luego ser nuevamente fosforilada a fructosa-1,6-bifosfato por la 
ATP. La fructosa-1,6-difosfato es dividida por una aldol
fosfato (4%) y dihidroxicetona fosfato (96%), la cual es 
ápidamente a gliceraldehido-3-fosfato (4%) por acción triosa fosfato isomerasa
. La futura conversión del gliceraldehido-3-fosfato depende de 
la capacidad de aceptar electrones por parte del NAD+ para producir NADH+H
ca es un proceso bioquímico, en el cual, los azúcares 
en condiciones 
Este proceso es realizado por levaduras y algunas bacterias como Zymomonas 
 
a fermentación alcohólica es un proceso mucho más complejo al representado en 
bioquímicas, químicas y fisicoquímicas. Además existen 
otras rutas metabólicas que realizadas a la par que sintetizan una gran variedad de 
, como los alcoholes superiores, ácidos, grasos esteres, cetonas, 
s. Los compuestos secundarios producidos, influyen de manera 
sobre características organolépticas de productos fermentados como el vino, 
 (figura 6). La 
consiste en transformar las hexosas en piruvato por una serie 
introducida a la célula por un transportador 
en el citoplasma a glucosa-6-
donador del grupo fosfato 
fosfato por una 
bifosfato por la 
por una aldolasa en 
fosfato (4%) y dihidroxicetona fosfato (96%), la cual es transformada 
fosfato (4%) por acción triosa fosfato isomerasa 
fosfato depende de 
para producir NADH+H+ en 
 
 
 
próximas etapas de la glucolisis. Si la capacidad de reoxidación del NAD
etapa, es posible regenéralo por 
fosfato, por medio de una deshidrogenasa y NADH+H
destinos, el primero es la utilización del glicerol
triacilgliceridos, el segundo destino es 
exterior de la célula (Heinisch and Rodicio 1996
Figura 6: Esquema del proceso de la glucolisis en las levaduras.
En el siguiente paso de la glucolisis, consiste en la transformación del gliceraldehido
fosfato en 1,3-bifosfoglicerato por una deshidrogenasa, esta reacción involucra la ox
de una molécula de NAD+ y simultáneamente la fosforilación con una molécula de fosforo 
inorgánico. El 1,3-bifosfoglicerato es convertido en 3
produce una molécula de ATP a partir de AMP. Después de esto, por medio d
el 3-fosfoglicerato es transformado en 2
obteniendo el 2-fosfoenolpiruvato, catalizada por la enzima enol
contiene un enlace fosfato de alta energía, es provechado por l
producir ATP a partir de ADP y una molécula de 
10 
etapas de la glucolisis. Si la capacidad de reoxidación del NAD+ es baja en esta 
etapa, es posible regenéralo por la conversión de la dihidroxicetona fosfato a glicerol
fosfato, por medio de una deshidrogenasa y NADH+H+. El glicerol-3-fosfato tiene dos 
la utilización del glicerol-3-fosfato para biosíntesis de 
triacilgliceridos, el segundo destino es la desfosforilación a glicerol para ser excretado al 
Heinisch and Rodicio 1996). 
 
: Esquema del proceso de la glucolisis en las levaduras. 
En el siguiente paso de la glucolisis, consiste en la transformación del gliceraldehido
bifosfoglicerato por una deshidrogenasa, esta reacción involucra la ox
y simultáneamente la fosforilación con una molécula de fosforo 
bifosfoglicerato es convertido en 3-fosfoglicerato por una quinasa y 
produce una molécula de ATP a partir de AMP. Después de esto, por medio d
fosfoglicerato es transformado en 2-fosfoglicerato, seguido por una deshidratación 
fosfoenolpiruvato, catalizada por la enzima enolasa. El 2-fosfoenolpiruvato 
contiene un enlace fosfato de alta energía, es provechado por la piruvato quinasa para 
producir ATP a partir de ADP y una molécula de piruvato. El piruvato y el NADH+H
es baja en esta 
dihidroxicetona fosfato a glicerol-3-
fosfato tiene dos 
fosfato para biosíntesis de 
a glicerol para ser excretado al 
En el siguiente paso de la glucolisis, consiste en la transformación del gliceraldehido-3-bifosfoglicerato por una deshidrogenasa, esta reacción involucra la oxidación 
y simultáneamente la fosforilación con una molécula de fosforo 
fosfoglicerato por una quinasa y 
produce una molécula de ATP a partir de AMP. Después de esto, por medio de una mutasa 
fosfoglicerato, seguido por una deshidratación 
fosfoenolpiruvato 
a piruvato quinasa para 
El piruvato y el NADH+H+ 
 
 
 
producidos durante la glicolisis son empleados es diversas rutas metabólicas 
de las condiciones del medio en el 
Las levaduras son microorganismos aeróbicos facultativos
capacidad de metabolizar los 
Las levaduras consumen los azúcar
anaeróbicas) y la respiración (condiciones aeróbicas). Estas rutas bioquímicas son 
presentadas en la figura 7. 
 
Figura 7:Destinos del piruvato en el metabolismo de las hexosas en las levaduras.
 
