1Cometto

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TESIS CARRERA DE MAESTRÍA EN FÍSICA MÉDICA
ANÁLISIS DE REDES APLICADO A DINÁMICAS
MOLECULARES DE TIPO COARSE-GRAIN. ESTUDIO
DE LA RELACIÓN ENTRE OLIGOMERIZACIÓN Y
SEÑALIZACIÓN DE LOS RECEPTORES DE LA
FAMILIA DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL
Autor
Franco Cometto Vincente
Dr. Mauricio Sica
Director
Dr. Cristian Smulski
Co-director
Miembros del Jurado
Dr. H. Asorey (Instituto Balseiro)
Dr. M. Kuperman (Instituto Balseiro)
Dr. G. Mato (Instituto Balseiro)
Febrero 2021
Departamento de F́ısica Médica – Centro Atómico Bariloche
Instituto Balseiro
Universidad Nacional de Cuyo
Comisión Nacional de Enerǵıa Atómica
Argentina
marisa.velazco
Texto escrito a máquina
T.M.
(043)61
2021
C734
marisa.velazco
Texto escrito a máquina
INVENTARIO: 24157
26.07.21
Biblioteca Leo Falicov
A mi madre.
Índice de śımbolos
AA: All atoms
BB: Backbone
CG: Coarse-grain
CDR: Dominios ricos en cistéına
DPPC: Dipalmitoil-fosfatidilcolina
DOPC: Dioleoil-fosfatidilcolina
MD: Dinámica Molecular
RMN: Resonancia Magnética Nuclear
TM: Dominio Transmembrana
TNF: Factor de Necrosis Tumoral
TNFR: Receptor de Factor de Necrosis Tumoral
v
Índice de contenidos
Índice de śımbolos v
Índice de contenidos vii
Índice de figuras ix
Resumen xvii
Abstract xix
Agradecimientos 1
1. PRINCIPIOS BIOQUÍMICOS 3
1.1. INTRODUCCIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2. MEMBRANAS BIOLÓGICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.1. Generalidades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.2. Composición, arquitectura y dinámica de las membranas . . . . 4
1.3. BIOSEÑALIZACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3.1. Mecanismos moleculares de transducción de señal . . . . . . . . 9
1.3.2. La apoptosis es la muerte celular programada . . . . . . . . . . 9
1.4. SUPERFAMILIAS TNF Y TNFR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.4.1. Generalidades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.4.2. Estudios y caracteŕısticas en miembros espećıficos . . . . . . . . 12
1.4.3. Dominios Transmembrana de los TNFR: antecedentes y abordaje
actual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.4.4. El modelado Coarse Grained : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2. MÉTODOS 17
2.1. INTRODUCCIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2. CAMPOS DE FUERZA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.3. CAMPO DE FUERZA MARTINI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.3.1. Part́ıculas CG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
vii
viii Índice de contenidos
2.3.2. Interacciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.3.3. Topoloǵıas Disponibles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.4. SIMULACIÓN DE DOMINIOS TRANSMEMBRANA DE MIEMBROS
DE LA FAMILIA TNFR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.5. ANÁLISIS DE LAS SIMULACIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.5.1. Análisis geométrico de la interacción entre hélices . . . . . . . . 26
2.5.2. Caracterización de resultados mediante Grafos . . . . . . . . . . 29
2.5.3. Otras herramientas de análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3. ANÁLISIS DE LAS SIMULACIONES Y RESULTADOS 33
3.1. INTRODUCCIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.2. ANÁLISIS VISUAL DE LAS SIMULACIONES CG . . . . . . . . . . . 33
3.3. MAPAS DE DENSIDAD RADIAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.4. HISTOGRAMAS DE DISTRIBUCIÓN ANGULAR . . . . . . . . . . . 39
3.5. MAPAS DE DENSIDAD DE ÁNGULOS α, β Y DISTANCIAS . . . . 43
3.6. CLASIFICACIÓN DE LAS INTERACCIONES . . . . . . . . . . . . . 44
3.6.1. Clusterizado basado en ángulos α y β . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.6.2. Clusterización Radial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.7. ESTUDIO DE INTERACCIONES MEDIANTE PROPIEDADES DE
GRAFOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4. OTROS MÉTODOS DE CLUSTERIZADO 59
4.1. INTRODUCCIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.2. MÉTODOS DE CLUSTERIZADO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.3. AGRUPAMIENTO CON EL ALGORITMO DBSCAN . . . . . . . . . 60
4.3.1. Generalidades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.3.2. Implementación del Algoritmo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.4. AGRUPAMIENTO CON EL ALGORITMO OPTICS . . . . . . . . . . 69
4.4.1. Generalidades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4.4.2. Implementación del algoritmo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
5. CONCLUSIONES 75
Bibliograf́ıa 79
Índice de figuras
1.1. Representación de Membrana Celular t́ıpica. En amarillo se
esquematizan los ácidos grasos de los fosfoĺıpidos unidos a sus cabezas
polares (esferas celestes). Las protéınas de membrana se muestran como
cintas rojas. Algunas forman parte integral de la membrana mientras
otras se asocian a cada una de las caras polares. Otros componentes
como el colesterol y azúcales también se muestran. . . . . . . . . . . . . 6
1.2. Representación esquemática de la superfamilia de ligandos TNF
(derecha) y sus receptores (izquierda). La familia de receptores puede
a su vez dividirse en tres subgrupos en base a su composición: aquellos
que tienen un dominio intracelular de muerte (cuadrado rojo), los que no
tienen dominio de muerte y reclutan moléculas espećıficas denominadas
TRAF (hexágonos de colores), y finalmente los receptores que no
tienen dominio intracelular (estos pueden ser solubles o estar ligados
a membrana y no tienen capacidad de transducir una señal). . . . . . . 11
1.3. Oligómeros de Fas, DR5 y NGFR. Representación en cinta en el plano de
membrana (grupo superior), y desde el lado extracelular (grupo inferior).
En Fas y NGFR, los dominios transmembrana de cada monómero
se muestran en colores distintos. En el caso de DR5 los dominios
transmembrana de tres receptores que forman cada tŕımero se muestran
del mismo color. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.1. Los modelos de MARTINI. Modelos CG de un fosfoĺıpido, la dipalmitoil
fosfatidil colina (DPPC), moléculas de agua y un fragmento helicoidal
de una protéına. En este último caso, se comparan la estructura
atomı́stica (AA, izquierda) con el modelo CG de MARTINI (derecha).
Los hidrógenos solo se muestran para el agua AA. En gris se indican los
nombres de algunos tipos de part́ıculas CG. . . . . . . . . . . . . . . . 20
ix
x Índice de figuras
2.2. Tabla de tipos de interacciones entre distintos tipo de part́ıculas CG.
Con las dos primeras filas y columnas se construye el nombre del tipo de
átomo. Aśı por ejemplo, las part́ıculas P5 y Q0 tienen una interacción
de tipo I. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.3. Representación tridimensional de un modelo CG de la hélice
transmembrana de DR5. En azul se ven los atomos BB unidos entre
śı formando la cadena carbonada. En amarillo, las part́ıculas CG que
representan las cadenas laterales (o residuos) de los aminoácidos. . . . . 23
2.4. Representación Coarse-Grained (CG) del modelo MARTINI para
aminoácidos. Las part́ıculas violetas son apolares, las azules y verdes
de polaridad intermedia, las grises y naranjas son polares y las rojas
representan part́ıculas cargadas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.5. Representación tridimensional del sistema a distintos tiempos de
simulación: 0 ns (paneles superiores) y 6000 ns (paneles inferiores). El
sistema se observa orientado sobre el eje XY de la membrana (paneles
izquierdos) o como un corte sobre el eje Z (paneles derechos). Las
part́ıculas CG de las hélices de DR5 se muestran como esferas (azules
las part́ıculas BB de la cadena carbonada, amarillas las de las cadenas
laterales). Los átomos delos fosfoĺıpidos de membrana se muestran
como ĺıneas (en gris los carbonos de los ácidos grasos; en cian los
grupos glicerol, en rosado los fosfatos y en azul los grupos colina de las
cabezas polares). Además, en la representación sobre el eje Z (derecha)
se muestra la capa de agua y iones como esferas verdes pequeñas por
encima y debajo de la membrana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.6. (a) Vista 3D de una hélice perteneciente al dominio transmembrana
de DR5. Como una cinta gris se representa la estructura helicoidal del
péptido. En naranja se muestra el átomo BB del residuo de referencia
(en este caso el aminoácido treonina 219, T219) y en azul los átomos
BB de los residuos adyacentes (V218 y V220). (b) Vista transversal del
péptido de DR5. En el centro, en negro, se esquematiza el centroide (
⊕
)
y el vector orientación de la hélice. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Índice de figuras xi
2.7. Vista esquemática de dos hélices sobre el plano XY indicando los ángulos
α y β. En el origen del marco de referencia, se ubica el centroide de
la hélice de referencia (h(ref)). Sobre las hélices se indican la posición
del centroide (punto blanco) y del vector de orientación (flecha negra).
