Estudio de algunos factores que afectan el establecimiento de un método espectrofotométrico

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Estudio de algunos factores que afectan el 
establecimiento de un método espectrofotométrico
Objetivos:
 Seleccionar tubos comunes de laboratorio para usarlos como cubetas para el
espectrofotómetro.
 Manejar algunos de los parámetros que intervienen en el establecimiento de un
método espectrofotométrico.
 Establecer las condiciones óptimas de los parámetros probados para la aplicación
del método.
Fundamento de la práctica: 
El fundamento del equipo se basa en la cantidad de luz que es absorbida y en la cantidad
de luz que es transmitida cuando se le incide un haz de luz monocromada a una muestra
colorida, la resultante de la suma de la luz transmitida más la absorbida nos da igual a la
intensidad de la luz que le hacemos incidir. La elección de tubos adecuados se
fundamenta en escoger los que sean de paredes ópticamente equivalentes y diámetros
regulares equivalentes. La reacción se fundamenta en la formación de un complejo
colorido entre el ion férrico presente en algún tipo de muestra con el tiocianato, este
complejo es de color rojo y puede cuantificarse a 480 nanómetros. 
Resultados: 
1:- Selección de tubos para ser usados como celdas.
Se calibro el espectrofotómetro al aire a 0% de transmitancia a 400 nm, después se
introdujo un tubo y se calibro el espectrofotómetro al 95% de transmitancia y
posteriormente se introdujeron varios tubos buscando que tuvieran valores cercanos de
más menos 2 unidades de transmitancia al 95%, esto para ver que tuvieran superficies
ópticamente equivalentes, posteriormente para ver si eran de diámetro interno
equivalente se les adiciono una solución de sulfato de níquel, la cual nos mostraría las
pequeñas variaciones en el paso de luz, se usó un tubo con agua para calibrar a 100% de
transmitancia y se buscaron tubos que no dieran más de dos unidades de diferencia, así
llegamos a la conclusión de que 13 del total de tubos proporcionados cumplían con estas
dos características y podían ser usados como celdas.
El diámetro interno equivalente hace referencia a que los tubos deben de tener la misma
medida de diámetro a lo largo del tubo para evitar variaciones en los resultados, y
superficies ópticamente equivalentes se refiere a que en la superficie del tubo debe de ser
de tal manera que la luz pase de manera homogénea a través de el, y del resto de los
tubos.
2.- Curva de calibración. 
Ecuación de la recta:
y = 0.015x
Ejemplo de la corrección de absorbancia: Para el valor de 0.698, este valor corresponde a 
la concentración de ion férrico, por lo tanto corresponde al eje de las X, así que para 
calcular el nuevo valor de y o de absorbancia para esa concentración, simplemente se 
multiplica el valor por la pendiente quedando así: 
Y = 0.015 x 0.698 .: Y = 0.0104 que es el valor de absorbancia corregida.
Discusión: Que el valor de r2 nos diera muy parecido a uno, nos indica que nuestros datos
se comportan como una recta y el grafico nos dice que la ordenada se encuentra al origen,
así que podemos decir que se trabajó bien, podemos usar la ecuación del grafico para
interpolar datos de absorbancia que es la variable dependiente de la concentración, y así
obtener la concentración de una muestra problema. Que nos diera como resultado una
línea recta nos indica que se cumple con la ley de Bouger y Beer ya que se observa que la
Figura 1.- Tabla que muestra los 
valores de absorbancias obtenidos 
a lo largo de la práctica de curva de 
titulación, también se incluyen los 
valores ajustados de Absorbancia. 
Concentración del ion férrico 
Ab
so
rb
an
cia
Figura 2.- Gráfico que muestra la curva de titulación junto con su 
línea de tendencia, también se muestra el valor de la r2 que nos 
muestra que los datos se comportan como una recta dándonos su 
correspondiente ecuación. 
cantidad de luz absorbida es directamente proporcional a la concentración de la muestra
por medio de la ecuación. En la ecuación y corresponde a la absorbancia, x a la
concentración y el valor de 0.015 es el coeficiente de absorción. 
Determinación del %Ep
El %Ep es igual al valor de absortancia. El valor de transmitancia se puede calcular
despejando %T de la siguiente formula: A= 2 – log %T donde A: Absorbancia
.: %T= 10(2-A) después calculamos la absortancia Abs = 100 - %T
Ejemplo: para la absorbancia de 0.01047; se calcula %T; 
%T = 10(2-(0.01047)) .: %T = 97.618% después calculamos la absortancia
Abs = 100 - %T .: Abs = 100 – 97.618 .: Abs = 2.38 y este es nuestro porciento de
error.
Como podemos observar en la gráfica, las determinaciones que se hicieron en los tubos 5,
6, 7, 8, 9 y 10, fueron en las cuales el error fotométrico fue mínimo, indicándonos que
estos valores corresponden a la zona donde el error es muy bajo y por lo tanto es la zona
que debemos utilizar.
3.- Efecto del tiempo en la estabilidad del color
Log [Fe 3+ ]
Ab
so
rt
an
cia
Figuras 3.- y 4.- Muestran los valores calculados para el logaritmo de la concentración de iones férricos, el % de
transmitancia y la absortancia, la gráfica muestra como la línea de tendencia tiene forma sigmoidea, en la 
parte recta de dicha curva es donde se observa que el error fotométrico es mínimo. 
Discusión: Se puede observar que a lo largo del tiempo la absorbancia va disminuyendo,
esto nos indica que el color no es estable, la inestabilidad se puede deber a muchos
factores, como la luz, radiaciones de más energía, la presencia de agentes contaminantes
en el aire o el mismo oxígeno. El tiempo estable va de los 60 a los 120 minutos, porque es
donde observamos que los datos forman una meseta, lo que nos indica que es estable el
color al no variar.
a) ¿es estable el color? No, no lo es, ya que se observan variaciones de lectura a lo largo
del tiempo.
b) ¿Cuál es el tiempo óptimo para hacer las lecturas? Entre los 60 y 120 minutos, ya que
en este intervalo es donde se observa menor variación entre los datos.
4.- Efecto de la concentración de cromógeno
 