En condiciones anaeróbicas, el piruvato producido durante la glicolisis es transformado 
acetaldehído y CO2 por una descarboxilación, para ser
11 
producidos durante la glicolisis son empleados es diversas rutas metabólicas 
de las condiciones del medio en el que esta la levadura. 
levaduras son microorganismos aeróbicos facultativos (Racker 1974)
capacidad de metabolizar los azúcares en condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas. 
azúcares por dos rutas, la fermentación alcohólica (condiciones
anaeróbicas) y la respiración (condiciones aeróbicas). Estas rutas bioquímicas son 
Destinos del piruvato en el metabolismo de las hexosas en las levaduras. 
En condiciones anaeróbicas, el piruvato producido durante la glicolisis es transformado 
por una descarboxilación, para ser transformado luego a etanol
producidos durante la glicolisis son empleados es diversas rutas metabólicas que dependen 
(Racker 1974), tienen la 
es en condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas. 
es por dos rutas, la fermentación alcohólica (condiciones 
anaeróbicas) y la respiración (condiciones aeróbicas). Estas rutas bioquímicas son 
 
En condiciones anaeróbicas, el piruvato producido durante la glicolisis es transformado en 
a etanol, por la 
 
 
12 
 
alcoholdeshidrogenasa. Durante este proceso llamado fermentación alcohólica es oxidado 
el NAD+ utilizado durante la glucólisis, además de obtener dos moléculas de ATP por cada 
molécula de hexosa metabolizada por las levaduras. 
En condiciones aeróbicas, el piruvato proveniente de la glucólisis y la Coenzima-A son 
transformados a acetil-Coenzima-A por medio de la piruvato deshidrogenasa, además de 
liberar NADH+H+ y CO2. El acetil-Coenzima-A es incorporado al ciclo de Krebs para ser 
reducido a CO2 y potencial reductor en forma de NADH+H
+ y FADH2 para ser oxidados 
en la fosforilación oxidativa para reducir el O2 en agua y obtener ATP (Barnett and Entian, 
2005), esta ruta es conocida como respiración. El rendimiento de la respiración es de 32 
moléculas de ATP por cada molécula de hexosa metabolizada. 
La transformación de piruvato en acetaldehído o acetil-Coenzima-A es un punto crucial en 
la regulación del metabolismo de las hexosas en las levaduras. 
2.2.1.3-Factores que afectan la fermentación alcohólica 
Luis Pasteur encontró que la aeración incrementa la biomasa y decrece la producción de 
etanol (Pasteur 1861). El concluyo que la fermentación alcohólica es inhibida por el 
oxígeno disuelto en el medio (Racker 1974). Este fenómeno es conocido como el efecto 
Pasteur, ha sido atribuido a diversos mecanismo de control en las levaduras (Barnetty col.; 
2004). 
 La respiración necesita grandes cantidades de ADP dentro de la mitocondria como sustrato 
para la fosforilación oxidativa. Por lo tanto, cuando la respiración es llevada a cabo, el 
citoplasma carece de ADP y fosforo inorgánico (Lagunas y col.; 1983). A su vez, decrece el 
transporte de hexosas al interior de la célula (Lagunas y col.; 1982). Este mecanismo 
explica como la aeración inhibe la fermentación alcohólica. 
Evidentemente, una vez que las levaduras comienzan a consumir las hexosas, son liberadas 
grandes cantidades del dióxido de carbono producido. La liberación del dióxido de carbono 
desplaza al oxígeno disuelto en el medio y crea condiciones de semi-anaerobiosis que 
favorecen la fermentación alcohólica. Por lo general, en presencia de oxígeno, 
Saccharomyces cerevisiae no fermenta si la concentración de azúcares es mayor de 9 g/L. 
Cabtree fue el primero en describir este fenómeno en 1929 que es conocido por diferentes 
 
 
13 
 
nombres: efecto Crabtree, represión catabólica por glucosa o efecto contrario al Pasteur 
(Meijery col.; 1998, Ribereau-Gayony col.; 2000). 
Cuando S.cerevisiae crece en altas concentraciones de azúcar como en mosto de uva o 
manzana, sus mitocondrias son degeneradas. Simultáneamente, las enzimas del ciclo de 
Krebs y los componentes de la cadena de la fosforilación oxidativa son reprimidas 
(Gancedo, 1992, Polakis y col.; 1965 & Barnett y col., 2005). Por lo tanto, en condiciones 
de fermentación de sidra o vino, S. cerevisiae solo puede fermentar los azúcares para 
producir energía. 
2.2.1.4 Metabolismo secundario 
Durante la fermentación alcohólica otras rutas metabólicas secundarias están activas, como 
el metabolismo de proteínas, ácidos grasos y compuestos azufrados, las cuales generan una 
gran variedad de compuestos que dan las características organolépticas a los vinos y sidras. 
Tomando como referencia a S. cerevisiae en la figura 8 se muestra un esquema de la 
integración de su metabolismo en la fermentación del vino. 
 
Figura 8: Integración de metabolismo de S. cerevisiae durante la fermentación del mosto de uva en la 
elaboración de vinos. 
Los principales metabolitos secundario generados durante la fermentación de la sidra y del 
vino son esteres, alcoholes superiores, ácidos grasos y aldehídos, estos juegan un rol 
determinante en el aroma y sabor del producto (Pincinelli y col., 2000; Antón y col., 
 
 
14 
 
2014). En la sidra algunas cepas de levaduras son capaces de producir compuestos 
fenólicos que producen malos olores (Buron y col., 2012). 
Los esteres son producidos por los lípidos y acetil-CoA del metabolismo de las levaduras o 
por esterificación de ácidos grasos con alcoholes (figura 9). 
 