Desde la hélice de referencia, el ángulo α se calcula como el ángulo entre
el vector de distancia (d) y el de orientación. A su vez, se calculan las
proyecciones en x y en y del vector de distancia (xh1 y yh1) con los que se
construye el mapa de densidad radial. El ángulo β indica la orientaciones
del vector de orientación de h1 respecto del de referencia (h(ref)). . . . 28
2.8. Representación tridimensional en el plano XY (izquierda) y sobre el eje
Z (derecha) de la estructura de RMN del dominio transmembrnana de
DR5 (código 6nhw del PDB). Cada una de las seis hélices que forman el
oligómero (d́ımero de tŕımeros) tiene un color distinto. A partir del los
datos de RMN se construyeron 15 modelos que se observan como cintas
superpuestas del mismo color. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.9. Esquema de un grafo con 5 vértices {a, b, c, d, e} y 5 enlaces
{a, b}, {a, d}, {b, e}, {c, d}, {d, e} . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.10. Grafo compuesto por 5 vértices que representan hélices. Se observan 4
enlaces que pueden relacionar hélices en base a su interacción. Observar
que la Hélice 5 no interacciona con el resto. Además, los tipos de enlaces
rojos (entre Hélices 1 con Hélice 2 y Hélice 1 con Hélice 3) se diferencian
del enlace verde (entre Hélices 2 y 3) y del enlace negro (entre Hélice 3
y 4), lo cual permite no solo visualizar el acercamiento entre hélices sino
también clasificar el tipo de interacción que estas mantienen. . . . . . . 31
3.1. Vista transversal al plano de la membrana de 6 hélices transmembrana de
DR5. El recorrido de la cadena carbonada está representado como cintas.
Como esferas se representan las part́ıculas BB de los residuos elegidos
para el centroide (
⊕
) y para calcular el vector orientación (flecha negra)
que se utilizan para el análisis de distribución radial. Las siglas D y T
indican las interacciones dimérica y triméricas, respectivamente. . . . . 34
xii Índice de figuras
3.2. Vista frontal de (A) dos hélices formando un d́ımero, (B) tres hélices
formando un tŕımero y (C) seis hélices formando un d́ımero de tŕımeros
de DR5. Se superponen el modelo de RMN (6NHW, como cintas grises)
y 10 instantáneas entre 3 y 8 µs obtenidas de la simulación Coarse-Grain
(CG MD, como segmentos azules). La zona de mayor acercamiento
entre hélices ocurre a nivel residual 219. La desviación cuadrática media
(RMSD) de las posiciones de los átomos de la cadena principal del
modelo CG-MD respecto del de RMN es de 4,53± 0,23Å, 6,02± 0,18Å
y 7,61± 0,18Å, respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.3. Análisis de distribución radial de la estructura RMN para DR5 (6nhw).
En el centro (x=0, y=0) se ubica el centroide de la hélice de referencia
con el vector de orientación sobre el eje x. Cada punto corresponde a la
posición del centroide de cada hélice respecto del centroide de la hélice
tomada como referencia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.4. Solapamiento de distribución radial de la estructura de referencia (6nhw,
con puntos negros), y el mapa de densidad radial obtenido de la
simulación CG-MD (escala de densidad de azules) para niveles residuales
217, 218, 219, 220 y 221. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.5. Análisis de distribución radial para diferentes intervalos de la simulación
de DR5 CG-MD a nivel residual 219 en los tiempos indicados. . . . . . 38
3.6. Distribución radial desde los 5000 ns para la simulación de las mutantes
DR5-G217Y y DR5-A222Y. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.7. Histograma de los valores de distancia entre hélices de DR5
CG-MD a nivel del residuo 219 a lo largo de toda la dinámica
molecular. Superpuesto, en rojo, el mismo análisis sobre las estructuras
experimentales por RMN de DR5 (6nhw). . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.8. Histograma de los valores de ángulo α entre hélices de DR5 CG-MD
acumulados a lo largo de toda la dinámica molecular junto con los datos
experimentales por RMN (en rojo) de DR5 (6nhw). . . . . . . . . . . . 40
3.9. Representación esquemática de la disposición angular α a nivel del
residuo 219 (naranja) entre hélices oligomerizadas de acuerdo a la
asignación de centroide y vector dirección. Los ángulos α en rojo (alpha
1 y alpha 2) están asociados a interacciones triméricas y su valor ronda
los ±150◦. El ángulo α en verde (alpha 3) se asocia a la interacción
dimérica entre residuos y ronda los 20◦ . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.10. Histograma de los valores acumulados de ángulo β entre hélices de DR5
CG-MD a lo largo de toda la dinámica molecular junto con los datos
experimentales por RMN (en rojo) de DR5 (6nhw). . . . . . . . . . . . 42
Índice de figuras xiii
3.11. Representación esquemática de la disposición angular β entre hélices
oligomerizadas de acuerdo a la asignación de centroide y vector dirección.
En ambos paneles se muestra en naranja la part́ıcula BB del residuo 219;
en azul, las part́ıculas BB del los residuos 218 y 220. En cintas grises, el
recorrido de la cadena carbonada de cada dominio transmembrana. A)
Vista sobre el plano XY. Para cada hélice se esquematiza la posición
del centroide junto con la orientación de la hélice. Observar que al
proyectar la orientación de los centroides 2 y 3 usando el centroide 1
como refenrencia se obtiene la disposición angular β caracteŕıstica de
tŕımeros, en tanto que si se proyecta el vector dirección del centroide 4
sobre el centroide 1, se obtiene la disposición angular β caracteŕıstica de
la interacción d́ımerica. B) Vista de las seis hélices de DR5 sobre el eje Z. 42
3.12. Distribución de (A) ángulos α y (B) valores absolutos de ángulos β,
abs(β), en función de distancia para DR5 a nivel del aminoácido 219.
Los puntos amarillos se corresponden con los valores de RMN y el mapa
de densidad con los valores de la simulación. Observar mayor densidad
de valores para distancias menores a 1 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.13. (A) Mapas de densidad angular α vs β de la simulación para DR5 a nivel
de residuo 219 junto con los valores obtenidos con el modelo de RMN
(puntos amarillos). (B) Mismo mapa añadiendo puntos celestes y rojos
que indican si dichos valores angulares pertenecen a distancias menores
o mayores a 1 nm, respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.14. Clusterizado de mapa de densidad α vs β para DR5 219. Se clasificó en
22 clusters de manera que puedan estudiarse regiones por separado bajo
dicho criterio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.15. Evolucióntemporal de los tipos de interacciones triméricas (t, en verde),
diméricas (d, en rojo) y no nativas (x, en azul) para cada región (Exterior
e Interior) de DR5 a nivel residual 219. Las interacciones triméricas
son mayores en la región Interior en tanto que las diméricas son más
numerosas en la región Exterior. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.16. Evolución temporal de los tipos de interacciones triméricas (t), diméricas
(d) y no nativas (x) para cada región (Exterior e Interior) de mutante
DR5 G217Y a nivel residual 219. Las interacciones triméricas (en verde)
no vaŕıan demasiado entre zonas Interior y Exterior en tanto que las
diméricas (en rojo) son levemente mayores en la región Exterior. Se
observa además un mayor aumento de interacciones no nativas (en azul)
en la región Exterior. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
xiv Índice de figuras
3.17. Evolución temporal de los tipos de interacciones triméricas (t), diméricas
(d) y no nativas (x) para cada región (Exterior e Interior) de mutante
DR5 A222Y a nivel residual 219. Las interacciones triméricas (en verde)
son mayores respecto a las no nativas (en azul) en la región Interior en
tanto que las diméricas (en rojo) son muy similares en ambas regiones.
Se observa además un mayor aumento de interacciones triméricas y no
nativas en la región Exterior. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.18. Clusterizado de mapa de densidad radial para DR5 a nivel de residuo
219 desde los 5000 ns hasta el final de la dinámica. Los puntos negros
corresponden a los datos de RMN. Se clasificó en 6 clusters de manera
que puedan estudiarse regiones por separado bajo dicho criterio. . . . . 50
3.19. Matriz de transición markoviana para la región Interior desde los 5000
ns hasta final de la dinámica. Los elementos de cada fila representan la
probabilidad de pasar a un nuevo estado partiendo del estado asociado
a la fila en cuestión. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.20. Matriz de transición markoviana para la región Exterior desde los 5000
ns hasta final de la dinámica. Los elementos de cada fila representan la
probabilidad de pasar a un nuevo estado partiendo del estado asociado
a la fila en cuestión. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.21. Representación mediante grafos de tipos de interacciones diméricas,
triméricas o de no nativas entre hélices. En análisis se realizó acumulando
la información para las instantáneas de la dinámica a partir de los 5000
ns hasta el final de la simulación. Las conexiones en azul son del tipo
trimérica, las rojas de tipo dimérica y las verdes no nativas. El atributo
”tipo de interacción” representado mediante enlaces se construyó en base
a un clusterizado basado en posición radial y ángulo β. Además, el grosor
del enlace es proporcional al tiempo de permanencia de la interacción. . 53
3.22. Registro de tŕıangulos formados a partir de los 1000 ns de la dinámica
para nivel del aminoácido 219 de DR5 que cumplen las restricciones
angulares β = 120◦ ± 30◦ y β = −120◦ ± 30◦, el tipo de interacción se
relaciona con los clusters 2 y 5 asociados a la formación de tŕımeros, y
la distancia de estudio abarca el rango de valores en la región Interior
(distancias menores o iguales a 1 nm). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.23. Registro de triángulos formados a partir de los 1000 ns de la dinámica
para nivel residual 219 de DR5 wt sin restricciones angulares, el tipo de
interacción se relaciona con los clusters 2 y 5 asociados a la formación
de tŕımeros, y la distancia de estudio abarca el rango de valores en la
región Interior (distancias menores o iguales a 1 nm). . . . . . . . . . . 55
Índice de figuras xv
3.24. Registro de triángulos a partir de los 1000 ns de la dinámica a nivel
residual 219 de DR5 wt que sólo cumplan la restricción de distancia
seleccionada. En este caso todos aquellos valores pertenecientes a la
región Interior (distancias menores o iguales a 1 nm). . . . . . . . . . . 56
4.1. Clusterizado de mapa de densidad radial y angular para DR5 a nivel
de residuo 219 mediante algoritmo DBSCAN. La técnica de clusterizado
produjo 27 clusters de formas irregulares. Ambos paneles muestran que
DBSCAN logra resolver tanto las distribuciones en el mapa radial, como
en el mapa de correlación angular entre α y β. En ambas figuras es
posible observar un conjunto de puntos grises detrás de los 27 clusters,
asociados a aquellos puntos clasificados como ruido. . . . . . . . . . . . 62
4.2. Visualización diferenciada de clusters 2 (en rojo) y 3 (en azul)
relacionados a la formación de tŕımeros en mapa de densidad radial
y angular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
4.3. Clusterizado de mapa de densidad α vs β para DR5 219 con conjunto
de datos completo a partir del subconjunto reducido. Se clasificó en
27 clusters permitiendo estudiarlos por separado bajo dichas variables.