Figuras 4.- y 5.- Tabla de resultados de la estabilidad del color con respecto al tiempo y su respectivo 
gráfico.
Figuras 6.- y 7.- Tabla que indica los valores obtenidos en la práctica para este experimento y su respectivo 
grafico donde observamos el efecto de la concertación de tiocianato en la determinación de iones férricos. 
Discusión: Se observa que a concentraciones muy altas, superiores a 29000 micro moles
por mililitro hay una constancia en la absorbancia, es decir, el máximo de absorbancia se
da a estas concentraciones muy altas, por eso en las demás experiencias se usa a
concentraciones de saturación.
¿Qué concertación de tiocianato recomienda? Se recomienda una concentración saturada
de tiocianato, porque se observó en la gráfica que a concentraciones muy altas se da la
mayor absorbancia por parte del complejo colorido. 
5.- Efecto del pH 
Discusión: Se observa que a pHs ácidos la absorbancia es mayor, en cambio a pHs alcalinos
el color casi desaparece, esto se debe a que el hierro es más soluble a pHs ácidos además
a pHs alcalinos puede que no se lleve a cabo la reacción de manera satisfactoria, o los
iones hidroxilo compitan contra el tiocianato por estar con el hierro.
a) ¿De qué manera influye el pH en el sistema colorido? Influye evitando que se
lleve a cabo la reacción o separando los iones una vez formado el compuesto
colorido.
b) ¿Cuál es el pH recomendado para que se efectué la reacción? El pH recomendado
es de 1 a 3, ya que observamos los puntos más altos de absorbancia en estos
valores de pH.
Figuras 8.- y 9.- Tabla con valores de pH y su correspondiente absorbancia, la gráfica muestra el efecto del
pH sobre la estabilidad del color.
6. - Efecto de algunos iones sobre la absorbancia absoluta.
Discusión: Se observa que el hierro es más afín a los aniones fluoruro y oxalato que al
tartrato y al fosfato, esto se aprecia por que en los dos primeros aniones,la absorbancia
es mucho más baja que en los dos últimos, y esto se debe a la competencia que tiene el
fluoruro y el oxalato contra el tiocianato para unirse al hierro.
a) ¿Cuál es el efecto de los diferentes aniones sobre la reacción? El efecto es una
competencia entre algunos aniones, como el fluoruro o el oxalato por el hierro.
b) ¿A qué se debe este efecto? Ya que el fluoruro al ser muy electronegativo se ve
atraído por las cargas positivas del hierro, y el oxalato tiende a formar un nuevo
complejo de tres moléculas de oxalato por un catión férrico.
Determinación del límite de detección del analito.
El límite de detección del analito se puede definir como la concentración de analito que
proporciona una señal igual a la señal del blanco más tres veces la desviación estándar del
blanco. Esto nos sirve para calcular la concentración mínima de analito que puede
detectar nuestro método espectrofotométrico. 
LDD= 3Sb/m
Donde Sb es la desviación estándar del blanco y m es la pendiente. 
Si: y = 0.015X; y Sb= 0.5857073
LDD= 0.5857073/0.015 .: LDD = 39.0471 μg/mL, esta es la concentración minima
detectable de analito. 
7.- Parámetros óptimos para el método del tiocianato de amonio para determinar iones
férricos.
Figura 10.- Tabla de valores de absorbancia para 
cada ion, antes y después de agregar el anión. 
 
Conclusiones:
Es posible usar tubos normales de ensaye como cubetas siempre y cuando cumplan con ciertas
características.
Los parámetros que pueden interferir en un método espectrofotométrico son: pH, tiempo, temperatura,
concentración del cromógeno, etc.
Las condiciones óptimas para llevar a cabo la reacción se dan a pH muy ácidos, de preferencia después
de que pasara una hora, a concentraciones de cromógeno saturadas, y evitando la presencia de
aniones que pudieran interferir con la medición, como los fluoruros o los oxalatos.
Es posible usar la curva de calibración para interpolar absorbancias y así obtener datos de
concentración.
Figura 11.- Tabla que nos indica los 
valores óptimos para cada 
determinación.