Figura 9: Biosíntesis general de ésteres 
En vino los principales esteres producidos son el acetato de etilo (aroma frutal o como 
solvente), acetato de isoamilo o acetato de isopentilo (aroma peras), acetato deisobutilo 
(aroma a banana), caproato deetiloohexanoato deetilo (aroma a manzana) y acetato de 2-
fenetilo (aroma a miel, fruta y floral) (Thurston y col., 1981). En sidra los principales 
esteres son el acetato de etilo, lactato de etilo (aroma frutal o fresa), 2-feniletanol (aroma 
floral) (Pincinelli y col., 2000, Antón y col., 2014). Las concentraciones de esteres varían 
de acuerdo al mosto y las cepas de levaduras involucradas en la fermentación. Se ha 
reportado que las cepas no-Saccharomyces tienen la capacidad de producen mayor 
diversidad y concentración de esteres comparadas con las levaduras del género 
Saccharomyces, en diferentes fermentaciones alcohólicas (Segura-Garcíay col.; 2014, 
Rojasy col.; 2001, Rojas et al 2003 y Plata y col.; 2003). Los esteres son parte fundamental 
de la estructura del aroma de vinos y sidras (Pincinelli y col., 2000, Antón y col., 2014). 
Los alcoholes superiores son metabolitos secundarios de las levaduras durante la 
fermentación alcohólica. Forman parte del aroma del vino y sidra, estos tienen diversos 
efectos en el aroma, en concentraciones mayores a 400 mg/l tienen un olor penetrante y 
sabor fuerte. En contracciones menores a 300 mg/L proporcionan notas aromáticas 
positivas, dando características frutales al vino y la sidra (Lambrechts y col., 2000, 
Swiegersy col.; 2005).Los principales alcoholes superiores encontrados en sidra son 1-
propanol, 1-butanol, iso-butanol, alcoholes alilicos, hexanol y alcoholes amílicos 
(Pincinelliy col., 2000, Antón y col.; 2014). 
 
 
15 
 
2.2.1-Fermentación maloláctica 
2.2.2.1-Introducción 
La fermentación maloláctica es un conjunto de reacciones bioquímicas que involucran el 
metabolismo de carbohidratos y ácidos orgánicos a la par. Una de las principales rutas 
bioquímicas es la transformación enzimática del ácido málico en ácido láctico por las 
bacterias ácido láctica (BAL) (Battermann y Radler 1991). 
Las BAL presentan dos tipos de metabolismo: el homofermentativo, los diferentes sustratos 
son transformados en ácido lácticocomo producto final. El heterofermentativo, los 
diferentes sustratos son transformados en diversos compuestos como el ácido láctico, 
etanol, glicerol, acetoína, esteres, etc. (Miyoshi y col., 2003). 
Las BAL heterofermentativas son capaces de crecer a pH bajos (<3.5), altas 
concentraciones de etanol (>10 %vol.) altas concentraciones de SO2 (50 mg/L) en procesos 
de fermentaciones de sidras y vinos (Davis y col., 1986; Wibowo y col., 1985). 
1.2.2.2-Bioquimica de la fermentación maloláctica 
Las BAL (heterofermentativas)en la fermentación maloláctica degradan diversos sustratos. 
Los azúcares son degradadas principalmente a L-lactato, etanol y CO2 (Würdig y col., 
1989; Dittrich y col., 2005). Son asociadas diversas especies de BAL, siendo la BAL 
mayoritaria en fermentaciones malolácticas de vinos y sidras, donde Oenococcus oeni es la 
BAL más representativa (Suarez y col., 2007), por lo cual es un modelo para entender los 
procesos bioquímico en la fermentación maloláctica. 
O. oeni es capaz de metabolizar la glucosa, fructosa y xilosa como fuente de carbono, 
además algunas cepas son capaces de metabolizar las hexosas (galactosa y manosa), 
pentosas (xilosa y arabinosa) y disacáridos (trealosa, celobiosa, sacarosa y melibiosa) 
(Beelmany col., 1977; Garvie, 1986; Zhang and Lovitt, 2005). 
La ruta para la degradación de los azúcares es llamada de la fosfocetolasa (Figura 10). A 
partir de la degradación de las pentosas se obtiene 1 NADH durante la conversión a 
piruvato, que es el último aceptor de electrones para oxidar el NADH, y el acetil-P que es 
convertido a acetato (Figura 10). Las hexosas son transformadas a pentosas por oxidación y 
descarboxilación (Figura 10), cediendo cuatro electrones extras (2 NADPH+H+), seguido 
por un NADH+H+ adicional derivado de la degradación de las pentosas a piruvato. La 
 
 
16 
 
formación de lactato es parte tanto de la fermentación de las hexosas como las pentosas. 
Dos NADPH son cargados en el acetil-P para la formación de etanol (ruta del etanol) en 
lugar de acetato. 
El metabolismo de los ácidos orgánicos juega un rol importante en las características 
organolépticas del vino y sidra, reflejado en una reducción de la acidez y estabilización 
microbiológica (Mangas 1999). Los principales ácidos orgánicos encontrados en la uva son 
el tartárico, málico y cítrico, mientras que en la manzana son el ácido shikimico, málico y 
cítrico (Pincinelliy col.; 2000). 
 
 
Figura 10: Fermentación de las hexosas y pentosas por la ruta de la fosfocetolasa en O. oeni. 
La degradación del malato (L-malato →L-lactato + CO2) por las BAL es 
fisicoquímicamente significativo en sidras, vinos y jugos de frutas que contienen altas 
concentraciones de este ácido C4–dicarboxilico. En O. oeni descarboxila el L-malato
1- (con 
solo un grupo carboxilo ionizado) (Figura 9) por medio de la enzima maloláctica (Caspritz 
y col.; 1983). Las BAL del genero Lactobacillus son capaces de metabolizar el malato2-
(completamente ionizado) por una ruta alterna (figura 10), donde el malato es transformado 
 
 
17 
 
a oxalacetato y dos protones por la malatodeshidrogenasa, el oxalacetato es transformado a 
piruvato que tiene dos destinos a lactato y acetato (Dittrich 1995). El piruvato puede ser 
usado como aceptor de electrones aceptor de electrones en la reoxidación de NADPH+H+ 
(Figura 11), pero es capaz de soportar el crecimiento de O. oeni y L. mesenteroides como 
único sustrato (Wagner y col., 2005). 
 