También se muestra el mismo mapa de densidad pero sólo señalando los
clusters 2 y 3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.4. Registro de triángulos a partir de los 1000 ns de la dinámica a nivel
residual 219 de DR5 que cumplan pertenecer a los clusters 2 y 3 asociados
a la formación de tŕımeros. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.5. Interacciones individuales del tŕımero fhZ. Gráfica de orientación β entre
enlace h-Z (panel superior), f-h (medio) y f-Z (inferior) pertenecientes al
tŕımero h-Z-f. En cada panel se indica el nombre de la hélice central. Las
flechas indican la posición y la orientación de la hélice vecina respecto
de la central. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.6. Distancia de alcanzabilidad por ordenamiento para la interacción entre
las hélices Z y h a lo largo de toda la simulación bajo condición ε = 0,1nm
y minPts = 7. La gráfica Z (a la izquierda) considera a la hélice Z como
central y estudia los puntos h periféricos. En la gráfica h (a la derecha)
ocurre a la inversa. Las regiones roja y verde corresponden a los datos
que cumplan ser menores o iguales a ε = 0,1nm y se incluyen en un
mismo cluster. La zona de color negro no cumple dicha condición y es
considerada ”ruido”. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
xvi Índice de figuras
4.7. Clusterización de la trayectoria de la interacción entre las hélices h-Z
utilizando OPTICS con un valor ε = 0,1nm. Los clusters se representan
en un mapa radial (izquierda) y angular (derecha). Independientemente
de qué hélice se tome como central, Z (izquierda) o h (derecha), el
algoritmo distingue claramente los dos grupos en ambos mapas. . . . . 72
4.8. Orientación de todos los clusters clasificados para todas las interacciones
en la dinámica con ε = 0,1. De esta manera se pueden analizar
agrupamientos cuya disposición espacial y angular se pueda asociar a
oligomerizaciones entre hélices. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
Resumen
Las familias de ligandos TNF y sus receptores (TNFR) cumplen un rol vital
en la regulación del sistema inmume. La función de estas protéınas de membrana
está regulada por la unión ligando-receptor, pero también por asociaciones entre
protéınas del mismo tipo ligando-ligando o receptor-receptor, proceso conocido como
(homo-)oligomerización. Las propiedades estructurales de la oligomerización de los
ligandos de la familia de TNF han sido ampliamente estudiadas. Distinto es el caso
de los receptores de la familia de TNFR. Estos receptores se pueden oligoremizar al
unirse a su ligando espećıfico. Sin embargo, varios estudios han demostrado que existe
oligomerización de los TNFR independiente de la unión a ligandos y que este proceso
tiene consecuencias en la señalización celular.
En el presentetrabajo se desarrollaron herramientas para el estudio del rol de los
dominios transmembrana en la oligomerización de miembros de la familia TNFR, el
cual es un fenómeno importante en la activación y señalización libre de ligandos de
dichos receptores. Para esto se utilizaron dinámicas moleculares de tipo Coarse-Grain
(grano grueso), las cuales se analizaron con herramientas que se desarrollaron en el
presente trabajo y se implementaron en el lenguaje de programación R.
Palabras clave: MODELADO MOLECULAR, GROMACS, INMUNOLOGÍA,
TNFR, PROTEÍNAS
xvii
Abstract
Families of TNF ligands and their receptors (TNFR) play a vital role in the regulation
of the immune system. The function of these membrane proteins is regulated by
ligand-receptor binding, but also by associations between prtoeins of the same type
ligand-ligand or receptor-receptor, a process that is knonw as (homo-)oligomerization.
The structural properties of oligomerization of ligands of TNF family has been largely
studied. However, less is known about TNF receptors (TNFR family). These receptors
can be olgigomerizated by binding to their spefific ligand.
Nevertheless, several reports have shown that there is oligomerization of TNFR
independent of ligand binding, and this process has consequences in cell signaling.
In the present work, diferent tools were developed for the study of the role of
transmembrane domains in the oligomerization of members of the TNFR family, which
is an important phenomenon in the activation and signaling free of ligands of these
receptors. For this, molecular dynamics using coarse grained models were used, which
were analyzed with tools that were developed in the present work and implemented in
the programming lenguaje R.
Keywords: MOLECULAR MODELING, GROMACS, IMMUNOLOGY, TNFR,
PROTEINS
xix
Agradecimientos
Son muchas las personas que deseo agradecer y que son, de una u otra manera,
responsables de esta Tesis.
Ante todo debo agradecer a mi director Dr. Mauricio P. Sica. El presente trabajo
fué posible gracias a su paciencia, vocación y profesionalismo. Agradecimiento que debo
hacer extensivo a mi coodirector Dr. Cristian R. Smulski.
En lo personal, quiero agradecer a todos mis seres queridos. A lo largo de todos
estos años siempre encontré en ellos el apoyo necesario para seguir adelante. Este es
el cierre de una etapa, pero a la vez el comienzo de otra, con otras circunstancias. A
todos ellos, mis más profundos cariños.
1
Caṕıtulo 1
PRINCIPIOS BIOQUÍMICOS
“Un hombre se confunde, gradualmente, con la firma de su
destino; un hombre es, a la larga, sus circunstancias”
— J. L. Borges, ”La escritura del dios”. El Aleph.
1.1. INTRODUCCIÓN
Este caṕıtulo comienza con una breve descripción de membranas biológicas. Se
presentan las propiedades básicas de composición y estructura aśı como caracteŕısticas
asociadas a su dinámica, mostrando aśı su relevancia frente al medio circundante tanto
desde un aspecto estructural como funcional.
Posteriormente se mencionan los mecanismos celulares de señalización describiendo
brevemente su asociación con la apoptosis celular, donde toman protagonismo los
ligandos de la familia de TNF y los receptores de miembros de la familia TNFR.
Luego se hace hincapié en los estudios y caracteŕısticas de miembros espećıficos de
dichas superfamilias que más han sido objeto de estudio hasta el d́ıa de la fecha.
Finalmente se muestra la relevancia de los dominios transmembrana (TM) de los
miembros de la familia TNFR en la señalización apoptótica; también se mencionan
los métodos actuales para el estudio de dichas estructuras, dando especial interés
a las simulaciones de dinámicas moleculares, particularmente a los modelos de tipo
Coarse-Grained (CG).
1.2. MEMBRANAS BIOLÓGICAS
1.2.1. Generalidades
Las membranas definen los ĺımites externos de las células y regulan el tráfico
molecular a través de estos ĺımites. En células eucariotas dividen el espacio interno en
3
4 PRINCIPIOS BIOQUÍMICOS
compartimientos discretos para segregar procesos y componentes. Además, organizan
secuencias complejas de reacciones y son de importancia principal tanto para la
conservación de la enerǵıa biológica como para la comunicación intercelular.
Vale mencionar que las membranas no son meras barreras pasivas. Incluyen en
su composición un conjunto de protéınas especializadas en promover o catalizar
varios procesos celulares. En la superficie celular, los transportadores mueven solutos
orgánicos aśı como iones inorgánicos a través de la membrana; los receptores captan
señales externas y provocan cambios moleculares en la célula y las moléculas de
adhesión mantienen células vecinas unidas.
De manera general, las membranas biológicas están compuestas simplemente por
dos capas de moléculas, por lo que son muy delgadas; se las puede considerar
básicamente como bidimensionales. A continuación se describe la composición de las
membranas celulares y su arquitectura qúımica, esto es, la estructura molecular sobre
la que se asientan sus funciones biológicas [1].
1.2.2. Composición, arquitectura y dinámica de las
membranas
Las membranas biológicas cumplen un rol fundamental en la vida celular. Por un
lado, separan a la célula de su entorno y compartimentalizan sus distintas organelas.
Pero las membranas celulares, especialmente la membrana plasmática, constituye un
órgano vital de la célula que le permite intercambiar materia, enerǵıa e información
con su entorno.
Los componentes moleculares principales de las membranas son protéınas y
ĺıpidos polares que, en distinta proporción, constituyen casi la totalidad de la masa
de las membranas biológicas. También contienen glúcidos que se encuentran como
parte de glicoprotéınas y glucoĺıpidos. A continuación se describen brevemente estas
biomoléculas.
Protéınas Son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos (en la
jerga también denominados residuos). Existen 20 tipos de aminoácidos y la secuencia de
cada protéına está codificada por la secuencia de nucleótidos de su gen correspondiente.
Entre las principales funciones de las protéınas puede mencionarse el metabolismo
(por ejemplo, las enzimas y muchas hormonas) y la inmunidad (los anticuerpos son
protéınas) y la estructura (el colágeno), entre muchas otras. Las protéınas adquieren
una estructura tridimensional muy precisa. Para describirlo de forma jerárquica,
se puede decir que la secuencia de aminoácidos (estructura primaria) da lugar a
plegamientos (estructura secundaria) que a su vez interactuar entre śı dando un
plegamiento tridimensional (estructura terciaria). En muchos casos, varias protéınas
1.2 MEMBRANAS BIOLÓGICAS 5
interactúan entre śı de manera espećıfica dando lugar a estructuras cuaternarias.
Existe un repertorio acotado de estructuras secundarias: principalmente se encuentran
las hélices α y las hebras β, las cuales se pliegan en hojas, además de los giros
(compuestos por 3 o 4 aminoácidos) y bucles (más largos que los giros y de mayor
diversidad estructural). Cada protéına adquiere una estructura tridimensional precisa
que de alguna manera está codificada en su secuencia de aminoácidos. La estructura
tridimensional se conoce como estado nativo y está ı́ntimamente relacionado con la
función biológica de una protéına.