Figura 11:Rutas y acarreadores para la fermentación del malato y citrato por O. oeni y L. mesenteroides 
 
Muchas BAL incluyendo O. oeni y L. mesenteroides utilizan el citrato como un aceptor de 
electrones en el co-metabolismo de los azúcares como glucosa, fructosa, lactosa o xilosa, 
que proporcionan NADH + H+ que reduce al piruvato proveniente del metabolismo del 
citrato y produciendo lactato además de CO2 y otros derivados (citrato + 2 [H] → lactato 
+acetoína+2,3-butanodiol + CO2) (Salou y col.,1994; Schmitt y col., 1997; Hache y col., 
 
 
18 
 
1999; Starrenburg y col., 1991; Drinan y col., 1976) (figura 11). Algunas otras BAL son 
capaces de crecer en citrato como el único sustrato (Medina de Figueroa y col.; 2000). El 
transporte de citrato y lactato están acoplados (figura 11), es producido un intercambio 
electrogénico entre precursor y producto (citrato2- y lactato-) resultando en un gradiente 
electroquímico sobre la membrana (Ramos et al 1994; Marty-Teysset y col., 1995; 
Konings, 2002), es decir al introducir el citrato es secretado el lactato al medio por el 
transportador de membrana antitrasporte citrato/lactato 
 
Figura 12: del ácido málico por una ruta alterna en BAL del genero Lactobacillus. 
El oxaloacetato es metabolizado por las BAL por medio de una descarboxilación(por una 
oxaloacetatodescarboxilasa citoplasmática) que produce piruvato (Marty-Teyssety col., 
1996; Mills y col., 2005; Remitente y col., 2004). En exceso de NADH + H+ (por ejemplo, 
durante la oxidación de hexosa) la mayor parte de la piruvato es reducido a lactato (Ramos 
y col.; 1994) que acciona el transportador de membrana antitransporte citrato/lactato (Salou 
y col.; 1994,Konings 2002). Pero el resto del piruvato es transformado en acetoína y 2,3-
butanodiol (Figura 12) (Ramos y col., 1994; Nielsen y col., 1999). La acetoína sufre una 
oxidación química (no enzimática) en O. oeni que produce diacetilo. El diacetilo es un 
compuesto que proporciona un sabor a mantequilla, en los productos tratados por LAB, se 
tolera en la sidra y el vino sólo en bajas concentraciones (Mills et al 2005, Nielsen y col., 
1999, Schmitt et al 1997, Bartowski y col., 2004). 
 
 
19 
 
El resultado de la fermentaciones una elevación del pH del medio por la conversión de un 
ácido carboxílico divalente a un monovalente. Esta redacción es aplicada en el proceso de 
elaboración de sidras y vinos empleando cepas comerciales de O. oeni o empleado cepas 
nativas por fermentación espontanea (Mills y col., 2005; Moreno-Arribas y col., 2005; Liu 
2002; Coucheney y col., 2005, Lonvaud-Funel 1999), afectando de manera positiva en las 
características organolépticas del producto final. 
2.2.3- Fermentaciones mixtas 
Los procesos fermentativos tradicionales son realizados por consorcios microbianos que 
incluyen a levaduras Saccharomyces, no-Saccharomyces, BAL y bacterias acéticas. En la 
actualidad no se tienen completamente esclarecidos los roles que juegan y sus interacciones 
de cada grupo microbiano. 
En el proceso de elaboración de sidras y vinos se ha caracterizado la fermentación mixta 
entre levaduras Saccharomyces y no-Saccharomyces (Suarez y col.; 2007). Al inicio de la 
fermentación alcohólica sean identificados gran variedad de levaduras tanto 
Saccharomyces y no-Saccharomyces, al medida que avanza la fermentación las levaduras 
no-Saccharomyces disminuyen su población y las especies, las levaduras Saccharomyces 
aumentan su población logrando ser la mayoritarias (Suarez y col.; 2007). En la etapa final 
de la fermentación en la mayoría de los casos solo son identificas levaduras Saccharomyces 
(Suarez y col.; 2007, Querol y col.; 1994). 
Las fermentaciones mixtas favorecen las características organolépticas en el vino. En el 
caso de S. cerevisiae y Toluroespora del brueckii presenta un aumento de las notasfrutales 
cuando es realizada la fermentación mixta, esto es debido a la gran concentración esteres 
como el propionato de etilo, isobutanoato de etilo, dihidroxicinamato de etilo y acetato de 
etilo comparado con la fermentación de S cerevisiae puro (Renault y col.; 2015). 
En el caso de la fermentación mixta de vino con S. cerevisiae y Hanseniaspora uvarum, se 
observó que el etanol, concentración de azúcar y otros metabolitos secundarios secretados 
por S. cerevisiae no disminuyen la población ni la viabilidad de H. uvarum durante la 
fermentación alcohólica (Wang et al 2014). También descartaron las posibles interacciones 
célula-célula entre las dos cepas como cauda de la disminución de viabilidad de H. uvarum 
(Wang et al 2014). 
 
 
20 
 
La fermentación secuencial del vino existen diversos factores que afectan el crecimiento de 
O. oeni durante la fermentación maloláctica, estos provienen de la fermentación alcohólica 
por S. cerevisiae, estos metabolitos secundarios son el etanol, el SO, los ácidos grasos 
(principalmente de C10-C12), además del nitrógeno disponible. El efecto de la inhibición se 
atribuye a la disminución de la actividad maloláctica en O. oeni pero aún no se tiene 
esclarecido (Nehmey col.; 2008). 
2.3-Identificación de microorganismos en procesos fermentativos 
2.3.1-Introduccion 
En los procesos fermentativos tradicionales son realizados por consorcios microbianos 
nativos (levaduras y bacterias), que aportan parte de las características organolépticas del 
producto. En la determinación tradicional de los microorganismo involucradas en los 
procesos fermentativos comienza con el aislamiento y purificación para esto, son 
empleadas placas con medios selectivos (adicionados con antibióticos o antifúngicos) y 
diferenciales (adicionados con colorantes por ejemplo verde de bromocresol). Con los 
microorganismos aislados y puros se procede a la identificación por técnicas bioquímicas 
tradicionales o por técnicas moleculares. Las técnicas empleadas depende el tipo de 
microorganismo, por lo cual los métodos de identificación se describirán por tipo de 
microorganismo (bacteria y levadura). 
2.3.2-Técnicas de cultivo e identificación de microorganismos 
Las técnicas para identificación de microorganismos tradicionales son basadas en sus 
características fisiológicas, fenotípicas y bioquímicas del microorganismo. Estas 
características dependen del estado sexual y metabólico. Estas técnicas con complejas y 
requieren bastante tiempo para ser realizas, por lo cual existen kits comerciales para cada 
tipo de microorganismo a identificar (bacterias y levaduras). 
2.3.2.1-Identificacion de levaduras 
Para la identificación fenotípica de levaduras son empleados diversos criterios. El primer 
criterio es la caracterización de la colonia de levaduras, consiste en calificar las colonias 
con base en sus características morfológicas, textura (mucosa, viscosa, grasosa, arenosa, 
fibrosa o membranosa), color (el color varía dependiendo del medio donde es cultivada la 
levadura), superficie (reluciente o mate, lisa, áspera, sectorizada, doblada, camellones), 
 
 
21 
 
elevación (si es plana, elevada, elevada con depresión en el centro o cónica) y bordes (si el 
borde de la colonia es ondulado, lobulado, flecos con hifas o pseudohifas) (Kurtzmany col.; 
2011). 
 El segundo criterio es la reproducción sexual y la reproducción vegetativa. Son 
clasificadas en taxones basados en la formación de su estado sexual (Ascomicota o 
Basidiomycota), para la ausencia del estado sexual fue creado un taxón denominado 
Deuteromycota. Las levaduras presentan diversas formas de reproducción vegetativa que 
son importantes para su identificación, el modo de agrupamiento (multilateral y bipolar), su 
división celular, formación de artroconidias y ballistoconidia, además de alguna otra 
característica morfológica (tamaño de la célula, desarrollo de hifas verdaderas o seudohifas) 
(Deaky col.; 2008). 
Otra característica es la capacidad de asimilar diversas fuentes de carbono y nitrógeno a 
30°C por dos semanas. Las fuentes de carbono más usadas son la D-glucosa, D-galactosa, 
sacarosa, maltosa, lactosa, rafinosa y trealosa, otros carbohidratos como la inulina, 
melibiosa, celobiosa y D-xilosano son tan comúnmente usados. Las fuentes de nitrógeno 
más comúnmente empleadas son el nitrato, nitrito, clorhidrato de etilamina, dihidrocloruro 
de cadaverina,L-lisina, imidazol, glucosamina, creatina, y creatinina. Las pruebas pueden 
ser realizadas en medio líquido tanto en medio sólido. 
2.3.2.1-Identificacion de bacterias 
La identificación de bacterias al igual que la de levaduras comienza con un aislamiento y 
clasificación de las características morfológicas de la colonia. Otra técnica muy utilizada es 
la tinción de Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la 
desarrolló en 1844.Esta técnica clasifica a las bacterias en dos grupos (color adquirido al 
final de la tinción), Gram-positivas (color azul) y Gram-negativas (color rojo).Las 
diferencias se basan en la constitución en la estructura de su pared celular (figura 13). La 
pared de las células de las bacterias Gram-positivas constade varias capas interconectadas 
de peptidoglicanos así como de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la 
célula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared celularde las Gram-negativas, contienen 
únicamente peptidoglicanos y está rodeada por una membrana exterior compuesta de 
fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas,sólo 10% - 20% de la pared de la célula 
Gram-negativa es peptidoglicano. 
 
 
 
Figura 13: Estructura general de la pared celular en los tipos de bacterias. A) Pared celular de bacterias Gram
negativas, está constituida por una doble capa fosfolipídica. B) Pared celular de bacterias Gram
consta de varias capas interconectadas de pe
El fundamento de la tinción se basa en la capacidad 
cristal violeta durante el tratamiento 
tipo de pared celular (figura 14
a la solución de yodo-lugol para formar 
colorante no sea removido 
comúnmente como la fijación del colorante. Sin embargo, el tratamiento posterior con el 
decolorante, es disuelta la capa lipídica de las célul
lixiviación del colorante de las células. En contraste, el disolvente se deshidrata la pared 
celular Gram positiva causando
deshidratación. Como resultado, la difusión d
la célula está obstruido, y las células permanecen manchada. 
colórate (safranina) que solo tiñe a las bacterias 
permeada (Martholomew y M
22 
Estructura general de la pared celular en los tipos de bacterias. A) Pared celular de bacterias Gram
stá constituida por una doble capa fosfolipídica. B) Pared celular de bacterias Gram
de varias capas interconectadas de peptidoglicanos y ácido teicoico. 
inción se basa en la capacidad de la célula para retener 
cristal violeta durante el tratamiento con un decolorante (alcohol-acetona) de acuerdo al 
4). Las células son penetradas por el cristal violeta
para formar un complejo (azul violeta-yodo), de modo que el 
 fácilmente del interior de la célula. Este paso se conoce 
comúnmente como la fijación del colorante. Sin embargo, el tratamiento posterior con el 
la capa lipídica de las células Gram-negativas aumentando la 
de las células. En contraste, el disolvente se deshidrata la pared 
causando el cierre de los poros y la pared y contrae durante la 
deshidratación. Como resultado, la difusión del complejo azul violeta-yodo hacia fuera de 
la célula está obstruido, y las células permanecen manchada. Al final es agregado otro 
colórate (safranina) que solo tiñe a las bacterias Gram-negativas que tienen una membrana 
Mittwer 1952, Martholomew yMittwer 1957). 
 