Ácidos grasos Son biomoléculas formadas por una larga cadena hidrocarbonada
lineal, de diferente longitud o número de átomos de carbono, en cuyo extremo hay un
grupo carboxilo. Son moléculas anfipáticas, es decir, tienen una región apolar hidrófoba
(la cadena hidrocarbonada) que repele el agua y una región polar hidrófila (el extremo
carbox́ılico) que interactúa con el agua. Además, los ácidos grasos se clasifican en
saturados, cuando todos los enlaces entre carbonos son covalentes simples. Estos tienden
a formar cadenas extendidas y aser sólidos a temperatura ambiente, excepto los de
cadena corta. Por otro lado, los ácidos grasos insaturados contienen dobles enlaces entre
algunos de sus carbonos. Estos suelen ser ĺıquidos a temperatura ambiente.
Fosfoĺıpidos Son moléculas liṕıdicas más complejas que las anteriores y están
compuestos por una molécula de alcohol (como glicerol o esfingosina), a la que se unen
dos ácidos grasos y un grupo fosfato. El fosfato se une mediante un enlace fosfodiéster
a otros grupos qúımicos (conocido como ”cabeza polar”), que generalmente contienen
nitrógeno, como colina, serina o etanolamina y muchas veces poseen una carga eléctrica
neta. Los fosfoĺıpidos son moléculas anfipáticas y, dada su estructura tridimensional, se
agregan formando bicapas en las que las regiones apolares de los ácidos grasos apuntan
hacia el centro de la bicapa y sus grupos de cabeza polares están dispuestos hacia el
exterior interactuando con la fase acuosa a cada lado. Todas las membranas biológicas
activas de las células poseen una bicapa de fosfoĺıpidos.
Existen varios tipos de fosfoĺıpidos que se distinguen por la composición de sus
ácidos grasos (cantidad de carbonos y de insaturaciones) pero principalmente por
naturaleza qúımica del la cabeza polar, el grupo qúımico unido al grupo fosfato que se
expone en la superficie de la bicapa.
Esteroles Compuestos por 27 a 29 átomos de carbono, su estructura qúımica deriva
del ciclopentanoperhidrofenantreno, una molécula de 17 carbonos formada por tres
anillos hexagonales y uno pentagonal. En los esteroles, se añade una cadena lateral de
8 o más átomos de carbono en el carbono 17 y un grupo alcohol o hidroxilo en el carbono
3. El colesterol es un ĺıpido del tipo esterol que se encuentra presente en la membrana
6 PRINCIPIOS BIOQUÍMICOS
plasmática de las células eucariotas (los vertebrados, por ejemplo), pero no en las
bacterias. Pese a que las cifras elevadas de colesterol en la sangre tienen consecuencias
perjudiciales para la salud, es una sustancia estructural esencial, ya que con ella la
célula regula propiedades biológicas de la membrana (fluidez, tensión superficial, punto
de fusión).
Las proporciones relativas de protéına y ĺıpido vaŕıan con cada tipo de membrana,
lo que refleja la diversidad de papeles biológicos.
Por otro lado, el análisis qúımico de las membranas aisladas de fuentes diversas
pone de manifiesto ciertas propiedades comunes. Por ejemplo, la composición de los
ĺıpidos de la membrana es caracteŕıstica de cada reino, especie, tejido y tipo celular
aśı como de las organelas dentro de un tipo determinado de célula. Aśı, la membrana
plasmática, por ejemplo, está enriquecida en colesterol y no contiene cardiolipina (un
tipo especial de fosfoĺıpido) en cantidades detectables (se da una situación inversa en la
membrana mitocondrial interna). Incluso, la composición de ĺıpidos de la cara interna
de la membrana plasmática es distinta de la que se expone hacia el espacio extracelular.
Por otro lado, la composición proteica de las membranas vaŕıa aún más ampliamente
que su composición liṕıdica según de donde se originen las mismas, reflejando aśı
su especialización funcional. En la Figura 1.1 se muestra una respresentación de
membrana celular usual.
Figura 1.1: Representación de Membrana Celular t́ıpica. En amarillo se esquematizan los
ácidos grasos de los fosfoĺıpidos unidos a sus cabezas polares (esferas celestes). Las protéınas
de membrana se muestran como cintas rojas. Algunas forman parte integral de la membrana
mientras otras se asocian a cada una de las caras polares. Otros componentes como el colesterol
y azúcales también se muestran.
Las membranas son impermeables a la mayoŕıa de solutos polares o cargados o de
alto peso molecular, pero son permeables a los compuestos apolares; tienen de 5 a 8
1.2 MEMBRANAS BIOLÓGICAS 7
nm de espesor si se tiene en cuenta los ĺıpidos junto con las protéınas sobresalientes y
tienen aspecto trilaminar cuando se observan en sección transversal con el microscopio
electrónico.
Una caracteŕıstica notable de todas las membranas biológicas es su flexibilidad, es
decir, su capacidad de cambiar de forma sin perder su integridad ni dejar salir sus
contenidos. La base de esta propiedad se encuentra en los tipos de interacciones que
se dan entre ĺıpidos de la bicapa mencionadas anteriormente. La bicapa se comporta
como un ĺıquido ”bidimensional” a temperaturas fisiológicas.
Modelo del Mosaico Fluido
Los estudios llevados a cabo durante décadas consolidaron un modelo para
describir el comportamiento de las membranas biológicas conocido como ”modelo del
Mosaico Fluido”. De acuerdo con este modelo, las moléculas de fosfoĺıpidos y las
protéınas de membrana forman un mosaico que cambia constantemente, debido a
la fluidez de la membrana. Esta fluidez está regulada por la composición de ácidos
grasos y otros componentes como el colesterol y se debe a que las interacciones
entre todos los componentes son no covalentes, dejando libertad a las moléculas de
ĺıpidos y de protéınas para difundir lateralmente en el plano de la membrana. Esta
difusión lateral podŕıa hacer pensar que la posición de las moléculas individuales es
siempre aleatoria. Sin embargo, muchas protéınas de membrana se asocian con mucha
especificidad formando grandes agregados donde las protéınas difunden de manera
correlacionada. Incluso los fosfoĺıpidos pueden formar microdominios en la membranan
con composiciones precisas, lo cual es objeto de intenso estudio en la actualidad.
Protéınas de membrana
Las protéınas de membrana se pueden dividir en dos grupos de acuerdo a su relación
con la bicapa: (i) protéınas integrales y (ii) protéınas periféricas. La Figura 1.1 muestra
un representación esquemática de estos tipos.
Las protéınas integrales se encuentran ancladas en la bicapa. Para ello cuentan en
su estructura con dominios que atraviesan la bicapa de lado a lado. Estos dominios,
conocidos como ”dominios transmembrana”, generalmente son hélices α cuya superficie
expone aminoácidos no polares que establecen interacciones hidrofóbicas con los ĺıpidos
de membrana. Estos dominios transmembrana de las protéınas se pueden encontrar en
medio de la secuencia de aminoácidos o en alguno de sus extremos. Otras protéınas
tienen varias dominios transmembrana. Estas protéınas, además tienen dominios
solubles que sobresalen a uno o ambos lados de la membrana, lo que depende de
la función que cumpla la protéına. Las protéınas integrales que atraviesan de lado
a lado a la bicapa sólo se pueden liberar por la acción de agentes que interfieren
8 PRINCIPIOS BIOQUÍMICOS
en las interacciones hidrofóbicas tales como detergentes, disolventes orgánicos o
desnaturalizantes. Como se describe más adelante, muchas de estas protéınas funcionan
como transductores que reciben información del entorno celular y la trasmiten hacia
componentes intracelulares con el objetivo de generar respuestas adecuadas al medio.
Las protéınas periféricas, por otro lado, se asocian con la membrana a través
de interacciones electrostáticas y enlaces de hidrógeno con los dominios hidrof́ılicos
de las protéınas integrales y con los grupos de las cabezas polares de los ĺıpidos de
membrana. Pueden liberarse con tratamientos fisicoqúımicos relativamente suaves. Las
protéınas periféricas pueden funcionar como reguladores de enzimas unidas a membrana
o pueden limitar la movilidad de las protéınas integrales formando interacciones
intrermoleculares.
Topoloǵıa de una protéına integral de membrana Determinar la estructura
tridimensional de una protéına de membrana, o su topoloǵıa, es generalmente mucho
más dif́ıcil que determinar su secuencia de aminoácidos, la cual se puede obtener por
secuenciación de la protéına o de su gen. De hecho, la presencia de secuencias continuas
de más de 20aminoácidos hidrofóbicos en una protéına se toma como fuerte indicio
de tales secuencias atraviesan la bicapa liṕıdica formando dominios transmembrana.
Por lo tanto, es sencillo inferir la presencia de dominios transmembrana en la secuencia
de una protéına. Sin embargo, debido a la complejidad experimental, técnicas como la
cristalograf́ıa de rayos X o la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)
han dado relativamente pocas estructuras tridimensionales de protéınas integrales de
membrana o de complejos entre dominios transmembrana.
1.3. BIOSEÑALIZACIÓN
En organismos pluricelulares, células con diferentes funciones intercambian una
amplia variedad de señales.
En todos estos casos, la señal representa información que es detectada por un
receptor espećıfico y se convierte en una respuesta celular en la que siempre interviene
un proceso qúımico. Esta conversión de información en un proceso qúımico, conocida
como ”transducción de señal”, es una función universal de las células.
A pesar de que el número de señales biológicas es grande, como lo es la variedad de
respuestas biológicas a dichas señales, los organismos usan sólo unos pocos mecanismos
conservados evolutivamente para detectar las señales extracelulares y transducirlas en
cambios intracelulares [1].
1.3 BIOSEÑALIZACIÓN 9
1.3.1. Mecanismos moleculares de transducción de señal
Las transducciones de señales son altamente espećıficas y muy sensibles. La
especificidad se consigue por complementariedad molecular precisa entre las moléculas
señal y receptor, en la que intervienen el mismo tipo de fuerzas débiles (no
covalentes) que tienen lugar en las interacciones enzima-sustrato y ant́ıgeno-anticuerpo.
Los organismos multicelulares tienen un nivel de especificidad adicional ya que
los receptores para una señal determinada, o las protéınas intracelulares de una
determinada v́ıa de señalización, son espećıficos de cada tipos de células.
El desencadenante es diferente para cada sistema pero las caracteŕısticas generales
de la transducción de señal son comunes a todos: una señal interactúa con un receptor;
el receptor activado interactúa con la maquinaria intracelular produciendo una segunda
señal, por ejemplo, un cambio en la actividad de una enzima. Entonces, la actividad
metabólica (definida en sentido amplio para incluir el metabolismo del DNA, RNA
y protéınas) de la célula blanco experimenta un cambio. Finalmente, el fenómeno de
transducción se acaba y la célula vuelve al estado anterior al del est́ımulo.
Una caracteŕıstica común en los mecanismos básicos de señalización es la activación
de protéınas quinasa, enzimas que transfieren un grupo fosforilo del ATP (molécula
fundamental para la obtención de enerǵıa en muchos procesos de la célula) a la cadena
lateral de una protéına.
En este mecanismo las señales pueden ser de naturaleza muy diversas. Las hay de
tipo qúımico, como las hormonas (proteicas o no), los neurotransmisores, sustancias
qúımicas gaseosas que dan origen a los aromas, toxinas, cambios en el pH, etc. También
hay señales f́ısicas como cambios en la temperatura, la luz (la base de la visión), acción
mecánica sobre las células, deformación de las membranas biológicas (la audición y la
reacción de las plantas carńıvoras se basan en este último tipo de señales). Por otro
lado, los receptores son casi universalmente protéınas membrana. Sólo las hormonas
esteroides, que por su carácter hidrófobo pueden atravesar libremente la bicapa liṕıdica,
tienen receptores que son protéınas solubles presentes en el citoplasma celular.
1.3.2. La apoptosis es la muerte celular programada
Muchas células pueden controlar con precisión el momento de su propia muerte
mediante el proceso de muerte celular programada o apoptosis. La apoptosis cumple
también algunas misiones en otros procesos además del desarrollo. Por ejemplo,
durante la maduración del sistema inmune, las células productoras de anticuerpos
que reconocen ant́ıgenos propios del cuerpo experimentan una muerte programada
en el bazo, un mecanismo esencial para eliminar los anticuerpos contra componentes
propios (autoanticuerpos). De manera general, la apoptosis puede desencadenarse por
dos mecanismos principales:
10 PRINCIPIOS BIOQUÍMICOS
(i) La v́ıa intŕınseca, donde señales intracelulares activan mecanismos en
la membrana mitocondrial, haciendo que su membrana pierda permeabilidad y
permitiendo aśı la liberación de enzimas proteoĺıticas espećıficas denominadas
genéricamente ”caspasas”. Estas enzimas destruyen espećıficamente otras protéınas
ya que atacan residuos (o aminoácidos) de cistéına unidos a residuos aspartato (su
nombre está compuesto por C por cistéına, asp por aspartato y asa, sufijo que indica
actividad enzimática).
(ii) La v́ıa extŕınseca que está mediada por una señal de muerte proveniente del
exterior de la célula, a través de un receptor de membrana. Las principales señales
involucradas en esta v́ıa provienen de una familia de protéınas conocidas como Factores
de Necrosis Tumoral (TNF, por su sigla en inglés) que actúan sobre una familia de
receptores conocidos como Receptores de TNF.
Entre la serie de procesos desencadenados en la apoptosis, los productos
monoméricos de la degradación de protéınas y del ADN (aminoácidos y nucleótidos)
son liberados en un proceso que permite su captación y reutilización por células vecinas.
Por lo tanto esto posibilita al organismo eliminar una célula sin desperdiciar sus
componentes. La caracteŕıstica principal de la apoptosis es que no genera una respuesta
inflamatoria y por lo tanto los restos celulares son eliminados de manera controlada.
1.4. SUPERFAMILIAS TNF Y TNFR
1.4.1. Generalidades
La familia de Factores de Necrosis Tumoral comprende una superfamilia de 19
ligandos (TNF) y una superfamilia de 30 receptores (TNFR). Los miembros de estas
dos superfamilias están involucrados en señales transducionales que trabajan mediante
una red compleja e integrada, que afectan significativamente el desarrollo, homeostasis
y respuestas adadpativas del sistema inmunolgógico. En la Figura 1.2 se muestra
una representación esquemática de dichos miembros y la relación entre ellos [2]. La
superfamilia de receptores TNFR puede a su vez dividirse en tres subgrupos en base a
su composición: (i) aquellos que tienen un dominio de muerte intracelular, responsable
de la activación de mecanismos apoptóticos y que recluta factores (protéınas) conocidas
como FADD, TRADD y EDARADD, (ii) aquellos que no tienen dominio de muerte
pero reclutan moléculas espećıficas denominadas TRAF, y finalmente (iii) los receptores
que no tienen dominio intracelular, los cuales pueden ser solubles o estar ligados a
membrana y no tienen capacidad de traducir una señal.
1.4 SUPERFAMILIAS TNF Y TNFR 11
Figura 1.2: Representación esquemática de la superfamilia de ligandos TNF (derecha) y sus
receptores (izquierda). La familia de receptores puede a su vez dividirse en tres subgrupos en base
a su composición: aquellos que tienen un dominio intracelular de muerte (cuadrado rojo), los que
no tienen dominio de muerte y reclutan moléculas espećıficas denominadas TRAF (hexágonos de
colores), y finalmente los receptores que no tienen dominio intracelular (estos pueden ser solubles
o estar ligados a membrana y no tienen capacidad de transducir una señal).
Mientras que los ligandos TNF se expresan en células del sistema inmune, los
receptores (TNFRs) están presentes en una amplia variedad de células. La mayoŕıa
de los ligandos se unen a un miembro de la superfamilia de TNFR, pero otros se
unen a más de uno. Inversamente, varios receptores TNFR pueden unirse a más de un
miembro de la familia TNF.
Algunos miembros de las superfamilias TNF y TNFR tienen estructuras
notablemente similares, y sus mecanismos en general se conservan. Además,tanto
los TNF como los TNFR tienen un único dominio transmembrana. Los ligandos de
la familia TNF son protéınas transmembrana con un dominio de homoloǵıa de TNF
extracelular que media su homo-trimerización (agrupamiento de 3 homotipos) [3]. En
12 PRINCIPIOS BIOQUÍMICOS
un modelo simple, cada subunidad de estos ligandos triméricos se unen a una subunidad
de su receptor de TNFR af́ın, induciendo a la oligomerización del receptor y disparando
señales intracelulares.
Los 19 ligandos de TNF ejercen su acción mediante la unión a algunos de los
30 receptores diferentes (TNFR), que también son protéınas transmembrana. Los
TNFR se caracterizan por la presencia de una o más copias de un dominio rico en
cistéına extracelular conservado (CRD) ubicado en la región del extremo N, un dominio
transmembrana (TM) único y uno o más dominios intracelulares conservados.
Los dominios CRD están presentes en varias copias. Algunas copias se unen al
ligando de TNF, pero otras median en la oligomerización del receptor. Además, los
dominios solubres de los ligandos y los receptores se pueden escindir de la membrana
mediante proteólisis, para formar protéınas ”señuelo” solubles que conservan sus
propiedades de unión y cumplen otras funciones importantes.
Asimismo, varios TNFR pueden unirse al mismo ligando, promoviendo asociaciones
hetero-oligoméricas inducidas por el ligando TNF [2]. Sin embargo en varios casos se ha
determinado que tanto hetero- como homo-oligómeros existen en ausencia de ligando, lo
cual es dif́ıcil de explicar y de estudiar. Todas estas observaciones plantean un escenario
muy complejo y dinámico que implica una autoasociación o heteroasociación entre
miembros de TNFR, la cual puede ser espontánea (independiente) o inducida por la
asociación a un ligando y que pueden estar presentes en cualquier momento en la
membrana celular.
1.4.2. Estudios y caracteŕısticas en miembros espećıficos
Los receptores de la familia TNFR tienen diferentes caracteŕısticas estructurales,
por ejemplo la variabilidad en la cantidad de dominios ricos en cistéına (CRD) ya
mencionados.
Uno de los primeros miembros caracterizados de la superfamilia TNFR es TNFR1.
Este es un receptor de membrana ubicuo que se une al factor de necrosis tumoral alfa
(TNF-α). TNFR1 no solo media la apoptosis sino que también funciona como regulador
de la inflamación. Las mutaciones en los genes que codifican TNFR1 relacionados
al ”Śındrome Periódico asociado al receptor del factor de necrosis tumoral”también
afectan su plegamiento y localización celular [3].
La estructura de TNFR1 comprende cuatro dominios extracelulares ricos en
cistéına (CRD). El primer CRD (distal de la membrana) tiene un papel clave en la
oligomerización del receptor, mientras que el segundo y el tercero están involucrados
en la unión del ligando [3]. Estudios mediante cristalograf́ıa muestran que la región
extracelular TNFR1 no ligada forma d́ımeros paralelos [4, 5], lo que plantea dos
posibles mecanismos. El primero implica que los receptores diméricos preensamblados
1.4 SUPERFAMILIAS TNF Y TNFR 13
se activan mediante un cambio conformacional inducido por el ligando trimérico. En
el segundo mecanismo, el ligando permite la extensión de una red de multimerización
entre ligandos triméricos y receptores diméricos. Estos modelos son todav́ıa una fuente
de debate y estudios recientes sugieren que la asociación previa de TNFR1 es necesaria
para responder a la unión del ligando [6].