Estructura general de la pared celular en los tipos de bacterias. A) Pared celular de bacterias Gram-
stá constituida por una doble capa fosfolipídica. B) Pared celular de bacterias Gram-positivas,er el colorante 
acetona) de acuerdo al 
células son penetradas por el cristal violeta, es añadida 
de modo que el 
. Este paso se conoce 
comúnmente como la fijación del colorante. Sin embargo, el tratamiento posterior con el 
aumentando la 
de las células. En contraste, el disolvente se deshidrata la pared 
contrae durante la 
yodo hacia fuera de 
Al final es agregado otro 
negativas que tienen una membrana 
 
 
 
Figura 14: Esquematización del proceso de la tinción de Gram. Consta de 5 etapas, la fijación de la muestra 
en un portaobjetos, tinción con cristal violeta, adición de solución de lugol
de alcohol-acetona y por último tinción c
 
La tinción de Gram permite visualizar 
coco (algunas derivaciones como diplococo, estafilococo, etc.)
derivaciones como cocobacilo, estreptobacilo, etc.)
tinción permite clasificar en dos grupos a las bacterias 
tinción 
1.3.3-Identificacion por técnicas basadas en biología mo
Estudios dirigidos a la identificación de di
basado en enfoques morfológicos y fisiológicos (Kreg
Estas características pueden variar de acuerdo con las condici
col., 1966, Yamamoto y col.
algo cuestionable, ya que en muchos casos dependen del est
microorganismo (Golden y col.
biología molecular son una alternativa a los métodos tradicionales, ya que analizan el 
23 
Esquematización del proceso de la tinción de Gram. Consta de 5 etapas, la fijación de la muestra 
en un portaobjetos, tinción con cristal violeta, adición de solución de lugol-yodo, decoloración con solución 
acetona y por último tinción con safranina 
permite visualizar la morfología de las bacterias y clasificarla como
(algunas derivaciones como diplococo, estafilococo, etc.), bacilos
derivaciones como cocobacilo, estreptobacilo, etc.), espirilos y Vibrio (figura
tinción permite clasificar en dos grupos a las bacterias de acuerdo al color adquirido en la 
Identificacion por técnicas basadas en biología molecular 
Estudios dirigidos a la identificación de diferentes especies de levaduras y bacterias, 
basado en enfoques morfológicos y fisiológicos (Kreger-van Rij 1984, Barnett
Estas características pueden variar de acuerdo con las condiciones de crecimiento (
y col., 1991).Sin embargo, la reproducibilidad de estas técnicas es 
algo cuestionable, ya que en muchos casos dependen del estado fisiológico del 
y col., 1994). Por el contrario, el empleo de técnicas 
una alternativa a los métodos tradicionales, ya que analizan el 
 
Esquematización del proceso de la tinción de Gram. Consta de 5 etapas, la fijación de la muestra 
oloración con solución 
de las bacterias y clasificarla como 
, bacilos (algunas 
Vibrio (figura 15). La 
de acuerdo al color adquirido en la 
ferentes especies de levaduras y bacterias, se han 
van Rij 1984, Barnett y col.,1990). 
ones de crecimiento (Scheda y 
.Sin embargo, la reproducibilidad de estas técnicas es 
ado fisiológico del 
técnicas basadas en 
una alternativa a los métodos tradicionales, ya que analizan el 
 
 
 
genoma independientemente del estado fisiológico de la célula
realización. 
Figura 15: Morfologías más comunes que presentan las bacterias. A) la forma esférica es conocida como 
cocos, presentado variantes según la forma que están agrupados, como diplococo (dos cocos), estreptococo 
(cadenas de cocos), estafilococo (formación de racimos),
(cuatro cocos). B) La forma alargada con puntas redondeadas es llamada bacilo, presentado variantes 
según la forma que están agrupados, como diplobacilo (dos bacilos), estreptobacilo (cadenas de bacilos).C) 
Existen otras morfologías algunas son la vibrio () y el espirilo (bastón largo en forma de espiral)
2.3.2.2.1-Métodos basados en el Análisis de Regiones Ribosomal
En la caso de las levaduras, l
agrupan para formar tándem unidades de transcripción que se repiten en el genoma entre 
100 y 200 veces (figura 16). En cada unidad de transcripción existen otras dos regiones, los 
espaciadores internos transcritos (ITS) y los externos (ETS), regiones que s
pero no se procesan. A su vez, las unidades codifican
espaciadores intergénicos, también llamados NTS. Los genes ribosomal 5.8S, 18S y 26S, 
así como las ITS y NTS, representan herramientas poderosas para establecer 
filogenéticas y para identificar las espe
han sido desarrollados para identificar especies de levadura utilizando la información 
contenida en estas regiones. 
24 
genoma independientemente del estado fisiológico de la célula y de menor tiempo de 
 