Como un intento por dilucidar la complejidad de la interacción ligando de miembro
de TNF y receptor de miembro de TNFR, se ha propuesto que la preoligomerización
independiente del ligando ocurre en otros tipos de receptores con estructura similar
a TNFR1 (Fas, CD40 y TRAILRs) [7–10]. Sin embargo, el mecanismo molecular de
la oligomerización y la transición pre-ligando a post-ligando sigue siendo dif́ıcil de
estudiar.
Existe una gran cantidad de evidencia sobre el papel de la oligomerización en la
señalización de TNF-TNFR. Recientemente se descubrió que un miembro relevante de
la familia TNFR denomiado TACI puede autoactivarse en ausencia de ligando y que la
autooligomerización de las regiones transmembrana es suficiente para desencadenar este
evento. Estos resultados sin precedentes sugieren que la oligomerización a través del
dominio transmembrana es responsable de la señalización independiente del ligando
y alimenta el debate sobre el papel de la unión del ligando en la red de asociación
entre los TNFR y sus ligandos. Experimentos relacionados sugieren que el dominio
transmembrana de TACI tiene dos caras involucradas en la oligomerización que se
enfrentan en direcciones opuestas.
Paralelamente, en 2019 un estudio con DR5, un TNFR que también posee un
”dominio de muerte” y se encuentra en la mayoŕıa de las células, mostró por RMN
que su dominio transmembrana (TM) es suficiente para formar un d́ımero de dos
tŕımeros [11], ocurriendo algo similar a la interacción del receptor TACI mencionado
en el párrafo anterior. Particularmente en células tumorales, DR5 puede inducir la
muerte por apoptosis y no produciendo la misma señal en células normales. Esta
cualidad de DR5 llevó a que se preste especial interés en dicho receptor implicado
en la apoptosis en tumores por la v́ıa extŕınseca de activación de caspasas. Además,
también existen reportes sobre la oligomerización de TM de otros diversos TNFR. Por
ejemplo, el dominio TM del receptor Fas (receptor de muerte inductor de apoptosis
protot́ıpico), puede formar solo tŕımeros y las mutaciones ubicadas en este dominio que
interrumpen la trimerización están fuertemente asociadas con el linfoma no Hodgkin
y la autoinmunidad [12]. Otro ejemplo, el dominio TM de los receptores del factor
de crecimiento nervioso (NGFR) forma d́ımeros, aunque en este caso, es necesario
un disulfuro intermolecular para mantener la geometŕıa adecuada entre las hélices TM
[13]. Vale la pena señalar que, a lo largo de esta familia, los procesos de oligomerización
informados no están asociados con motivos conservados. La Figura 1.3 muestra una
representación de cinta de las estructuras de RMN de estos dominios de TM y sus
14 PRINCIPIOS BIOQUÍMICOS
distintos modos de oligomerización.
Figura 1.3: Oligómeros de Fas, DR5 y NGFR. Representación en cinta en el plano de membrana
(grupo superior), y desde el lado extracelular (grupo inferior). En Fas y NGFR, los dominios
transmembrana de cada monómero se muestran en colores distintos. En el caso de DR5 los
dominios transmembrana de tres receptores que forman cada tŕımero se muestran del mismo
color.
1.4.3. Dominios Transmembrana de los TNFR: antecedentes
y abordaje actual
El puente o nexo entre la unión de un ligando en el espacio extracelular y los eventos
de transducción de señales en el espacio intracelular está localizado en la membrana
plasmatica. Por lo tanto, obteniendo información de las propiedades oligoméricas y
estequiométricas de las asociaciones en el dominio de transmembrana permitiŕıa un
mejor entendimiento de las asociaciones independientes de ligandos, aśı como las
transiciones inducidas por ligando.
La resonancia magnética nuclear (RMN) es el método de elección para el estudio de
estructura y organización de los segmentos TM en una fase liṕıdica. Pero la solubilidad
de las protéınas y la oligomerización no nativa mediada por la formación de disulfuros
en presencia de cistéınas libres hacen que este método sea muy engorroso de aplicar,
especialmente con péptidos cortos, que deben ser mutados como sucedió con p75, Fas
y DR5.
De manera alternativa, simulaciones de dinámicas moleculares atomı́sticas resultan
adecuadas para estudiar fenómenos a escalas temporales por debajo de los
1.4 SUPERFAMILIAS TNF Y TNFR 15
microsegundos que abarquen oligomeros ya formados de segmentos en membrana.
No obstante esta aproximaciónse torna computacionalmente inviable para muestrear
estad́ısticamente procesos en escalas de tiempo de microsegundos con membranas
lo suficientemente grandes como para albergar docenas de hélices transmembrana
separadas individualmente. Dadas dichas limitaciones, se han desarrollado varios
métodos con el objetivo de reducir la carga computacional de las simulaciones.
1.4.4. El modelado Coarse Grained :
El uso de modelos de grano grueso o Coarse-Grained (CG) ha demostrado ser una
herramienta valiosa en una variedad de técnicas de simulación computacional para
probar las escalas de tiempo y longitud de los sistemas más allá de lo que es factible
con los modelos tradicionales de todos los átomos (all atoms, AA). Los modelos CG
aplicados al estudio de sistemas liṕıdicos en particular, se han vuelto ampliamente
utilizados. Se dispone de una gran diversidad de enfoques CG que van desde modelos
cualitativos sin moléculas solventes (solvente impĺıcito), pasando por modelos más
realistas con agua expĺıcita pero simplificada, hasta modelos que incluyen especificidad
qúımica.
De manera general, los modelos CG de un sistema a un nivel de sub-residuo, busca
mantener las propiedades qúımicas relevantes de las estructuras, y pretende establecer
un balance fino entre incrementar el muestreo y el valor estad́ıstico de la simulación,
pero con una reducción razonable en los detalles del sistema [14].
Entre sus principales caracteŕısticas, la reducción del número de grados de libertad
junto con el uso de potenciales de corto alcance lo hace computacionalmente muy
eficiente. En comparación con los modelos atomı́sticos, se puede lograr una ganancia
en tiempos de simulación de 3-4 órdenes de magnitud [15]. Por lo tanto, las escalas de
longitud de micrómetros o las escalas de tiempo de milisegundos están al alcance de
estudio con dicha metodoloǵıa.
A partir de esta aproximación, el grupo de trabajo de los directores realizó
simulaciones de dinámica molecular de modelos CG de varios miembros de la familia
TNFR: p75NTR wt (wild type), C257A (TNFRSF16), Fas (TNFRSF6) y DR5
(TNFRSF10B). Las estructuras de estos receptores ha sido estudiadas por RMN y
cada una muestran diferentes modos de asociación tales como d́ımeros [13], tŕımeros
[12] y d́ımeros de tŕımeros [11], respectivamente. En general las simulaciones lograron
identificar unidades oligoméricas nativas de manera satisfactoria y permitieron analizar
el impacto de diferentes enfermedades relacionadas a mutaciones de estas asociaciones.
En el presente trabajo se desarrollaron herramientas para el análisis de los modos
de oligomerización para el domino transmembranan de DR5. Estas herramientas tienen
caracter general y permitiŕıan el análisis de las simulaciones con otros dominios
16 PRINCIPIOS BIOQUÍMICOS
transmembrana de la familia de TNFR.
Caṕıtulo 2
MÉTODOS
2.1. INTRODUCCIÓN
La sección comienza describiendo brevemente el concepto de Campos de Fuerza en
el ámbito de las ciencias qúımicas. Aśı, se detallan las propiedades del campo de fuerza
MARTINI, siendo este último el utilizado para las simulaciones de la presente tesis.
A continuación se describe el diseño de una simulación Coarse-Grain (CG) para
generar dinámicas moleculares de 36 hélices correspondientes al miembro 10B de la
superfamilia de TNFR, también conocido como receptor TRAIL 2 o receptor de muerte
5 (DR5).
Luego se muestra la construcción de mapas de dispersión radial que permiten
estudiar las distancias y disposiciones angulares relativas entre hélices, tanto para los
datos experimentales por RMN como para los de la simulación.
El caṕıtulo finaliza proponiendo la caracterización de los resultados de la dinámica
mediante grafos; los vértices representando hélices a cierto nivel residual de la secuencia
aminoácida tomada como referencia, y las aristas al tipo de interacción entre las mismas
dadas las restricciones y manipulación de los datos previamente mencionada.
2.2. CAMPOS DE FUERZA
En el contexto de la qúımica y el modelado molecular, un campo de fuerza es un
método computacional que se utiliza para estimar las fuerzas entre átomos dentro de
moléculas y también entre moléculas. Más precisamente, el campo de fuerza se refiere
a la forma funcional y los conjuntos de parámetros utilizados para calcular la enerǵıa
potencial de un sistema de átomos o part́ıculas de grano grueso en mecánica molecular,
dinámica molecular o simulaciones de Monte Carlo. Los parámetros para una función
energética elegida pueden derivarse de experimentos en f́ısica y qúımica, cálculos en
mecánica cuántica o ambos.
17
18 MÉTODOS
En concreto los campos de fuerza están compuestos por parámetros, tipos de átomos
(o part́ıculas) y potenciales clásicos que describen las interacciónes entre los mismos.
Las fuerzas que actúan sobre cada part́ıcula se derivan como un gradiente de la enerǵıa
potencial con respecto a las coordenadas de las part́ıculas [16].
Los campos de fuerza ”atomı́sticos” o AA (all atom) proporcionan parámetros para
cada tipo de átomo en un sistema, incluido el hidrógeno, mientras que los campos de
fuerza de átomos unidos tratan los átomos de hidrógeno y carbono en los grupos metilo
y los puentes de metileno como una sola part́ıcula [17].
Los campos de fuerza de grano grueso (Coarse-Grain, CG), que a menudo se utilizan
en simulaciones a largo plazo de macromoléculas como protéınas, ácidos nucleicos y
complejos de múltiples componentes, sacrifican los detalles qúımicos por una mayor
eficiencia informática [14]. Otra ventaja de estos campos de fuerza es que suavizan
los paisajes de enerǵıa de los sistemas simulados, lo cual implica una aceleración en
el tiempo de simulación ya que el sistema no queda atrapado en mı́nimos locales de
enerǵıa.
Las simulaciones de grano grueso (CG) constituyen un grupo de técnicas que han
demostrado ser una herramienta valiosa para probar las escalas de tiempo y tamaño de
los sistemas más allá de lo que es factible con los modelos tradicionales atomı́sticos, ya
que el enfoque de grano grueso permite eliminar grados de libertad menos relevantes
para lograr una mejor exploración de sistemas complejos. Estas aplicaciones se han
vuelto muy útiles en la simulación de membranas liṕıdicas. Si bien los agregados de
ĺıpidos y tensioactivos presentan un comportamiento de fase muy rico (que incluye
fases micelar, lamelar, hexagonal y cúbica), las simulaciones por computadora han
proporcionado una herramienta útil para dilucidar la estructura de las fases liṕıdicas,
especialmente las fases micelar y lamelar.
Para comprender las ventajas de los modelos CG pueden mencionarse cuatro
aspectos a tener en cuenta para los mismos: velocidad, precisión, aplicabilidad y
versatilidad [15].
(i) La velocidad de simulación se logra al reducir el número de part́ıculas del sistema
ya que se requieren menos cálculos por paso de simulación. Además al ser más pesados
los átomos, las frecuencias mı́nimas de vibraciones de los términos covalentes son más
grandes permitiendo utilizar pasos de integración mayores.
(ii) La precisión se maximiza porque los parámetros del campo de fuerza han sido
ajustados para reproducir resultados obtenidos con simulaciones atomı́sticas y datos
experimantales para una variedad de componentes y fases simultáneamente.
(iii) La aplicabilidad se mejora mediante la simplicidad del campo de fuerza, el uso
de potenciales de interacción estándar y pocos parámetros. Además, los parámetros
son f́ısicamente significativos y se utilizan de manera coherente.
(iv) En el caso particular del campo de fuerza MARTINI, que utilizamos en el
2.3 CAMPO DE FUERZA MARTINI 19
presente trabajo, la versatilidad está impĺıcita ya que este campo de fuerza conserva
caracteŕısticas qúımicas que lo hacen de aplicación casi universal en distintos tipos de
biomoléculas(ĺıpidos y protéınas).
2.3. CAMPO DE FUERZA MARTINI
El campo de fuerza MARTINI es un campo de fuerza de grano grueso (CG)
adecuado para simulaciones de dinámica molecular de sistemas biomoleculares. Dicho
campo proporciona parámetros para una variedad de biomoléculas, que incluyen ĺıpidos,
colesterol, aminoácidos, azúcares, ADN, fullereno, colágeno, dendŕımeros, péptidos y
protéınas.
La experiencia en numerosos trabajos demuestra que MARTINI reproduce
satisfactoriamente las propiedades de una amplia gama de sistemas, las cuales incluyen
propiedades estructurales (como densidades ĺıquidas, área/ĺıpido para muchos tipos
de ĺıpidos en bicapas, conformaciones de ĺıpidos accesibles, ángulo de inclinación de
péptidos helicoidales en membrana o motivos de empaquetamiento de hélice-hélice),
elásticas (módulo de flexión bicapa, tensión de ruptura), dinámicas (tasas de difusión
de ĺıpidos, péptidos y protéınas, agua transmembrana, tasa de permeación, escalas de
tiempo para la agregación de ĺıpidos) y termodinámicas (temperaturas de transición
de fase bicapa, propensión a la orientación de péptidos interfacial, enerǵıa libre de
disociación de ĺıpidos, datos de formación del dominio de membrana) [14, 15].
2.3.1. Part́ıculas CG
El modelo de grano grueso (Coarse-Grain) se basa en un mapeo de cuatro-a-uno, es
decir, en promedio, cuatro átomos pesados del modelo atomı́stico están representados
por una sola part́ıcula. Para las estructuras de anillo se introduce un mapeo diferente.
Para mantener el modelo simple pero conservando las caracteŕısticas qúımicas de los
átomos mapeados en la part́ıcula CG, se consideran sólo cuatro tipos principales de
part́ıculas CG: polar (P), no polar (N), apolar (C) y cargado (Q). Cada tipo de part́ıcula
tiene varios subtipos que permiten una representación más precisa de la naturaleza
qúımica de la estructura atómica subyacente. El número total de subtipos es 18. Dentro
de un tipo principal, los subtipos se distinguen por una letra que indica las capacidades
de enlace (puentes) de hidrógeno (d = dador, a = aceptor, da = ambos, 0 = ninguno),
o por un número que indica el grado de polaridad (de 1, polaridad baja, a 5, polaridad
alta). Por razones de eficiencia computacional, la masa de las part́ıculas CG se establece
en 72 uma (correspondiente a cuatro moléculas de agua) para todas las part́ıculas,
excepto para las part́ıculas en estructuras de anillo, para las cuales la masa se establece
en 45 uma. En la Figura 2.1 se muestra cómo algunas de estas part́ıculas se unen de
20 MÉTODOS
manera covalente para formar alguna de las biomoléculas que se pueden simular con
este campo de fuerza.
Figura 2.1: Los modelos de MARTINI. Modelos CG de un fosfoĺıpido, la dipalmitoil fosfatidil
colina (DPPC), moléculas de agua y un fragmento helicoidal de una protéına. En este último
caso, se comparan la estructura atomı́stica (AA, izquierda) con el modelo CG de MARTINI
(derecha). Los hidrógenos solo se muestran para el agua AA. En gris se indican los nombres de
algunos tipos de part́ıculas CG.
2.3.2. Interacciones
Para calcular la enerǵıa potencial del sistema, el campo de fuerza considera dos tipos
de relaciones entre átomos: 1) las interacciones no covalentes que tienen una enerǵıa
de disociación del orden de la enerǵıa térmica y por lo tanto contribuyen con múltiples
eventos de asociación-disociación durante la dinámica; 2) los enlaces covalentes que
mantienen unidos a los átomos en las moléculas y nunca se disocian a lo largo de la
dinámica.
Interacciones no covalentes
Todos los pares de part́ıculas i y j a una distancia ri,j menor a cierto valor de corte
rcut interactúan a través de un potencial de Lennard-Jones (LJ):
VLJ(r) = 4εi,j
[(
σi,j
ri,j
)12
−
(
σi,j
ti,j
)6
]
(1)
donde ri,j es la distancia entre las part́ıculas i y j en un tiempo dado de la
dinámica, σi,j representa la distancia más cercana (de menor enerǵıa) de acercamiento
entre dos part́ıculas y εi,j la fuerza de su interacción. El parámetro σi,j define el
radio de la part́ıcula CG y el campo de fuerza supone el mismo tamaño efectivo,
σi,j = 0,47nm, excepto para las dos clases especiales de anillos y moléculas de agua.
2.3 CAMPO DE FUERZA MARTINI 21
Hay otra excepción: para interacciones entre tipos cargados (tipo Q) y los tipos más
apolares (C1 y C2), el rango de repulsión se ampĺıa estableciendo σi,j = 0,62nm. Este
cambio hace que sea más favorable para las part́ıculas cargadas mantener sus capas de
hidratación cuando son arrastradas a un medio apolar.
Las interacciones dentro del modelo se dividen en 10 niveles de enerǵıa. Esto permite
un ajuste más fino en la reproducibilidad de las enerǵıas de solvatación experimentales.
La fuerza de interacción vaŕıan entre las de tipo ”O” de mayor enerǵıa (ε = 5,6
kJ/mol), hasta las tipo ”IX” de menor enerǵıa (ε = 2,0 kJ/mol). Como se muestra
en la Figura 2.2 estos niveles de enerǵıa se asignan a interacciones entre part́ıculas
CG espećıficas. Por ejemplo, el nivel ”O” modela interacciones en compuestos sólidos
a temperatura ambiente o la capa de hidratación de los grupos cargados. El nivel ”I”
modela interacciones polares fuertes como en el seno de agua, el nivel ”IV” modela
las interacciones no polares en cadenas alifáticas y los niveles ”V”-”VIII” se utilizan
para modelar varios grados de repulsiones hidrofóbicas entre fases polares y apolares.
El nivel ”IX” finalmente describe la interacción entre part́ıculas cargadas y un medio
muy apolar.
Figura 2.2: Tabla de tipos de interacciones entre distintos tipo de part́ıculas CG. Con las
dos primeras filas y columnas se construye el nombre del tipo de átomo. Aśı por ejemplo, las
part́ıculas P5 y Q0 tienen una interacción de tipo I.
Además de la interacción LJ, los grupos con carga, q, completa o parcial, interactúan
a través de una función de enerǵıa potencial de Coulomb desplazada, tal como muestra
la Ecuación 2:
Uel(r) =
qiqj
4πε0εrr
(2)
con constante dieléctrica relativa εr = 15.
22 MÉTODOS
Potenciales del enlace covalente
Los enlaces covalentes se describen mediante un conjunto de funciones de enerǵıa
potencial, de las cuales pueden mencionarse las siguientes:
Vb =
1
2
Kb(di,j − db)2 (3)
Va =
1
2
Ka(cosφijk − cosφa)
2 (4)
actuando entre los sitios enlazados i, j, k con distancia de equilibrio db y ángulo φa.