fologías más comunes que presentan las bacterias. A) la forma esférica es conocida como 
cocos, presentado variantes según la forma que están agrupados, como diplococo (dos cocos), estreptococo 
(cadenas de cocos), estafilococo (formación de racimos), Sarcina (agrupación en forma de cubo) y Tétrada 
(cuatro cocos). B) La forma alargada con puntas redondeadas es llamada bacilo, presentado variantes 
según la forma que están agrupados, como diplobacilo (dos bacilos), estreptobacilo (cadenas de bacilos).C) 
Existen otras morfologías algunas son la vibrio () y el espirilo (bastón largo en forma de espiral)
Métodos basados en el Análisis de Regiones Ribosomales 
En la caso de las levaduras, los genes ribosomales (5.8S, 18S y 26S) en levaduras 
agrupan para formar tándem unidades de transcripción que se repiten en el genoma entre 
). En cada unidad de transcripción existen otras dos regiones, los 
espaciadores internos transcritos (ITS) y los externos (ETS), regiones que s
pero no se procesan. A su vez, las unidades codificantes están separadas
s, también llamados NTS. Los genes ribosomal 5.8S, 18S y 26S, 
así como las ITS y NTS, representan herramientas poderosas para establecer 
filogenéticas y para identificar las especies (Kurtzman y Robnett 1998).Diferentes métodos 
han sido desarrollados para identificar especies de levadura utilizando la información 
y de menor tiempo de 
fologías más comunes que presentan las bacterias. A) la forma esférica es conocida como 
cocos, presentado variantes según la forma que están agrupados, como diplococo (dos cocos), estreptococo 
Sarcina (agrupación en forma de cubo) y Tétrada 
(cuatro cocos). B) La forma alargada con puntas redondeadas es llamada bacilo, presentado variantes 
según la forma que están agrupados, como diplobacilo (dos bacilos), estreptobacilo (cadenas de bacilos).C) 
Existen otras morfologías algunas son la vibrio () y el espirilo (bastón largo en forma de espiral) 
en levaduras se 
agrupan para formar tándem unidades de transcripción que se repiten en el genoma entre 
). En cada unidad de transcripción existen otras dos regiones, los 
espaciadores internos transcritos (ITS) y los externos (ETS), regiones que se transcriben 
separadas por los 
s, también llamados NTS. Los genes ribosomal 5.8S, 18S y 26S, 
así como las ITS y NTS, representan herramientas poderosas para establecer las relaciones 
Diferentes métodos 
han sido desarrollados para identificar especies de levadura utilizando la información 
 
 
 
Figura 16: Estructura ADN ribosomal nuclear.
En las bacterias se encuentra el
gran variabilidad para diferenciar las especies. 
sitios de cebado y han permitido de
Wilkinson, 2004). En la actualidad este gene es empleado para la identificación de 
microorganismos por diversas técnicas como la secuenciación
Con una aplicación industrial en mente
desarrollaron, basados en la amplificación por PCR de estas regiones del DNA ribosomal y 
para depuse ser digeridas con enzimas de
emplear una pequeña cantidad de biomasa
2.3.2.2.2-Secuenciación de regiones ribosomales
Este método está basado en la determinación y comparación de la secuencia de nucleótidos 
en estas regiones. Tradicionalmente 
regiones ribosomales, la correspondiente
5’ del gen 26S (Kurtzman y Robnett 1998) y el gen 18S 
últimos años también se ha empleado la región de los ITS1, ITS2 y el gen 5.8S
útiles para determina la cercanía 
exhiben mucho mayores que las diferenciasinterespecíficas que los genes 18S y 25S
col., 1996; James y col., 1996)
hace que esta técnica asigne a una levadura desconocida 
de sus secuencias similar al 99%
como se ha mencionado antes es usado el gen 
iniciadores, los iniciadores universales 
col., 2013, Katsivela y col., 2013)y 1510R(
2013), el R (5´CGGTTACCTTG
Este proceso es ilustrado en la figura 1
utilizando el ADN total (Proveniente de una extracción o directo de las células). Los 
25 
Estructura ADN ribosomal nuclear. 
se encuentra el gen ribosomal16S, el cual es altamente conservado y con 
variabilidad para diferenciar las especies. Las secciones conservadas
han permitido determinar rápidamente secuencias 
. En la actualidad este gene es empleado para la identificación de 
por diversas técnicas como la secuenciación. 
Con una aplicación industrial en mente, métodos de identificación simples se
en la amplificación por PCR de estas regiones del DNA ribosomal y 
para depuse ser digeridas con enzimas de restricción, para estos estudios se necesario 
emplear una pequeña cantidad de biomasas de las cepas a identificar. 
Secuenciación de regiones ribosomales 
Este método está basado en la determinación y comparación de la secuencia de nucleótidos 
en estas regiones. Tradicionalmente para la identificación de levaduras son usadas dos 
correspondiente a los dominós D1 y D2 localizados en el extremo 
Robnett 1998) y el gen 18S (James y col.; 1997)
últimos años también se ha empleado la región de los ITS1, ITS2 y el gen 5.8S
cercanía en las relaciones genealógicas de los hongos ya que 
las diferencias interespecíficas que los genes 18S y 25S
1996). La disponibilidad de estas secuencias en bases de datos, 
hace que esta técnica asigne a una levadura desconocida a una especie con una homología 
al 99% (Kurtzman y Robnett 1998). En el caso de las bacterias 
ntes es usado el gen 16S, para el cual se ha reportado diversos 
los iniciadores universales 9F (5′́ -GAGTTTGATCCTGGCTCAG
2013)y 1510R(5′́-GGCTACCTTGTTACGA-3′) 
el R (5´CGGTTACCTTGTTACGGACTT-3´) (Katsivela y col, 2013).
Este proceso es ilustrado en la figura 17, el dominio de interés es amplificado por PCR 
utilizando el ADN total (Proveniente de una extracción o directo de las células). Los 
 