Las constantes de fuerza K son generalmente débiles, lo que permite la flexibilidad de
la molécula en el nivel CG que reflejan los movimientos colectivos en el nivel de grano
fino. El potencial enlazado Vb se utiliza para grupos atómicos enlazados qúımicamente
y el potencial de ángulo Va para representar la rigidez de la cadena. También se utilizan
otros potenciales para imponer la estructura secundaria del esqueleto del péptido, y
para evitar distorsiones fuera del plano, por ejemplo en el caso de grupos quirales. Se
excluyen las interacciones LJ entre vecinos más cercanos.
Implementación
La forma funcional del campo de fuerza CG se desarrolló originalmente para un uso
conveniente con el software de simulación GROMACS [18]. Pero existen otros paquetes
de simulación tales como NAMD, GROMOS and Desmond.
2.3.3. Topoloǵıas Disponibles
Diferentes grupos de investigación han desarrollado bloques de construcción
genéricos para varios tipos de moléculas como ĺıpidos, protéınas, azúcares, pero también
para otras más espećıficas como fullereno, ADN, colágeno y poĺımeros. Todas estas
topoloǵıas están disponibles en el sitio web de MARTINI: http://cgmartini.nl.
Ĺıpidos
El campo de fuerza de MARTINI se desarrolló originalmente con una fuerte
orientación hacia los sistemas de ĺıpidos. Los modelos de ĺıpidos se han probado
exhaustivamente en muchos tipos de sistemas que abarcan no solo el estado bicapa sino
también las fases micelar, monocapa, hexagonal y cúbica. En la Figura 2.1 semuestra
un ejemplo de topoloǵıa para una molécula de dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC).
Las colas hidrófobas están formadas por part́ıculas de tipo C1, el resto de glicerol de
part́ıculas Na de polaridad intermedia y el grupo de cabeza de una part́ıcula Qa cargada
negativamente para el grupo fosfato y una part́ıcula Q0 cargada positivamente para
http://cgmartini.nl
2.3 CAMPO DE FUERZA MARTINI 23
el grupo colina. Los dobles enlaces en la cola se pueden modelar eficazmente usando
part́ıculas ligeramente menos hidrófobas (C2, C3) junto con un cambio del potencial
angular que gobierna la rigidez y la orientación de las colas liṕıdicas. Las topoloǵıas
actualmente disponibles incluyen PC (fosfatidilcolina), PE (fosfatidiletanolamina), PG
(fosfatidilglicerol) y PS (fosfatidilserina) entre otros fosfoĺıpidos.
Protéınas
Cada aminoácido de una cadena polipet́ıdica en el modelo CG está formada por:
i) una part́ıcula backbone (BB) que enlaza los aminoácidos unos con otros en la
”cadena carbonada” para formar el polipéptido; ii) part́ıculas que forman las cadenas
laterales caracteŕısticas de cada tipo de aminoácido. En la Figura 2.3 se muestra una
representación 3D del modelo CG de la hélice transmembrana de DR5.
Figura 2.3: Representación tridimensional de un modelo CG de la hélice transmembrana de
DR5. En azul se ven los atomos BB unidos entre śı formando la cadena carbonada. En amarillo,
las part́ıculas CG que representan las cadenas laterales (o residuos) de los aminoácidos.
La mayoŕıa de los aminoácidos se construyen con los tipos de part́ıculas
CG estándar. Los aminoácidos cargados positivamente se modelan mediante una
combinación de una part́ıcula de tipo Q y una de tipo N o C. Las cadenas laterales
más voluminosas basadas en anillos están modeladas por tres o cuatro part́ıculas
de la clase especial de part́ıculas de anillo. Los residuos glicina o alanina solo están
representados por la part́ıcula de la cadena carbonada (BB). La Figura 2.4 muestra
de manera ilustrativa el mapeo CG de los 20 aminoácidos naturales. Para compensar
la falta de direccionalidad en las interacciones de la cadena carbonada (enlaces H),
24 MÉTODOS
el tipo de part́ıcula utilizada para la cadena carbonada se hace una función de su
estructura secundaria; cuando está libre en solución o en una estructura tipo ”curva”,
la cadena carbonada tiene un fuerte carácter polar (tipo P), mientras que como parte
de una hélice α o hebra β, los enlaces de hidrógeno entre la cadena carbonada reducen
significativamente el carácter polar (tipo N) de estas part́ıculas.
Figura 2.4: Representación Coarse-Grained (CG) del modelo MARTINI para aminoácidos.
Las part́ıculas violetas son apolares, las azules y verdes de polaridad intermedia, las grises y
naranjas son polares y las rojas representan part́ıculas cargadas.
Solventes
De todos los solventes disponibles con modelado CG, el de mayor interés es sin duda
el agua, que se lleva el mayor costo computacional debido a la cantidad de moléculas
requeridas para su simulación. Cuatro moléculas de agua se representan como un solo
sitio CG de tipo P4 (Figura 2.1) y existen diversas representaciones para otros solventes
como el benceno, cloroformo, ente otros.
Iones
Los iones CG están representados por part́ıculas de tipo Q. En el caso de iones
de un solo átomo (por ejemplo, sodio, cloruro), se considera que la primera capa de
hidratación está incluida en la representación CG. Teniendo en cuenta la dificultad de
modelar iones que ya tienen campos de fuerza AA, el campo de fuerza de iones CG es
solo cualitativamente preciso.
2.4. SIMULACIÓN DE DOMINIOS
TRANSMEMBRANA DE MIEMBROS DE
LA FAMILIA TNFR
Con estas herramientas, el grupo de trabajo construyó modelos de grano grueso
(CG) para simular las interacciones de los dominios transmembrana (TM) de DR5, Fas
2.4 SIMULACIÓN DE DOMINIOS TRANSMEMBRANA DE MIEMBROS DE LA
FAMILIA TNFR 25
y p75 incrustados en un entorno de bicapa liṕıdica solvatada con agua CG expĺıcita. Los
péptidos CG se construyen utilizando la herramienta martinize.py [19]. Las estructuras
de entrada para cada hélice se obtienen a partir de las estructuras oligoméricas de todos
los átomos determinadas por RMN para DR5 (PDB: 6nhw), Fas (PDB: 2na7) y p75
(PDB: 2mic).
En el presente trabajo, solo nos concentraremos en el análisis de la oligomerización
del dominio transmembrana de DR5 y de dos variantes mutadas del mismo.
El sistema de partida consiste en una caja de 25 x 25 x 10 nm con 36 hélices CG
individuales espaciadas uniformemente en el plano XY con sus ejes orientados en el eje
Z. Las 36 hélices se incrustan en una bicapa liṕıdica orientada en el plano XY utilizando
la herramienta INSANE (INSert membrANE) y se solvatan con moléculas de agua
CG. En la Figura 2.5 se muestra una representación tridimensional del sistema en dos
momentos distintos de la simulación: al comienzo, cuando las hélices están espaciadas
de manera equidistante con sus orientaciones al azar y a los 6 microsegundos, cuando
ya se establecieron varias interacciones.
Figura 2.5: Representación tridimensional del sistema a distintos tiempos de simulación: 0
ns (paneles superiores) y 6000 ns (paneles inferiores). El sistema se observa orientado sobre el
eje XY de la membrana (paneles izquierdos) o como un corte sobre el eje Z (paneles derechos).
Las part́ıculas CG de las hélices de DR5 se muestran como esferas (azules las part́ıculas BB de
la cadena carbonada, amarillas las de las cadenas laterales). Los átomos de los fosfoĺıpidos de
membrana se muestran como ĺıneas (en gris los carbonos de los ácidos grasos; en cian los grupos
glicerol, en rosado los fosfatos y en azul los grupos colina de las cabezas polares). Además, en la
representación sobre el eje Z (derecha) se muestra la capa de agua y iones como esferas verdes
pequeñas por encima y debajo de la membrana.
26 MÉTODOS
Para simular la membrana liṕıdica se utilizó una composición de fosfoĺıpidos de
grano grueso de tipo DOPC y DLPC que simulan satisfactoriamente fosfoĺıpidos
insaturados de entre 14 y 18 átomos de carbono. Estas composiciones son similares a las
utilizadas en los experimentos de RMN donde se determinó la estructura oligomérica
de DR5. Los fosfoĺıpidos se distribuyeron por igual en ambos lados de la membrana.
El sistema se completa con part́ıculas de agua CG y consta de 36 péptidos,
1700 ĺıpidos, 26000 aguas y 600 iones (a una concentración fisiológica de 150 mM),
totalizando 48000 part́ıculas. Las simulaciones se realizan con el paquete GROMACS
versión 2016.5 [18] utilizando el campo de fuerza Martini v2.1 [14]. Después de los
pasos iniciales de minimización y equilibrado, los sistemas se simularon con un paso
de tiempo de 20 fs a 310 K y 1 bar utilizando el termostato de cambio de velocidad
de Busi et al. [20] y el barostato semi-isotrópico Parrinello-Rahman. Cada sistema se
simula durante al menos 8.5 µs.
2.5. ANÁLISIS DE LAS SIMULACIONES
En el presente trabajo nos concentramos en los análisis de la geometŕıa que adoptan
las interacciónes hélice-hélice. En especial, trabajamos en el desarrollo de distintos
mapas de densidad y en el análisis de grafos.
2.5.1. Análisis geométrico de la interacción entre hélices
El sistema que se simuló está formado por 36 hélices que difunden e interactúan
libremente. Esto permite mejorar el valor estad́ıstico de los análisis ya que una
sola simulación permite analizar al mismo tiempo un gran número de interacciones.
Además este sistema permite que se formen oligomerizaciones no sesgadas, como ocurre
cuando el sistema está formado por la cantidad de hélices que a priori se conoce que
interactúan. Por lo tanto, el análisis tiene por objetivo acumular la información de las
interacciones que se dan con cada una de las 36 hélices con sus vecinas a lo largo de la
simulación.
Aśı, con los datos de las simulaciones