, el cual es altamente conservado y con 
secciones conservadas, sirven como 
terminar rápidamente secuencias (Devereux & 
. En la actualidad este gene es empleado para la identificación de 
, métodos de identificación simples sean 
en la amplificación por PCR de estas regiones del DNA ribosomal y 
, para estos estudios se necesario 
Este método está basado en la determinación y comparación de la secuencia de nucleótidos 
son usadas dos 
D1 y D2 localizados en el extremo 
1997). Pero en los 
últimos años también se ha empleado la región de los ITS1, ITS2 y el gen 5.8S ya que son 
hongos ya que 
las diferencias interespecíficas que los genes 18S y 25S (Caiy 
La disponibilidad de estas secuencias en bases de datos, 
una especie con una homología 
En el caso de las bacterias 
para el cual se ha reportado diversos 
GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´) (Hayat y 
) (Hayat y col., 
2013). 
, el dominio de interés es amplificado por PCR 
utilizando el ADN total (Proveniente de una extracción o directo de las células). Los 
 
 
 
productos de PCR son purificados usando k
exceso de desoxinucleotidos que pueden interferir con secuenciación
es necesario purificar, son empleados los productos de PCR directos)
automático de secuenciación, son
identificación de las bases nitrogenadas. 
amplificación por PCR utilizando los mismos iniciadores. Los fragmentos de ADN 
marcados de esta manera se separan por cap
excitan simultáneamente por un láser, produciendo una emisión que es diferente para cada 
uno de los colorantes. Las señales generadas son posteriormente transformadas por un 
software en picos de color, cada uno de 
separación es rápida y permite aproximadamente 600 nucleótidos que se deben leer 2 o 3 h, 
de acuerdo con el modelo de secuenciador.
Figura 17: Método para la identificación de especies 
posterior secuenciación de las regiones ribosomal.
2.3.2.2.2-Analisis de restricción de regiones ribosomales
Otros métodos de identificación más simples se desarrollaron en paralelo, basado en la 
amplificación por PCR de estas regiones del DNA 
con enzimas de restricción (Enzimas endonucleasas que contar en sitos específicos del 
ADN) del fragmento amplificado.
patrón de fragmentos generados. 
la reacción de amplificación, en una serie de estudios
de biomasa de una colonia aislada
un gran ahorro en el tiempo y sólo necesita un paso 15 
26 
productos de PCR son purificados usando kits comerciales para eliminar los iniciadores y el 
exceso de desoxinucleotidos que pueden interferir con secuenciación (en algunos casos no 
es necesario purificar, son empleados los productos de PCR directos). En 
automático de secuenciación, son usados cuatro colorantes fluorescentes para l
identificación de las bases nitrogenadas. Los colorantes se incorporan por medio de la 
amplificación por PCR utilizando los mismos iniciadores. Los fragmentos de ADN 
marcados de esta manera se separan por capilares finos en función de su tamaño y se 
excitan simultáneamente por un láser, produciendo una emisión que es diferente para cada 
uno de los colorantes. Las señales generadas son posteriormente transformadas por un 
software en picos de color, cada uno de los cuales corresponde a un nucleótido. La 
separación es rápida y permite aproximadamente 600 nucleótidos que se deben leer 2 o 3 h, 
de acuerdo con el modelo de secuenciador. 
Método para la identificación de especies de levaduras basado en la amplificación por PCR y la 
posterior secuenciación de las regiones ribosomal. 
Analisis de restricción de regiones ribosomales 
métodos de identificación más simples se desarrollaron en paralelo, basado en la 
icación por PCR de estas regiones del DNA ribosomal y seguida por
(Enzimas endonucleasas que contar en sitos específicos del 
del fragmento amplificado. Esto permite identificar a los microorganismos por el 
rón de fragmentos generados. Aunque es habitual el uso de ADN como una plantilla en 
la reacción de amplificación, en una serie de estudios se observó que una pequeña cantidad 
una colonia aislada, se puede utilizar como plantilla. Este enfoque
empo y sólo necesita un paso 15 min. a 95 ° C en el protocolo de 
its comerciales para eliminar los iniciadores y el 
(en algunos casos no 
. En un sistema 
usados cuatro colorantes fluorescentes para la 
Los colorantes se incorporan por medio de la 
amplificación por PCR utilizando los mismos iniciadores. Los fragmentos de ADN 
ilares finos en función de su tamaño y se 
excitan simultáneamente por un láser, produciendo una emisión que es diferente para cada 
uno de los colorantes. Las señales generadas son posteriormente transformadas por un 
los cuales corresponde a un nucleótido. La 
separación es rápida y permite aproximadamente 600 nucleótidos que se deben leer 2 o 3 h, 
 
de levaduras basado en la amplificación por PCR y la 
métodos de identificación más simples se desarrollaron en paralelo, basado en la 
seguida por una digestión 
(Enzimas endonucleasas que contar en sitos específicos del 
Esto permite identificar a los microorganismos por el 
Aunque es habitual el uso de ADN como una plantilla en 
una pequeña cantidad 
plantilla. Este enfoque representa 
a 95 ° C en el protocolo de 
 
 
27 
 
amplificación con el fin de liberar el ADN en la mezcla de reacción. Los productos de 
amplificación se visualizaron en geles de agarosa al 1 a 1,4%. Los productos de 
amplificación de diferente tamaño corresponden a diferentes especies; sin embargo, cuando 
los fragmentos amplificados son del mismo tamaño que no siempre corresponden a la 
misma especie y es necesario recurrir a la digestión de estos fragmentos a ser capaz de 
identificar ellos definitivamente.